Rola βhcg i USG w ciąży prawidłowej i nieprawidłowej

Transkrypt

1 Rola βhcg i USG w ciąży prawidłowej i nieprawidłowej Oznaczenie stężenia βhcg w surowicy lub osoczu krwi pełni obecnie istotną, chociaż pomocniczą rolę w potwierdzeniu ciąży, jej monitorowaniu oraz prognozowaniu dalszego przebiegu ciąży, a także służy do oceny wydolności łożyska oraz oceny stanu płodu. Gonadotropina kosmówkowa (ang. human Chorionic Gonadotropin) zbudowana jest z dwóch podjednostek: alfa-wytwarzanej przez cytotrofoblast oraz betawytwarzanej przez syncytiotrofoblast. Rutynowe oznaczenia dotyczą stężenia wolnej podjednostki beta we krwi i wykonywane są z użyciem przeciwciał monoklinalnych swoistych dla βhcg oraz przeciwciał znakowanych metodą sandwich (1). Badanie cieszy się dość dużym zainteresowaniem, ponieważ jest stosunkowo prostym i powszechnie dostępnym sposobem na potwierdzenie wczesnej ciąży. Oznaczeniu poziomu βhcg czasem towarzyszy oznaczenie poziomu progesteronu, który informuje o czynności ciałka żółtego ciążowego i stanowi objaw rokowniczy. W komercyjnych testach ciążowych poziom βhcg oznaczany jest w moczu. Pozytywny wynik testu można już uzyskać po 8 dniach od zapłodnienia (w zależności od czułości testu, zwykle od 25 miu/ml) niemniej jednak biologiczna aktywność βhcg jest większa w surowicy krwi niż w moczu, a test najlepiej jeast wykonać najwczesniej w terminie spodziewanej miesiączki. Stężenie βhcg we krwi ulega logarytmicznemu podwajaniu co 2-3 dni, uzyskując maksimum około 9-12 tygodnia ciąży. Wzrost hormonu we krwi obserwuje się do tygodnia ciąży, po czym jego poziom stopniowo się obniża w miarę dojrzewania łożyska, uzyskując wartości śladowe w ostatnim trymestrze ciąży (1,4).

2 Normy βhcg mogą nieznacznie różnić się między laboratoriami, bowiem zależą od analizatora i zestawu odczynników, a także jednostek miary stosowanych w danym laboratorium. Wyniki badań mogą być wyrażone w miu/ml lub IU/L. Istnieją różnego typu kalkulatory przyrostu βhcg (np. kalkulator), które jednak powinny być traktowane wyłącznie jako informacja orientacyjna, bowiem wnikliwa interpretacja wyników należy do lekarza. Poza okresem ciąży u kobiet przed menopauza wartość βhcg jest niższa od 1 miu/ml lub 5 miu/ml w zależności od laboratorium, natomiast u kobiet po menopauzie poniżej 9 miu/ml. Przykładowe normy βhcg w okresie ciąży (analizator Elecsys 2010, odczynniki HCG+β, ROCHE, normy laboratoryjne): Tydzień ciąży Poziom βhcg (miu/ml) 1-4 tydzień tydzień tydzień tydzień tydzień tydzień tydzień tydzień tydzień tydzień tydzień

3 Uważa się, że poziom βhcg może mieć również związek z tzw. niepowściągliwymi wymiotami ciężarnych (ang. hyperemesis gravidarum, HG). HG dotyczy nudności i wymiotów, które pojawiają się przed 20. tygodniem ciąży i są na tyle ciężkie, że mogą prowadzić do hospitalizacji. Duża częstotliwość występowania wymiotów może bowiem powodować odwodnienie, kwasicę, zaburzenia elektrolitowe i równowagi kwasowo-zasadowej oraz inne poważne stany. Objawy rozwijają się równolegle ze wzrostem βhcg we krwi ciężarnej. Niektóre wyniki badań wskazują na wyższy niż przeciętnie poziom βhcg u kobiet z HG. Upatruje się także związku HG ze stanami zwiększonego stężenia βhcg takimi jak ciąża bliźniacza, zaśniad groniasty oraz z zespołem Downa i płcią żeńską płodu (7). W przypadku niższych niż spodziewane stężeń βhcg we wczesnej ciąży można podejrzewać upośledzenie funkcji trofoblastu i spodziewać się poronienia, bądź też być oznaką poronienia zatrzymanego, ciąży ektopowej (pozamacicznej) lub obumarcia płodu (1). Poronienia samoistne występują w 25% do 50% ciąż przed 14 tygodniem ciąży. Wyróżnia się poronienie całkowite, niecałkowite oraz opóźnione. Wśród cech świadczących o poronieniu całkowitym wymienia się całkowite usunięcie elementów jaja płodowego, zamknięta szyjka macicy, endometrium cieńsze niż 15 mm. Poronienie niecałkowite może cechować się niecałkowitym usunięciem elementów jaja płodowego, otwartą lub zamkniętą szyjką macicy, tkanka może zawierać pęcherzyk ciążowy i być heterogeniczna. O poronieniu opóźnionym (w tym pustym jaju płodowym ) może świadczyć brak usuwania elementów jaja płodowego, zamknięta szyjka macicy, obecność pęcherzyka ciążowego o wielkości powyżej 20 mm bez echa zarodka i pęcherzyka żółtkowego, obecność pęcherzyka ciążowego o wielkości poniżej 20 mm i bez wzrostu w ciągu 7 dni, zgrubienie na krawędzi embrionu (ang. fetal pole) powyżej 6 mm bez wykrywalnej aktywność serca zarodka, bądź poniżej 6 mm bez zmian w ciągu 7 dni (3). Przyczyny poronień: 1. Zaburzenia w obrębie jaja płodowego; 2. Patologie matczyne (zaburzenia anatomiczne narządów rodnych, mięśniaki, zrosty zapalne);

4 3. Nieprawidłowości kosmówki (zmiany naczyniowe, zwyrodnienie zaśniadowe, zmiany wsteczne, mikrozawały, zwapnienia); 4. Zaburzenia czynnościowe (niewydolność ciałka żółtego, upośledzona zdolność wydzielania hcg i progesteronu, poronienie biochemiczne); 5. Choroby matki (wirusowe, zakaźne, immunologiczne, urazy, czynniki psychiczne); 6. Czynniki środowiskowe (leki-cytostatyki, antymetabolity, preparaty jodu, sulfonamidy) (4). Stosunkowo częstą nieprawidłowością wczesnej ciąży jest wystąpienia tzw. ciąży bezzarodkowej (ang. anembryonic pregnancy) zwanej także poronieniem chybionym (ang. missed abortion) oraz występującą także pod popularną, choć zwykle nieużywaną przez lekarzy nazwą pustego pęcherzyka ciążowego pustego jaja płodowego (ang. blighted ovum). Stanowi ono około 49% do 90% wszystkich poronień samoistnych. Wśród przyczyn pustego jaja płodowego wymienia się przede wszystkim nieprawidłowy kariotyp, w którym dominuje przede wszystkim autosomalna trisomia, triploidia oraz monosomia X. Podejrzenie pustego jaja płodowego może pojawić się, gdy w USG stwierdza się takie cechy jak pęcherzyk ciążowy w macicy przy braku echa zarodka i pęcherzyka żółtkowego, zbyt mała średnica pęcherzyka ciążowego w stosunku do wieku ciąży, nieprawidłowy wzrost pęcherzyka ciążowego (gdy pęcherzyk wielkości 2,5 cm przyrasta mniej niż 75% w ciągu 1 tygodnia), nisko osadzony pęcherzyk ciążowy, przy równoczesnym prawidłowym lub nieprawidłowym przyroście βhcg. Bicie serca płodu powinno być już wykrywalne w 8 tygodniu ciąży, dlatego też stwierdzenie we wczesnej ciąży braku pewnych ultrasonograficznych cech budzi pewne podejrzenia. Zaleca się wykonanie kolejnego USG po 7-14 dniach celem potwierdzenia i podjęcia odpowiednich działań terapeutycznych (wyczekiwanie na poronienie lub środki farmaceutyczne lub zabieg łyżeczkowania) (2, 3). Seryjne oznaczenia βhcg odgrywają dość dużą rolę w diagnostyce ciąży pozamacicznej. Poziom tego hormonu jest względnie stały w 70% takich ciąż, natomiast w co piątej ciąży pozamacicznej poziom βhcg może mieć prawidłowy przyrost. Oprócz oznaczeń beta hcg duże znaczenie diagnostyczne mają także w USG przezpochwowe, poziom progesteronu w surowicy krwi, wgląd do jamy otrzewnej za pomocą laparoskopii oraz diagnostyczne wyłyżeczkowanie jamy

