PL B BUP 26/ WUP 04/09. Rafał Witek, WTS sp.p.

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (13) B1 (51) Int.Cl. C12Q 1/68 ( ) A61P 35/00 ( ) (54) Sposób i zestaw do wykrywania wysokiej genetycznie uwarunkowanej predyspozycji do raka prostaty oraz zastosowanie zmiany germinalnej w obrębie genu NBS1 (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 26/04 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 04/09 (73) Uprawniony z patentu: Cybulski Cezary,Przecław,PL Lubiński Jan,Szczecin,PL Górski Bohdan,Szczecin,PL Gliniewicz Bartłomiej,Szczecin,PL Sikorski Andrzej,Szczecin,PL Pomorska Akademia Medyczna,Szczecin,PL (72) Twórca(y) wynalazku: Cezary Cybulski,Przecław,PL Jan Lubiński,Szczecin,PL Bohdan Górski,Szczecin,PL Bartłomiej Gliniewicz,Szczecin,PL Andrzej Sikorski,Szczecin,PL (74) Pełnomocnik: Rafał Witek, WTS sp.p. PL B1 (57) 1. Sposób wykrywania wysokiej genetycznie uwarunkowanej predyspozycji do raka prostaty, znamienny tym, że w próbce materiału genetycznego pobranej od pacjenta bada się obecność zmiany germinalnej w obrębie genu NBS1, przy czym obecność rzeczonej zmiany wskazuje na predyspozycję do raka prostaty. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że bada się obecność mutacji 657del5. 6. Zastosowanie według zastrz. 5, znamienne tym, że zmianą germinalną jest mutacja9. Zestaw do wykrywania wysokiej genetycznie uwarunkowanej predyspozycji do raka prostaty metodą opartą o PCR, znamienny tym, że składa się przynajmniej z dwóch różnych oligonukleotydów pozwalających na amplifikację regionu zawierającego zmianę germinalną w obrębie genu NBS1, przy czym korzystnie amplifikowany region zawiera mutację 657del5. 9. Zestaw do wykrywania wysokiej genetycznie uwarunkowanej predyspozycji do raka prostaty metodą opartą o PCR, znamienny tym, że składa się przynajmniej z dwóch różnych oligonukleotydów pozwalających na amplifikację regionu zawierającego zmianę germinalną w obrębie genu NBS1, przy czym korzystnie amplifikowany region zawiera mutację 657del Zestaw do ASO-PCR według zastrz. 8, znamienny tym, że zawiera primery Nbsex6f, Nbsex6r oraz Nbsdel5.

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotami wynalazku są sposób i zestaw do wykrywania wysokiej genetycznie uwarunkowanej predyspozycji do raka prostaty oraz zastosowanie zmiany germinalnej w obrębie genu NBS1 do wykrywania takiej predyspozycji. Ogólnie wynalazek dotyczy nowej metody diagnostycznej. Przedmioty wynalazku służą do syntezy DNA oraz identyfikacji anomalii w materiale genetycznym pacjenta, które są skorelowane z dziedziczną predyspozycją do raka prostaty. Rak prostaty (PC) jest wiodącą przyczyną zachorowalności i śmiertelności mężczyzn na świecie. Badania epidemiologiczne sugerują, że około 5-10% przypadków zachorowań na raka prostaty można przypisać wysokiej dziedzicznej predyspozycji. Najdobitniej o wpływie czynników genetycznych świadczą badania zachowań na nowotwory u bliźniąt jednojajowych, które wykazują aż 42% zgodność zachorowań na PC (1). Badania te również wskazują na złożoną patogenezę PC i zakładają, że istnieje wiele genów o zróżnicowanej ekspresji predysponujących do PC. Poznano kilka regionów chromosomalnych (loci), które prawdopodobnie zawierają geny wysokiego ryzyka raka prostaty: HPC1, HPC2, PCAP, CAPB, HPCX, 20q13, 16q23, lecz dotychczas w obrębie tych loci nie udało się zidentyfikować konkretnego genu związanego ze znaczącym ryzykiem PC, który miałby istotne znaczenie kliniczne. Jedynie dwa badania zakończyły się sklonowaniem konkretnych genów w obrębie powyższych regionów chromosomalnych - geny RNASEL (HPC1) i ELAC2 (HPC2) (2;3). Jednak liczne analizy sugerują, że owe geny mają jedynie ograniczone znaczenie w rozwoju dziedzicznego PC (4-6). Zgłoszenie patentowe WO (Myriad Genetics, Inc) opisuje gen HPC1 oraz obserwowane w nim mutacje, których występowanie skorelowano z rakiem prostaty. Gen składa się z 15 egzonów, które po splicingu mogą tworzyć liczne warianty transkrypcyjne. US A1 ujawnia sposoby i produkty służące do wykrywania genu HPC2, warunkującego predyspozycję do raka prostaty oraz wybrane allele tego genu, których występowanie skorelowano z rakiem prostaty. Zgłoszenie patentowe WO (Urocor, Inc) ujawnia sekwencję genu UC41, który może być wykorzystywany jako marker genetyczny w diagnozowaniu raka prostaty. Ujawniono także sposoby leczenia raka prostaty wykorzystujące konstrukty antysensowne lub przeciwciała specyficzne wobec produktów genu UC41. Większość nowotworów