(62) Numer zgłoszenia, z którego nastąpiło wydzielenie:

Transkrypt

1 PL B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (62) Numer zgłoszenia, z którego nastąpiło wydzielenie: (13) B1 (51) Int.Cl. C12Q 1/68 ( ) A61P 35/00 ( ) C12N 5/09 ( ) C12N 15/12 ( ) (54) Sposób i zestaw do wykrywania dziedzicznej predyspozycji do nowotworów złośliwych nerki, jelita grubego, raka prostaty, zespołu mieloproliferacyjnego, lobularnego raka piersi oraz zastosowanie mutacji germinalnej I157T do wykrywania rzeczonej predyspozycji (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 22/12 (73) Uprawniony z patentu: CYBULSKI CEZARY, Przecław, PL LUBIŃSKI JAN, Szczecin, PL POMORSKI UNIWERSYTET MEDYCZNY w SZCZECINIE, Szczecin, PL (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 09/13 (72) Twórca(y) wynalazku: CEZARY CYBULSKI, Przecław, PL JAN LUBIŃSKI, Szczecin, PL (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Anna Rożkowicz

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotami wynalazku są sposób i zestaw do wykrywania genetycznie uwarunkowanej predyspozycji do raków różnych narządów oraz zastosowanie zmiany germinalnej w obrębie genu CHEK2 (I157T) do wykrywania takiej predyspozycji. Ogólnie wynalazek dotyczy nowej metody diagnostycznej. Przedmioty wynalazku służą do syntezy DNA oraz identyfikacji anomalii w materiale genetycznym pacjenta, które są skorelowane ze zwiększoną dziedziczną predyspozycją do różnych nowotworów. Gen CHEK2 jest zlokalizowany na chromosomie 22q i zawiera 14 eksonów. CHEK2 koduje białko biorące udział w procesach rozpoznawania i naprawy uszkodzeń DNA. Białko to współdziała z produktami innych znanych genów supresorowych (ATM, BRCA1, TP53). Białko CHEK2 fosforyluje BRCA1 i TP53, regulując działanie tych genów supresorowych (1-7). W Polsce występują 3 polimorficzne warianty genu CHEK2, które łącznie są obecne u 5,7% osób z populacji ogólnej. Dwa z nich (1100delC i IVS2 + 1G>A) powodują skrócenie białka CHEK2 i są rzadsze. Trzeci to częsta zmiana missensowna (I157T), która powoduje substytucję izoleucyny na treoninę w pozycji 157 białka CHEK2. Białko CHEK2 ulega ekspresji w wielu tkankach. Spektrum zmian narządowych związanych z mutacjami inaktywującymi gen CHEK2 nie zostało zbadane. Mutacja genu CHEK2 1100delC jest obecna z częstością około 1,1-1,4% w populacjach krajów europejskich badanych dotychczas i wydaje się być względnie rzadka w Ameryce Północnej (9, 10). Opisano, że allel ten wiąże się ze zwiększoną predyspozycją do raków sutka i gruczołu krokowego (9, 11), dlatego analiza związku tej mutacji z predyspozycją do raków nie jest przedmiotem niniejszego wynalazku. Najczęstsza zmiana genu CHEK2 wykryta dotychczas to I157T. W oparciu o dane literaturowe, znaczenie funkcjonalne tej zmiany jest kontrowersyjne. Badania biochemiczne sugerują, że ta zmiana I157T może być patogenna (4, 12, 13). Z drugiej strony, I157T została wykryta u 2,1% (2/95) zdrowych osób w Finlandii i opisana jako polimorfizm (14). Również, inne doniesienia wskazują, że ta substytucja jest względnie częsta u osób zdrowych (9, 15). Ponadto, nie wykazano związku występowania I157T, a predyspozycją do raków prostaty i sutka (15, 16). Jedynie badanie grupy rodzinnych raków z prostaty z Finlandii zasugerowało, że zmiana I157T może być związana ze zwiększonym ryzykiem raka gruczołu krokowego (11). Poza tym doniesieniem nie istnieją inne badania dokumentujące związek pomiędzy I157T a predyspozycją do zachorowań na nowotwory. Mimo długotrwałych wysiłków badawczych zmierzających do pozyskania sposobu diagnozowania zwiększonej predyspozycji do różnego rodzaju nowotworów istnieje ciągłe zapotrzebowanie na tego rodzaju narzędzia diagnostyczne. Celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie sposobów i produktów, które mogłyby być zastosowane do wykrywania wrodzonej predyspozycji do różnego rodzaju nowotworów. Nieoczekiwanie problem ten został rozwiązany w istotnym stopniu w niniejszym wynalazku. Przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania genetycznie uwarunkowanej predyspozycji do nowotworów, charakteryzujący się tym, że w próbce materiału genetycznego pobranej od pacjenta będącego osobą pochodzenia polskiego bada się obecność zmiany germinalnej I157T w obrębie genu CHEK2, przy czym obecność rzeczonej zmiany wskazuje na predyspozycję do przynajmniej jednego spośród następujących nowotworów: raka nerki, jelita grubego, raka prostaty, zespołu mieloproliferacyjnego, lobularnego raka piersi. Korzystnie, obecność zmiany germinalnej bada się techniką wybraną spośród metod pośredniego wykrywania mutacji jak np. ASO PCR (ang. Allele specific - PCR), SSCP (ang. single-strand conformation polymorphism), ASA (ang. allele specific analysis), RFLP-PCR (ang. restriction fragment length polymorphism - polymerase chain reaction), lub bezpośredniego wykrywania mutacji jak sekwencjonowanie. Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie zmiany germinalnej I157T w obrębie genu CHEK2 do wykrywania in vitro, w populacji polskiej genetycznie uwarunkowanej predyspozycji do przynajmniej jednego spośród następujących nowotworów: raka nerki, jelita grubego, raka prostaty, zespołu mieloproliferacyjnego, lobularnego raka piersi. Korzystnie, obecność zmiany germinalnej bada się techniką wybraną spośród metod pośredniego wykrywania mutacji jak np. ASO PCR (ang. Allele specific - PCR), SSCP (ang. single-strand conformation polymorphism), ASA (ang. allele specific analysis), RFLP-PCR (ang. restriction fragment

3 PL B1 3 length polymorphism - polymerase chain reaction), lub bezpośredniego wykrywania mutacji jak sekwencjonowanie. Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie polipeptydu kodowanego przez allel genu CHEK2 zawierający zmianę germinalną I157T do wykrywania in vitro, w populacji polskiej genetycznie uwarunkowanej predyspozycji do przynajmniej jednego spośród następujących nowotworów: raka nerki, jelita grubego, raka prostaty, zespołu mieloproliferacyjnego, lobularnego raka piersi. Korzystnie, obecność polipeptydu kodowanego przez allel genu CHEK2 zawierający zmianę germinalną ustala się za pomocą przeciwciała lub innej substancji specyficznej wobec tego polipeptydu lub jego fragmentu. Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zestaw do wykrywania wysokiej genetycznie uwarunkowanej predyspozycji do nowotworów w populacji polskiej metodą opartą o PCR, charakteryzujący się tym, że składa się przynajmniej z dwóch różnych oligonukleotydów pozwalających na amplifikację regionu zawierającego zmianę germinalną w obrębie genu CHEK2, przy czym amplifikowany region zawiera mutację I157T. Korzystnie, nowotwór organu wewnętrznego został wybrany z grupy obejmującej: raka nerki, jelita grubego, raka prostaty, zespołu mieloproliferacyjnego, lobularnego raka piersi. Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie polinukleotydu zawierającego polinukleotyd kodujący wariant białka CHEK2 zawierający w pozycji 157 substytucję I157T albo polipeptydu kodowanego przez rzeczony polinukleotyd albo przeciwciała specyficznego wobec takiego polipeptydu do wytwarzania kompozycji diagnostycznej do wykrywania in vitro zwiększonej genetycznie uwarunkowanej predyspozycji do nowotworu wybranego z grupy obejmującej nowotwór narządów takich jak: raka nerki, jelita grubego, raka prostaty, zespołu mieloproliferacyjnego, lobularnego raka piersi u osoby pochodzenia polskiego posiadającej genom zawierający wariant allelu genu CHEK2, przy czym ten wariant allelu genu CHEK2 posiada mutację I157T. Jako zmianę germinalną w obrębie genu CHEK2 rozumie się dziedziczną zmianę w obrębie genu CHEK2 powodującą produkowanie białka o zmienionej znacząco aktywności, którego obecność podnosi ryzyko zachorowania na nowotwór. Przykładem takiej zmiany germinalnej jest mutacja IVS2+1G>A powodująca produkcję nieprawidłowego, skróconego wariantu białka CHEK2. Dla potrzeb tego wynalazku, jako zmianę germinalną w obrębie genu CHEK2 rozumie się także dziedziczną zmianę w obrębie genu CHEK2 powodującą produkowanie białka o zmienionej sekwencji i potencjalnie zmienionej funkcji, której obecność podnosi ryzyko zachorowania na n o- wotwór. Przykładem takiej zmiany germinalnej jest częsta zmiana missensowna (I157T), która powoduje substytucję izoleucyny na treoninę w pozycji 157 białka CHEK2. Stąd też w przykładowej realizacji sposobu według wynalazku bada się obecność zmiany I157T w obrębie eksonu 3 genu CHEK2. Najprawdopodobniej jest jednakowo korzystne, gdy pacjent jest osobą pochodzenia polskiego lub wywodzącą się z innych grup etnicznych. W szczególnej realizacji sposobu według wynalazku obecność zmiany germinalnej bada się techniką wybraną spośród RFLP, ASA (Allele specific amplification) oraz sekwencjonowania. Sposób według wynalazku nadaje się zwłaszcza do wykrywania predyspozycji do nowotworów narządów takich jak: nerka, jelito grube, zespół mi e- lodysplastyczny. W korzystnych realizacjach ujawnionego sposobu obecność zmiany I157T wskazuje także na predyspozycję do lobularnego raka piersi. Zgodnie z wynalazkiem, można również zaproponować i eksperymentalnie zweryfikować inne warianty białka CHEK2 będące analogami strukturalnymi wariantu CHEK2 produkowanego w wyniku obecności mutacji zmiany I157T. W przypadku naturalnie występujących wariantów białka CHEK2, weryfikacja eksperymentalna ich wpływu na rozwój procesu nowotworowego pol e- gać będzie na przeprowadzeniu statystycznych asocjacyjnych badań populacyjnych, których przykład podano poniżej. Kolejno