5 macicy. Uważa się, że poziom progesteronu poniżej 5 ng/ml dość wiarygodnie wskazuje na duże prawdopodobieństwo wystąpienia ciąży pozamacicznej lub patologicznej ciąży wewnątrzmacicznej. Już po 5,5 tygodnia trwania ciąży można wykazać w USG przezpochwowym pozamaciczną lokalizację ciąży, jednak gdy poziom βhcg jest poniżej miu/dl nie można na tej podstawie postawić jednoznacznej diagnozy (5,6). Istnieje także mozliwość równoczesnego istnienia ciąży pozamacicznej oraz wewnatrzmacicznej. Zjawisko to nazywane jest ciążą heterotopową (6). Należy również pamiętać, że poza wykryciem i monitorowaniem ciąży, poziom βhcg znajduje zastosowanie w monitorowaniu pacjentów z chorobami trofoblastycznymi oraz pacjentów z produkującymi ten hormon komórkami nowotworowymi. Podwyżone wartości hcg wraz z podjednostką beta występują w wielu nowotworach złośliwych takich jak choriokarcinoma jądra lub łożyska, zaśniad groniasty, nasieniak, rak trzustki, żołądka, jajnika, okrężnicy, płuca, piersi, wątroby czy nerki (8). Stosunkowo częstą nieprawidłowością wczesnej ciąży jest wystąpienie ciąży bezzarodkowej Wykorzystanie seryjnych oznaczeń odpowiednich hormonów płciowych, w tym βhcg, wraz z badaniem ultrasonograficznym pozwala w około 95% do 99% przypadków na ustalenie właściwego rozpoznania ciąży zagrożonej lub nieprawidłowej oraz rokowania co do jej dalszych losów. mgr Agnieszka Helis, diagnosta laboratoryjny PIŚMIENNICTWO: 1. Kaźmierczak W. i wsp. Przydatność oznaczeń biochemicznych we współczesnej diagnostyce poronień. Gin Prak 2004;4(12):16-20.

6 2. Bernard KG., Cooperberg PL. Sonographic differentiation between blighted ovum and early viable pregnancy. AJR 1985; 144: Allison JN. et al. Management of first trimester pregnancy loss can be safely moved into the office. Rev Obstet Gynecol. 2011; 4(1): Kaźmierczak W. i wsp. Przyczyny, etiologia oraz współczesne metody diagnostyki i leczenia poronień. Gin Prakt 2004, 12, 4: Jakiel G. i wsp. Ciąża ektopowa. Prz Menopauz 2006; 1: Farquharson RG. et al. Updated and revised nomenclature for description of early pregnancy events. Hum Reprod ;20(11): Tkaczuk-Włach J. i wsp. Niepowściągliwe wymioty ciężarnych. Prz Menopauz 2007; 5: Stenman UH. et al. Human chorionic gonadotropin in cancer. Clin Biochem 2004; 37(7): Różnorodność morfologiczna erytrocytów stopień wybarwienia W rozmazie krwi obwodowej możemy zaobserwować pojawienie się różnych wariantów erytrocytów. Zmiany w obrębie kształtu i wielkości zostały omówione w poprzednim artykule. W niniejszym artykule przedstawiamy różnorodność stopnia wybarwienia oraz obecność

7 nieprawidłowo wybarwionych krwinek czerwonych w rożnych stanach chorobowych. W celu uzyskania rozmazu krwi obwodowej, po jego odpowiednim przygotowaniu na szkiełku podstawowym, należy badany materiał poddać barwieniu metodą MayGrunwald-Giemsa. Wysuszone rozmazy powinny zostać umieszczone w odczynniku MayGrunwalda na około 2-3 minuty. Po tym czasie spłukane wodą i umieszczone w wodnym roztworze Giemsy (rozcieńczenie w stosunku 10:1) na około 15 minut. Po barwieniu należy odczynniki spłukać i pozostawić rozmaz do całkowitego wyschnięcia. Tak przygotowane rozmazy są gotowe do oglądania w mikroskopie w powiększeniu imersyjnym. W chwili obecnej dostępne są odczynniki do szybkiego barwienia rozmazów krwi obwodowej, pozwalające na znaczne skrócenie czasu barwienia (przykładowo zestaw RapiHem prod. Aqua-Med.) Prawidłowo dojrzałe erytrocyty są kwasochłonne. Chłoną one eozynę i wybarwiają się na kolor różowawy. Nieprawidłowe zabarwienie erytrocytów może mieć charakter hipochromii, hiperchromii lub polichromatofilii. Hipochromia znana także jako niedobarwliwość to stan, w którym pojawiają się w rozmazie krwinki o zmniejszonej zawartości hemoglobiny. W przypadku erytrocytów niedobarwliwych mamy do czynienia z mniej intensywnym zabarwieniem. Ten typ krwinek czerwonych spotyka się najczęściej w niedokrwistości z niedoboru żelaza oraz niedokrwistości syderoblastycznej. Obok sferocytów, krwinek czerwonych o szczególnym kształcie i zwiększonej barwliwości, pojawiają się anulocyty. Anulocyty zwane również leptocytami to erytrocyty z niewielką zawartością hemoglobiny, ułożonej głównie w części periferalnej krwinki, posiadające duże przejaśnienie środkowe (powyżej 1/3 krwinki). Ich obecność można odnotować w zaburzeniach czynności wątroby [1]. Pojawienie się erytrocytów niedobarwliwych we krwi obwodowej może mieć swoje odzwierciedlenie w obniżeniu średniego stężenia hemoglobiny w krwince czerwonej MCHC (ang. mean corpuscular hemoglobin concentration). MCHC jest parametrem wyliczonym. Aby wyznaczyć wartość MCHC potrzebna jest znajomość stężenia hemoglobiny, hematokrytu oraz liczby erytrocytów. Stosuje się następujący wzór: MCHC [g/dl]= Hb [g/dl] x 100 / Ht [%] MCHC fizjologicznie powinno wynosić od 32 do 36 g/dl (20 22 mmol/l), przy czym

8 zakresy referencyjne mogą nieznacznie się różnić pomiędzy poszczególnymi laboratoriami. W wielu analizatorach hematologicznych MCHC pełni funkcję kontrolną w stosunku do innych parametrów układu czerwonokrwinkowego. Należy pamiętać, że spadek MCHC może świadczyć nie tylko o niedokrwistości z niedoboru żelaza, ale także o zaburzeniach wodno-elektrolitowych typu hipertonicznej hiperhydracji. Hiperchromia to nadbarwliwość krwinek czerwonych. Wzrasta stężenie hemoglobiny w krwinkach czerwonych czego wykładnikiem jest wzrost wartości MCHC. Zmianę tego typu obserwuje się w dziedzicznej sferocytozie oraz przy długotrwałym odwodnieniu. Wysokie MCHC może sygnalizować również możliwość wystąpienia hemolizy w badanej próbce. Stwierdzono także, iż hiperchromia oraz wzrost MCH (eng. mean corpuscular hemoglobin) towarzyszy niedokrwistości megaloblastycznej i marskości wątroby oraz stanom związanym z wysoką retikulocytozą [2]. Anizochromia jest zjawiskiem związanym ze zróżnicowaną intensywnością wybarwienia erytrocytów. W rozmazie krwi obwodowej pojawiają się równocześnie erytrocyty normochromatyczne, hipochromiczne oraz hiperchromiczne. Może to być związane z niedokrwistością hemolityczną lub niedokrwistością z niedoboru żelaza. Polichromatofilia, zwana także wielobarwliwością i polichromazją, jest wskaźnikiem braku całkowitej dojrzałości krwinek czerwonych. Niedojrzałe erytrocyty, jeszcze przed zakończeniem hemoglobinizacji, dostają się ze szpiku kostnego do krwi obwodowej. W rozmazie obserwujemy krwinki o niejednorodnym wybarwieniu, w obrębie pojedynczej krwinki istnieją obszary o różnej intensywnościzabarwienia. Nasilenie procesów krwiotwórczych sprzyja zjawisku. Obserwujemy je między innymi w niedokrwistości pokrwotocznej, hemolitycznej, chorobie Addisona-Biermera, żółtaczce hemolitycznej, przerzutach nowotworowych do szpiku, przy niedotlenieniu i czerwienicy [3]. Wielobarwliwości erytrocytów towarzyszy często retikulocytoza, tak jak w przypadku anemii autoimmunohemolitycznej u pacjentów z przeciwciałami typu ciepłego [4].