człowieka jest związana z niestabilnością chromosomalną. W komórce istnieje układ rozpoznawania i naprawy uszkodzeń DNA, który pełni kluczową rolę w utrzymaniu integralności genomu w odpowiedzi na czynniki mutagenne. Badania wskazują, że układ ten bierze udział w patogenezie PC. Mutacje germinalne wywołujące zespoły łamliwości chromosomów takie jak Nijmegen (NBS), Bloom, Fanconi anaemia and ataxia telangiectasia, związane są z uszkodzeniem tego szlaku naprawy DNA, dlatego tez zespoły te charakteryzują się niestabilnością chromosomalną, niedoborami immunologicznymi oraz predyspozycją do nowotworów [7,8]. Gen wywołujący zespół Nijmegen - NBS1 został zlokalizowany na chromosomie 8q21 i sklonowany [9]. W zgłoszeniu WO wskazano liczne polimorfizmy genu NBS1 i mutacje skorelowane z występowaniem zespołu Nijmegen. Produkt ekspresji genu NBS1, nibryna (lub p95), jest częścią składową kompleksu nuklezay hmre11/hrad50/nbs1. Kompleks ten z kolei wchodzi w skład dużego kompleksu białkowego, którego centralnym ogniwem jest białko BRCA1 (BRCA1-asociated genome surveillance complex (BASC)) odpowiedzialnego za naprawę DNA [8]. U większości pacjentów z zespołem NBS stwierdzono homozygotyczną delecję germinalną 5 nukleotydów w obrębie eksonu 6 genu NBS1 (657del5). Zdecydowana większość pacjentów dotkniętych zespołem Nijmegen pochodzi z krajów słowiańskich, gdyż heterozygotyczne nosicielstwo mutacji założycielskiej 657del5 jest bardzo częste (0,6%) w tych krajach (Polska, Ukraina i Czechy) [10]. Dlatego wszyscy pacjenci z zespołem NBS słowiańskiego pochodzenia są homozygotami prostymi 657del5. Dotychczas opisano, że zaburzenia germinalne genu NBS1 są związane z rozwojem białaczki, czerniaka, raka piersi oraz jajnika (11-14), a nie badano znaczenia mutacji genu NBS1 w rozwoju PC. Mimo długotrwałych wysiłków badawczych zmierzających do pozyskania sposobu diagnozowania predyspozycji do raka prostaty istnieje ciągłe zapotrzebowanie na tego rodzaju narzędzia diagnostyczne. Celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie sposobów i produktów, które mogłyby być zastosowane do wykrywania wrodzonej predyspozycji do raka prostaty. Przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania wysokiej genetycznie uwarunkowanej predyspozycji do raka prostaty, charakteryzujący się tym, że w próbce materiału genetycznego pobranej od

3 PL B1 3 pacjenta bada się obecność zmiany germinalnej w obrębie genu NBS1, przy czym obecność rzeczonej zmiany wskazuje na predyspozycję do raka prostaty. Korzystnie, w sposobie według wynalazku bada się obecność mutacji 657del5, natomiast pacjent jest osobą pochodzenia słowiańskiego. W jednej z możliwych realizacji sposobu obecność zmiany germinalnej bada się techniką wybraną spośród ASO PCR (ang. Allele specific - PCR), SSCP (ang. single-strand conformation polymorphism), sekwencjonowanie, ASA (ang. allele specific analysis), RFLP-PCR (ang. restriction fragment lenght polymorphism - polymerase chain reaction). Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie zmiany germinalnej w obrębie genu NBS1 do wykrywania wysokiej genetycznie uwarunkowanej predyspozycji do raka prostaty u człowieka. Korzystnie, zmianą germinalną jest mutacja 657del5, natomiast predyspozycję do raka prostaty wykrywa się u osoby pochodzenia słowiańskiego. W jednej z możliwych realizacji wykrywania wykorzystuje się technikę wybraną spośród ASO PCR (ang. Allele specific - PCR), SSCP (ang. single-strand conformation polymorphism), bezpośrednie sekwencjonowanie, ASA (ang. allele specific analysis), RFLP-PCR (ang. restriction fragment lenght polymorphism - polymerase chain reaction). Przedmiotem wynalazku jest także zestaw do wykrywania wysokiej genetycznie uwarunkowanej predyspozycji do raka prostaty metodą opartą o PCR, charakteryzujący się tym, że składa się przynajmniej z dwóch różnych oligonukleotydów pozwalających na amplifikację regionu zawierającego zmianę germinalną w obrębie genu NBS1, przy czym korzystnie amplifikowany region zawiera mutację 657del5. Korzystnie, zestaw do ASO-PCR według wynalazku zawiera primery Nbsex6f, Nbsex6r oraz NbsdelS. Zgodnie z niniejszym wynalazkiem, nieoczekiwanie ustalono, że uszkodzenie genu NBS1 ma związek z rozwojem PC. Pozwoliło to na uzyskanie nowych sposobów i produktów, które mogą być zastosowane do wykrywania wrodzonej predyspozycji do raka prostaty. Dla lepszego zilustrowania wynalazku opis wzbogacono o załączone figury. Na figurze 1 przedstawiona została analiza