Słodki świat enzymów

Transkrypt

1 Takao Ishikawa, Anna Karnkowska, Joanna Lilpop, Jakub Urbański Opracowanie merytoryczne treści zestawu: Takao Ishikawa, Anna Karnkowska, Joanna Lilpop, Jakub Urbański Ilustracje: Anna Lea Chojnacka Korekta: Michał Mlącki Zestaw opracowany w ramach projektu Science of Modern Biology Exploratory Resources for Biology Teachers and Students finansowanego przez UNESCO. Autorzy pragną serdecznie podziękować wszystkim osobom, które przyczyniły się do powstania zestawu, w szczególności współpracownikom Szkoły Festiwalu Nauki, Fundacji BioEdukacji oraz instytucjom założycielskim Szkoły Festiwalu Nauki: Międzynarodowemu Instytutowi Biologii Molekularnej i Komórkowej, Instytutowi Biochemii i Biofizyki PAN, Instytutowi Biologii Doświadczalnej PAN, Szkole Głównej Gospodarstwa Wiejskiego. Część pomysłów i procedur zamieszczonych w zestawie pochodzi od National Centre for Biotechnology Education w Reading ( którym serdecznie dziękujemy za nieocenioną pomoc i wsparcie. Niniejsze materiały podlegają licencji Creative Commons: Uznanie autorstwa-użycie niekomercyjne-bez utworów zależnych 2.5 Polska Niniejsze materiały wolno kopiować i rozpowszechniać wyłącznie niekomercyjnie w celach edukacyjnych, pod warunkiem umieszczenia na kopiach logo Funacji BioEdukacji i Szkoły Festiwalu Nauki oraz informacji o autorach. Nie zezwala się na zmiany ani przekształcenia niniejszego skryptu. W przypadku innych zastosowań lub zmian materiałów niezbędna jest zgoda Fundacji BioEdukacji ( Ver

2 Enzymy Enzymy pełnią w komórkach wszystkich organizmów żywych niezwykle istotną funkcję działają jako biokatalizatory. Pośredniczą we wszystkich szlakach anabolicznych i katabolicznych, obniżając energię aktywacji reakcji biochemicznych. Większość znanych enzymów jest białkami, lecz odkryto również cząsteczki RNA wykazujące aktywność katalityczną, tak zwane rybozymy. Jako katalizator enzym nie zmienia stanu równowagi reakcji chemicznej, tylko przyspiesza jego osiągnięcie. Reakcja przemiany substratu S w produkt P przechodzi przez stan przejściowy. Wartość energii swobodnej stanu przejściowego jest zdecydowanie wyższa niż energia swobodna substratu i produktu. W warunkach fizjologicznych energia wewnętrzna układu jest na tyle niska, że nie wystarcza na pokonanie progu energetycznego stanu przejścia. Enzym, jako katalizator obniża znacznie energię aktywacji energię swobodną Gibbsa oznaczaną jako G. Enzymy mają niezwykle dużą siłę katalityczną w obecności enzymu reakcja zachodzi o kilka rzędów wielkości szybciej. Anhydraza węglanowa katalizująca reakcję przeniesienia dwutlenku węgla z tkanek do krwi przyspiesza reakcję 10 7 razy!!! Cząsteczka tego enzymu jest w stanie uwodnić 10 5 cząsteczek dwutlenku węgla na sekundę!!! Budowa enzymów Wiele enzymów białkowych ma bardzo złożoną strukturę. Oprócz części białkowej apoenzymu zbudowanego z jednego lub kilku łańcuchów polipeptydowych, występuje w nich również niebiałkowa, trwale związana z cząsteczką enzymu grupa prostetyczna (np. jon metalu) lub nietrwale związany koenzym (np. witamina). Cały tego typu kompleks nazywany jest holoenzymem. Centrum aktywne enzymu, a więc rejon odpowiedzialny za katalizowanie reakcji stanowi z reguły niewielki rejon cząsteczki enzymu. Specyficzność substratowa Niezwykle istotną właściwością enzymów jest ich specyficzność substratowa. Już pod koniec XIX wieku, dla opisania specyficzności enzymów Emil Fischer zaproponował model zamka i klucza. Zgodnie z założeniami tego modelu trójwymiarowa struktura substratu odpowiada dokładnie trójwymiarowej strukturze wnętrza centrum aktywnego enzymu. W późniejszych latach wykazano jednak, że tego typu, niezwykle precyzyjne dopasowanie obydwu cząsteczek uniemożliwiałoby wydajne obniżenie energii aktywacji. W związku z tym zaproponowano model indukcyjnego dopasowania, zgodnie z którym struktury trójwymiarowe centrum aktywnego enzymu oraz substratu wykazują powinowactwo, nie są jednak idealnie dopasowane. Podczas łączenia się cząsteczki substratu (lub cząsteczek substratów) z centrum aktywnym dochodzi do nieznacznych zmian konformacji cząsteczek, w efekcie czego powstają naprężenia wiązań w obrębie cząsteczki, przez co obniża się energia reakcji katalitycznej. Często porównuje się dopasowywanie struktury substratu do centrum aktywnego do dopasowywania się kształtu rękawiczki do dłoni. Enzymy różnią się stopniem specyficzności. Jeżeli rozpatrzymy specyficzność rozkładających wiązania peptydowe enzymów proteolitycznych zauważymy, że mimo iż enzymy te przeprowadzają dokładnie ten sam typ reakcji, wykorzystują różne substraty. Trypsyna hydrolizuje tylko wiązania peptydowe po karboksylowej stronie reszty lizyny lub argininy. Trombina, jeden z enzymów odpowiedzialnych za krzepnięcie krwi, hydrolizuje tylko wiązania między resztami argniny i glicyny, podczas gdy bakteryjna subtilopeptydaza hydrolizuje wiązania peptydowe bez względu na to, między jakimi aminokwasami występują. Ryc. 1. Schemat indukcyjnego dopasowania Regulacja reakcji enzymatycznych Oprócz miejsca wiązania substratu centrum aktywnego wiele enzymów ma również centrum allosteryczne, czyli miejsce regulatorowe, do którego wiązać mogą się cząsteczki 2