9 Stosunkowo częstą nieprawidłowością wczesnej ciąży jest wystąpienie ciąży bezzarodkowej W dobie postępu technologii większość badań wykonywanych jest przez analizatory. Pamiętajmy jednak, że nie są one niezawodne i w momencie pojawienia się wątpliwości co do uzyskanych wyników powinniśmy podjąć odpowiednie działania zaradcze. Stwierdzenie nieprawidłowości dotyczących objętości erytrocytu czy też stężenia hemoglobiny powinny zasygnalizować nam, że być może pojawiły się pewne odchylenia od stanu prawidłowego i skłaniać nas ku wykonaniu ręcznego rozmazu krwi obwodowej. mgr Agnieszka Helis, diagnosta laboratoryjny Piśmiennictwo: 1. Lynch E. Peripheral blood smear [In:] Walker HK., Hall WD., Hurst JW. ed. Clinical Methods: The History, Physical, and Laboratory Examinations. 3rd ed., Boston; Butterworths, Pleskaczyńska A., Dobrzańska A. Podstawy diagnostyki niedokrwistości w praktyce pediatrycznej. Przew Lek, 2008; 2: Mariańska B., Fabijańska-Mitek J., Windyga J. Badania laboratoryjne w hematologii. Warszawa; Wyd Lek. PZWL, Packman CH. Hemolytic anemia due to warm autoantibodies. Blood Rev, 2008; 22, 1:

10 QPCR seminarium w sieci polecamy Seminarium sieciowe na temat qpcr (quantitative PCR, Real-Time PCR) organizowane przez Agilent Technologies odbędzie się 30 lipca 2015 o godzinie (CET). Seminarium poświęcone rozwiązywaniu problemów z qpcr oraz optymalizacji metody poprowadzi Dr. Robert Loewe, który jest jest założycielem GeneWake i specjalistą w zakresie ilościowego PCR. Rejestrować się na seminarium należy tutaj. Stosunkowo częstą nieprawidłowością wczesnej ciąży jest wystąpienie ciąży bezzarodkowej

11 Znaczenie PT i INR Doustne leki przeciwzakrzepowe znajdują zastosowanie w leczeniu i profilaktyce zakrzepicy. Około 1% społeczeństwa podlega takiej terapii, przy czym w połowie przypadków nie przebiega ona we właściwy sposób, mimo powszechnej wiedzy o schemacie kontroli ustalania dawki i monitorowania leczenia. Czas protrombinowy (ang. prothrombin time, PT) jest czynnościowym testem oceniającym zewnątrzpochodny układ krzepnięcia. Oznaczenie tego parametru niezbędne jest w monitorowaniu leczenia doustnymi antykoagulantami (ang. oral anticoagulants, OA), będącymi antagonistami witaminy K, oraz pomocne w diagnostyce chorób wątroby. Wartość PT zależy od zawartości w osoczu kilku czynników: protrombiny, czynnika V, VII, X oraz fibrynogenu. Pozostałe czynniki krzepnięcia oraz liczba płytek nie wpływają na wartość PT. W praktyce klinicznej obserwuje się zarówno skrócony jak i wydłużony PT. Skrócenie PT występuje przede wszystkim w: zakrzepicy; nadkrzepliwości. Wydłużenie PT obserwuje się przy: wrodzonym niedoborze czynnika/czynników krzepnięcia II, V, VII, X; niedoborach witaminy K (przykładowo karmienie pozajelitowe, biegunki, zaburzenia wchłaniania, cholestaza, kamica pęcherzykowa, antybiotykoterapia); dysfibrynogenemii;

12 w rozsianym wykrzepianiu wewnątrznaczyniowym (DIC); przewlekłych chorobach miąższu wątroby; obecności inhibitorów krzepnięcia (przykładowo heparyna, FDP, D-dimery, krążące antykoagulanty u chorych z toczniem rumieniowatym); w przebiegu niektórych chorób: białaczek, mocznicy, choroby Addisona- Biermera; podczas leczenia salicylanami Oznaczenie PT wykonuje się w osoczu cytrynianowym, dodając preparat tromboplastyny tkankowej i po inkubacji mierząc czas od dodania jonów wapnia do skrzepnięcia próbki. W zależności od aktywności tromboplastyny użytej do badania wartości prawidłowe PT wahają się w granicach od 11 do 15 sekund. W związku z rozbieżnościami w wynikach PT, doprowadzono do standaryzacji tromboplastyny tkankowej. Word Heath Organization uznała serię ludzkiej mózgowej tromboplastyny (67/40) za pierwotny międzynarodowy preparat referencyjny (ang. International Reference Preparation, IRP) w 1977 roku. Po kalibracji nadano IRP współczynnik ISI = 1,0 (ang. International Sensitivity Index). Od tej pory wszystkie odczynniki z tromboplastyną kalibrowane są w odniesieniu do IRP lub do wtórnych materiałów referencyjnych [1, 2, 4]. Najczęściej czas protrombinowy wyraża się pod postaciąwskaźnika protrombinowego, współczynnika protrombinowego (R) lub międzynarodowego współczynnika znormalizowanego (INR). Wskaźnik protrombinowy [%] = PT referencyjny*/pt pacjenta x 100 Współczynnik protrombinowy = PT pacjent/pt referencyjny* INR = R podniesiony do potęgi ISI *PT referencyjny jest wartością charakterystyczną dla danego laboratorium i powinien zostać uzyskany dla mieszaniny osoczy prawidłowych Wartości prawidłowe wskaźnika protrombinowego mieszczą się w granicy od 80 do 120% (zakres terapeutyczny od 30 do 50%), współczynnika protrombinowego od 0,8 do 1,2, a INR od 0,9 do 1,3 (zakres terapeutyczny od 2 do 4,5). INR zależy od czułości zastosowanej tromboplastyny (ISI). Zakresy terapeutyczne INR mogą różnić się w zależności od wieku i stanu

13 klinicznego. Stosunkowo częstą nieprawidłowością wczesnej ciąży jest wystąpienie ciąży bezzarodkowej Według brytyjskiego Towarzystwa Hematologicznego zakres INR od 2,0 do 2,5 stosuje się w zapobieganiu zakrzepicy żył głębokich po zabiegach operacyjnych, zakres od 2,0 do 3,0 w leczeniu zakrzepicy żył głębokich, zatorze tętnicy płucnej oraz stanach niedokrwiennych mózgu, zakres od 3,0 do 4,5 w nawrotach zakrzepicy żylnej i zatoru tętnicy płucnej, zawale serca, chorobach naczyń tętniczych oraz niektórych stanach po zabiegach kardiochirurgicznych. Utrzymanie INR na poziomie od 2,0 do 3,0 jest tak samo skuteczne jak INR powyżej 4,0, ale ryzyko wystąpienia powikłań krwotocznych jest znacznie mniejsze [1, 2, 5]. Wartości PT i INR różnią się w zależności od wieku pacjenta. Według ekspertyzy przeprowadzonej przez Royal Children s Hospital w Australii na potrzeby Diagnostica Stago, ustalono następujące zakresy referencyjne PT oraz INR u dzieci (STA-Neoplastine CI Plus; sec)przedstawioe w tabeli 1. Tabela 1. Zakresy referencyjne INR i PT u dzieci [3]. Badania przeprowadzono na grupie ponad 50 pacjentów obu płci. Podczas interpretacji wyników PT należy pamiętać, że: prawidłowy PT nie wyklucza klinicznie istotnych koagulopatii takich jak hemofilia A, B i C; przy wykrywaniu LA (ang. lupus coagulants) można wykorzystać PT jako

14 skrining. Test jest jednak mało czuły ze względu na dużą zawartość fosfolipidów, które neutralizują przeciwciała antyfosfolipidowe; PT jest podstawą dla testów 1-stopniowych służących ocenie aktywności czynników krzepnięcia. Dotyczy to głównie czynnika II, V, VII oraz X. Test może być jednak mało czuły na niewielkie niedobory niektórych czynników krzepnięcia; wyniki oznaczeń PT różnią się w zalezności od stosowanej aparatury pomiarowej oraz metody oznaczenia, dlatego też zaleca się stosowanie lokalnej kalibracji tromboplastyny; INR nie powinien być używany do oceny ciężkości zaburzeń wątroby, ale do monitorowania leczenia antykoagulantami antagonistami witaminy K [1, 2]. Oznaczenie czasu protrombinowego oraz okreslenie wartości INR nalezy do badań przesiewowych zaburzeń hemostazy. Parametry te znajdują także szerokie zastosowanie w monitorowaniu leczenia doustnymi antykoagulantami. mgr Agnieszka Helis, diagnosta laboratoryjny Piśmiennictwo: 1. Practical-Haemostasis. A practical guide to laboratory haemostasis, Raszeja-Szpecht A., Kabata J. Praktyczne aspekty koagulologii. Grudziądz, 2001; Bio-Ksel. 3. Diagnostica Stago. Reference ranges. 4. Ernst DJ. et al. Procedures for the Collection of Diagnostic Blood Specimens by Venipuncture. NCCLS H3-A6, 2007; 27, Altman R. New oral anticoagulants: are coagulation units still required? Thromb J, 2014; 12, 1: 3.