ujawniono zastosowanie zmiany germinalnej w obrębie genu CHEK2 do wykrywania genetycznie uwarunkowanej predyspozycji do przynajmniej jednego sp o- śród następujących nowotworów: rak żołądka, tarczycy, jelita grubego, nerki oraz zespół mieloproliferacyjny. Korzystnie, zmiana germinalna w obrębie genu CHEK2 jest mutacją I157T. Równie korzystnie mutacja 1157T służy do wykrywania predyspozycji do lobularnego raka piersi. W korzystnej realizacji tego aspektu wynalazku obecność zmiany germinalnej bada się jedną z wymienionych powyżej technik. W celach diagnostycznych mogą być stosowane zarówno zmutowane warianty genu CHEK2 jak również odpowiednie białka kodowane przez takie allele. Stąd też, kolejnym aspektem wynalazku

4 4 PL B1 jest zastosowanie polipeptydu kodowanego przez allel genu CHEK2 zawierający zmiany germinalne do wykrywania genetycznie uwarunkowanej predyspozycji do przynajmniej jednego spośród następujących nowotworów: rak żołądka, tarczycy, jelita grubego, nerki oraz zespół mieloproliferacyjny. Zmiana germinalna w obrębie genu CHEK2 jest mutacją wybraną spośród: IVS2+1G>A, I157T. Polipeptyd kodowany przez allel genu CHEK2 zawierający mutację IVS2+1G>A służy także do wykrywania predyspozycji do raka piersi i/lub prostaty, natomiast polipeptyd kodowany przez allel genu CHEK2 zawierający mutację I157T służy także do wykrywania predyspozycji do lobularnego raka piersi. Zgodnie z wynalazkiem obecność polipeptydu kodowanego przez allel genu CHEK2 zawierający zmianę germinalną ustala się za pomocą przeciwciała lub innej substancji specyficznej wobec tego polipeptydu lub jego fragmentu. Korzystnie, rzeczone przeciwciała lub inne substancje specyficzne wobec takiego polipeptydu lub jego fragmentu rozpoznają epitop zawierający wspomnianą substytucję lub charakterystyczną strukturę skróconego wariantu białka CHEK2 będącą efektem mutacji w miejscu splicingowym. Stosowne przeciwciała specyficzne wobec wariantów białka CHEK2 mogą być uzyskane znanymi metodami stosującymi jako antygen oczyszczone białka według wynalazku lub ich (syntetyczne) fragmenty lub pochodne. Przeciwciała monoklonalne mogą być uzyskane, przykładowo, techniką opisaną przez Kohler i Milstein, Nature 256 (1975)7 495, oraz w Meth. Enzymol. 73 (1981)9 3, które obejmują fuzję mysich komórek czerniaka z komórkami szpiku uzyskanymi ze ssaków poddanych immunizacji. Przeciwciała mogą być przeciwciałami monoklonalnymi, przeciwciałami poliklonalnymi lub przeci w- ciałami sztucznymi albo fragmentami przeciwciał, takimi jak Fab, Fv lub scfv. Ponadto, przeciwciała lub ich fragmenty specyficzne wobec polipeptydów według wynalazku mogą być uzyskane spos o- bem opisanym, np. przez Harlow i Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, Kolejno ujawniono zestaw do wykrywania wysokiej genetycznie uwarunkowanej predyspozycji do nowotworu metodą opartą o PCR, charakteryzujący się tym, że składa się przynajmniej z dwóch różnych oligonukleotydów pozwalających na amplifikację regionu zawierającego zmianę germinalną w obrębie genu CHEK2. W przypadku, gdy korzystnie amplifikowany region zawiera zmianę I157T, zestaw nadaje się do wykrywania predyspozycji do nowotworów, który został wybrany z grupy obejmującej raki jelita grubego i nerki oraz zespół mieloproliferacyjny. Ujawniono także zastosowanie polinukleotydu zawierającego polinukleotyd posiadający w pozycji odpowiadającej miejscu splicingowemu eksonu 2 ludzkiego genu CHEK2 mutację IVS2+1G>A albo polinukleotyd posiadający w pozycji odpowiadającej pozycji 430 eksonu 3 ludzkiego genu CHEK2 mutację 430T>C albo inny polinukleotyd kodujący wariant białka CHEK2 zawierający w pozycji 157 substytucję I157T albo polipeptydu kodowanego przez rzeczony polinukleotyd albo przeciwciała specyficznego wobec takiego polipeptydu do wytwarzania kompozycji diagnostycznej do wykrywania zwiększonej genetycznie uwarunkowanej predyspozycji do now o- tworu u osoby posiadającej genom zawierający wariant allelu genu CHEK2, przy czym ten wariant allelu genu CHEK2 posiada odpowiednio mutację IVS2+1G>A w pozycji odpowiadającej miejscu splicingowemu eksonu 2 ludzkiego genu CHEK2 albo posiada mutację IVS2+1G>A w pozycji odpowiadającej miejscu splicingowemu eksonu 2 ludzkiego genu CHEK2. Nowotwór został odpowiednio wybrany z grupy obejmującej nowotwór narządów takich jak: gruczoł krokowy, sutek, tarczyca i żołądek, albo grupy obejmującej nowotwór narządów takich jak: nerka, jelito grube, zespół mielodysplastyczny. Jednym z możliwych przykładów rzeczonego polinukleotydu jest polinukleotyd otrzymywany za pomocą zestawu według wynalazku, natomiast przykładami rzeczonego polipeptydu są warianty CHEK2 kodowane przez te polinukleotydy. Określenie odpowiadający stosowane w tym opisie oznacza, że pozycja nie