3 inhibitorów lub aktywatorów, odpowiednio hamujących, bądź indukujących aktywność enzymu. W enzymach wchodzących w skład złożonych szlaków metabolicznych inhibitorami, na zasadzie ujemnego sprzężenia zwrotnego, bardzo często są produkty szlaku metabolicznego nadmiar produktu danego szlaku, powoduje zahamowanie enzymów tego szlaku. Z reguły ostateczny produkt szlaku jest inhibitorem dla enzymu katalizującego pierwszy etap danego szlaku dzięki temu minimalizowana jest utrata energii na syntezę pośrednich produktów szlaku. Przykładem może być tutaj szlak syntezy izoleucyny, którego ostateczny produkt izoleuzyna działa jako inhibitor pierwszego enzymu szlaku dehydratazy treoninowej. Spadek stężenia izoleucyny powoduje ponowne uruchomienie reakcji. Inhibicja enzymu może mieć charakter kompetycyjny. O tego typu oddziaływaniu mówimy wówczas, gdy inhibitor oddziałuje z centrum aktywnym enzymu i konkuruje z substratem. Cząsteczka inhibitora wykazuje podobieństwo struktury przestrzennej do struktury przestrzennej substratu, wzajemny stosunek stężeń obydwu cząsteczek wpływa na ogólne tempo przeprowadzania reakcji. Inhibitory mogą wiązać się z cząsteczkami enzymów nieodwracalnie, prowadząc do całkowitego ich unieczynnienia. W ten sposób działa wiele antybiotyków, między innymi antybiotyki betalaktamowe, takie jak penicylina hamująca biosyntezę peptydoglikanu wchodzącego w skład ściany komórkowej bakterii. Właściwości środowiska mają wpływ na aktywność enzymów Aktywność enzymów zależy od parametrów środowiska, takich jak temperatura, ph i osmolarność, czyli stężenie soli. Każdy z enzymów ma optymalną temperaturę działania dla większości enzymów mieści się ona w granicach o C. Wyższe temperatury powodują z reguły trwałe unieczynnienie enzymu poprzez denaturację jego struktury wyjątkiem są tu enzymy niektórych archeonów i bakterii zasiedlających środowiska ekstremalne, których enzymy osiągają optymalną aktywność w temperaturach o. Stężenie soli i ph są na ogół stałe w komórkach, bądź ich określonych przedziałach. Większość enzymów działa optymalnie w ph bliskim obojętnego, chociaż na przykład niektóre enzymy trawienne wydzielane w soku żołądkowym, lub enzymy obecne w lizosomach katalizują reakcje przy silnie kwasowym ph rzędu 2 3. Kinetyka reakcji enzymatycznych Kinetykę reakcji enzymatycznych katalizowanych przez enzymy nieallosteryczne opisuje model Michaelisa-Menten zaproponowany w 1913 roku przez Leonor Michaelis i Maud Menten. Model ten opiera się na założeniu, że niezbędnym etapem pośrednim procesu katalitycznego jest powstanie kompleksu enzym-substrat: Równanie Michaelisa-Menten przedstawia się następująco: [S] V = Vmax [S]+Km gdzie: V prędkość katalizowanej reakcji Vmax maksymalna prędkość katalizowanej reakcji (w warunkach optymal nych) [S] stężenie substratu Km stała Michaelisa - oznacza stały dla danego enzymu stosunek szybkości reakcji (k2+k3)/k1 (patrz Ryc.2.) Przy bardzo dużych stężeniach substratu Km można pominąć, co pozwala na uproszczenie równania do formy V=Vmax. W takich warunkach wszystkie cząsteczki enzymu będą wysycone substratem i będą pracować z pełną wydajnością. 3 Copyright :

4 Ryc. 2. Schemat reakcji enzymatycznej Jeżeli stężenie substratu będzie równe Km, prędkość reakcji będzie równa połowie prędkości maksymalnej zgodnie z równaniem: [S] V = Vmax [S]+[S] A więc stała Michaelisa wyznacza stężenie substratu, przy którym prędkość reakcji jest równa połowie prędkości maksymalnej. Zmieniając stężenie substratu przy zachowaniu pozostałych warunków reakcji można wyznaczyć eksperymentalnie Vmax i Km. Z aktywnością enzymów związane jest pojęcie liczby obrotów enzymu jest to liczba reakcji, jaką cząsteczka enzymu jest w stanie katalizować w ciągu jednej sekundy, przy maksymalnej prędkości. Podział enzymów Enzymy dzieli się na sześć klas. Podstawą klasyfikacji jest rodzaj katalizowanej reakcji i rodzaj substratów. Oksydoreduktazy katalizują reakcje typu redoks (np. peroksydaza katalizująca rozkład wody utlenionej). Transferazy - katalizują przenoszenie grup funkcyjnych między cząsteczkami lub w obrębie jednej cząsteczki (np. metylaza przenosząca grupę metylową CH 3 ) Hydrolazy katalizują reakcje rozpadu z udziałem wody hydrolizę (np. amylaza hydrolizująca wiązania w cząsteczkach skrobii). Liazy katalizują reakcje rozpadu bez udziału wody (np. dekarboksylaza pirogronianowa katalizująca rozpad pirogronianu do dwutlenku węgla i aldehydu octowego). Ligazy katalizują reakcje syntezy (np. ligaza faga T4 katalizuje łączenie cząsteczek dwuniciowego DNA) Izomerazy katalizują reakcje izomeryzacji (np. izomeraza fosfofruktozy, przekształca fosfofruktozę w fosfoglukozę). Wedle nomenklatury ustalonej przez Komisję Enzymów, każdemu scharakteryzowanemu enzymowi nadaje się specyficzny numer katalogujący go do odpowiedniej klasy. Litery E.C. umieszczone przed numerem enzymu oznaczają skrót Enzyme Catalogue. Na przykład omawiane w tym zestawie doświadczalnym hydrolazy mają numer E.C N, gdzie N jest numerem danego enzymu. Enzymy w biotechnologii i przemyśle Na długo zanim uczonym udało się dociec jakie cząsteczki biologiczne odpowiedzialne są za katalizę, nie mówiąc już o wyizolowaniu ich i oczyszczeniu, ludzie wykorzystywali 4

5 w życiu codziennym enzymy naturalnego pochodzenia. Wspomnieć wystarczy o produkcji alkoholu (dehydrogenaza alkoholowa z drożdży), czy serów podpuszczkowych (podpuszczka z żołądków bydlęcych). Jednak dzięki dynamicznemu rozwojowi biotechnologii, w ciągu ostatnich kilkudziesięciu lat naukowcy opanowali nie tylko metody izolacji i oczyszczania białek enzymatycznych, ale również ich modyfikowania i otrzymywania na skalę przemysłową. Na masową skalę enzymy otrzymywane są z bakterii, po uprzednim wprowadzeniu genu kodującego pożądany enzym do ich komórek. Hodowla bakterii jest prowadzona w tzw. chemostacie, w którym panują stałe warunki hodowli umożliwiające ciągłe otrzymywanie bakterii o takich samych własnościach. Zazwyczaj wprowadzany do bakterii gen kodujący enzym jest dodatkowo opatrzony w odpowiedni promotor, znacznie zwiększający ekspresję tego genu, co umożliwia nadprodukcję pożądanego enzymu. Jest to niezwykle istotne, ponieważ dzięki takiemu zabiegowi produkowany enzym występuje w bardzo dużej przewadze liczbowej w stosunku do innych białek występujących w komórce bakterii. Każde laboratorium genetyczne korzysta z enzymów otrzymywanych na skalę przemysłową począwszy od wirusowych enzymów służących do syntezy RNA i DNA, przez bakteryjne enzymy restrykcyjne, fosfatazy sklonowane z genomu krewetek i innych organizmów morskich, aż po zmodyfikowaną peroksydazę pochodzącą z chrzanu. Oczywiście rekombinowane enzymy wykorzystuje się nie tylko w laboratoriach stykamy się z nimi na codzień: w skład proszków do prania wchodzą zmodyfikowane bakteryjne enzymy proteolityczne i lipolityczne, w przemyśle serowarskim stosuje się produkowaną przez bakterie podpuszczkę cielęcą (w wielu krajach, w tym Polsce znakomita większość serów podpuszczkowych produkowana jest przy użyciu takiej podpuszczki), a diabetycy korzystają z produkowanej przez bakterie ludzkiej insuliny. To zaledwie kilka przykładów, kolejne można by mnożyć niemal w nieskończoność... Enzymy są wokół nas i nie jesteśmy świadomi, jak wiele produktów, których używamy na co dzień, zawiera je lub powstało właśnie dzięki nim. W proponowanych doświadczeniach przedstawiamy trzy enzymy z klasy hydrolaz, zaangażowane w metabolizm cukrowców amylazę, laktazę i izomerazę. Są one podstawowymi enzymami trawiennymi w przewodach pokarmowych ludzi, ale także ich odpowiedniki przemysłowe są istotnymi narzędziami w przemyśle spożywczym. WĘGLOWODANY Węglowodany to jedna z czterech najważniejszych klas cząsteczek biologicznych. Węglowodany, zwane też cukrowcami są związkami organicznymi składającymi się z węgla, wodoru i tlenu. Cukrowce są to wielowodorotlenowe aldehydy bądź ketony oraz ich pochodne. Występują jako cukry proste oraz ich polimery: oligosacharydy i polisacharydy. W wielu strukturach komórkowych węglowodany występują jako fragmenty cukrowe o różnej budowie i wielkości, często w połączeniu z białkami (glikoproteiny) i lipidami (glikolipidy). Cukrowce stanowią materiał zapasowy i główne źródło energii w komórkach istot żywych, wchodzą w skład szkieletu struktury RNA i DNA, jako elementy strukturalne budują ściany komórkowe bakterii, roślin, grzybów oraz szkielety zewnętrzne stawonogów. Rola cukrów w organizmie człowieka Najważniejszą funkcją węglowodanów w organizmie człowieka jest dostarczanie energii. Po strawieniu i wchłonięciu, węglowodany w postaci glukozy są rozprowadzane przy udziale krwi do tkanek. Tam zachodzi oddychanie, czyli utlenienie glukozy do CO 2 i H 2 O z wytworzeniem energii, którą organizm wykorzystuje zgodnie z aktualnymi potrzebami energetycznymi. Niezmiernie ważne jest utrzymywanie stałego poziomu glukozy we krwi, gdyż istnieje ciągła potrzeba zaopatrywania w glukozę wszystkich komórek ciała, zwłaszcza czerwonych krwinek i mózgu, które nie mogą korzystać z innych źródeł energii. Poziom glukozy we krwi ma także ścisły związek z metabolizmem tłuszczów i białek, gdyż glukoza wykorzystywana jest również do syntezy struktur komórkowych (np. podczas ciąży i w okresie wzrostu) oraz 5 Copyright :