LOH w tkankach nowotworowych PC u probanda rodziny nr 8 (linie 1-5) oraz u probanda rodziny 9 (linie 1b-5b) z użyciem markerów położonych w pobliżu genu NBS1 (linie 1-3 oraz linie 1b-3b) i za pomocą amplifikacji eksonu6 genu NBS1 (linie 4-5, linie 4b-5b). Utrata allela dzikiego genu NBS1 w tkance nowotworowej PC jest zaznaczona strzałkami. Kropki wskazują na allele zawierające mutację 657del5 genu NBS1. Na figurze 2 przedstawione zostały rodowody przedstawiające rodziny z mutacją założycielską genu NBS1. Segregacja mutacji NBS1 z występowaniem raka prostaty w rodzinie została pokazana w rodzinach 8, 9 11, 12. Wiek pacjenta jest podany po prawej stronie nazwy nowotworu. Kropka ( ) przy prawym dolnym rogu symbolu wskazuje, że próbka krwi pacjenta była badana. Plus (+) przy prawym dolnym rogu symbolu wskazuje na obecność heterozygotycznej mutacji MBS1 u badanego pacjenta, a minus (-) wskazuje pacjentów, u których nie stwierdzono mutacji. Strzałki wskazują na probandów. Całkowicie zaczernione symbole oznaczają pacjentów z nowotworem, w przypadku których dotarto do wyników histopatologicznych potwierdzających rozpoznanie nowotworu, w ¾ zaczernione symbole wskazują pacjentów, w przypadku których nie udało się dotrzeć do wyników histopatologicznych. Typ nowotworu znajduje się pod każdym symbolem. Figura 3 prezentuje Fragment sekwencji genomowej genu NBS1 zawierający ekson 6 genu (zaznaczony pogrubionymi literami) Sekwencja pochodzi z Banku Genów (Genbank, Accession AB013139) (Matsuura,S., Tauchi,H., Nakamura,A., Kondo,N., Sakamoto,S., Endo,S., Smeets,D., Solder,B., Belohradsky,B.H., Kaloustian,V.M., Oshimura,M, Isomura,M., Nakamura,Y. and Komatsu,K. Positional cloning of the gene for Nijmegen breakage syndrome Nat. Genet. 19 (2), (1998)) Mutacja 657del5 obejmuje nukleotydy zaznaczone pochylonymi literami. Dla ułatwienia realizacji wynalazku został on zilustrowany poniższymi przykładami, które nie powinny być jednak uznane za ograniczenie jego zakresu. P r z y k ł a d 1. Ustalanie korelacji pomiędzy zmianą germinalną w obrębie genu NBS1, a predyspozycją do raka prostaty - na przykładzie mutacji 657del5. Zasady testu, wybór grup pacjentów. Przeprowadziliśmy analizę występowania mutacji 657del5 w grupie kolejnych 340 raków prostaty zdiagnozowanych w Klinice Urologii w Szczecinie oraz w grupie kolejnych 56 rodzinnych przypadków PC zdiagnozowanych w Ośrodku Nowotworów Dziedzicznych w Szczecinie, w których proband i co najmniej jeden krewny pierwszego lub drugiego stopnia zachorowali na PC. Podejrzenie PC stawiano na postawie stwierdzenia poziomu PSA powyżej 4,0 ng/ml i/lub badania przezodbytniczego prostaty; PC diagnozowano w Klinice Urologii na podstawie biopsji gruboigłowej wykonywanej pod kontrolą USG we wszystkich kolejnych przypadkach podejrzanych o PC kierowanych do Kliniki; każdy

4 4 PL B1 wycinek ze stercza oznaczony był oddzielnie a uzyskany materiał histologiczny badano metodami standartowymi w Zakładzie Genetyki i Patomorfologii PAM w Szczecinie. Ostateczna diagnoza raka prostaty była stawiana zawsze po ocenie jednego patologa konsultującego - prof. Jana Lubińskiego. Grupę kontrolną stanowiło 1000 osób z populacji wybranych losowo przez lekarzy rodzinnych w Szczecinie. W celu wykrycia częstej mutacji genu NBS1 stosowano technikę ASO-PCR oraz bezpośrednie sekwencjonowanie DNA wyizolowanego z limfocytów krwi obwodowej. Aby stwierdzić czy gen NBS1 ulega somatycznej inaktywacji w tkance raka prostaty przeprowadziliśmy analizę utraty heterozygotyczności (LOH). Do analizy LOH zakwalifikowano 9 z 12 guzów nowotworowych, z których było możliwe wykonanie mikrodissekcji ognisk komórek nowotworowych, (od 5 pacjentów były to tkanki uzyskane za pomocą biopsji gruboigłowej a od 4 tkanki uzyskane w drodze prostatektomii). Po starannej mikrodyssekcji tkanki nowotworowej, przyprowadziliśmy badanie LOH za pomocą markerów mikrosatelitarnych D8S88, D8S1811 (11, 12), oraz za pomocą amplifikacji PCR eksonu 6 genu NBS1 ze starterami znakowanymi fluorescencyjnie. P r z y k ł a d 2. Wykrywanie mutacji 657del5 genu NBS1 Izolacja genomowego DNA Krew obwodową pobraną w ilości 5 ml mieszano z 100 μl 1M EDTA a następnie wirowano w 50 ml polipropylenowych probówkach typu Falcon" przez 10 minut przy 3000 g w temperaturze 4 C. Górną warstwę osocza odciągano, zaś dolną mieszano z 45 ml buforu 2X (0,1 M NH 4 Cl, 0,25 M KHCO 3, 1 mm EDTA) i pozostawiano na 15 minut w temperaturze 4 C. Następnie mieszaninę wirowano przy 3000 g przez 