jest jedynie determinowana przez ilość kolejnych nukleotydów czy aminokwasów. Pozycja danego nukleotydu lub aminokwasu według wynalazku, który może także ulec delecji, substytucji lub obejmować j e- den lub więcej dodatkowych nukleotydów, może być różna dla delecji lub dodatkowych/zmienionych nukleotydów lub aminokwasów w genie lub polipeptydzie. Zatem, jako pozycję odpowiadającą według wynalazku rozumie się, że nukleotydy lub aminokwasy mogą być ozn a- czone innymi numerami, lecz nadal posiadać podobne sąsiedztwo nukleotydowe lub aminokw a- sowe. Takie nukleotydy lub aminokwasy, które mogą być wymienione, ulec delecji lub zawierać dodatkowe insercje nukleotydów lub aminokwasów są również zawarte w określeniu odpowiad a- jącej pozycji. Takie nukleotydy lub aminokwasy mogą przykładowo wraz z sąsiadującymi z nimi

5 PL B1 5 tworzyć sekwencje spełniające istotną rolę w regulacji ekspresji genu, stabilności RNA lub edycji RNA, jak również kodować domeny funkcjonalne, miejsca splicingu lub charakterystyczne motywy wariantów białka CHEK2 lub jego pochodnych. Kolejno ujawniono sposób identyfikowania markera genetycznego związanego z podwyższonym ryzykiem zachorowania na nowotwór charakteryzujący się tym, że pobiera się próbki zawierające genomowe DNA od grupy pacjentów cierpiących na określony typ nowotworu, bada się obecność zmiany strukturalnej w genie CHEK2 w pobranych próbkach i porównuje się ze średnią częstością populacyjną występowania tej zmiany, a następnie zmianę strukturalną, dla której częstość występowania w próbkach pobranych od pacjentów jest istotnie wyższa od częstości populacyjnej uznaje się za marker genetyczny podwyższonego ryzyka zachorowania na określony typ nowotworu. Korzystnie, badaną zmianę strukturalną identyfikuje się poprzez porównanie struktury zmutowanego allelu genu CHEK2 ze strukturą dzikiego allelu genu CHEK2, natomiast badana grupa pacjentów jest dostatecznie liczna. Za istotnie wyższą uznaje się wartość z p < 0,05. Na Figurze 1 przedstawiono fragment genu CHEK2 zawierający zmianę IVS2+1G>A (mutacja jest zaznaczona pogrubioną czcionką) oraz zmianę 430T>C (I157T)(zmiana jest zaznaczona podkreśloną czcionką) P r z y k ł a d 1. A) Identyfikacja mutacji genu CHEK2 u mężczyzn z rakiem prostaty z polskiej populacji. Wybór grupy pacjentów Grupę badaną stanowiło 96 mężczyzn ze sporadycznym rakiem prostaty oraz 44 pacjentów z rodzinnym rakiem prostaty (pacjenci z rakiem prostaty, których co najmniej jeden krewny 1 lub 2 stopnia chorował na raka stercza) zdiagnozowanych w Klinice Urologii PAM w Szczecinie. Izolacja genomowego DNA Krew obwodową pobraną w ilości 5 ml mieszano z 100 μl 1M EDTA a następnie wirowano w 50 ml polipropylenowych probówkach typu Falcon przez 10 minut przy 3000 g w temperaturze 4 C. Górną warstwę osocza odciągano, zaś dolną mieszano z 45 ml buforu 2X (0,1M NH 4 CI, 0,25M KHCO 3, 1 mm EDTA) i pozostawiano na 15 minut w temperaturze 4 C. Następnie mieszaninę wirowano przy 3000 g przez 10 minut w temperaturze 4 C. Supernatant zawierający zhemolizowane erytrocyty zlewano. Osad leukocytów ponownie zalewano buforem 2X i wirowano przy 3000 g przez 10 minut w temperaturze 4 C. Wyżej wymienioną czynność powtarzano 3-krotnie, do uzyskania czystego osadu leukocytarnego. Następnie osad mieszano z 3 ml buforu trawiącego (50mM NaCl, 25 mm MgCl 2, 1mM EDTA; ph 8,0) z dodatkiem 200 μl 10% SDS i 500 μg Proteinazy K. Trawienie przeprowadzano w cieplarce o temperaturze 37 C przez okres 24 godzin. Produkty trawienia mieszano z 3 ml fenolu buforowanego 0,5M Tris HCl (ph 8,4), a następnie do roztworu dodawano 3 ml mieszaniny chloroformu i alkoholu izoamylowego w stosunku objętości 1:25. Całą mieszaninę wstrząsano przez około 1 minutę aż do uzyskania homogennej emulsji, po czym wirowano przy 8000 g przez 10 minut w temperaturze 20 C. Po odwirowaniu uzyskiwano bezbarwną górną fazę wodną zawierającą DNA, pierścień białka w interfazie oraz dolną organiczną fazę zawierającą chloroform i fenol. Fazę górną przenoszono do odrębnej probówki, mieszano z taką samą ilością chloroformu, po czym wirowano przy 8000 g przez 10 minut. Wyżej opisane oczyszczanie chloroformem powtarzano 3-krotnie aż do zaniku pierścienia białkowego w interfazie. Tak oczyszczoną fazę wodną zawierającą DNA mieszano z 5M NaCl (stosunek objętości fazy wodnej do NaCl - 10:1) i 96% alkoholem etylowym (stosunek objętości fazy wodnej z NaCl do etanolu - 1:10). Mieszaninę pozostawiano przez noc w temperaturze 20 C. Uzyskany kłaczek DNA przenoszono do odrębnej probówki, przemywano zimnym 70% alkoholem etylowym, po czym suszono przez 30 minut w otwartej probówce w temperaturze 37 C. Oczyszczony DNA po rozpuszczeniu w 400 μl buforu TE (25 mm Tris HCl, 1 mm EDTA; ph 8.4) przechowywano w 4 C.