6 do syntezy laktozy w czasie laktacji. Energia pochodząca z węglowodanów jest także w niewielkim stopniu magazynowana w postaci glikogenu w wątrobie i mięśniach. W sytuacji niewystarczającego poziomu glukozy we krwi, w wątrobie uruchamiany zostaje proces glikogenolizy i glikogen rozkładany jest do glukozy. W przeciwieństwie do glikogenu wątroby glikogen zmagazynowany w mięśniach jest zużywany jedynie dla ich własnych potrzeb energetycznych. Przy przeciętnym i niezbyt wysokim spożyciu węglowodanów zasadniczą drogą ich metabolizowania jest utlenianie. Ze wzrostem spożycia węglowodanów rośnie tempo ich utleniania, a także intensywność odkładania glikogenu. Gdy potrzeby energetyczne organizmu zostaną zaspokojone, nadmiar węglowodanów wykorzystywany jest do syntezy triglicerydów odkładanych w tkance tłuszczowej. Podział węglowodanów: MONOSACHARYDY (cukry proste) są najprostszymi cukrowcami, ich klasyfikacja opiera się na liczbie atomów węgla w cząsteczce. TRIOZY (zawierają 3 atomy węgla) najprostsze cukry proste: aldehyd glicerynowy i dihydroksyaceton. PENTOZY (zawierają 5 atomów węgla). Najistotniejsze to: dezoksyryboza budulec DNA i ryboza, budulec RNA, ATP i ryboflawiny. U roślin natomiast istotną rolę odgrywa arabinoza występująca w większej ilości w gumach roślinnych i ksyloza, tzw. cukier drzewny. Przeważnie występują one jako związki spolimeryzowane w formie pentozanów. HEKSOZY (zawierają 6 atomów węgla). W układzie fizjologicznym występują jedynie cztery heksozy - fruktoza, galaktoza, glukoza i mannoza. W naturze w formie wolnej występują tylko fruktoza i glukoza. Galaktoza wchodzi w skład laktozy i rafinozy oraz polisacharydu galaktanu, zaś mannoza w skład polisacharydu mannanu. Pentozy i heksozy w roztworach występują głównie w postaci pierścieniowej Glukoza (cukier gronowy) jest cukrem prostym o sześciu atomach węgla w cząsteczce. Chemicznie jest alkoholem polihydroksylowym o pierścieniowej budowie cząsteczki. Istnienie życia na ziemi wiąże się nierozerwalnie z syntezą, przemianami i spalaniem glukozy. Glukoza produkowana jest min. w procesie fotosyntezy i to na ogromną skalę, bo aż sto miliardów ton rocznie w skali całego globu. Glukoza w smaku jest słodka. OLIGOSACHARYDY zawierają 2-10 cukrów prostych. Dwucukry (disacharydy) są związkami składającymi się z dwóch cukrów prostych, połączonych wiązaniem O-glikozydowym. Najbardziej istotne w żywieniu ludzi spośród dwucukrów są laktoza cukier mleczny, sacharoza - dawniej nazywana cukrem trzcinowym lub buraczanym, a dziś po prostu cukrem, oraz maltoza. Melezytoza, rafinoza i stachioza występują w roślinach, lecz nie są trawione przez układ enzymatyczny człowieka. Dwa ostatnie, zawarte w nasionach roślin strączkowych (np. grochu i fasoli), są przyczyną wzdęć i powstawania gazów będących skutkiem wykorzystywania tych cukrów przez mikroflorę jelitową. Laktoza (cukier mleczny) składa się z połączonych cząsteczek dwóch cukrów glukozy i galaktozy. Laktoza naturalnie występuje tylko w mleku ssaków. Krowie, owcze i kozie mleko zawiera około 5% laktozy, a ludzkie 7%. Laktoza ma istotne znaczenie pokarmowe dla młodych ssaków, będąc podstawowym źródłem cukrów prostych dla rozwijającego się organizmu. Laktoza jest zdecydowanie mniej słodka od produktów jej rozkładu glukozy i galaktozy. Sacharoza (cukier buraczany, cukier trzcinowy) jest zbudowana z połączonych ze sobą wiązaniem glikozydowym cząsteczek glukozy i fruktozy. Występuje u wielu roślin i jest najdogodniejszą formą transportu cukrów z liści do korzeni. Gromadzi się w dużych ilościach szczególnie w korzeniach buraka cukrowego (20%) i źdźbłach trzciny cukrowej (13 20%), skąd pozyskuje się ją do produkcji cukru rafinowanego. POLISACHARYDY są wielkocząsteczkowymi polimerami cukrów prostych. W organizmach roślin i zwierząt spełniają rolę strukturalną lub są formą zmagazynowania energii. Głównymi polimerami zbudowanymi z glukozy są celuloza, glikogen i skrobia. Niestrawnym polimerem fruktozy jest inulina, która w żywieniu człowieka nie odgrywa istotnej roli, będąc węglowodanem zapasowym roślin niejadalnych. 6