10 minut w temperaturze 4 C. Supernatant zawierający zhemolizowane erytrocyty zlewano. Osad leukocytów ponownie zalewano buforem 2X i wirowano przy 3000 g przez 10 minut w temperaturze 4 C. Wyżej wymienioną czynność powtarzano 3-krotnie, do uzyskania czystego osadu leukocytarnego. Następnie osad mieszano z 3 ml buforu trawiącego (50 mm NaCl, 25 mm MgCl 2, 1 mm EDTA; ph 8.0) z dodatkiem 200 μl 10% SDS i 500 μg Proteinazy K. Trawienie przeprowadzano w cieplarce o temperaturze 37 C przez okres 24 godzin. Produkty trawienia mieszano z 3 ml fenolu buforowanego 0,5 M Tris HCl (ph 8,4), a następnie do roztworu dodawano 3 ml mieszaniny chloroformu i alkoholu izoamylowego w stosunku objętości 1:25. Całą mieszaninę wstrząsano przez około 1 minutę aż do uzyskania homogennej emulsji, po czym wirowano przy 8000 g przez 10 minut w temperaturze 20 C. Po odwirowaniu uzyskiwano bezbarwną górną fazę wodną zawierającą DNA, pierścień białka w interfazie oraz dolną organiczną fazę zawierającą chloroform i fenol. Fazę górną przenoszono do odrębnej probówki, mieszano z taką samą ilością chloroformu po czym wirowano przy 8000 g przez 10 minut. Wyżej opisane oczyszczanie chloroformem powtarzano 3-krotnie aż do zaniku pierścienia białkowego w interfazie. Tak oczyszczoną fazę wodną zawierającą DNA mieszano z 5M NaCl (stosunek objętości fazy wodnej do NaCl - 10:1) i 96% alkoholem etylowym (stosunek objętości fazy wodnej z NaCl do etanolu - 1:10). Mieszaninę pozostawiano przez noc w temperaturze 20 C. Uzyskany kłaczek" DNA przenoszono do odrębnej probówki, przemywano zimnym 70% alkoholem etylowym po czym suszono przez 30 minut w otwartej probówce w temperaturze 37 C. Oczyszczony DNA po rozpuszczeniu w 400 μl buforu TE (25 mm Tris HCl, 1 mm EDTA; ph 8.4) przechowywano w 4 C. Allele specific - PCR (ASO-PCR) Reakcję ASO-PCR przeprowadzano w automatycznym termocyklerze (DNA ThermalCycler Perkin Elmer). Mieszanina reakcyjna o objętości 25 μl zawierała: 1 μl (50 ng) genomowego DNA, 4 pmol startera Nbsex6f, 6 pmol startera Nbsex6r, 10 pmol startera Nbsdel5, 2.5 μl buforu reakcyjnego (100 mm Tris-HCl, 500 mm KCL, 15 mm MgCl 2, 1 mg/ml żelatyny; ph 8.6), 200 μm każdego z deoksynukleotydów (datp, dctp, dgtp i dttp) oraz 1 U Taq polimerazy DNA. W każdej reakcji stosowano 2 kontrole dodatnie (kontrole z DNA od heterozygoty NBS1 oraz homozygoty NBS1) oraz 2 kontrole ujemne (kontrola z DNA od pacjenta bez mutacji NBS1 oraz kontrola, która nie zawierała DNA). Amplifikację przeprowadzano w następujących warunkach: a) wstępna denaturacja - 95 C 5 minut b) wstępnych 11 cykli składających się z: denaturacji - 94 C 30 sekund przyłączania starterów - 62 do 56 C 30 sekund* wydłużania komplementarnego DNA - 72 C 30 sekund c) kolejnych 30 cykli, każdy składający się z: denaturacji - 94 C 30 sekund

5 PL B1 5 przyłączania starterów - 56 C 30 sekund wydłużania komplementarnego DNA - 72 C 30 sekund * - podczas pierwszych 11 cykli temperatura przyłączania starterów była obniżana o 0,6 C w każdym kolejnym cyklu (w pierwszym cyklu wynosiła 62 C, w drugim 61,4 C, w trzecim 60,8 C, w czwartym 60,2 C, w piątym 59,6 C, w szóstym 59 C, siódmym 58,4 C, w ósmym 57,8 C, w dziewiątym 57,2 C, w dziesiątym 56,6 C, jedenastym 56 C) Sekwencja primerów użytych w reakcji ASO-PCR: Nbsex6f, 5' CACCTCTTGATGAACCATCT Nbsex6r, 5' CGTTAACAACTACTGATAAGAG Nbsdel5, 5' GGACGGCAGGAAAGAAATCTT (starter specyficzny dla 657del5) Produkty reakcji PCR w ilości 5 μl mieszano z 10 μl buforu Stop" (roztwór sacharozy zabarwiony barwnikiem bromophenol blue) i poddawano elektroforezie w żelu agarozowym (1.5% agaroza (SeaKem FMC), IX bufor TBE, 25 μg/ml bromku etydyny) w warunkach 6V/cm przez 30 min. Rozdzielone produkty uwidaczniano w świetle UV. Wszystkie przypadki, w których uwidocznił się na żelu agarozowym dodatkowy, krótszy, prążek opowiadający produktowi amplifikacji z starterem specyficznym dla delecji 657del5, były sekwencjonowane w celu potwierdzenia obecności mutacji genu NBS1. Sekwencjonowanie PCR preparatywny Amplifikację eksonu 6 genu NBS1 przeprowadzono ze starterami Nbsex6f i Nbsex6r w analogicznych warunkach eksperymentalnych jak powyżej opisana reakcja ASO-PCR. Jedyna różnica polegała na tym, że w reakcji PCR preparatywny nie stosowano startera NbsdelS. Oczyszczanie produktów PCR Produkty amplifikacji eksonu 6 genu NBS1 przenoszono na kolumienkę Microcon-100 (Amicon) umieszczoną na probówce Eppendorf, dodawano 400 μl wody destylowanej i wirowano przy 1850 g przez 15 