15 Farmakologia w diagnostyce. Część czwarta parametry azotu pozabiałkowego Istnieje ryzyko ingerencji zażywanych środków farmakologicznych w wyniki oznaczeń biochemicznych krwi pacjenta. Obserwuje się interferencje leków zmieniające wyniki badań kreatyniny, mocznika, azotu mocznika, kwasu moczowego, żelaza, białka całkowitego i wielu innych. Pojawia się zatem potrzeba zdefiniowania rodzaju interferencji i jej faktycznego znaczenia klinicznego.> Kreatynina, mocznik i kwas moczowy są głównymi reprezentantami azotu pozabiałkowego surowicy lub osocza. Kreatynina rola, interferencje farmakologiczne Kreatynina jest związkiem powstałym w wyniku rozpadu fosforanu kreatyny. W surowicy pojawia się głównie jako metabolit przemian w mięśniach szkieletowych. Usuwanie kreatyniny z krwioobiegu odbywa się drogą nerek, stąd też pozostaje ona parametrem pozwalającym ocenić i monitorować stan tego narządu wewnętrznego. Wzrost stężenia we krwi obserwuje się dopiero przy 50% spadku przesączania kłębuszkowego. Dzięki oznaczeniu stężenia kreatyniny możliwe jest określenie klirensu kreatyniny, oceniającego skuteczność filtracji nerkowej (kreatynina we krwi i moczu), oraz współczynnika przesączania kłębuszkowego (ang. Estimated Glomerular Filtration Rate, egfr), traktowanego jako badanie przesiewowe w kierunku uszkodzenia nerek. Poziom kreatyniny we krwi różni się u pacjentów w zależności od masy mięśniowej oraz metody oznaczenia. Prawidłowe stężenie w surowicy waha się w granicach od 53 do 114 mmol/l (0,6

16 do 1,3 mg%). Do oznaczenia omawianego parametru powszechnie wykorzystuje się metodę Jaffe (reakcja kolorymetryczna kreatyniny z alkalicznym pikrynianem mierzona kinetycznie przy określonej długości fali). Niestety interferuje w niej wiele substancji chromogennych takich jak białka, monosacharydy, kwas askorbinowy, kwas moczowy, związki ketonowe, podwyższając wyniki nawet o 15-20%. Fałszywie ujemne wyniki mogą być spowodowane obecnością lipemii, hemolizy i hiperbilirubinemii. Bardziej wiarygodne są metody z użyciem kinazy kreatyninowej lub kreatyninazy. Są to metody enzymatyczne, w których jednak zakres wartości prawidłowych może być nawet o 10% niższy niż standardowo. Ingerencja w poziom kreatyniny może mieć także podłoże farmakologiczne. Zastosowanie wysokich dawek niektórych leków może zwiększać stężenie kreatyniny we krwi. Takie działanie wykazują niektóre leki przeciwzakaźne (gentamycyna, amfoterycyna B), przeciwnowotworowe (gemcytabina, worynostat), immunostymulujące (interferon alfa, aldesleukin), immunosupresyjne (sirolimus, takrolimus), moczopędne (sulfonamidy), witamina D i wiele innych. Mocznik rola, interferencje farmakologiczne Mocznik jest organicznym związkiem chemicznym powstającym w szlaku ornitynowym jako końcowy metabolit przemiany białkowej. Jego ilość w głównej mierze zależy od zawartości białka w pokarmie, rozpadu endogennych białek, a także od czynności wydalniczej nerek. Podobnie jak w przypadku kreatyniny, wzrost stężenia mocznika we krwi obserwuje się dopiero przy zmniejszeniu przesączania kłębuszkowego o 50%. W niektórych stanach można zaobserwować zmniejszenie poziomu mocznika we krwi (niedobory białkowe, podawanie anabolików, ostre uszkodzenia miąższu wątroby). Oddziaływania farmakologiczne są w stanie przyczynić się do zwiększenia stężenia mocznika we krwi. Obserwowano takie działanie w przypadku stosowania leków przeciwzakaźnych(ertapenem), przeciwnowotworowych (plikamycyna) oraz przeciwpierwotniakowych (pentamidyna). Azot mocznika rola, interferencje farmakologiczne W wyniku rozpadu białek w wątrobie powstaje azot (w postaci amoniaku), podlegający dalszym przemianom metabolicznym. W następstwie połączeń z

17 innymi cząsteczkami tworzy się ostateczny produkt rozpadu mocznik, wydalany wraz z moczem. Proces ten odbywa się w sposób ciągły, co powoduje obecność we krwi niewielkiej, stałej ilości azotu mocznikowego (ang. Blood Urea Nitrogen BUN). Zakresy referencyjne BUN różnią się w zależności od metody i badanej populacji. Aby obliczyć azot mocznika należy pomnożyć wartość mocznika (w mg/dl) przez 0,467 [1]. W celu wyznaczenia poziomu azotu mocznikowego stosuje się najczęściej metodę kolorymetryczną z odczynnikiem Nesslera, reakcję Berthelota oraz inne analizy konduktometryczne. Fundamentem powyższych metod jest reakcja: mocznik + H2O + 2H+ ureaza > CO2 + 2NH4+ W metodzie z odczynnikiem Nesslera (zasadowym roztworem tetrajodortęcianu (II) potasu) powstaje żółty związek oznaczany kolorymetrycznie, w reakcji Berthelota natężenie niebieskiej barwy indolofenolu mierzone jest fotometrycznie. Interferencje farmakologiczne wpływające na poziom azotu mocznika w surowicy polegają na ingerencji w metodologię oznaczeń oraz wpływie na funkcję nerek. Obserwuje się podwyższenie/obniżenie poziomu parametru we krwi. Interferencje metodologiczne podwyższające poziom azotu mocznika: metoda z odczynnikiem Nesslera (chloramfenikol, sole amonowe) reakcja Berthelota (asparagina, sole amonowe) Interferencje metodologiczne obniżające poziom azotu mocznika: reakcja Berthelota (chloramfenikol, streptomycyna) Interferencje podwyższające poziom azotu mocznika: nefrotoksyczność (amfoteryczna B, doksycyklina, kolistyna) Leki mogą wywoływać martwicę kanalików nerkowych oraz nefropatie. Niektóre związki farmakologiczne zmieniają metabolizm białkowy: steroidy anaboliczne zwiększają stan równowagi azotu (podnoszą BUN), chemioterapeutyki oraz tetracykliny przyspieszają katabolizm białek (zmniejszają BUN). Kwas moczowy rola, interferencje farmakologiczne W wyniku przemian zasad purynowych powstaje kwas moczowy. Główną drogą wydalania tego związku jest układ moczowy (75%). Pozostała część rozkładana

18 jest przez bakterie jelitowe. Stężenie kwasu moczowego zależy przede wszystkim od płci, endogennej syntezy puryn oraz nerkowego wydalania, a w mniejszym stopniu od zawartości puryn w pokarmach. Zakresy referencyjne wahają się w granicach od 180 do 420 mmol/l (od 3 do 7 mg%), będąc wyższymi u mężczyzn. Metody stosowane do wyznaczenia poziomu kwasu moczowego we krwi oparte są na zdolności redukcji zasadowego ph oraz specyficznej degradacji przez urykazę. Czulą i specyficzną metodą jest oznaczenie enzymatyczne, w którym zasada metody opiera się o reakcje: kwas moczowy + 2H2O + O2 urykaza > allantoina + H2O2 2H2O2 + 4-Aminoantypiryna+ TOOS peroksydaza > chinonoimina + 4H2O Obserwuje się jednak interferencję w przypadku hiperbilirubinemii, silnej lipemii oraz ze strony niektórych leków [2]. Natomiast w metodzie z kwasem fosforowolframowym może dojść do interferencji polegających na redukcji fosforowolfromianu. Uzyskuje się wtedy wyniki fałszywie zawyżone. Interferencje farmakologiczne wpływające na poziom kwasu moczowego w surowicy można podzielić ze względu na ingerencję w metodologię oznaczeń oraz na sposób działania na organizm. Interferencje metodologiczne: metoda SMA/autoanalyzer (epinefryna, lewodopa) metoda z kwasem fosforowolframowym (glukoza, paracetamol) Interferencje farmakologiczne podwyższające poziom kwasu moczowego: hamowanie wydalania nerkowego (acetooctan, kwas acetylosalicylowy) działanie cytotoksyczne (busulfan, prednizon) obniżenie klirensu nerkowego (chlortalidon, prednizon) poprawianie równowagi azotowej (androgeny, steroidy anaboliczne) działanie neurotoksyczne (mitomycyna C) inne (fenytoina, lewodopa) Interferencje farmakologiczne obniżające poziom kwasu moczowego: działanie urykozuryczne (kumaryna, salicylany) obniżenie produkcji kwasu moczowego (allopurynol) inne (kadm, kortykosteroidy)

