Wykład 3 Procesy biotechnologiczne

Transkrypt

1 Rodzaje przemysłowych procesów fermentacyjnych - procesy, w których produktem jest biomasa - procesy, w których produktem jest białko, najczęściej enzym - procesy, w których produktem jest metabolit (biosynteza) - procesy, których celem jest przekształcenie związku dodanego do mieszaniny fermentacyjnej (biotransformacja) - procesy mikrobiologicznej degradacji makromolekuł (biodegradacja)

2 Przedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNOLOGIA CHEMICZNA Rodzaje bioprocesów Biosynteza Biotransformacja Biohydroliza Fermentacja Bioługowanie Biodegradacja

3 Blokowy schemat technologiczny procesu biosyntezy mikrobiologicznej

4

5 Cechy charakterystyczne procesu biotechnologicznego trzy wyraźne fazy: przygotowanie produkcji (upstream processing) właściwa fermentacja obróbka poprodukcyjna (downstream processing) przygotowanie produkcji odbywa się w warunkach laboratoryjnych konieczność kilkukrotnego powiększania skali konieczność utrzymania i przechowywania szczepów produkcyjnych konieczność zapewnienia warunków aseptycznych konieczność rygorystycznej kontroli parametrów fermentacji

6

7 Sposoby prowadzenia procesów biotechnologicznych A proces okresowy; B proces okresowy z zasilaniem; C proces ciągły w układzie homogenicznym; D proces ciągły homogeniczny z częściową recyrkulacją ; E proces ciągły dwustopniowy; F proces ciągły heterogeniczny w reaktorze z przepływem tłokowym; G proces ciągły heterogeniczny z częściową recyrkulacją; H proces ciągły dwustopniowy w układzie mieszanym; I proces z odprowadzeniem produktu metodą dializy; J proces okresowy w kolumnie ze złożem biokatalizatora, z recyrkulacją cieczy; K proces ciągły w kolumnie ze złożem biokatalizatora; L proces jak w K, z częściową recyrkulacją

8 Sposoby prowadzenia procesów biotechnologicznych z wykorzystaniem drobnoustrojów Hodowle w podłożach ciekłych: wgłębne lub powierzchniowe; z unieruchomionym materiałem biologicznym Hodowle w podłożach stałych (jedynie dla grzybów strzępkowych) Procesy okresowe prostota technologiczna, łatwość utrzymania warunków jałowych, odnawialność zaszczepki, ale konieczność powtarzania w każdym cyklu operacji przed- i poprocesowych, niska produkcyjność -m.in. produkcja enzymów i białek terapeutycznych. Hodowle wielokrotne browarnictwo, produkcja octu Procesy ciągłe m.in. wytwarzanie białka paszowego, fermentacja alkoholowa, fermentacja octanowa, oczyszczanie ścieków metodą osadu czynnego Procesy okresowe z zasilaniem namnażanie drożdży w celu produkcji SCP, produkcja antybiotyków, witamin, aminokwasów. Szczególne zastosowanie nietypowe źródła węgla.

9 Hodowla okresowa (ang. batch culture) system zamknięty Bilans biomasy Q natężenie dopływu pożywki X gęstość komórek S stężenie składników odżywczych dx dt = µ X αx µ- szybkość wzrostu α -szybkość obumierania µ jest funkcją stężenia substratu limitującego wzrost Zakładając α 0, r-nie upraszcza się do postaci: dx dt = µ X

10 Hodowla okresowa z zasilaniem (ang. fed batch culture) Bilans biomasy Q natężenie dopływu pożywki X gęstość komórek S stężenie składników odżywczych Biomasa akumulowana = biomasa dopływająca + przyrost biomasy komórki martwe d VX ) dt QX V ( 0 µ- szybkość wzrostu = + µ VX αx α -szybkość obumierania Zakładając α 0 i brak zasilania biomasą, r-nie upraszcza się do postaci: d( VX ) dt = µ VX