minut. Przesącz zawierający startery i pozostałości mieszaniny reakcyjnej PCR wylewano, zaś produkty reakcji pozostałe na filtrze kolumienki zalewano 400 μl H 2 O i wirowano ponownie przez 15 minut przy 1850 g. Ostatnią czynność powtarzano 3-krotnic. W celu odzyskania oczyszczonych produktów PCR odwróconą o 180 kolumienkę przenoszono na nową probówkę i wirowano przez 3 minuty przy 9000 g. Wszystkie wirowania przeprowadzono w temp 25 C. Uzyskiwano w ten sposób około 5 μl czystego produktu, który rozcieńczano wodą do objętości 20 μl. PCR sekwencyjny Asymetryczny PCR sekwencyjny wykonywano w automatycznym termocyklerze Gene Amp PCR System 9600 firmy Perkin Elmer w 20 μl mieszaninie reakcyjnej zawierającej: 1 pmol startera Nbsexl6f, 4 μl oczyszczonego matrycowego produktu PCR, 8 μl BigDye Terminator Ready Reaction Kit v3.0 (Applied Biosystems). W celu potwierdzenia wyników sekwencjonowania z starterem Nbsex6f w każdym przypadku przeprowadzono oddzielną reakcję sekwencjonowania z użyciem startera Nbsex6r. Parametry sekwencyjnego PCR: wstępna denaturacja - 96 C 30 sekund 30 cykli, każdy składający się z: denaturacji - 94 C 30 sekund przyłączania starterów - 56 C 30 sekund wydłużania komplementarnego DNA - 72 C 30 sekund Całość produktów sekwencjonowania (20 μl) przenoszono do probówki Eppendorf o pojemności 0,5 ml, zalewano 60 μl 96% etanolu oraz dodawano 1 μl kwaśnego octanu sodu (ph 5,0) w celu wytrącenia produktów PCR. Probówki wirowano w 3000 g przez 20 min w 25 C. Po żwirowaniu etanol wylewano, a osad zawierający produkty PCR-u sekwencyjnego przepłukiwano zalewając go 200 μl 70% etanolu oraz wirowano w 3000 g przez 5 min w 25 C. Następnie cały alkohol ostrożnie wylewano, a pozostały w probówce osad suszono w aparacie próżniowym Eppendorf Concentrator 5301 przez min, po czym rozpuszczano w 4 μl sekwencyjnego buforu obciążającego (150 μl formamidu dejonizowanego, 50 μl 50 mm EDTA, 0.05% Dextran Blue). Rozpuszczone w buforze obciążającym produkty denaturowano przez 4 minuty w 94 C, przenoszono do łaźni z lodem, po czym nanoszono na denaturujący poliakrylamidowy żel sekwencyjny (4% akrylamid - 19:1, 1 x TBE, 6M mocznik). Rozdział elektroforetyczny dokonywano w automatycznym aparacie do sekwencjonowania ABI PRISM 377 DNA Sequencer (Applied Biosystems). Zbieranie danych w trakcie elektroforezy oraz ich

6 6 PL B1 analiza odbywały się za pomocą programów ABI PRISM 377 Collection Software and Sequencing Analysis Software Version 3.0 (Applied Biosystems). P r z y k ł a d 3. Badanie utraty heterozygotyczności (LOH) w tkance nowotworowej raka prostaty. Mikrodyssekcja tkanek i izolacja DNA Utrwalone w formalinie i zarchiwizowane w bloczkach parafinowych tkanki od pacjentów z rakiem prostaty (tkanki pochodzące z biopsji gruboigłowej lub tkanki pochodzące z postatektomii radykalnej) zostały skrojone za pomocą mikrotomu oraz umieszczone na czystych szkiełkach podstawkowych. Od każdego pacjenta tkanki skrojono na 6 szkiełek. Tkanki na jednym ze szkiełek były zabarwione hematoksyliną i eozyną. Tkanki umieszczone na pozostałych 5 szkiełkach posłużyły jako materiał do izolacji DNA. Przed mirodyssekcją, aby skrawki tkankowe uległy dokładnemu przyklejeniu do szkiełek, inkubowano je w cieplarce w 60 C przez noc. Następnie tkanki na szkiełkach były deparafinizowane w xylenie przez 24 h w temperaturze pokojowej. Po deparafinizacji skrawki przeprowadzono 2 razy przez roztwór 96% etanolu, jednokrotnie przez roztwór 70% etanolu (po 5 minut w każdym roztworze) i następnie umieszczono naczyniu z w dh2o. Uwodnione w ten sposób tkanki zabarwiono nanosząc na szkiełko kroplę hematoksyliny, a następnie nadmiar hematoksyliny spłukiwano wkładając szkiełka do naczynia z wodą i miesząc. Posługując się mikroskopem świetlnym wybierano możliwie jednolite ogniska raka prostaty w preparatach barwionych HE, oraz znajdywano te same ogniska w preparatach wybarwionych jedynie hematoksyliną przygotowanych do izolacji DNA. Pod mikroskopem świetlnym, za pomocą igły do iniekcji wycinano ogniska komórek nowotworowych (unikając zanieczyszczenia komórkami prawidłowymi) i przenoszono je do 1,5 ml probówek Eppendorf. Równolegle z tych samych szkiełek przeprowadzano mikrodyssekcję tkanek prawidłowych, które umieszczano w oddzielnych probówkach. W ten sposób powstały pary probówek zawierających tkankę nowotworową i tkankę prawidłową od tego samego pacjenta uzyskanych z tego samego fragmentu tkankowego. Następnie tkanki zalewano 1 ml buforu trawiącego (50 mm