7 Skrobia jest polimerem glukozy. Składa się z rozgałęzionych nici amylopektyny i nie rozgałęzionych amylozy. Można ją znaleźć w wielu roślinach, które magazynują skrobię, jako substancję zapasową (zboża, ziemniaki, banany). Dlatego też stanowi ponad połowę węglowodanów spożywanych przez ludzi. Skrobia, w odróżnieniu od cukrów prostych i disacharydów nie jest słodka w smaku. Pod wpływem gorącej wody polimeryzuje, przybierając konsystencję gęstego żelu. Możemy to obserwować podczas robienia kisielu lub krochmalu. Jak słodki jest cukier, czyli ile jest cukru w cukrze? Ważną rolą węglowodanów jest oddziaływanie na zmysły, gdyż o akceptacji lub odrzuceniu pożywienia, a także o preferencjach konsumenckich decydują przede wszystkim cechy organoleptyczne produktów spożywczych. Węglowodany mają swój udział w tworzeniu ich smaku, barwy, konsystencji i struktury. Smak cukrów jest rozpoznawany przez zlokalizowane na języku kubki smakowe jako słodki, a sacharoza uchodzi za standard smaku słodkiego, dlatego inne środki słodzące, naturalne lub sztuczne, są charakteryzowane najczęściej przez porównywanie ich siły słodzącej do słodkości sacharozy. Względna siła słodzenia wybranych węglowodanów: Węglowodany Względna siła słodzenia Laktoza 16 Ksyloza 40 Ksylitol 40 Sorbitol 70 Glukoza 70 Sacharoza 100 Cukier inwertowany 130 Fruktoza Inne słodkie związki, a nie cukry Ze smakiem słodkim zazwyczaj kojarzymy związki chemiczne będące węglowodanami. Jest znanych jednak kilka gatunków roślin, które są słodkie dzięki słodkim białkom, a nie związkom cukrowym. Najbardziej znanym białkiem z tej grupy jest taumatyna, która izolowana jest z rośliny tropikalnej Thaumatococcus daniellii. Uważa się, że taumatyna jest 3000 razy słodsza od sacharozy. Jest to całkowicie bezpieczny związek słodzący, gdyż w organizmie człowieka, podobnie jak inne białka, jest rozkładany do pojedynczych aminokwasów. 7 Copyright :

8 Enzymy wykorzystane w doświadczeniach zestawu Amylaza (E.C ) Ryc. 3. Struktura przestrzenna amylazy. Na żółto zaznaczone są betakartki, na różowo alfahelisy [1amy.pdb: Kadziola, A., Abe, J., Svensson, B., Haser, R. J.Mol.Biol. v239 pp , 1994] Enzym katalizujący reakcję rozkładu skrobi. W zależności od katalizowanej reakcji, amylazy można podzielić na podklasy, choć zawsze wspólną ich cechą jest zdolność hydrolizy skrobi. Alfa-amylaza odpowiedzialna jest za hydrolizę wiązań alfa-1,4-glikozydowych, co powoduje skrócenie łańcuchów polisacharydowych budujących skrobię. Powstają dwucukry i triozy. Alfa-amylaza jest enzymem trawiennym, występuje w ślinie (przeprowadza jeden z pierwszych etapów trawienia) oraz w trzustce. Kiedy długo trzymamy kawałek pieczywa w ustach, po pewnym czasie zaczynamy wyraźnie czuć słodki smak. Dzieje się tak za sprawą właśnie amylazy rozkładającej skrobię z mąki na dwucukry, które odczuwamy jako słodkie. W zestawie doświadczalnym znajduje się alfa-amylaza spożywcza, czyli Termamyl. Enzym ten stosowany jest w przemyśle spożywczym do upłynniania skrobi, np. podczas produkcji syropu. Laktaza (E.C ) Ryc. 4. Struktura przestrzenna betafruktofuranozydazy [1uwq.pdb: Gloster, T.M., at all. Biochemistry v43 pp.6101, 2004] Laktaza (beta-fruktofuranozydaza) jest enzymem hydrolitycznym rozkładającym cząsteczkę laktozy na galaktozę i glukozę. Wiadomo jednak, że zdolność hydrolizy wiązania glikozydowego zachowuje również przy innych związkach tej grupy. Można stwierdzić więc, że laktaza nie wykazuje dużej specyficzności względem substratu. Laktaza występuje w układzie pokarmowym niemowląt ssaków. Umożliwia rozkład zawartej w mleku matki laktozy, do pożywnych cukrów prostych. Jednak z czasem u dorosłych osobników dochodzi do zahamowania syntezy tego enzymu, tak jest na przykład u dorosłych kotów. Blisko 75% dorosłych ludzi na świecie nie jest w stanie trawić laktozy, a ich organizm reaguje na mleko dolegliwościami gastrycznymi. Jest to stan naturalny, nie tylko ze względu na powszechność występowania w populacji ludzkiej, ale i powszechność w świecie dorosłych ssaków, którym laktaza nie jest potrzebna, gdy przestają pić mleko matki. Jednak pozostałe 25% dorosłych ludzi na świecie może pić mleko bez najmniejszych dolegliwości. Co więcej, procent ludzi zdolnych do trawienia laktozy w wieku dorosłym jest bardzo zróżnicowany pomiędzy różnymi populacjami i rasami ludzi. Na przykład u rasy białej w Europie (ludy zamieszkujące Skandynawię, ale także Polacy) aż 75% dorosłych zachowuje zdolność trawienia laktozy, ponieważ ich organizmy wytwarzają przez całe życie laktazę. Natomiast rasa czarna zazwyczaj nie posiada tej zdolności. Zjawisko to jest bardzo ciekawym przykładem ewolucji cechy zbieżnej z ewolucją kulturową. Zdolność ekspresji genu laktazy przez całe życie pojawiła się w związku z udomowieniem przed ok. 8 tys. lat bydła i korzystaniem z mleka jako ważnego składnika pokarmowego także po okresie niemowlęctwa. 8

9 Z myślą o ludziach, którzy nie tolerują laktozy, w wielu krajach zaczęto na etapie produkcyjnym poddawać mleko działaniu laktazy. Takie mleko jest słodsze od zwykłego, ponieważ glukoza i galaktoza, które powstają w wyniku hydrolizy laktozy, są słodsze od tego dwucukru. Inwertaza (E.C ) Inwertaza jest enzymem katalizującym reakcję hydrolizy sacharozy do fruktozy i glukozy. Inwertaza jest wytwarzana przez komórki drożdży, pozwala rozłożyć sacharozę do łatwo przyswajalnych cukrów prostych, jakimi są glukoza i fruktoza. U ludzi inwertaza, podobnie jak laktaza, występuje na wewnętrznej powierzchni komórek nabłonka wyściełającego jelito cienkie. Inwertaza występuje też w ślinie pszczół i bierze udział w przetwarzaniu cukru z nektaru kwiatowego do cukrów prostych. W przemyśle spożywczym inwertaza jest wykorzystywana np. podczas produkcji czekoladek nadziewanych półpłynnym nadzieniem. Podczas produkcji nadzienie w postaci stałej (głównym składnikiem jest sacharoza) pokrywane jest czekoladą, a następnie w ciągu kilkutygodniowego dojrzewania czekoladek w wyniku działania inwertazy dodanej w procesie produkcji, sacharoza rozkładana jest do fruktozy i glukozy, które chłonąc wilgoć ze środowiska powodują w efekcie upłynnienie nadzienia. Zasada wykrywania glukozy na pasku diagnostycznym Paski diagnostyczne służące do wykrywania glukozy w rozworze używane są między innymi przez diabetyków do pomiaru stężenia glukozy w moczu. Na pasku diagnostycznym pod wpływem glukozy oraz tlenu zachodzą dwie reakcje enzymatyczne, w wyniku których pojawia się barwny produkt. Reakcje zachodzą tylko, gdy w środowisku wodnym (paski zawsze zanurzamy w roztworze wodnym) i przy obecności tlenu z powietrza, obecna będzie glukoza substrat dla pierwszego enzymu. Zapoczątkowany wtedy zostaje ciąg reakcji prowadzący do powstania barwnego produktu. Bibułka na pasku nasączona jest dwoma enzymami: oksydazą glukozy oraz peroksydazą chrzanową, a także jodkiem potasu. Ryc. 5. Struktura przestrzenna betalaktamazy (inwertazy) [1uyp.pdb: Alberto, F., Bignon, C., Sulzenbacher, G., Henrissat, B., Czjzek, M. J.Biol.Chem. v279 pp.18903, 2004] I etap katalizowany przez oksydazę glukozy: beta-d-glukoza + tlen + woda > nadtlenek wodoru + kwas glukuronowy II etap katalizowany przez peroksydazę chrzanową: jodek potasu + nadtlenek wodoru > jod + woda. Jod ma intensywnie brązowy kolor, który obserwujemy na pasku. Ryc. 6. Skala barwna paska diagnostycznego 9 Copyright :