11 Hodowla ciągła (ang. continuous culture) Q natężenie dopływu pożywki X gęstość komórek S stężenie składników odżywczych Biomasa akumulowana = biomasa dopływająca + przyrost biomasy biomasa usuwana komórki martwe dx dt QX V = 0 QX + µ X αx V Wprowadzając: D = Q/V szybkość rozcieńczania, zakładając α 0 i brak zasilania biomasą, r-nie upraszcza się do postaci: dx dt = µ X QX V µ- szybkość wzrostu α -szybkość obumierania

12 Hodowla ciągła z recyrkulacją biomasy (Chemostat) Bilans biomasy Biomasa akumulowana = biomasa dopływająca + przyrost biomasy biomasa usuwana komórki martwe dx dt QX = V 0 QCγX + V + µ X (1 + γ ) QX V αx Q natężenie dopływu pożywki X gęstość komórek S stężenie składników odżywczych γ - współczynnik recyklingu C współczynnik zatężenia biomasy zawracanej µ- szybkość wzrostu α -szybkość obumierania Wprowadzając: D = Q/V szybkość rozcieńczania, zakładając α 0 i brak zasilania biomasą oraz uzyskanie stanu równowagi, czyli otrzymujemy: µ = D(1 + γ - γc) dx dt = 0

13 1. Możliwość degeneracji szczepów lub pojawienia się niekorzystnych mutacji i opanowania hodowli przez populacje komórek o pogorszonych właściwościach produkcyjnych 2. Trudności w utrzymaniu warunków aseptycznych procesu w bioreaktorze przez dłuższy czas 3. Niekorzystny sposób rozwoju niektórych drobnoustrojów, tworzących układy wielokomórkowe, skupiska w postaci kłaczków i kuleczek, obrastanie przewodów 4. Niekorzystna relacja pomiędzy wzrostem drobnoustrojów, a tworzeniem niektórych produktów metabolizmu syntezowanych przez komórki nie rosnące Wykład 3 Procesy biotechnologiczne BIOTECHNOLOGICZNE PROCESY CIĄGŁE Zalety: 1. Wyeliminowanie wpływu czasu hodowli na zmiany warunków w pożywce i fizjologię drobnoustrojów 2. Możliwość prowadzenia hodowli dowolnie długo w ustalonych, optymalnych warunkach 3. Możliwość regulacji stanu fizjologicznego komórek przez dobór zasilania i składu podłoża zasilającego hodowlę 4. Jednorodność fizyczna i chemiczna hodowli 5. Możliwość automatyzacji procesu 6. Większa szybkość i wydajność wielu procesów 7. Możliwość maksymalnego wykorzystania aparatury i jej równomiernego obciążenia Wady:

14 Porównanie profili wzrostu drobnoustrojów i produkcji antybiotyku w warunkach hodowli okresowej i hodowli okresowej z zasilaniem

15 Podstawowe typy bioreaktorów do tlenowych procesów wgłębnych A bioreaktor z mieszadłem tarczowo-turbinowym i bełkotką; B bioreaktor z mieszadłem aeratorem; C bioreaktor strumienicowy z pompą zewnętrzną i eżektorowym zasysaniem powietrza; D bioreaktor kolumnowy z bełkotką; E bioreaktor kolumnowy z inżektorowym doprowadzeniem powietrza i rurą cyrkulacyjną; F bioreaktor z mieszadłem śmigłowym, dyszą doprowadzającą powietrze i rurą cyrkulacyjną G bioreaktor z hydrostatyczną cyrkulacją zewnętrzną