6 6 PL B1 Sekwencjonowanie PCR preparatywny

7 PL B1 7 Reakcję PCR przeprowadzano w automatycznym termocyklerze (DNA ThermalCycler Perkin Elmer). Mieszanina reakcyjna o objętości 25 μl zawierała: 1 μl (50 ng) genomowego DNA, po 4 pmol każdej pary starterów, 2.5 μl buforu reakcyjnego (100mM Tris-HCl, 500mM KCL, 15mM MgCl 2, 1 mg/ml żelatyny; ph 8.6), 200 μμ każdego z deoksynukleotydów (datp, dctp, dgtp i dttp) oraz 1 U polimerazy Taq DNA. Analogicznie przygotowano kontrolę ujemną, która nie zawierała DNA. Amplifikację przeprowadzano w następujących warunkach: a) wstępna denaturacja C 5 minut b) 35 cykli składających się z: denaturacji - 94 C 30 sekund przyłączania starterów C 45 sekund wydłużania komplementarnego DNA - 72 C 60 sekund Oczyszczanie produktów PCR Produkty amplifikacji eksonu 6 genu NBSl przenoszono na kolumienkę Microcon-100 (Amicon) umieszczoną na probówce Eppendorf, dodawano 400 μl wody destylowanej i wirowano przy 1850 g przez 15 minut. Przesącz zawierający startery i pozostałości mieszaniny reakcyjnej PCR wylewano, zaś produkty reakcji pozostałe na filtrze kolumienki zalewano 400 μl H 2 O i wirowano ponownie przez 15 minut przy 1850 g. Ostatnią czynność powtarzano 3-krotnie. W celu odzyskania oczyszczonych produktów PCR odwróconą o 180 kolumienkę przenoszono na nową probówkę i wirowano przez 3 minuty przy 9000 g. Wszystkie wirowania przeprowadzono w temp 25 C. Uzyskiwano w ten sposób około 5 μl czystego produktu, który rozcieńczano wodą do objętości 20 μl. PCR sekwencyjny Asymetryczny PCR sekwencyjny wykonywano w automatycznym termocyklerze Gene Amp PCR System 9600 firmy Perkin Elmer w 20 μl mieszaninie reakcyjnej zawierającej: 1 pmol jednego z starterów, 4 μl oczyszczonego matrycowego produktu PCR, 8 μl BigDye Terminator Ready Reaction Kit v3.0 (Applied Biosystems). W przypadkach gdy stwierdzono zmianę w trakcje sekwencjonowania z jednym starterem, wynik został potwierdzony poprzez sekwencjonowanie z drugim starterem z danej pary. Parametry sekwencyjnego PCR: wstępna denaturacja - 96 C 30 sekund 30 cykli, każdy składający się z: denaturacji - 94 C 30 sekund przyłączania starterów - 55 C 45 sekund wydłużania komplementarnego DNA - 72 C 60 sekund Całość produktów sekwencjonowania (20 μl) przenoszono do probówki Eppendorf o pojemności 0,5 ml, zalewano 60 μl 96% etanolu oraz dodawano 1 μl kwaśnego octanu sodu (ph 5,0) w celu wytrącenia produktów PCR. Probówki wirowano w 3000g przez 20 min w 25 C. Po odwirowaniu etanol wylewano, a osad zawierający produkty PCR-u sekwencyjnego przepłukiwano zalewając go 200 μl 70% etanolu oraz wirowano w 3000 g przez 5 min w 25 C. Następnie cały alkohol ostrożnie wylewano, a pozostały w probówce osad suszono w aparacie próżniowym Eppendorf Concentrator 5301 przez min, po czym rozpuszczano w 4 μl sekwencyjnego buforu obciążającego (150 μl formamidu dejonizowanego, 50 μl 50mM EDTA, 0.05% Dextran Blue). Rozpuszczone w buforze obciążającym produkty denaturowano przez 4 minuty w 94 C, przenoszono do łaźni z lodem, po czym nanoszono na denaturujący poliakrylamidowy żel sekwencyjny (4% akrylamid - 19:1, 1 x TBE, 6M mocznik). Rozdział elektroforetyczny dokonywano w automatycznym aparacie do sekwencjonowania ABI PRISM 377 DNA Sequencer (Applied Biosystems). Zbieranie danych w trakcie elektroforezy oraz ich analiza odbywały się za pomocą programów ABI PRISM 377 Collection Software and Sequencing Analysis Software Version 3.0 (Applied Biosystems). Wyniki Za pomocą sekwencjonowania regionu kodującego genu CHEK2 u 140 mężczyzn z rakiem prostaty wykryto 3 różne zmiany germinalne (IVS2+1G>A, 1100delC i I157T). B) Ustalanie korelacji pomiędzy zmianami germinalnymi IVS2+1G>A, I157T, a predyspozycją do różnych nowotworów. Zasady testu, wybór grupy pacjentów Aby ustalić do jakich nowotworów predysponują mutacje genu CHEK2, przeprowadzono analizę występowania zmian IVS2+1G>A, I157T w grupie 3915 pacjentów leczonych w latach w czterech dużych szpitalach w Szczecinie, u których to pacjentów stwierdzono przypadki wybranych