10 Amylaza Cel doświadczenia: Wykrywanie aktywności enzymatycznej amylazy w ślinie Czas wykonania doświadczenia: jedna jednostka lekcyjna Wstęp Aktywność amylazy można bardzo łatwo wykryć, dodając tego enzymu do krochmalu, który jest gęstym roztworem skrobi. Działanie amylazy powoduje rozkład skrobi na mniejsze cząsteczki, w wyniku czego krochmal wyraźnie zmienia konsystencję i staje się płynny. Rozkład skrobi można stosunkowo łatwo obserwować wykorzystując specyficzną reakcję barwną, w której wykorzystuje się jodynę. Związek ten wiąże się ze skrobią, dając intensywnie granatowe zabarwienie. W miarę rozkładu skrobi intensywność zabarwienia wyraźnie maleje. W zestawie jest: 5 płytek plastikowych z 25 dołkami 10 pipet pasterowskich o objętości 1 ml 1 pusta probówka o poj. 50 ml z podziałką 20 g skrobi 1 łyżeczka do odmierzenia 2 g skrobi 5 mieszadełek 1 butelka o poj. 125 ml na roztwór jodyny 1 butelka jodyny 1 probówka o poj. 15 ml zawierająca 0,120 ml roztworu amylazy Termamyl. Należy przechowywać w lodówce 5 kubeczków plastikowych Dodatkowo potrzebne będzie: 5 słoików odpornych na ciepło (mogą być zlewki lub szklanki) o pojemności 200 ml gorąca woda 200 ml wody destylowanej (wodę destylowaną można kupić na stacji benzynowej) zegarek z funkcją stopera Przygotowania wstępne Ponieważ przygotowanie krochmalu w warunkach szkolnych może nastręczyć nieco kłopotów, radzimy przygotować go dzień wcześniej. Skróci to czas potrzebny do przeprowadzenia doświadczenia. 1 Przygotowanie krochmalu dla każdej z pięciu grup: a b c Wsyp porcję skrobi (ok. 2 g to płaska łyżeczka) do słoika o poj. 200 ml, a następnie rozrób w jak najmniejszej objętości zimnej wody (nie więcej niż 5 ml). Najlepiej posłużyć się łyżeczką do herbaty. Zagotuj w czajniku wodę. Odmierz 50 ml wrzątku przy pomocy probówki z podziałką. Zawiesinę skrobi zalej gorącą wodą. Zalanie wrzącą wodą jest kluczowe, w przeciwnym 10

11 d razie może nie powstać krochmal! Zamieszaj bardzo energicznie, by nie powstały grudki skrobi. Dokładne mieszanie pozwoli uzyskać krochmal idealnie nadający się do przeprowadzenia doświadczenia. Przygotowany krochmal można przechowywać przez 24 godziny w lodówce. Na minimum godzinę przed wykonaniem eksperymentu należy wyjąć go z lodówki, by osiągnął temperaturę pokojową. Jeżeli przygotowujemy krochmal w trakcie lekcji, Pkt. 1a Pkt. 1c Pkt. 1d należy pamiętać o ostudzeniu go do temperatury pokojowej. 2 Przygotowanie roztworu jodyny a b c Roztwór jodyny do wykrywania skrobi należy przygotować bezpośrednio przed lekcją. Uwaga! Odczynnik plami ubrania. Napełnij wodą destylowaną plastikową buteleczkę objętości 125 ml. Za pomocą pipetki dodaj do butelki z wodą 0,5 ml jodyny. Zakręć i dokładnie wymieszaj. Pkt. 2a Pkt. 2b Pkt. 2d d Przygotowany odczynnik rozlej po ok. 25 ml do 5 kubeczków, po jednym dla każdej grupy. 3 Przygotowanie enzymu Roztwór enzymu Termamyl (alfa-amylaza spożywcza) należy przygotować tuż przed lekcją. Probówkę zawierającą 0,120 ml enzymu Termamyl dopełnij wodą destylowaną do 15 ml i wymieszaj. Jeden zespół uczniów powinien otrzymać tę probówkę i użyć jej zawartość jako kontroli zamiast śliny. Zaleca się użycie w tym celu 2-3 ml rozcieńczo- 11 Copyright :

12 nego enzymu Termamyl na 50 ml przygotowanego krochmalu. Każdy z pięciu zespołów uczniów powinien otrzymać: płytkę z 25 dołkami naczynie z krochmalem 2 pipetki pasterowskie mieszadełko kubek z przygotowanym roztworem jodyny kubek z wodą do płukania pipetek kserokopię przepisu wykonania doświadczenia Podział zadań w klasie: Wszystkie próby są przeprowadzane w tych samych warunkach, z tego samego roztworu skrobi, w tej samej temperaturze, kolejne próbki są pobierane zawsze po tym samym czasie i takiej samej objętości. Kontrolą pozytywną, którą wykonują wszystkie zespoły, jest pierwsza próbka kropla krochmalu bez śliny dodana do roztworu jodyny. Dzięki niej udowadniamy, że roztwór jodyny zabarwia się na granatowo pod wpływem skrobi, a nie na przykład substancji zawartych w ślinie. Grupa A wariant doświadczalny A (kontrola +) Pozytywną kontrolą w tym doświadczeniu jest roztwór komercyjnej amylazy wykorzystywanej w przemyśle spożywczym. Enzym ten nosi nazwę Termamyl. Grupa B wariant doświadczalny B (właściwa próba) Do roztworu skrobi dodawana jest ślina uczestników doświadczenia i badana aktywność amylazy zawartej w ślinie. Grupa C wariant doświadczalny B (kontrola -) Do roztworu skrobi nie dodawany jest żaden enzym, tylko woda i badana jest zmiana zabarwienia jodyny z próbkami roztworu skrobi w czasie. Kontrola ma na celu sprawdzenie czy skrobia samoistnie nie zmienia swoich właściwości w czasie. Opis doświadczenia 1 Przygotuj zegarek, najlepiej z funkcją stopera. 2 Dodaj przy pomocy pipetki pasterowskiej po 1 ml roztworu jodyny do wszystkich dołków na płytce z 25 dołkami. Pkt. 2 Pkt. 6 Pkt