19 Przy interpretacji wyników stężenia kwasu moczowego we krwi należy wziąć pod uwagę, że niektóre leki takie jak kwas etakrynowy, chlorotiazyd, furosemid i salicylany w niskich dawkach powodują zatrzymanie wydalania kwasu moczowego, natomiast stosowane w wysokich dawkach nasilają jego wydalanie. Leki mogą wpływać na testy laboratoryjne poprzez działanie farmakologiczne in vivo w sposób niezależny od metodologii badań lub bezpośrednio interferując w metodologię analiz in vitro. W związku z powyższym osoby wykonujące badania powinny brać pod uwagę interferencję leków jako potencjalną przyczynę nieuzasadnionych, nieprawidłowych wyników. Stosunkowo częstą nieprawidłowością wczesnej ciąży jest wystąpienie ciąży bezzarodkowej Farmakologia w diagnostyce. Część trzecia transaminazy i

20 bilirubina. Interferencja z reakcją chemiczną to zmiana w wyniku badania wywołana przez pewien składnik nie będący przedmiotem pomiaru, ale obecny w badanej próbce. Wśród endogennych interferencji dominują te wywołane przez hemolizę, hiperbilirubinemię oraz lipemiczność badanej próbki. Interferencje egzogenne powstają głównie w wyniku interakcji z lekami i ich metabolitami. Transaminazy i bilirubina należą do badań pozwalających na wykrywanie zaburzeń funkcjonowania wątroby. Zwiększone stężenie bilirubiny czy podwyższona aktywność aminotransferaz niejednokrotnie mają jednak przyczyny pozawątrobowe. Transaminazy rola, interferencje farmakologiczne Terminem transaminazy określa się dwa enzymy katalizujące przemiany aminokwasów i alfa-oksokwasów poprzez przenoszenie grup aminowych. Należy tutaj aminotransferaza alaninowa (AlAT) oraz aminotransferaza asparaginianowa (AspAT). Obydwie transaminazy występują powszechnie w wielu narządach. AlAT postrzegana jest jako test pierwszej linii diagnostycznej, będąc enzymem wskaźnikowym uszkodzenia hepatocytów. Oznaczenie aktywności AspAT jest mniej czułą i swoistą dla chorób wątroby metodą. W związku z powyższym przydatne jest stosowanie tzw. wskaźnika de Ritisa (AspAT/ALAT). Wartość powyżej 1 jest typowa dla zapaleń wątroby, wartość poniżej 1 obserwuje się, gdy czynnik uszkadzający naruszył strukturę wątrobowych mitochondriów (alkoholowa choroba wątroby, ostre/przewlekłe niedokrwienie, uszkodzenie toksyczne) [1]. Można wyróżnić ingerencje leków w zmiany stężenia transaminaz na drodze wpływu na organizm (in vivo) oraz na oznaczenie biochemiczne (in vitro). Aktywność aminotransferaz w surowicy może być oznaczana za pomocą metod kolorymetrycznych, spektroskopią ultrafioletową lub metodami wykorzystującymi wiązanie barwnika. Ingerencja leków może prowadzić do zakłóceń odczytu w wyniku interferencji z reakcją chemiczną wykorzystaną w analizie. Metody zautomatyzowane, które wykorzystują ultrafiolet są zdecydowanie mniej wrażliwe na interferencje ze strony leków. Tymczasem rzadziej wykorzystywane w praktyce

21 metody z barwnikiem ulegają interferencjom chemicznym ze strony leków takich jak erytromycyna, hydralazyna, kwas askorbinowy, lewodopa, paracetamol i inne. Ingerencja leków w zmiany mierzonego poziomu transaminaz może wynikać także z interferencji metabolicznych. Niektóre leki w wyniku działania hepatotoksycznego i uszkodzenia innych tkanek, zwiększają aktywność transaminaz. Zwiększenie aktywności AspAT i AlAT na drodze mechanizmu farmakologicznego i fizjologicznego może zachodzić na drodze: uaktywnienia enzymu (pirydoksyna) mechanizmu zatrzymania odpływu żółci (acetylocholina, leki cholinergiczne) w wyniku działania środków przeciwbólowych (kodeina, morfina) Leki jako środki chemiczne metabolizowane w wątrobie mogą prowadzić do uszkodzeń komórek wątrobowych. Nasilenie działania toksycznego leków jest różne zależąc od budowy i właściwości chemicznych. Przykładowo fizjologiczne zwiększenie aktywności aminotransferaz następuje pod wpływem działania leków cholinergicznych i leków przeciwbólowych. Związki farmakologiczne mogą wykazywać działanie toksyczne zwiększając poziom transaminaz w surowicy poprzez: uszkodzenie tkanki mięśniowej (barbiturany, karbromal) uszkodzenie hepatocytów (aspiryna, doustne leki antykoncepcyjne) uszkodzenie cholestatyczne (estrogeny, metyldopa) Część leków wykazuje działanie zwiększające aktywność transaminaz w przypadku zastosowania wysokich dawek przykładowo niektóre leki przeciwzakaźne (Tigecyklina, Amfoteryczna B), przeciwnowotworowe (Anastrazol, Asparaginaza), immunostymujące (Interferon alfa, Interferon beta), immunosupresyjne (Alefacept, Takrolimus), immunoglobuliny (Gammunex) i wiele innych. Bilirubina rola, interferencje farmakologiczne Bilirubina jest organicznym związkiem chemicznym powstającym w wyniku rozpadu hemoglobiny. Rozpad hemoprotein i katabolizm pierścienia hemowego odbywa się w komórkach układu siateczkowo-śródbłonkowego (głównie wątroby, śledziony, szpiku kostnego). Hemoglobina rozpada się na globinę, hem i żelazo, następnie w wyniku utleniania wiązania alfa-metylenowego przez oksygenazę hemową, powstaje biliwerdyna. Reduktaza biliwerdyny doprowadza do powstania

22 bilirubiny, która przechodzi do krwioobiegu. Bilirubina wolna nazywana też pośrednią czy niezwiązaną jest nierozpuszczalna w wodzie. Jej transport odbywa się w połączeniu z albuminą. Kompleks ten nie jest przesączany przez kłębuszki nerkowe, ale bilirubina przedostaje się do hepatocytów, z których zostaje wydzielona do żółci wątrobowej w postaci bilirubiny bezpośredniej (związanej z kwasem glukuronowym). Usuwanie bilirubiny z krwioobiegu następuje wieloetapowo poprzez wychwyt z krwioobiegu, przemiany w hepatocytach oraz wydzielanie sprzężonych pochodnych bilirubiny do kanalików żółciowych. Ilość bilirubiny we krwi jest wypadkową zdolności klirensowej wątroby, zdolności komórek wątrobowych do estryfikowania bilirubiny z kwasem glukuronowym lub siarkowym, integralności czynnościowej bieguna żółciowego hepatocytów oraz drożności dróg żółciowych. Istnieje szereg metod służących oznaczeniu bilirubiny we krwi. Opierają się one na reakcji bilirubiny z roztworem dwuazowego kwasu sulfanilowego, skutkiem czego powstaje barwna substancja azopochodna. Metoda Molley-Evelyn stosuje dodatkowo alkohol, a metoda Jendrassik-Grof katalizator, by uniknąć błędnej interpretacji testu w wyniku wiązania bilirubiny z białkami surowicy. Należy także podkreślić możliwą interferencję ze strony lipochromów w metodach spektrofotometrycznych. Czynnikami interferującymi w oznaczenia bilirubiny jest hemoliza (zawyża poziom bilirubiny), ekspozycja na światło słoneczne (rozkład bilirubiny, a tym samym spadek jej stężenia), niektóre leki (uzyskanie wyników fałszywie zawyżonych powodu wystąpienia precypitacji w reakcji z odczynnikiem diazo przykładowo tyrozyna, histydyna, ryfampicyna). Interferencje farmakologiczne wpływające na poziom bilirubiny w surowicy można podzielić ze względu na ingerencje w metodologię oznaczeń oraz poprzez zmiany w metabolizmie związku. Obserwuje się podwyższenie/obniżenie poziomu bilirubiny we krwi. Interferencje metodologiczne podwyższające poziom bilirubiny: metoda SMA 12/60 (epinefryna, kwas askorbinowy) metody spektrofotometryczne (lipemia) metoda Evelyn-Malloy (dekstran, nowobiocyna) reakcja z odczynnikiem diazo (histydyna, rifampicyna)