TrisHCl, 1 mm CaCl 2, ph 8.0) z dodatkiem 20 μl 10% SDS i 500 μg Proteinazy K. W każdej serii stosowano kontrole ujemne - próbki, które nie zawierały tkanek. Trawienie przeprowadzano w cieplarce o temperaturze 55 C przez okres 2 tygodni. W tym czasie dodatkowo dodawano dwukrotnie po 100 μg proteinazy K do próbek w trzecim i szóstym i dziewiątym dniu trawienia. Następnie probówki umieszczano w 96 C przez 10 min w celu inaktywacji enzymu. Około 600 μl mieszaniny uzyskanej po trawieniu oczyszczano na kolumienkach Microcon-100 (Amicon) według opisanej powyżej procedury oczyszczania produktów PCR preparatywnego. Po oczyszczeniu uzyskiwano około 5 μl roztworu zawierającego DNA, który rozcieńczano dh2o do 50 μl. W ten sposób od każdego nosiciela mutacji genu NBS1 uzyskano próbkę DNA zarówno z tkanki nowotworowej raka prostaty jak i próbkę zawierającą DNA z tkanki prawidłowej gruczołu krokowego. Analiza utraty heterozygotyczności (LOH) Analizę przeprowadzano za pomocą 3 reakcji PCR: 1) PCR1 z pimerami D8S88f - 5' TCCAGCAGAGAAAGGGTTAT; D8S88r - 5' GGCAAAGAGA- ACTCATCAGA 2) PCR2 z starterami D8S1811f - 5' CCCACCCCCAAAATGC; D8S1811r - 5' GGGTTTA- GGGAAGTGCAGAA). 3) PCR3 z użyciem znakowanych fluorescencyjnie starterów Nbsex6f i Nbsex6r amplifikujących ekson 6 genu NBS1 zawierający mutacje założycielską 657del5. Reakcje PCR przeprowadzano w automatycznym termocyklerze (DNA ThermalCycler Perkin Elmer). Mieszanina reakcyjna o objętości 25 μl zawierała: 4 μl izolowanego z tkanek DNA, 2.5 μl buforu reakcyjnego (100 mm Tris-HCl, 500 mm KCL, 1 5 mm MgCl 2, 1 mg/ml żelatyny; ph 8.6), 200 μm każdego z deoksynukleotydów (datp, dctp, dgtp i dttp) oraz 1 U Taq polimerazy DNA oraz 10 μg albuminy surowicy wołowej (ang. bovine serum albumin) (BSA - Fermentas). Mieszanina PCR1 zawierała dodatkowo po 5 pmol starterów D8S88f oraz D8S88r, PCR2 - po 5 pmol starterów D8S1811f oraz D8S1811r, PCR3 - po 5 pmol starterów Nbsex6f i Nbsex6r. W każdej reakcji stosowano kontrole dodatnie z DNA izolowanego z krwi obwodowej heterozygotycznych nosicieli mutacji NBS1 i kontrole ujemne PCR-u (PCR bez dodatku matrycowego DNA) i kontrole ujemne izolacji DNA z tkanek. Wszystkie reakcje przeprowadzano w następujących warunkach: a) wstępna denaturacja - 95 C 5 minut b) 42 cykli składających się z: denaturacji - 94 C 30 sekund

7 PL B1 7 przyłączania starterów 56 C 30 sekund wydłużania komplementarnego DNA - 72 C 30 sekund Jeden μl produktu PCR rozpuszczano w 10 μl sekwencyjnego buforu obciążającego (150 μl formamidu dejonizowanego, 50 μl 50 mm EDTA, 0.05% Dextran Blue). Rozpuszczone w buforze obciążającym produkty denaturowano przez 4 minuty w 94 C, przenoszono do łaźni z lodem, po czym 1 μl nanoszono na denaturujący poliakrylamidowy żel (4% akrylamid - 19:1, 1x TBE, 8M mocznik). Rozdział elektroforetyczny dokonywano w automatycznym aparacie do sekwencjonowania 377A DNA Sequencer (Applied Biosystems). Zbieranie danych w trakcie elektroforezy oraz ich analiza odbywały się za pomocą programów using ABI PRISM 377 Collection Software and GenScan Analysis Software Version 3.0 (Applied Biosystems). Obniżenie sygnału jednego z alleli powyżej 75% odczytywano jako utratę heterozygotyczności. Analizy statystyczne wyników uzyskanych w powyższych przykładach wykonano stosując Fisher's exact test. Nosicielstwo mutacji germinalnej 657del5 stwierdziliśmy w 9 (2,6%) z 340 kolejnych przypadków PC, w 5 z 56 (9%) rodzinnych przypadków oraz wóz 1000 (0,6%) osób z grupy kontrolnej za pomocą technik ASO-PCR i sekwencjonowanie. Częstość populacyjna 657del5 wykryta w naszym badaniu jest podobna do częstości opisanej w krajach słowiańskich przez Varona i wsp. (10). W 8 z 9 guzów poddanych mikrodyssekcji udało się wyizolować DNA o jakości wystarczającej do reakcji PCR. Utratę allela dzikiego genu NBS1 wykazaliśmy w 7 z 8 badanych guzów za pomocą amplifikacji eksonu 6 oraz z użyciem markerów polimorficznych (fig. 1). W 4 z 5 rodzinnych przypadków raka prostaty wykazaliśmy segregację mutacji z chorobą (fig. 2). Niniejszy wynalazek po raz pierwszy ujawnia znaczenie mutacji genu NBS1 w rozwoju PC. Nieoczekiwanie wykazano znamiennie częstsze występowanie mutacji założycielskiej genu NBS1 w grupie kolejnych (p-0,005, RR-2,365, 95% przedział ufności - 1,548-3,611) i rodzinnych raków prostaty (p-0,002, RR-8,571, 95% przedział ufności 4,274-17,190) w porównaniu do populacji kontrolnej oraz stwierdzono utratę allela dzikiego genu NBS1 w tkance nowotworowej PC u nosicieli mutacji 