13 3 Do pierwszego dołka dodaj przy pomocy czystej pipety pasterowskiej jedną kroplę krochmalu, zamieszaj. Obserwuj barwę mieszaniny. 4 Dodaj do słoika z krochmalem kilka mililitrów śliny (objętość około 1 łyżkii). (UWAGA! W wariancie A zamiast śliny dodawany jest 2-3 ml otrzymanego od prowadzącego roztworu enzymu Termamyl, natomiast w wariancie C zamiast śliny dodawane są 2 ml wody). Bardzo ważne jest mieszanie, aby enzym był rozprowadzony równomiernie w krochmalu. 5 Dokładnie wymieszaj krochmal i od razu dodaj jedną kroplę do drugiego dołka. Uruchom stoper lub zanotuj dokładną godzinę. 6 Po upływie jednej minuty, czystą pipetą pobierz próbkę krochmalu i dodaj jedną kroplę do trzeciego dołka, mieszając jego zawartość końcówką pipety. Cały czas mieszaj krochmal. 7 Czynność opisaną w pkt. 6 powtarzaj co minutę, dodając krochmal do kolejnych dołków, za każdym razem odnotowując w tabeli zmianę barwy. Zaleca się płukanie w czystej wodzie pipetki po każdym pobraniu krochmalu, gdyż pozostający w niej krochmal może wpływać na wiarygodność wyniku. 8 Możesz zakończyć doświadczenie, gdy odczynnik przestanie zmieniać barwę. Oczekiwane wyniki: Wariant Dodany enzym Pomiar 0 Pomiar 1... Pomiar 20 A termamyl granatowy granatowy brak zmiany koloru B amylaza ze śliny granatowy granatowy brak zmiany koloru C woda granatowy granatowy granatowy Rozwiązywanie problemów: 1 Nawet w próbkach pobieranych po 23 minutach nie widać zmiany zabarwienia: Aktywność amylazy w próbce jest zbyt niska. Należy dodać więcej enzymu z probówki Termamyl lub więcej śliny. Doświadczenie wychodzi zdecydowanie lepiej, jeżeli osoba plująca do próbki żuła wcześniej gumę lub jadła pieczywo. Krochmal przygotowywany był tuż przed doświadczeniem i był za gorący w momencie, kiedy dodano do niego próbkę śliny. Wysoka temperatura spowodowała dezaktywację enzymu. Przegotowany poprzedniego dnia krochmal nie został wyjęty z lodówki odpowiednio wcześniej. Jeżeli temperatura krochmalu jest zbyt niska, amylaza działa z bardzo małą wydajnością. Krochmal powinien mieć temperaturę pokojową. 2 Roztwór odbarwia się niemal od razu: Enzym zawarty w próbce ma bardzo wysoką aktywność, lub objętość dodanego enzymu była zbyt duża. Należy powtórzyć doświadcznie zmniejszając objętość dodawanej śliny 3 Próba kontrolna w postaci roztworu enzymu Termamyl nie działa: Można zwiększyć objętość próbki enzymu oraz delikatnie podgrzać słoik z krochmalem (np. wstawić go do naczynia z ciepłą wodą). Amylaza Termamyl wykazuje aktywność w temperaturze pokojowej, ale optymalną temperaturą dla jej działania jest o C. Uwagi: Roztwory po eksperymencie można wylać do zlewu Płytka po opłukaniu i umyciu detergentem nadaje się do powtórnego użytku 13 Copyright :

14 Jodynę i jej roztwory należy chronić przed światłem, np. zakrywając cały pojemnik folią aluminiową Pytania kontrolne: Jak zmienił się kolor odczynnika, w której minucie nastąpiła zmiana barwy, o czym może świadczyć zmiana barwy odczynnika? Jak zmieniła sie konsystencja krochmalu, w której minucie nastąpiła zmiana i o czym to świadczy? Jak można porównać aktywność enzymu amylazy pochodzącego od różnych osób? Czy zmienia sie aktywność enzymu jeśli ktoś wcześniej spożył posiłek (bogaty w węglowdany)? 14

15 Laktaza Cel doświadczenia: Wykrywanie aktywności enzymatycznej laktazy Czas wykonania doświadczenia: jedna jednostka lekcyjna Wstęp Jednym ze sposobów wykrycia aktywności enzymatycznej laktazy jest wykrycie produktu katalizowanej przez ten enzym reakcji, w tym wypadku wykrycie glukozy. W proponowanym doświadczeniu do wykrywania obecności glukozy posłużą stosowane przez diabetyków paski diagnostyczne. W pierwszym etapie enzym zostanie unieruchomiony w złożu alginianowym, przez które uczniowie przesączać będą mleko. W miarę przesączania mleka przez złoże, obecny w nim enzym laktaza będzie rozkładać laktozę do glukozy i galaktozy. Tempo przepływu przez żel ma kluczowe znaczenie dla doświadczenia. Jeżeli mleko będzie przepływać zbyt szybko, to enzym nie zdąży związać się z cząsteczkami laktozy i nie będzie w stanie katalizować reakcji. Jeśli mleko będzie się sączyć zbyt wolno, dojdzie do tzw. inhibicji allosterycznej enzymu. Galaktoza, produkt katalizowanej przez laktazę reakcji, działa jako inhibitor laktazy jest to typowy przykład regulacji aktywności enzymu na zasadzie ujemnego sprzężenia zwrotnego. Przy odpowiednio dobranym tempie przepływu mleka w przesączu z kolumny obecne jest około 2,5 % glukozy, co można wykryć przy pomocy paska diagnostycznego. Pasek nie powinien wykazywać natomiast obecności glukozy w mleku przed nałożeniem na kolumnę. Laktoza w mleku przesączonym przez kolumnę bez enzymu nie ulega rozkładowi, toteż pasek diagnostyczny nie wykaże obecności glukozy u wylotu kolumny. W zestawie jest: Enzym laktaza w płynie (24 ml). Należy przechowywać w lodówce 2 butelki z alginianem sodu (1 g) 2 pudełeczka z chlorkiem wapnia (7,5 g) 5 strzykawek o pojemności 10 ml 5 plastikowych kubków 5 pipetek pasterowskich o pojemności 1 ml 1 pudełko glukozy w proszku (1 g) 1 pudełko laktozy w proszku (10 g) 5 sitek wata bawełniana 5 kieliszków 10 pasków diagnostycznych 5 mieszadełek 1 pusta probówka 50 ml z podziałką Dodatkowo potrzebne będzie: 15 kubeczków (mogą być słoiki lub zlewki) około 200 ml mleka (może być UHT, ale nie może być to mleko z obniżoną zawartością laktozy). Mleko powinno mieć temperaturę pokojową. 100 ml wody destylowanej (wodę destylowaną można kupić na stacji benzynowej) 15 Copyright :

16 Przygotowania wstępne Pkt. 2 1 Dzień przed doświadczeniem przygotuj roztwór alginianu sodu: do butelki z 1 g alginianu sodu dolej 50 ml wody destylowanej (do odmierzenia użyj probówki z podziałką). Intensywnie zamieszaj rozbijając grudki. Uwaga! Alginian rozpuszcza się bardzo ciężko i powoli. Po kilkunastu godzinach w cieple (najlepiej powyżej temperatury pokojowej) powinien powstać jednorodny, gęsty 2% roztwór alginianu. 2 Znajdujący się w zestawie chlorek wapnia (7,5 g) rozpuść w 500 ml wody destylowanej (na przykład w butelce po wodzie mineralnej) w ten sposób otrzymasz 500 ml roztworu chlorku wapnia o stężeniu ok. 1,5%. Roztwór można przechowywać w szczelnie zamkniętej butelce przez praktycznie nieograniczony czas. Na zajęcia należy przygotować pięć naczynek, np. szklanek zawierających ok. 50 ml 1,5% roztworu chlorku wapnia. 3 Do pojemniczka z naważką glukozy (1 g) wlej 25 ml wody destylowanej. Do odmierzania użyj 50 mililitrowej probówki z podziałką. Po wymieszaniu otrzymasz ok. 4% roztwór glukozy. 4 Laktozę (5 g) wsyp do szklanki i rozpuść w 100 ml wody destylowanej. Otrzymasz ok. 5% roztwór. 5 Płynny roztwór enzymu laktaza jest gotowy do użycia. Każdy z pięciu zespołów uczniów powinien otrzymać: naczynko z roztworem chlorku wapnia ok. 50 ml do stworzenia kulek z alginianu zwitek waty bawełnianej do uszczelnienia kolumny strzykawkę pipetkę pasteurowską o poj. 1 ml 2 paski diagnostyczne do wykrywania glukozy (paski można przeciąć wzdłuż na pół) 2 ml enzymu laktaza (lub wody dla grupy B) sitko do odcedzenia kulek alginianu 2 puste kubeczki lub szklanki jeden na roztwór alginianu, drugi do zbierania płynu wyciekającego przez kolumnę 1 plastikowy kieliszek do zbierania właściwej frakcji płynu wyciekającego przez kolumnę mieszadełko ok. 20 ml mleka (grupy B i C), lub roztworu laktozy (grupa A), lub wody (grupa D) jako substraty reakcji kserokopię przepisu wykonania doświadczenia (wariant A, B, C lub D) Organizacja pracy w klasie: Wszystkie próby są przeprowadzane w tych samych warunkach, z tego samego alginianu sodu, w tej samej temperaturze, przez złoże jest przepuszczana zawsze ta sama objętość i pobierana próbka do pomiaru glukozy po jednakowej objętości, która zeszła z kolumny. Kontrolę pozytywną wykonuje nauczyciel jako pokaz dla całej klasy. Aby udowodnić, że pasek diagnostyczny faktycznie wykrywa glukozę, należy zanurzyć go w gotowym roztworze glukozy. Wszystkie grupy sprawdzają na wstępie zawartość glukozy w badanym roztworze (A laktozy, B i C mleka, D - wody) przed przepuszczeniem przez kolumnę. Zakładając, że jest to świeże mleko, w temperaturze pokojowej, nie poddane wcześniejszemu działaniu laktazy, powinno być całkowicie wolne od glukozy. Woda i roztwór laktozy również nie powinny zawierać glukozy. Próba ta ma na celu wykluczenie możliwości obecności glukozy w nakładanym roztworze. Grupa A wariant doświadczalny A (kontrola +) Przez złoże z enzymem przepuszczamy roztwór laktozy (5%) i wykrywamy glukozę Kontrola ta ma na celu udowodnienie, że glukoza spływająca z kolumny rzeczywiście pochodzi z rozkładu laktozy. 16