8 8 PL B1 nowotworów złośliwych. Seria przypadków została powiększona o dodatkowych 313 mężczyzn z rakiem prostaty zdiagnozowanym w innych ośrodkach w Polsce (Olsztyn, Białystok, Opole) oraz 607 kobiet z rakiem sutka (Koszalin, Poznań, Opole). Pacjenci wyrazili świadomą zgodę na udział w badaniach. Pacjenci byli kolejnymi, nowymi osobami, u których rozpoznano przypadki nowotworów złośliwych. Nie stosowano dodatkowych kryteriów selekcji, takich jak wiek płeć lub rodzinna historia występowania nowotworów. Grupa kontrolna obejmowała 2000 osób, spośród których 910 stanowiły noworodki urodzone w 2003 roku w sześciu szpitalach na terenie Polski (Szczecin, Białystok, Gorzów, Katowice i Wrocław). Pozostałą część osób należących do grupy kontrolnej stanowiły osoby wybrane na zasadzie przypadku z list pacjentów trzech lekarzy rodzinnych praktykujących na terenie Szczecina. Izolację genomowego DNA prowadzono jak powyżej. Restriction Fragment Length Polymorphism Polymerase Chain Reaction (RFLP-PCR) Wykrywanie mutacji IVS2+1G>A za pomocą RFLP-PCR. Mutację IVS2+1G>A była analizowana z użyciem enzymu Hpy 188III (New England Biolabs). Reakcję PCR przeprowadzono z parą starterów Ch2/3f 5 -TT TAT GAG CAA TTT TTA AAC G i Ch2/3r 5 -CC AGT AAC CAT AAG ATA ATA ATA TTA C. Zastosowano warunki eksperymentalne PCR takie jak dla amplifikacji eksonów 2/3 (patrz PCR preparatywny). Trawienie produktów PCR przeprowadzono w 37 C przez 16 godzin w objętości 20 μl zawierającej: 5 μl produktu PCR, 1 x NE Buffer 4 (New England Biolabs) oraz 2U enzymu Hpy188III. Następnie, 15 μl strawionego produktu rozdzielano na 2% żelu agarozowym (żel agarozowy (SeaKem FMC), 1X bufor TBE, 25 μg/ml bromku etydyny) pod napięciem 6 V/cm przez 30 minut. Rozdzielone produkty uwidaczniano w świetle UV. Produkt PCR był trawiony w przypadkach z mutacją. Wszystkie przypadki, w których obserwowano dodatkowy, krótszy produkt PCR, zostały zsekwencjonowane w celu potwierdzenia obecności mutacji IVS2+1G>A. Wykrywanie mutacji I157T za pomocą RFLP-PCR. Mutacja I157T była analizowana z użyciem enzymu PstI (New England Biolabs). Reakcję PCR przeprowadzono z parą starterów Chl57F (5 - A CCC ATG TAT CTA GGA GAG CTG) oraz Ch157R (5 - CCA CTG TGA TCT TCT ATG TCT GCA). Za pomocą startera Ch157R wprowadzono sztuczne miejsce restrykcyjne dla enzymu PstI. Zastosowano warunki eksperymentalne amplifikacji PCR takie jak dla amplifikacji eksonów 2/3 (patrz PCR preparatywny). Trawienie produktów PCR przeprowadzono w 37 C przez 16 godzin w objętości 20 μl zawierającej: 5 μl produktu PCR, 1 x NE Buffer 3 (New England Biolabs) and 2U enzymu PstI. Następnie, 15 μl strawionego produktu rozdzielano na 3% żelu agarozowym (żel agarozowy (SeaKem FMC), IX bufor TBE, 25 μg/ml bromku etydyny) pod napięciem 6 V/cm przez 45 minut. Rozdzielone produkty uwidaczniano w świetle UV. Produkt PCR był trawiony w przypadkach z mutacją. Wszystkie przypadki, w których obserwowano dodatkowy, krótszy produkt PCR, zostały zsekwencjonowane w celu potwierdzenia obecności zmiany I157T. Sekwencjonowanie Przypadki, w których wykryto mutacje IVS2+1G>A lub I157T za pomocą RFLP-PCR potwierdzono przez sekwencjonowanie eksonów 2/3 genu CHEK2 (opisano powyżej). Wyniki Uzyskane wyniki testów przeprowadzonych w grupach pacjentów opisanych powyżej przedstawiono w tabeli 1. T a b e l a 1 Częstości występowania alleli genu CHEK2 u osób z nowotworami różnych narządów. Lokalizacja nowotworu Liczba badanych Ilość pozytywnych wyników (częstość), odds ratio, wartość p IVS2+1G>A Pęcherz moczowy (0.6%) OR 2.3 p=0.4 I157T 12 (7.0%) OR 1.4 p=0.3 Sutek (1.1%) OR 4.4 p= (6.7%) OR 1.3 p=0.10

9 PL B Jelito (0.3%) OR 1.3 p= (9.3%) OR 1.9 p=0.007 Nerki (9.8%) OR 2.0 p=0.004 Krtań (4.1%) OR 0.8 p=0.5 Płuco (2.6%) OR 0.5 p=0.07 Jajnik (4.8%) OR 0.9 p=0.9 cd. tabeli 1 Prostata 690 8(1.2%) OR 4.7, p=0.007 Żołądek 241 4(1.7%) OR 6.7 p=0.01 Chłoniaki nieziarnicze OR 3.3 p= (7.8%) OR 1.6 p= (5.4%) OR 1.0 p= (9.2%) OR 1.8 p=0.09 Zespół mieloproliferacyjny (14.3%) OR 3.0 p= Trzustka (6.4%) OR 1.3 p=0.6 Czerniak 129 2(1.5%) OR 6.3 p=0.06 Tarczyca 80 4 (5%) OR 21 pc (4.6%) OR 0.9 p=0.9 7 (8.5%) OR= 1.7 p=0.26 Kontrola (0.25%) 104 (5.2%) Zwiększoną częstość IVS2+1G>A statystycznie istotną stwierdzono (tabela 1) w grupie pacjentów z rakami sutka, prostaty, żołądka i tarczycy. Dowodzi to, że obecność skróconego białka CHEK2 jest czynnikiem odgrywającym istotne znaczenie w rozwoju tych nowotworów. Zwiększoną częstość