657del5. Wyniki te jednoznacznie wskazują na znaczenie mutacji NBS1 w patogenezie PC. Wydaje się, że nosicielstwo mutacji 657del5 może być związane nie tylko z predyspozycją do PC w populacjach słowiańskich, lecz również u osób słowiańskiego pochodzenia zamieszkujących inne kraje. Mutacja ta jest bardzo częsta i stanowi 100% wszystkich zaburzeń genu NBS1 wykrytych dotychczas u pacjentów z zespołem NBS w krajach słowiańskich. Tak wiec diagnostyka PC może być znacząco usprawniona, co najmniej w tej grupie etnicznej, poprzez wykrywanie tej mutacji założycielskiej genu NBS1 prostą techniką ASO-PCR. Ryzyko raka prostaty wynosi około 3% w populacji Polski liczącej blisko 40 milionów osób. Biorąc pod uwagę 2,6% częstość występowania mutacji założycielskiej genu NBS1 u pacjentów z PC, u około (14%) nosicieli defektu genu NBS1 rozwinie się PC. Ponieważ mutacje 657del5 wykryto statystycznie istotnie częściej w przypadkach rodzinnych w porównaniu do przypadków kolejnych (p-0,04, RR-2,526, 95% przedział ufności 1,201-5,313), ryzyko PC jest prawdopodobnie kilkukrotnie wyższe, gdy krewny nosiciela NBS1 jest dotknięty rakiem prostaty. Szczegółowa analiza penetracji - ryzyka PC związanego z uszkodzeniem genu NBS1 wymaga badań na znacznie większej grupie przypadków. Literatura 1. Lichtenstein P, Holm NV, Verkasalo PK, Iliadou A, Kaprio J, Koskenvuo M, Pukkala E, Skytthe A, Hemminki K. Environmental and heritable factors in the causation of cancer-analyses of cohorts of twins from Sweden, Denmark, and Finland. N Engl J Med 2000 Jul 13;343(2): Tavtigian SV, Simard J, Teng DH, Abtin V, Baumgard M, Beck A, Camp NJ, Carillo AR, Chen Y, Dayananth P, Desrochers M, Dumont M, Farnham JM, Frank D, Frye C, Ghaffari S, Gupte JS, Hu R, Iliev D, Janecki T, Kort EN, Laity KE, Leavitt A, Leblanc G, McArthur-Morrison J, Pederson A, Penn B, Peterson KT, Reid JE, Richards S, Schroeder M, Smith R, Snyder SC, Swedlund B, Swensen J, Thomas A, Tranchant M, Woodland AM, Labrie F, Skolnick MH, Neuhausen S, Rommens J, Cannon-Albright LA. A candidate prostate cancer susceptibility gene at chromosome 17p. Nat Genet 2001 Feb;27(2): Carpten J, Nupponen N, Isaacs S, Sood R, Robbins C, Xu J, Faruque M, Moses T, Ewing C, Gillanders E, Hu P, Bujnovszky P, Makalowska I, Baffoe-Bonnie A, Faith D, Smith J, Stephan D, Wiley K, Brownstein M, Gildea D, Kelly B, Jenkins R, Hostetter G, Matikainen M, Schleutker J, Klinger K, Connors T, Xiang Y, Wang Z, De Marzo A, Papadopoulos N, Kallioniemi OP, Burk R, Meyers D,

8 8 PL B1 Gronberg H, Meltzer P, Silverman R, Bailey-Wilson J, Walsh P, Isaacs W, Trent J. Germline mutations in the ribonuclease L gene in families showing linkage with HPC1. Nat Genet 2002 Feb;30(2): Wang L, McDonnell SK, Elkins DA, Slager SL, Christensen E, Marks AF, Cunningham JM, Peterson BJ, Jacobsen SJ, Cer-han JR, Blute ML, Schaid DJ, Thibodeau SN (2001) Role of HPC2/ELAC2 in hereditary prostate cancer. Cancer Res 61: Xu J, Zheng SL, Carpten JD, Nupponen NN, Robbins CM, Mestre J, Moses TY, Faith DA, Kelly BD, Isaacs SD, Wiley KE, Ewing CM, Bujnovszky P, Chang B, Bailey-Wilson J, Bleecker ER, Walsh PC, Trent JM, Meyers DA, Isaacs WB (2001) Evaluation of linkage and association of HPC2/ELAC2 in patients with familial or sporadic prostate cancer. Am J Hum Genet 68: Rebbeck TR, Walker AH, Zeigler-Johnson C, Weisburg S, Martin AM, Nathanson KL, Wein AJ, Malkowicz SB (2000) Association of HPC2/ELAC2 genotypes and prostate cancer. Ani J Hum Genet 67: Digweed M. (1993) Human genetic instability syndromes: single gene defects with increased risk of cancer. Toxicol. Lett; 67: Futaki M, and Lui JM. (2001) Chromosome breakage syndromes and the BRCA1 genome surveillance complex. Trends Mol Med; 7: Varon R, Vissinga C, Platzer M, Cerosaletti KM, Chrzanowska KH, Saar K, et al. (1998) Nibrin, a novel DNA double-strand break repair protein, is mutated in Nijmegen breakage syndrome. Cell; 93: Varon R, Seemanova E, Chrzanowska K, Hnateyko O, Piekutowska-Abramczuk D, Krajewska-Walasek M, et al. (2000) Clinical ascertainment of Nijmegen breakage syndrome (NBS) and prevalence of the major mutation, 657del5, in three Slav populations. Eur J Hum Genet; 8: Górski B, Dębniak T, Masojć B, Mierzejewski M, Medrek K, Cybulski C, Jakubowska A, Kurzawski G, ChosiaM, ScottRJ, Lubiński J. Germline 657del5 mutation in the NBS1 gene in breast cancer patients. Int J Cancer 2003 in press 12. Dębniak T, Górski B, Cybulski C, Jakubowska A, Kurzawski G, LenerM, Mierzejewski M, Masojć B, Mędrek K, Kładny J, Załuga E, Maleszka R, Chosia M, Lubiński J Germline 657del5 mutation in the NBS1 gene in patients with malignant melanoma of the skin Melanoma Research 2003, Vol 13 No X 13. Varon R, Reis A, Henze G, von Einsiedel HG, Sperling K, Seeger K. Mutations in the Nijmegen Breakage Syndrome gene (NBS1) in childhood acute lymphoblastic leukemia (ALL).