17 Grupa B Wariant B (kontrola ) Przez złoże BEZ ENZYMU przepuszczamy mleko i wykrywamy glukozę. Aby wykluczyć możliwość, że laktoza zawarta w mleku ulega rozkładowi za sprawą samego kontaktu z żelem alginianowym, należy przesączyć mleko przez złoże nie zawierające enzymu. Najlepiej to zrobić w ten sposób, że jeden z zespołów przygotuje kolumnę, w której do roztworu algininianu sodu zamiast roztworu laktazy doda 2 ml wody destylowanej. Grupa C Wariant C (właściwa próba) (może go wykonać kilka zespołów) Przez złoże z enzymem przepuszczamy mleko, w spływającym z kolumny mleku powinna być wykrywalna glukoza. Dodatkowy wariant: grupa D wariant D (kontrola ) Przez przygotowane złoże z enzymem przepuszczona zostaje woda (w objętości takiej samej jak badany roztwór w pozostałych wariantach) i po przejściu przez kolumnę wykrywana jest w niej glukoza. Jest to dodatkowa kontrola negatywna, która udowodni, że glukoza nie spływa z przygotowanego złoża. Opis doświadczenia 1 Przy pomocy otrzymanego paska diagnostycznego sprawdź zawartość glukozy w roztworze twojego substratu odpowiednio mleku, laktozie lub wodzie: a b c Zanurz pasek w roztworze na 3 sekundy Wyjmij i poczekaj 30 sekund Odczytaj stężenie glukozy porównując kolor paska z kolorem wzorca. Podobnie postępuj przy następnych pomiarach glukozy Pkt. 1a Pkt. 1b Pkt. 1c 2 Nabierz za pomocą strzykawki 8 ml 2% roztworu alginianu sodu (znajdującego się w butelce o poj. 125 ml) i wlej do pustego kubeczka. 3 Dodaj za pomocą pipety pasterowskiej 2 ml enzymu laktazy do tego samego naczynka z 8 ml alginianu. Dobrze wymieszaj roztwór przy pomocy mieszadełka. (UWAGA! W przypadku Wariantu B należy dodać 2 ml wody zamiast enzymu.) 4 Nabierz przy pomocy strzykawki 10 ml mieszaniny alginianu sodu z laktazą i dodawaj ostrożnie, dokładnie po kropli, do zlewki z roztworem chlorku wapnia. Pozwól powstałym kulkom stężeć przez ok. 4 minuty. W tym czasie możesz wykonać punkt 5. 5 Wyjmij tłoczek ze strzykawki i umieść w środku zwitek waty bawełnianej. Porządnie go ubij tłoczkiem, na dnie kolumny powinno być około 1 cm zbitej waty. Wyjmij tłoczek. 6 Odcedź powstałe kulki alginianu na sitku i umieść je w strzykawce. Tak przygotowana strzykawka posłuży jako kolumna ze złożem. 17 Copyright :

18 7 Do kolumny wlewaj powoli mleko (UWAGA! W wariancie A zamiast mleka wlewany będzie roztwór laktozy, w wariancie D woda. Dalej postępuj analogicznie). Zwróć uwagę, by podczas trwania eksperymentu kolumna ZAWSZE była wypełniona roztworem. 8 Wyciekający z kolumny roztwór zbieraj do czystego kubeczka. Pierwszą frakcję wyciekającą z kolumny, do momentu, gdy poziom zbieranej cieczy pokryje dno kieliszka, należy wylać. Następnie podstaw, pod wylot kolumny nowy, czysty, plastikowy kieliszek. 9 Zbieraj właściwą frakcję przez około 5-10 minut, aż kieliszek zostanie napełniony. 10 Sprawdź zawartość glukozy w zebranym roztworze paskiem diagnostycznym. Pkt. 4 Pkt. 6 Pkt. 7 Oczekiwane wyniki: Wariant Substrat reakcji Obecność enzymu w złożu Obecność glukozy przed wlaniem badanego roztworu na kolumnę A roztwór laktozy B mleko C mleko D woda Rozwiązywanie problemów: Obecność glukozy po przepuszczeniu badanego roztworu przez kolumnę 1 W mleku nie pojawiła się glukoza Mogło zostać użyte mleko, które ma obniżoną zawartość laktozy, albo mleko, które było zbyt zimne (powinno mieć temperaturę pokojową). Możliwe jest też, że mleko przesączało się przez kolumnę zbyt szybko i wtedy laktoza nie zdążyła się związać z enzymem i nie uległa rozkładowi. Można przesączyć to samo mleko jeszcze raz przez kolumnę. Gdy zaś mleko sączyło się zbyt wolno, powstająca w wyniku rozpadu laktozy galaktoza, mogła zahamować aktywność laktazy. Należy kolumnę przemyć wodą. 2 Wyniki w różnych grupach są różne: Warstwa waty nie była równa we wszystkich grupach grubość i stopień ubicia warstwy waty ma wpływ na tempo przepływu mleka. Kolumna nie była przez cały czas w pozycji pionowej, co mogło spowodować nierównomierne spływanie mleka. Kolumna nie była przez cały czas wypełniona mlekiem, w efekcie część mleka krócej reagowała z enzymem. Zebrano złą frakcję mleka, to znaczy nie tylko tę, która faktycznie przeszła przez cała kolumnę. Badanie poziomu glukozy należy przeprowadzić dopiero w mleku zbieranym do drugiego naczynka. 18

19 Propozycje dodatkowego wykorzystania zestawu: Na rynku dostępne jest mleko o obniżonej zawartości laktozy, warto również takie mleko wykorzystać do eksperymentu i sprawdzić, czy dane producenta sa zgodne z rzeczywistością. Uwagi: Zużyte złoże, watę i paski diagnostyczne można wyrzucić do pojemnika na zwykłe śmieci. Strzykawki po dokładnym umyciu wodą z detergentem i wypłukaniu nadają się do powtórnego użycia. Resztki roztworu chlorku wapnia można wylać do zlewu. Kulki alginianu sodu z immobilizowanym na nich enzymem można wyrzucić do pojemnika na zwykłe śmieci. 19 Copyright :