16 BIOREAKTORY Bioreaktory przemysłowe Bioreaktor laboratoryjny

17 Bioreaktor (1) korpus; (2) płaszcz; (3) izolacja; (4) zamocowanie; (5) króciec do podawania inokulum; (6) króćce czujników ph, temperatury i poziomu tlenu; (7) mieszadło; (8) bełkotka; (9) uszczelka mechaniczna; (10) sprzęgło; (11) napęd; (12) króciec odbioru produktu; (13) króćce doprowadzenia czynnika chłodzącego do płaszcza; (14) króciec do poboru próbki z podłączeniem do przewodu dostarczającego parę; (15) wziernik boczny; (16) króćce przewodów podawania czynników regulujących ph oraz środków antypieniących; (17) króciec wlotu powietrza; (18) pokrywa; (19) króciec dopływu pożywki; (20) dysza wylotowa gazów; (21) inne podłączenia; (22) mechaniczny rozbijacz piany; (23) wziernik w pokrywie i podłączenie do przewodu odprowadzającego parę; (24) dysza z zaworem bezpieczeństwa.

18 Rodzaje mieszadeł mechanicznych stosowanych w biofermentorach: a/ turbina Rushtona; b/ turbina z łopatkami wklęsłymi; c/ turbina hydropłatowa; d/ turbina typu śruby okrętowej

19 PROBLEMY ZWIĄZANE Z PIENIENIEM 1. Wzrost heterogeniczności środowiska spowodowany wynoszeniem stałych części podłoża i komórek wraz z pianą i osadzaniem ich na ścianach lub innych elementach bioreaktora 2. Utrudnienie lub wręcz uniemożliwienie kontroli stężenia składników podłoża oraz objętości hodowli, co jest szczególnie niekorzystne w przypadku procesu ciągłego 3. Zagrożenie wypienienia hodowli z bioreaktora oraz możliwość jego zainfekowania obcą mikroflorą przez zawilgocony pianą układ wentylacyjny 4. Obniżenie pojemności użytkowej bioreaktora o 30-50% 5. Konieczność stosowania oprzyrządowania przeciwdziałającego pienieniu, co podraża proces 6. Możliwość przechodzenia śladowych ilości substancji przeciwpianowych do produktów 7. Możliwość pogarszania się warunków natlenienia na skutek wprowadzania środków przeciwpianowych 8. Możliwość niekorzystnego wpływu środków przeciwpianowych na morfologię i fizjologię drobnoustrojów

20 Urządzenia do mechanicznego rozbijania piany A dysk szybkoobrotowy (1 wylot powietrza, 2 doprowadzenie chemicznego środka przeciwpianowego); B mieszadło łapowe pomiędzy dwoma dyskami; C fundafom CHEMAP (1 zasysanie piany, 2 wylot powietrza, 3 wyrzut cieczy); D cyklon (1 pompa, 2 - wylot powietrza)

21 Rozwiązania techniczne bioreaktora typu air-lift

22 Kontrola procesów biotechnologicznych Wielkości fizyczne mierzone w bioreaktorach Temperatura Natężenie przepływu powietrza Natężenie przepływu cieczy Poziom cieczy Poziom piany Ciśnienie Szybkość obrotów mieszadła Lepkość płynu czujniki opornościowe, termistory, termopary kryzy pomiarowe, rotametry j.w., przepływomierze łopatkowe czujniki pojemnościowe, oporowe czujniki pojemnościowe przetworniki membranowe czujniki elektryczne lub optyczne reometry śrubowe, rotacyjne Wielkości chemiczne mierzone w bioreaktorach Stężenie rozpuszczonego tlenu ph Potencjał redoks Stężenie tlenu w gazach Stężenie CO 2 w gazach Gęstość biomasy Stężenie cukrów Skład roztworu elektrody polarograficzne lub galwaniczne elektrody ph-metryczne elektrody platynowe analizatory paramagnetyczne analizatory IR czujniki nefelometryczne, fluorymetryczne elektrody enzymatyczne elektrody jonoselektywne, enzymatyczne