23 Interferencje metodologiczne obniżające poziom bilirubiny: obecność hemoglobiny, światła, pindolol Leki mogą interferować w metabolizm bilirubiny na każdym etapie począwszy od momentu jej powstawania z hemoglobiny aż po proces wydalania z organizmu. Część leków może w wyniku swojego działania podnosić stężenie bilirubiny, przykładowo niektóre leki przeciwzakaźne (Tigecyklina, Ryfampicyna), przeciwnowotworowe (Imatynib, Asparaginaza), immunostymujące (Interferon alfa, Sargramostym), immunosupresyjne (Takrolimus) i inne. Niektóre środki farmakologiczne podwyższają wynik pomiaru bilirubiny poprzez swoje działanie hepatotoksyczne. Należy tu między innymi amfoteryczna B, etanol, gentamycyna, kumaryna i nitrofurany. W innych przypadkach mechanizm zwiększający poziom bilirubiny może wiązać się z wywoływaniem żółtaczki cholestatycznej. W ten sposób mogą działać estrogeny, doustne leki antykoncepcyjne, erytromycyna czy kwas aminosalicylowy. Mechanizmów prowadzących do wzrostu poziomu bilirubiny we krwi jest wiele. Sulfonamidy i salicylany mogą podnosić poziom bilirubiny na drodze współzawodnictwa z niekoniugowaną bilirubiną o miejsce wiązania z albuminą. Z kolei nowobiocyna hamuje transferazę glukuronową. Obserwuje się także zjawisko zwiększenia stężenia bilirubiny w wyniku hemolizy i anemii hemolitycznej (cefalotyna, leki przeciwmalaryczne,nitrofurany) lub w wyniku hemolizy wywołanej niedoborem dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej (furazolidon, sulfacetamid, antypiryna). Transaminazy i bilirubina nie są jedynymi wskaźnikami dysfunkcji wątroby. Często pojawia się konieczność poszerzenia panelu diagnostycznego o fosfatazę alkaliczną, GGTP, albuminy, czas protrombinowy, przeciwciała anty-hcv i wiele innych. W każdym z tych przypadków może dojść do zafałszowania wyników badań na drodze interakcji farmakologicznej o różnym mechanizmie działania. Opracowano na podstawie: Mrozikiewicz P. M. et. al., Wpływ leków na wyniki badań laboratoryjnych. Fundacja Wiener Lab. 2009,

24 Stosunkowo częstą nieprawidłowością wczesnej ciąży jest wystąpienie ciąży bezzarodkowej Farmakologia w diagnostyce. Część druga wapń i magnez Prawidłowe przeprowadzenie badań laboratoryjnych jest zadaniem trudnym, zależnym w dużym stopniu od czynników endogennych (wiek, płeć), ale i egzogennych. Te ostatnie, związane ze sposobem pobierania materiału do badań, transportem próbki, jej przechowywaniem oraz walidacją metod badawczych, wydają się mieć kluczowe znaczenie. Klinicysta i diagnosta mają jednak przed sobą jeszcze jedno istotne zadanie: uwzględnić wpływ czynników fizjologicznych, metabolicznych i środowiskowych. Gwałtowny wzrost liczby dostępnych i stosowanych leków nastręcza problemy diagnostyczne i kliniczne. Stosowane środki farmakologiczne są związkami chemicznymi, mogącymi w sposób wieloaspektowy interferować na wyniki badań laboratoryjnych.

25 Wapń rola, interferencje farmakologiczne Wapń jest niezwykle istotnym pierwiastkiem dla naszego organizmu. Około 99,85% wapnia znajduje się w kościach, 0,05% występuje w postaci zjonizowanej w płynie pozakomórkowym. Standardowo kojarzony z układem mięśniowokostnym, odgrywa szereg innych funkcji. Wapń jest aktywatorem enzymatycznym, bierze udział w przewodzeniu impulsów bioelektrycznych, w krzepnięciu krwi, skurczu mięśni szkieletowych, gładkich i mięśnia sercowego, reakcjach zapalenia, regeneracji i proliferacji komórkowej, pojawia się przy wydzielaniu hormonów i neurotransmiterów, a także obniża stopień uwodnienia koloidów komórkowych. Jego funkcje można by mnożyć. Na homeostazę wapnia wpływa między innymi parathormon, kalcytonina oraz 1,25-dihydroksycholekalcyferol. Regulacja poziomu wapnia następuje poprzez dostarczanie pierwiastka w pożywieniu, zależy także od stopnia wchłaniania w przewodzie pokarmowym oraz stopnia wydalania z moczem. Prawidłowe stężenie wapnia w osoczu waha się w granicach 2,25 2,75 mmol/l (9-11 mg/dl). Wśród stosowanych metod oznaczeń wapnia należy wymienić miareczkowanie oksydoredukcyjne z użyciem nadmanganianiu potasu, miareczkowanie z użyciem EDTA, emisyjna spektroskopię płomieniową, pomiar fluorymetryczny oraz absorpcyjną spektroskopię atomową. Metody kolorymetryczne, często wykorzystujące zjawisko chelatacji wapnia przez EDTA, często powodują trudności w określeniu punktu końcowego z powodu zakłóceń przez obecność jonów miedzi, magnezu, żelaza i cynku. Zastosowanie metody fluorometrycznej z użyciem kalceiny jest dosyć popularna techniką, jednakże określenie punktu końcowego może nastręczać trudności. Możliwa jest w tym przypadku interferencja ze strony leków wykazujących fluorescencję. Najpowszechniej wykorzystywane są metody automatyczne, w których wapń jest kompleksowany przez komplekson krezoloftaleiny, który z kolei reagując z dietyloaminą tworzy barwny produkt. Wykazano jednak, że istnieja środki farmakologiczne interferujące z ta metodą aminofenol i hydralazyna podwyższają faktyczny oziom wapnia o 0,3 0,6 mg/100ml. Spektrofotometria adsorpcyjna, obecnie najbardziej czuła i szybka metoda oznaczenia wapnia wydaje się być wolna od interferencji. Interferencje farmakologiczne wpływające na poziom wapnia można podzielić ze względu na ingerencje w metodologię oznaczeń oraz poprzez zmiany metabolizmie pierwiastka. Obserwuje się podwyższenie/obniżenie poziomu wapnia we krwi.

26 Interferencje metodologiczne podwyższające poziom wapnia: miareczkowanie z użyciem EDTA (miedź, sole żelaza) emisyjna spektroskopia płomieniowa (potas, sód) metoda z kompleksonem krezoloftaleiny (aminofenol, hydralazyna) Interferencje metodologiczne obniżające poziom wapnia: miareczkowanie z użyciem EDTA (heparyna, cytrynian) emisyjna spektroskopia płomieniowa (fosforany, siarczany) metoda z pomiarem fluorometrycznym (heparyna, kwas acetylosalicylowy) Interferencje w metabolizm wapnia podwyższające poziom wapnia: adsorpcja z przewodu pokarmowego (laktoza, witamina D) resorpcja z kości (parathormon, tyroksyna) wchłanianie zwrotne w kanalikach nerkowych (parathormon, witamina D) Interferencje w metabolizm wapnia obniżające poziom wapnia: absorpcja z przewodu pokarmowego (leki przeczyszczające, kortykosteroidy) resorpcja z kości (kalcytonina, kortykosteroidy) wchłanianie zwrotne w kanalikach nerkowych (acetazolamid, kortykosteroidy) antagonizm hormonalny (kortykosteroidy, leki hamowanie syntezy albumin (asparaginaza, doustne środki antykoncepcyjne) Magnez rola, interferencje farmakologiczne Magnez jest jednym z podstawowych kationów niezbędnych do zachowania równowagi pomiędzy poszczególnymi fizjologicznymi procesami w organizmie. Ponad połowa magnezu umiejscowiona jest w kościach, pozostała część znajduje się w tkankach miękkich. Prawidłowe stężenie magnezu w surowicy waha się w granicy od 0,75 mmol/l do 0,95 mmol/l w zależności od stosowanej metody i aparatury pomiarowej. Rola magnezu została omówiona szczegółowo w artykułach Tajemnica magnezu (część pierwsza) oraz Tajemnica magnezu (część druga). Wśród przyczyn obniżonego poziomu magnezu w osoczu, związanych z zażywaniem leków można wymienić: stosowanie diuretyków: diuretyki pętlowe(furosemid) oraz tiazydowe (hydrochlorotiazyd) mogą znacząco obniżać zawartość magnezu w osoczu, dlatego też przy ich stosowaniu niezbędna jest suplementacja magnezu terapia przeciwnowotworowa: cisplatyna w 90% przypadków wywołuje hipomagnezemię. Mechanizm działania leku wynika z jego właściwości