20 Inwertaza Cel doświadczenia: Wykrywanie aktywności enzymatycznej inwertazy drożdżowej Czas wykonania doświadczenia: jedna jednostka lekcyjna Wstęp Komórki drożdży wytwarzają inwertazę. Wykrycie aktywności enzymatycznej tego enzymu w proponowanym doświadczeniu nastąpi pośrednio, przez wykrycie jednego z produktów reakcji glukozy. Do zawiesiny świeżych drożdży piekarniczych dodamy substratu reakcji 5% roztwór sacharozy. Do wykrycia obecności glukozy po przeprowadzonej reakcji, posłużą stosowane przez diabetyków paski diagnostyczne. Pasek diagnostyczny nie powinien wykazywać obecności glukozy w zawiesinie drożdży przed reakcją. Inwertazę drożdżową można również w łatwy sposób wyizolować z drożdży. Poniżej podajemy przepis, jak w warunkach domowych wyizolować enzym. IZOLACJA INWERTAZY Z DROŻDZY PIEKARSKICH Do 3 g świeżych drożdży (lub 10 g suszonych) dodaj 30 ml 0,1 M roztworu węglanu sodu (sody oczyszczonej). Inkubuj przez 24 h w temperaturze 40 C. Po tym czasie pozostaw mieszaninę w lodówce na kolejne 24 h. Utworzą się dwie warstwy. Zbierz przezroczystą górną warstwę i zbadaj w niej aktywność inwertazy. Tak otrzymaną inwertazę można przetrzymywać w temperaturze 4 C. Preparat ten jest podatny na zakażenia, jeśli zaobserwujemy zmętnienie roztworu należy go wylać. Przed użyciem inwertazę można rozcieńczyć wodą destylowaną. W zestawie jest: Roztwór inwertazy (20 ml). Należy przechowywać w lodówce 5 płytek 25 dołkowych 10 pipetek pasterowskich o objętości 1 ml glukoza w proszku (1 g) sacharoza w proszku ( 2 probówki 50 ml po 2,5 g) 27 pasków diagnostycznych do wykrywania glukozy 5 mieszadełek Dodatkowo potrzebne będzie: 12 kubeczków (mogą być słoiki lub zlewki) świeże drożdże piekarskie (5g) 50 ml wody destylowanej (wodę destylowaną można kupić na stacji benzynowej) ciepła woda flamastry 20

21 Przygotowania wstępne 1 Przygotowanie roztworu sacharozy: probówkę z sacharozą (2,5 g) dopełnij do 50 ml wodą mineralną lub destylowaną. Rozlej tak przygotowany 5% roztwór do 5 zlewek lub kubków po ok. 10 ml. 2 Do pojemniczka z naważką glukozy (1 g) wlej 25 ml wody destylowanej. Wymieszaj. Otrzymasz ok. 4% roztwór glukozy. 3 Drożdże rozdziel na 1 gramowe fragmenty (objętość ok. łyżeczki do kawy), każdy umieść w osobnym kubeczku Każdy z pięciu zespołów uczniów powinien otrzymać: zlewkę lub kubek z ok. 10 ml 5% roztworu sacharozy 1 pytkę 25 dołkową 2 pipetki pasterowskie o obj. 1 ml mieszadełko 6 pasków do wykrywania glukozy (paski można przeciąć wzdłuż na pół) 1 g drożdży w kubeczku enzym inwertazę (2 ml) ciepłą wodę flamaster kserokopię przepisu wykonania doświadczenia Organizacja pracy w klasie: Wszystkie próby są robione w tych samych warunkach, z tego samego roztworu sacharozy i tych samych drożdży, w tej samej temperaturze, pomiar glukozy następuje po tym samym czasie. Kontrolę pozytywną nr O wykonuje nauczyciel jako pokaz dla całej klasy. Aby udowodnić, że pasek diagnostyczny faktycznie wykrywa glukozę, należy zanurzyć go w gotowym roztworze glukozy. Nauczyciel powinien także wykonać kontrolę negatywną nr O sprawdzając zawartość glukozy w roztworze sacharozy przed rozdaniem jej uczniom. Każdy z zespołów uczniów wykonuje wszystkie podane niżej próby: Próba A (kontrola +) Do roztworu sacharozy dodajemy komercyjną inwertazę spożywczą i wykrywamy obecność glukozy po przeprowadzonej reakcji. Jest to kontrola pozytywna, mająca na celu udowodnienie, że reakcja hydrolizy sacharozy katalizowana jest rzeczywiście przez inwertazę, nie jakiś inny składnik komórek drożdży. Próba B (kontrola ) Zamiast sacharozy podajemy wodę katalizatorem jest komercyjna inwertaza spożywcza. Kontrola ma na celu sprawdzenie czy roztwór enzymu nie zawiera glukozy. Próba C (właściwa próba) Substratem reakcji jest sacharoza, a źródłem enzymu mają być komórki drożdży. Po reakcji, w mieszaninie wykrywamy poziom glukozy. Próba D (kontrola ) Zamiast substratu reakcji podajemy wodę, źródłem enzymu są komórki drożdży. Kontrola ma na celu udowodnienie, że w zawiesinie drożdży nie ma glukozy. Dodatkowy wariant E i F (kontrola ) Aby potwierdzić specyficzność działania inwertazy można wykonać dodatkowo kontrole używając jako substratu innego cukru. Może to być na przykład skrobia lub roztwór disacharydów powstały po rozkładzie skrobi przez amylazę lub laktoza. Substrat należy poddać działaniu zarówno inwertazy komercyjnej (wariant E), jak i zawiesinie drożdży (wariant F). W obu przypadkach nie powinna się pojawić glukoza. 21 Copyright :

22 Opis doświadczenia 1 1 g świeżych drożdży w kubeczku zalej 6 ml ciepłej wody. Zamieszaj. 2 Podpisz sześć kolejnych dołków na płytce cyframi od 1 do 6. 3 Do dołków w 25-dołkowej płytce rozlej za pomocą pipetki pasterowskiej po 0,5 ml roztworów substratów: Do dołków nr 2 i 4 wlej wody Do dołków 1 oraz 3 wlej roztworu sacharozy. *(dla chętnych) do dołków 5 i 6 wlej drugą pipetką po 2 ml roztworu innego cukru (np. laktozy) 4 Opłucz dokładnie pipetki w czystej wodzie 5 Do dołków nr 1 i nr 2 dodaj za pomocą pipetki pasterowskiej po 1 ml komercyjnego enzymu inwertazy, zamieszaj. Pkt. 1 Pkt. 3 Pkt. 6 6 Po 5 minutach dokonaj pomiaru zawartości glukozy w badanej mieszaninie, przy pomocy paska diagnostycznego. a b c Zanurz pasek w roztworze na ok. 3 sekundy. Wyjmij i poczekaj 30 sekund Odczytaj stężenie glukozy porównując kolor paska z kolorem wzorca, zapisz wynik. 7 Powtórz kroki piąty i szósty dodając do dołków nr 3 i 4 po 1 ml przygotowanej zawiesiny drożdży. 8 Następnie powtórz kroki piąty i szósty dodając do dołka nr 5 1 ml enzymu inwertazy, a do dołka nr 4 1 ml drożdży. Pamiętaj, aby za każdym razem myć lub wymieniać pipetkę! Schemat doświadczenia: Nr dołka *5 *6 substrat sacharoza woda sacharoza woda Inny cukier Inny cukier enzym inwertaza inwertaza drożdże drożdże inwertaza drożdże 22