23 Schemat dodatkowych urządzeń kontrolnych bioreaktora biomasa czujnik optyczny fluorescencja - czujnik fluorescencyjny piana detektor piany FFF rozdzielanie w polu przepływu FIA iniekcyjny analizator przepływu GC- chromatograf gazowy HPLC wysokosprawny chromatograf cieczowy MS spektrometr mas redoks czujnik potencjału redoks W masa T różnica temperatury między zawiesiną hodowlaną i płaszczem wodnym

24 Schemat układu pomiarowego i sterującego bioreaktora Standardowe zmienne bioprocesowe F objętościowe natężenie przepływu zasilania; p ciśnienie; ph wartość ph cieczy; po 2 prężność cząstkowa tlenu rozpuszczonego; P moc pobierana napędu mieszadła; rpm częstotliwość obrotów mieszadła; T temperatura cieczy; vvm- szybkość napowietrzania; V L objętość cieczy; W masa reaktora

25 Schematy wybranych bioreaktorów do procesów z biokatalizatorami immobilizowanymi A kolumna ze złożem upakowanym; B kolumna ze złożem zraszanym; C kolumna ze złożem fluidalnym; D bioreaktor z mieszadłem mechanicznym; E bioreaktor z wkładami unieruchomionego biokatalizatora; F bioreaktor z krzyżowym przepływem fazy ciekłej i gazowej; G bioreaktor rurowy z wkładami (włóknami) z materiału półprzepuszczalnego

26

27 Sposoby sterylizacji - jałowienie termiczne parą wodną podłoża, biofermentory, rury, zawory -- sterylizacja chemiczna lub fizyczna (tlenek etylenu, lizol, chloraminy, UV) pomieszczenia - sterylizacja przez filtrację (filtry membranowe) powietrze, tlen

28 A okresowa; B- ciągła przeponowa, wymienniki płytowe; C ciągła bezprzeponowa 1- inżektor parowy, 2 rura sterylizacyjna, 3 komora próżniowa Wykład 3 Procesy biotechnologiczne Metody wyjaławiania podłoża

29 Sterylizacja podłoża z użyciem wymienników spiralnych

30 Instalacja do sterylizacji gazów odlotowych

31

32 Schemat postępowania podczas przygotowania materiału posiewowego do procesu biosyntezy

33 Przemysłowymi producentami antybiotyków są szczepy wysokowydajne Cechy szczepu wysokowydajnego maksymalna wydajność pożądanego produktu minimalizacja wytwarzania niepożądanych produktów ubocznych stabilność genetyczna odporność na zakażenia wirusowe Przykład wyniku optymalizacji szczepu: Penicillium chrysogenum wytwarzający Penicylinę G oryginalny szczep producencki 0.1 mg/ml - szczep zoptymalizowany 30 mg/ml

34 Schemat namnażania inokulum do procesu biosyntezy

35 Namnażanie zaszczepki Dane dotyczą wytwarzania sagamycyny przez Micromonospora sagamiensis

36 Trójstopniowa instalacja przemysłowa do namnażania zaszczepki

37 Parametry przykładowego procesu fermentacyjnego

38 Porównanie składów pożywek dla fazy wzrostu i fazy produkcyjnej Zaszczepka w kolbie Glukoza 3 5 % WNK 3 5% Węglan wapnia 0,5 1 % Fosforan 0,1 0,5% Siarczan amonu 0,1 1,0% Mocznik 0,1 0,5% Olej roślinny 0,1 0,5% Biofermentor produkcyjny Glukoza 0,5 0,8 % Skrobia 3 5% WNK 5 8% Mąka sojowa 1 5% Siarczan amonu 0,5 1% + uzup. periodyczne Fosforan 0,1 1,0% Olej roślinny 1% + uzup. stałe Syrop kukurydziany zasilanie stałe