27 neurotoksycznych. Uszkadza on mechanizmy związanych z readsorpcją magnezu z pętli Henlego sole wapnia mineralokortykosteroidy hormony tarczycy hormon antydiuretyczny gentamycyna, tetracyklina Czasami dochodzi do interakcji zwiększających mierzony poziom magnezu. Mamy z nimi do czynienia podczas podawania lub zażywania soli magnezu oraz środków zobojętniających zabierających magnez. Niezaprzeczalnie metody oznaczeń wapnia i magnezu nie są idealne. Istnieje szereg związków mogących potencjalnie wywoływać interferencje i fałszować uzyskane rezultaty. Świadomość pojawienia się takiej możliwości jest dobrym kierunkiem uniknięcia błędów. Opracowano na podstawie: Mrozikiewicz P. M. et. al. Wpływ leków na wyniki badań laboratoryjnych. Fundacja Wiener Lab 2009, s Stosunkowo częstą nieprawidłowością wczesnej ciąży jest wystąpienie ciąży bezzarodkowej

28 Farmakologia w diagnostyce. Część pierwsza glukoza, elektrolity Środki farmakologiczne są coraz bardziej znaczącą częścią naszego życia. Według raportu Głównego Urzędu Statystycznego konsumpcja leków w Polsce stale rośnie. Jesienią roku 2009 niemalże 71% społeczeństwa zażywało leki, podczas gdy 5 lat temu było to 54% ludności. Wzrasta praktykowanie samoleczenia. Kobiety o wiele częściej niż mężczyźni stosują zarówno leki na receptę jak i te dostępne bez konieczności wizyty u lekarza. Określenie poziomu hormonów, białek i innych parametrów w płynach ustrojowych wiąże się z zajściem szeregu reakcji chemicznych, często katalizowanych przez inne związki chemiczne. Produkty metabolizmu leków mogą interferować w oznaczenia chemiczne i fałszować wyniki badań krwi i moczu. Leki interferują w szereg oznaczeń diagnostycznych. Wśród nich należy wymienić określenie poziomu parametrów takich jak glukoza, elektrolity, wapń, magnez, żelazo, transaminazy, bilirubina, kreatynina, mocznik, azot mocznika oraz białko całkowite. Glukoza rola, interferencje farmakologiczne Glukoza stanowi podstawowy związek energetyczny dla większości organizmów. Homeostaza jej metabolizmu zależy od wielu czynników. Należy do nich przede wszystkim jelitowa absorpcja glukozy, glukoneogeneza i glikogenoliza, mięśniowy wychwyt glukozy, wydzielanie insuliny przez komórki β wysp trzustkowych a także działanie hormonów diabetogennych takich jak kortyzol czy hormony tarczycy.wartości prawidłowe glukozy we krwi wahają się w granicach 3,3 5,5 mmol/l ( mg/dl) w zależności od stosowanej metody i grupy wiekowej. Powyżej 6,7 7,5 mmol/ l ( mg/dl) mówimy już o hiperglikemii. Przyczynami zwiększonego stężenia glukozy we krwi może być cukrzyca, akromegalia, choroba Cushinga, wylewy, urazy, wstrząs. Lek może interferować na etapie pomiaru glukozy we krwi lub zmieniać jej metabolizm i wydalanie. Metody enzymatyczne pomiaru glukozy są wysoce

29 specyficzne i nie ulegają wpływom leków. Leki mogą zawyżać poziom glukozy przy stosowaniu metod nieenzymatycznych. Obserwowano ingerencje środków farmakologicznych w oznaczenia metodą z redukcją żelaza (hydralazyna, lewodopa, kwas askorbinowy, mannoza, paracetamol, oksazepam, ryboza), metodą z żelazocyjankiem (ksyloza, kwas askorbinowy, lewodopa. mannoza, ryboza) oraz metodą z o-toluidyną (dekstran, ksyloza, mannoza, oksazepam). Elektrolity rola, interferencje farmakologiczne Zachowanie równowagi wodno-elektrolitowej organizmu jest niezwykle ważne. Jej zachwianie często niesie ze sobą poważne konsekwencje. Dlatego też pomiar elektrolitów powinien być precyzyjny w wysokim stopniu. Najważniejszym wewnątrzkomórkowym elektrolitem jest potas. Wartości prawidłowe mieszczą się w zakresie 3,8 do 5,0 mmol/l. Powyżej 5,5 mmol/l obserwujemy już hiperkaliemię, przy czym w zależności od uzyskanej wartości możemy mówić o hiperkaliemii łagodnej, umiarkowanej i ciężkiej. W medycynie pojawia się także pojęcie pseudohiperkaliemii. Mówimy o niej wówczas, gdy doszło do hemolizy próbki, zanieczyszczeń płynem infuzyjnym wiążącym potas czy przy obecności EDTA. Na wynik potasu w osoczu wpływa także trombocytoza > /l i leukocytoza > /l. Brak jest istotnych chemicznych i fizycznych interferencji leku ze standardowymi metodami wykorzystywanymi do oznaczania elektrolitów. Potencjalne interferencje wynikają z aktywności farmakologicznej wielu klas leków na funkcjonowanie nerek. Szczególne znaczenie uzyskują tu diuretyki, które zmieniają równowagę wodno-elektrolitową. Przykładowo mannitol i mocznik jako związki o działaniu hipertonicznym nasilają przepływ wody do kanalików nerkowych. Tymczasem chlorek amonu wywołuje swoistego typu kwasicę, zwiększając poziom jonu amonowego i utratę chlorku, wody oraz sodu. Furosemid hamując ATP-azę w pętli Henlego, w części proksymalnej i dystalnej kanalika nerkowego, obniża resorpcję zwrotną sodu. Inhibitory anhydrazy węglanowej zapobiegają zwrotnemu wchłanianiu sodu poprzez hamowanie anhydrozy węglanowej. W tym przypadku ilość dostępnego dikarbonianu do jego wymiany jest ograniczona. Działanie diuretyków rtęciowych polega natomiast na hamowaniu zwrotnego wchłaniania sodu dzięki blokowaniu w kanaliku proksymalnym i pętli Henlego enzymów z grupą sulfhydrylową.

30 Interferencje farmakologiczne wpływające na poziom sodu, potasu i chlorku w surowicy można podzielić ze względu na podwyższenie/obniżenie ich poziomu oraz mechanizm działania. Podwyższenie poziomu sodu: zatrzymanie soli lub wody (androgeny, doustne środki antykoncepcyjne, glikokortykosteroidy); działanie na kanaliki nerkowe (klonidyna, metoksyfluran, tetracyklina); wpływ mineralokortykosteroidów (kortyzon, steroidy anaboliczne). Obniżenie poziomu sodu: działanie diuretyczne (furosemid, mocznik, tiazydy); zatrzymanie wody (sulfonylomocznik, wazopresyna); inne mechanizmy (chlorek amonu, chlortalidon, dichlorfenamid). Podwyższenie poziomu potasu: toksyczne działanie na nerki (amfoteryczna B, metacylina, tetracyklina); działanie na kanaliki nerkowe (spironolakton); inne mechanizmy (izoniazyd, fenformina). Obniżenie poziomu potasu: działanie diuretyczne (furosemid, klopamid, kwas acetylosalicylowy); wzrost wydalania nerkowego (hydrokortyzon, kortykosteroidy, kwas amino salicylowy); inne mechanizmy (aldosteron, mocznik, chlorek amonu). Podwyższenie poziomu chlorku: zatrzymanie soli lub wody (androgeny, estrogeny, kortykosteroidy); alkaloza, często przy wydłużonej terapii (chlortiazyd, hydrochlortiazyd). Obniżenie poziomu chlorku: działanie diuretyczne (furosemid, politiazyd, tiazydy); alkaloza (aldosteron, bikarbonaty, kortyzon). Rozwój technologii i medycyny zmniejsza możliwość wystąpienia interferencji w oznaczenia biochemiczne. Ciągle jednak powstają nowe środki farmakologiczne, których działanie na oznaczenia tak podstawowych parametrów biochemicznych jak elektrolity i glukoza nie zostało jeszcze dostatecznie poznane.