(2001) Cancer Res; 61(9): Plisiecka-HaLasa J, Dansonka-Mieszkowska A, Rembiszewska A, Bidzinski M, Steffen J, Kupryjanczyk J. Nijmegen breakage syndrome gene (NBS1) alterations and its protein (nibrin) expression in human ovarian tumours. Ann Hum Genet 2002 Nov;66(Pt 6): Steffen J, Varon R, Thomas M, Maurer M, Stumm M, Nowakowska D, Rubach M, Kosakowska D, Ruka W, Nowacki Z, Rutkowski P, Demkow T, Piekutowska-Abramczuk D, Sperlink K. Frequency of the Heterozygous Germline NBS1 mutation 657del5 in Cancer Patients from Poland. International Workshop on Nijmegen Breakage Syndrome, Prague, Czech Republic Voelkel-Johnson C, Voeks DJ, Greenberg NM, Barrios R, Maggouta F, Kurtz DT, Schwartz DA, Keller GM, Papen-brock T, Clawson GA, Norris JS (2000) Genomic instability-based transgenic models of prostate cancer. Carcinogenesis 21: Fan Z, Chakravarty P, Alfieri A, Pandita TK, Vikram B, Guha C (2000) Adenovirusmediated antisense ATM gene transfer sensitizes prostate cancer cells to radiation. Cancer Gene Ther 7: Koivisto PA, Rantala 1 (1999) Amplification of the androgen receptor gene is associated with P53 mutation in hormone-refractory recurrent prostate cancer. J Pathol 187: Gayther SA, de Foy KA, Harrington P, Pharoah P, Dunsmuir WD, Edwards SM, Gillett C, Ardern-Jones A, Dearnaley DP, Easton DF, Ford D, Shearer RJ, Kirby RS, Dowe AL, Kelly J, Stratton MR, Ponder BA, Barnes D, Eeles RA (2000) The frequency of germ-line mutations in the breast cancer predisposition genes BRCA1 and BRCA2 in familial prostate cancer. The Cancer Research Campaign/British Prostate Group United Kingdom Familial Prostate Cancer Study Collaborators. Cancer Res 60: Dong X, Wang L, Taniguchi K, Wang X, Cunningham JM, McDonnell SK, Qian C, Marks AF, Slager SL, Peterson BJ, Smith DI, Cheville JC, Blute ML, Jacobsen SJ, Schaid to DJ, Tindall DJ,

9 PL B1 9 Thibodeau SN, Liu W. Mutations in CHEK2 associated with prostate cancer risk. Am J Hum Genet 2003 Feb;72(2): Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób wykrywania wysokiej genetycznie uwarunkowanej predyspozycji do raka prostaty, znamienny tym, że w próbce materiału genetycznego pobranej od pacjenta bada się obecność zmiany germinalnej w obrębie genu NBS1, przy czym obecność rzeczonej zmiany wskazuje na predyspozycję do raka prostaty. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że bada się obecność mutacji 657del5. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że pacjent jest osobą pochodzenia słowiańskiego. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że obecność zmiany germinalnej bada się techniką wybraną spośród ASO PCR (ang. Allele specific - PCR), SSCP (ang. single-strand conformation polymorphism), sekwencjonowanie, ASA (ang. allele specific analysis), RFLP-PCR (ang. restriction fragment lenght polymorphism - polymerase chain reaction). 5. Zastosowanie zmiany germinalnej w obrębie genu NBS1 do wykrywania wysokiej genetycznie uwarunkowanej predyspozycji do raka prostaty u człowieka. 6. Zastosowanie według zastrz. 5, znamienne tym, że zmianą germinalną jest mutacja 657del5. 7. Zastosowanie według zastrz. 6, znamienne tym, że predyspozycję do raka prostaty wykrywa się u osoby pochodzenia słowiańskiego. 8. Zastosowanie według zastrz. 5, znamienne tym, że do wykrywania wykorzystuje się technikę wybraną spośród ASO PCR (ang. Allele specific - PCR), SSCP (ang. single-strand conformation polymorphism), bezpośrednie sekwencjonowanie, ASA (ang. allele specific analysis), RFLP-PCR (ang. restriction fragment lenght polymorphism - polymerase chain reaction). 9. Zestaw do wykrywania wysokiej genetycznie uwarunkowanej predyspozycji do raka prostaty metodą opartą o PCR, znamienny tym, że składa się przynajmniej z dwóch różnych oligonukleotydów pozwalających na amplifikację regionu zawierającego zmianę germinalną w obrębie genu NBS1, przy czym korzystnie amplifikowany region zawiera mutację 657del Zestaw do ASO-PCR według zastrz. 8, znamienny tym, że zawiera primery Nbsex6f, Nbsex6r oraz Nbsdel5.

10 10 PL B1 Rysunki

11 PL B1 11

12 12 PL B1 Departament Wydawnictw UP RP Cena 4,00 zł.