I157T statystycznie istotną stwierdzono u pacjentów z rakami jelita, nerki, prostaty oraz zespołem mielodysplastycznym. Wynik świadczy o tym, że wariant I157T jest patogenną mutacją, której nosiciele obarczeni są zwiększonym ryzykiem powyższych nowotworów. Aczkolwiek nie wykazano istotnego związku pomiędzy I157T a ryzykiem rakiem sutka, lecz zaobserwowano statystycznie istotnie częstsze występowanie I157T w szczególnym podtypie histopatologicznym raka piersi - lobularnym (11/100 OR 2.2, p=0.02), co sugeruje, że mutacja I157T jest markerem genetycznej predyspozycji dla lobularnego raka piersi. Nie można wykluczyć, że mutacje CHEK2 predysponują również do innych raków. Aby wykazać związek mutacji CHEK2 z innym nowotworami konieczne byłoby zbadanie większych grup pacjentów. Niniejszy wynalazek pokazuje po raz pierwszy, że mutacje germinalne IVS2+1G>A oraz I157T w obrębie genu CHEK2 są markerami zwiększonej genetycznej predyspozycji do raków różnych narządów, w szczególności do nowotworów opisanych powyżej. Zaproponowane testy DNA pozwalają wyłonić pacjentów, którzy powinni być poddani szczegółowej opiece medycznej jako osoby należące do grupy podwyższonej zapadalności na nowotwory. Literatura: 1. Matsuoka, S., Rotman, G., Ogawa, A., Shiloh, Y., Tamai, K., Elledge, S.J. Ataxia telangiectasiamutated phosphorylates Chk2 in vivo and in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97: , Chaturvedi, P., Eng, W.K., Zhu, Y., Mattern, M.R., Mishra, R., Hurle, M.R., Zhang, X., Annan, R.S., Lu, Q., Faucette, L.F., Scott, G.F., Li, X., Carr, S.A., Johnson, R.K., Winkler, J.D., Zhou, B.B. Mammalian Chk2 is a downstream effector of the ATM-dependent DNA damage checkpoint pathway. Oncogene, 18: , 1999.

10 10 PL B1 3. Ahn, J.Y., Schwarz, J.K., Piwnica-Worms, H., Canman, C.E. Threonine 68 phosphorylation by ataxia telangiectasia mutated is required for efficient activation of Chk2 in response to ionizing radiation. Cancer Res., 60: , Falck, J., Mailand, N., Syljuasen, R.G., Bartek, J., Lukas, J. The ATM-Chk2-Cdc25A checkpoint pathway guards against radioresistant DNA synthesis. Nature, 410: , Chehab, N.H., Malikzay, A., Appel, M., Halazonetis, T.D. Chk2/hCds1 functions as a DNA damage checkpoint in G(1) by stabilizing p53. Genes Dev., 14: , Shieh, S.Y., Ahn, J., Tamai, K., Taya, Y., Prives, C. The human homologs of checkpoint kinases Chk1 and Cds1 (Chk2) phosphorylate p53 at multiple DNA damage-inducible sites. Genes Dev., 14: , Lee, J.S., Collins, K.M., Brown, A.L., Lee, C.H., Chung, J.H. hcds1-mediated phosphorylation of BRCA1 regulates the DNA damage response. Nature, 404: , Dong, X., Wang, L., Taniguchi, K., Wang, X., Cunningham, J.M., McDonnell, S.K., Qian, C., Marks, A.F., Slager, S.L., Peterson, B.J., Smith, D.I., Cheville, J.C., Blute, M.L., Jacobsen, S.J., Schaid, D.J., Tindall, D.J., Thibodeau, S.N., Liu, W. Mutations in CHEK2 associated with prostate cancer risk. Am. J. Hum. Genet., 72: , CHEK2 Breast Cancer Consortium. Low-penetrance susceptibility to breast cancer due to CHEK2*1100delC in noncarriers of BRCAl or BRCA2 mutations. Nat. Genet., 31: 55-59, Offit K, Pierce H, Kirchhoff T, Kolachana P, Rapaport B, Gregersen P, Johnson S, Yossepowitch O, Huang H, Satagopan J, Robson M, Scheuer L, Nafa K, Ellis N. Frequency of CHEK2* 1100delC in New York breast cancer cases and controls. BMC Med Genet. 15;4( 1):1, Seppala, E.H., Ikonen, T., Mononen, N., Autio, V., Rokman, A., Matikainen, M.P., Tammela, T.L., Schleutker, J. CHEK2 variants associate with hereditary prostate cancer. Br. J. Cancer, 89: , Bell DW, Varley JM, Szydło TE, Kang DH, Wahrer DC, Shan-non KE, Lubratovich M, Verselis SJ, Isselbaeher KJ, Fraumeni JF, Bireh JM, Li FP, Garber JE, Haber DA Heterozygous germ line hchk2 mutations in Li-Fraumeni syndrome. Science 286: , Li J, Williams BL, Haire LF, Goldberg M, Wilker E, Durocher D, Yaffe MB, Jackson SP, Smerdon SJ. Structural and functional versatility of the FHA domain in DNA-damage signaling by the tumor suppressor kinase Chk2. Mol Cell 9: , Vahteristo P, Tamminen A, Karvinen P, Eerola H, Eklund C, Aaltonen LA, Blomqvist C, Aittomaki K, Nevanlinna H. p53, CHK2, and CHK1 genes in Finnish families with Li-Fraumeni syndrome: further evidence of