39 Różnice warunków hodowli w kolbie i w fermentorze Hodowla w kolbie Hodowla w biofermentorze ml w kolbie ml objętości litrów tylko hodowla okresowa hodowle okresowe, okresowe z zasilaniem, chemostat, ciągłe możliwość kontroli T, brak kontroli O 2 kontrola temperatury, ph, poziomu O 2 wysokie początkowe stężenia substratów, prekursorów, induktorów ciśnienie normalne utrudnione pobieranie próbek zmniejszanie objętości hodowli możliwość stopniowanego dodawania możliwe nadciśnienie do 2 atn łatwość pobierania próbek możliwość zwiększania objętości wzrost drobnoustrojów na ściankach wzrost jednorodny brak problemów z pienieniem konieczność stosowania antypieniaczy

40

41 Sterylne stanowisko pracy z zastosowaniem laminarnego przepływu powietrza 1 komora; 2 filtr wstępny; 3 filtr HEPA 4 wentylator; 5 regulacja tyrystorowa; 6 - wskaźniki Budowa aseptycznej jednostki pracy I obszar niesterylny; II obszar czysty; III obszar sterylny ak autoklaw w ścianie z podwójnymi drzwiami jako śluza materiałowa szare prostokąty śluzy powietrzne

42 OBRÓBKA POPRODUKCYJNA DOWNSTREAM PROCESSING Dezintegracja Fermentacja brzeczka pofermentacyjna Separacja ciecz/składniki nierozpuszczalne roztwór osad Zatężenie Oczyszczanie produkt surowy ciecz zagospodarowanie odpadów Formulacja produkt oczyszczony odpady produkt w formie ostatecznej

43 OBRÓBKA POPRODUKCYJNA DOWNSTREAM PROCESSING 0,25 5 obr/min powierzchnia filtracji 2 10 m 2 Obrotowy filtr bębnowy próżniowy rotary drum vacuum filter

44 Prasa filtracyjna Powierzchnia filtracyjna od 100 do cm 2 na płytę

45 OBRÓBKA POPRODUKCYJNA DOWNSTREAM PROCESSING Wirówki wykorzystywane w przemysłowych procesach separacji zawiesin pofermentacyjnych a) kalander rurowy b) c) wirówka talerzowa; talerzy pod kątem około 40 d) wirówka ślimakowa do bardzo gęstych zawiesin

46 Przemysłowe metody dezintegracji komórek A. Metody mechaniczne 1. Poddawanie działaniu wysokiego ciśnienia 2. Ucieranie (młyny kulowe) 3. Mikrofluidyzacja B. Metody niemechaniczne 1. Suszenie/zawieszanie w roztworze 2. Szok osmotyczny 3. Szok termiczny 4. Traktowanie rozpuszczalnikami organicznymi lub surfaktantami 5. Zastosowanie enzymów litycznych

47 Przemysłowe metody zagęszczania roztworów 1. Odparowywanie, w tym: odparowywanie ze spływającą warstwą, odparowywanie płytowe 2. Ekstrakcja ciecz/ciecz -prosta - dysocjatywna - reakcyjna 3. Wytrącanie - frakcjonowanie siarczanem amonu -wytrącanie powinowactwa - immunoprecypitacja 3. Adsorpcja -na węglu aktywnym -na żywicach jonowymiennych - na adsorbentach hydrofobowych metoda złoża fluidalnego w kolumnie proces ciągły

48 Ekstrakcja płynem w stanie nadkrytycznym Diagram fazowy pojedynczej substancji P c ciśnienie krytyczne; T c temperatura krytyczna

49

50 Zestaw do ultrafiltracji spiralnej

51 Zasada działania hollow fibre filtration

52 Przemysłowe techniki chromatograficzne Stosowane głównie dla oczyszczania białek i DNA Techniki: - Chromatografia rozmiarów wykluczających (Sephadex, Sepharose) - Chromatografia jonowymienna (DEAE-, Q-, CM-, S) - Chromatografia hydrofobowa (Phenyl-Sepharose) - Chromatografia adsorpcyjna (hydroksyapatyt) - Chromatografia powinowactwa

53 Liofilizatory Metody formulacji produktu - krystalizacja - suszenie - liofilizacja Suszarka z wymuszonym obiegiem powietrza