CHK2 in inherited cancer predisposition. Cancer Res 61: , Allinen M, Huusko P, Mantyniemi S, Launonen V, Winqvist R. Mutation analysis of the CHK2 gene in families with hereditary breast cancer. Br J Cancer 85: , Schutte, M., Seal, S., Barfoot, R., Meijers-Heijboer, H., Wasielewski, M., Evans, D.G., Eccles, D., Meijers, C., Lohman, F., Klijn, J., van den Ouweland, A., Futreal, P.A., Nathanson, K.L., Weber, B.L., Easton, D.F., Stratton, M.R., Rahman, N.; Breast Cancer Linkage Consortium. Variants in CHEK2 other than 1100delC do not make a major contribution to breast cancer susceptibility. Am. J. Hum. Genet., 72: , Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób wykrywania genetycznie uwarunkowanej predyspozycji do nowotworów, znamienny tym, że w próbce materiału genetycznego pobranej od pacjenta będącego osobą pochodzenia polskiego bada się obecność zmiany germinalnej I157T w obrębie genu CHEK2, przy czym obecność rzeczonej zmiany wskazuje na predyspozycję do przynajmniej jednego spośród następujących nowotworów: raka nerki, jelita grubego, raka prostaty, zespołu mieloproliferacyjnego, lobularnego raka piersi. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że obecność zmiany germinalnej bada się techniką wybraną spośród metod pośredniego wykrywania mutacji jak np. ASO PCR (ang. Allele specific - PCR), SSCP (ang. single-strand conformation polymorphism), ASA (ang. allele specific analysis), RFLP-PCR (ang. restriction fragment length polymorphism - polymerase chain reaction), lub bezpośredniego wykrywania mutacji jak sekwencjonowanie. 3. Zastosowanie zmiany germinalnej I157T w obrębie genu CHEK2 do wykrywania in vitro, w populacji polskiej genetycznie uwarunkowanej predyspozycji do przynajmniej jednego spośród na-

11 PL B1 11 stępujących nowotworów: raka nerki, jelita grubego, raka prostaty, zespołu mieloproliferacyjnego, lobularnego raka piersi. 4. Zastosowanie według zastrz. 3, znamienne tym, że obecność zmiany germinalnej bada się techniką wybraną spośród metod pośredniego wykrywania mutacji jak np. ASO PCR (ang. Allele specific - PCR), SSCP (ang. single-strand conformation polymorphism), ASA (ang. allele specific analysis), RFLP-PCR (ang. restriction fragment length polymorphism - polymerase chain reaction), lub bezpośredniego wykrywania mutacji jak sekwencjonowanie. 5. Zastosowanie polipeptydu kodowanego przez allel genu CHEK2 zawierający zmianę germinalną I157T do wykrywania in vitro, w populacji polskiej genetycznie uwarunkowanej predyspozycji do przynajmniej jednego spośród następujących nowotworów: raka nerki, jelita grubego, raka prostaty, zespołu mieloproliferacyjnego, lobularnego raka piersi. 6. Zastosowanie według zastrz. 5, znamienne tym, że obecność polipeptydu kodowanego przez allel genu CHEK2 zawierający zmianę germinalną ustala się za pomocą przeciwciała lub innej substancji specyficznej wobec tego polipeptydu lub jego fragmentu. 7. Zestaw do wykrywania wysokiej genetycznie uwarunkowanej predyspozycji do nowotworów w populacji polskiej metodą opartą o PCR, znamienny tym, że składa się przynajmniej z dwóch różnych oligonukleotydów pozwalających na amplifikację regionu zawierającego zmianę germinalną w obrębie genu CHEK2, przy czym amplifikowany region zawiera mutację I157T. 8. Zestaw według zastrz. 7, znamienny tym, że nowotwór organu wewnętrznego został wybrany z grupy obejmującej: raka nerki, jelita grubego, raka prostaty, zespołu mieloproliferacyjnego, lobularnego raka piersi. 9. Zastosowanie polinukleotydu zawierającego polinukleotyd kodujący wariant białka CHEK2 zawierający w pozycji 157 substytucję I157T albo polipeptydu kodowanego przez rzeczony polinukleotyd albo przeciwciała specyficznego wobec takiego polipeptydu do wytwarzania kompozycji diagnostycznej do wykrywania in vitro zwiększonej genetycznie uwarunkowanej predyspozycji do nowotworu wybranego z grupy obejmującej nowotwór narządów takich jak: raka nerki, jelita grubego, raka prostaty, zespołu mieloproliferacyjnego, lobularnego raka piersi u osoby pochodzenia polskiego posiadającej genom zawierający wariant allelu genu CHEK2, przy czym ten wariant allelu genu CHEK2 posiada mutację I157T. Rysunek

12 12 PL B1 Departament Wydawnictw UP RP Cena 4,92 zł (w tym 23% VAT)