31 Opracowano na podstawie: Mrozikiewicz P. M. et. al. Wpływ leków na wyniki badań laboratoryjnych. Fundacja Wiener Lab 2009, s Stosunkowo częstą nieprawidłowością wczesnej ciąży jest wystąpienie ciąży bezzarodkowej Histogramy morfologii krwi w praktyce Morfologia krwi obwodowej jest podstawowym badaniem diagnostycznym i obejmuje ilościową oraz jakościową ocenę elementów morfotycznych obecnych we krwi. Badanie wykonuje się w pełnej krwi pobranej na antykoagulant (K2EDTA lub K3EDTA). Do przesiewowego badania morfologii służą analizatory hematologiczne różnicujące krwinki białe na trzy populacje (tzw. 3-diff) oraz pozwalające na rozdział elementów morfotycznych na płytki krwi, erytrocyty i leukocyty. Podstawową techniką, na której opiera się działanie aparatów 3-diff

32 jest impedancja (konduktometria). Wykorzystuje ona różnice oporności krwinek, które przechodząc przez szczelinę pomiarową powodują zmianę oporu elektrycznego między elektrodami. Rozdział krwinek jest przeprowadzany przy pomocy ruchomych progów dyskryminacyjnych analizatora, które rozdzielają je na poszczególne populacje. Ilość i wielkość generowanych impulsów jest proporcjonalna do liczby i objętości komórek [1,4,5]. Histogram jest to graficzna wizualizacja rozkładu zależności między wielkością poszczególnych komórek (w femtolitrach), a ich liczbą. Na histogramie (krzywej dystrybucji) oś X odpowiada objętości komórki wzrastając od lewej do prawej, a oś Y odpowiada liczbie komórek. Prawidłowy histogram powinien leżeć między dwoma dyskryminatorami oraz zaczynać się i kończyć na linii podstawy [5]. Pomimo stale rozwijających się technik pomiarowych stosowanych do oznaczania morfologii krwi istnieje wiele potencjalnych czynników, powodujących zafałszowanie wyniku badania, takich jak obecność agregatów płytkowych w probówce (np. zimne aglutyniny, pseudotrombocytopenia EDTA-zależna, skrzep), obecność płytek olbrzymich, czy niezhemolizowanych erytrocytów [1,3]. Poniżej opisano najważniejsze informacje przydatne w analizie histogramów, a także przykłady najczęstszych nieprawidłowości w ich przebiegu [1,3]. Histogram płytek krwi (PLT): Płytki krwi mają średnią wielkość 8-12 fl i są liczone w komorze pomiarowej między 2 a 30 fl. Za ich prawidłowe zliczanie odpowiadają trzy dyskryminatory stały znajdujący się na 12 fl oraz dyskryminatory płynne dolny umieszczony między 2 a 6 fl (tzw. PL) i górny między 12 a 30 fl (tzw. PU) [4]. Ryc. 1 Prawidłowy histogram PLT z

33 dyskryminatorami [4] Parametry ułatwiające interpretację histogramów płytek: P-LCR (ang. ratio of large PLT) udział dużych PLT, dla których wartość dyskryminatora to 12 fl lub więcej. Wartość otrzymujemy przez podzielenie liczby płytek między stałym i górnym dyskryminatorem przez całkowitą liczbę trombocytów między dolnym i górnym dyskryminatorem. Zakres referencyjny: % [4]. PDW (ang. PLT distribution width) rozpiętość dystrybucji PLT na wysokości 20% wysokości krzywej przy założeniu, że wysokość histogramu wynosi 100%. Histogram prawidłowej krwi przecina prostą na wysokości 20% dwa razy. Zakres referencyjny: 9-14 fl. MPV (ang. mean PLT volume) średnia objętość PLT. Zakres referencyjny: 8-10 fl. Jeśli występuje jakaś nieprawidłowość w rozpiętości krzywej dystrybucji na histogramie, to obliczenie jednego lub kilku wskaźników PLT może być niemożliwe [4,5]. Nieprawidłowości w histogramach PLT: NIEPRAWIDŁOWA WYSOKOŚĆ PRZY DOLNYM DYSKRYMINATORZE (PL): Krzywa nie zaczyna się od linii podstawy, co może być spowodowane obecnością w pobranej próbce krwi fragmentocytów, pęcherzyków powietrza, bakterii, cząsteczek kurzu oraz wysokim tłem pomiaru. NIEPRAWIDŁOWA WYSOKOŚĆ PRZY GÓRNYM DYSKRYMINATORZE (PU): Krzywa nie kończy się na linii podstawy, co może być spowodowane obecnością w próbce krwi agregatów PLT, dużych płytek, mikroerytrocytów (RBC mniejsze od 25 fl) [7].

34 Ryc. 2 Krzywa nie kończy się na linii podstawy błąd w górnym dyskryminatorze PU [4] KILKA SZCZYTÓW NA HISTOGRAMIE PLT: Obecność kilku populacji komórek (ang. multi peaks) może występować po transfuzji koncentratu płytek lub może być spowodowana obecnością agregatów płytkowych. BŁĄD W ANALIZIE ROZPIĘTOŚCI DYSTRYBUCJI: PDW nie może być zmierzona ponieważ histogram nie przecina dwa razy linii na poziomie 20%, co zazwyczaj związane jest z obecnością agregatów płytkowych [7]. Histogram erytrocytów (RBC): Erytrocyty mają średnią wielkość fl, a liczone są od fl. Rozkład wielkości RBC jest ustalany między dwoma płynnymi dyskryminatorami dolnym (RL) ustawiony między 25 a 75 fl oraz górnym (RU) znajdującym się między 200 a 250 fl [5]. Parametry ułatwiające interpretację histogramów RBC: RDW-SD (ang. standard deviation of RBC distribution width, odchylenie standardowe) rozpiętość rozkładu mierzona na wysokości 20% histogramu, przy założeniu, że wysokość maksymalna to 100%. Histogram prawidłowej krwi przecina prostą na wysokości 20% dwa razy. Zakres referencyjny: fl (istotne klinicznie > 60 fl). RDW-CV (ang. coefficient variation of RBC distribution width, rozpiętość dystrybucji) oblicza się na podstawie punktów L 1 i L 2 określanych dla 68,26%

35 powierzchni wokół wartości średniej (MCV). Zakres referencyjny: 11-16% [2,5]. Ryc. 3 Mikrocytoza krzywa przesunięta w lewo, obniżone RDW i MCV [2] Ryc. 4 Anemia Megaloblastyczna wysokie RDW oraz znaczny wzorst MVC [2] Nieprawidłowości w histogramach RBC: NIEPRAWIDŁOWA WYSOKOŚĆ PRZY DOLNYM DYSKRYMINATORZE (RL): Krzywa nie zaczyna się od linii podstawy, co spowodowane jest obecnością mikroerytrocytów (np. eliptocytów, mikrosferocytów), fragmentocytów, dużych płytek oraz agregatów płytkowych. NIEPRAWIDŁOWA WYSOKOŚĆ PRZY GÓRNYM DYSKRYMINATORZE (RU): Krzywa nie kończy się na linii podstawy, co może wynikać z obecności dużych erytrocytów (makrocytów), erytroblastów oraz zimnych aglutynin. Wszystkie wyniki o nieprawidłowej wysokości RL i RU powinny być sprawdzone innymi metodami.

36 KILKA SZCZYTÓW NA HISTOGRAMIE RBC (MP): Obecność kilku populacji erytrocytów (multiple peaks) najczęściej spotykana w anemii z niedoboru żelaza, po transfuzjach oraz niektórych infekcjach i krwawieniu z dróg pokarmowych [2,5]. BŁĄD W ANALIZIE ROZPIĘTOŚCI DYSTRYBUCJI (DW): Rozpiętość dystrybucji nie może być zmierzona ponieważ histogram nie przecina krzywej rozkładu dwa razy na poziomie 20%. Spowodowana najczęściej przez różnorodność kształtów i rozmiarów erytrocytów (anizocytozę i poikilocytozę) [2,7]. Histogramy leukocytów (WBC): W komorze pomiarowe dla WBC erytrocyty są lizowane, a leukocyty kurczą się do pożądanych wielkości, dzięki czemu zachodzi ich podział na trzy populacje (granulocyty, limfocyty i MXD), uwidoczniony na histogramie. Lizat znajdujący się w odczynniku najsilniej obkurcza monocyty, eozynofile i bazofile, które na histogramie prezentowane są jako jedna populacja. Przedstawione na histogramie wielkości leukocytów, nie są więc rzeczywistymi rozmiarami tych komórek [3,5]. Erytrocyty ulegają w komorze pomiarowej lizie, a płytki, których wielkość mieści się zazwyczaj między 8 a 12 fl, są oddzielone od WBC przez dolny dyskryminator. Rozkład wielkości WBC jest ustalany między dwoma dyskryminatorami dolnym (WL), który jest dyskryminatorem płynnym, znajdującym się między 30 a 60 fl oraz górnym (WU) stale ustalonym na poziomie 300 fl. Za prawidłowy rozdział leukocytów odpowiadają dwa dodatkowe dyskryminatory dolny środkowy (T 1 ) oraz górny środkowy (T 2 ). Są to dyskryminatory płynne, automatycznie ustalane między WL i WU, które rozdzielają populację limfocytów i neutrofili [3,5]. Nieprawidłowości w histogramach WBC: NIEPRAWIDŁOWA WYSOKOŚĆ PRZY DOLNYM DYSKRYMINATORZE (WL): Krzywa nie zaczyna się od linii podstawy co może być wywołane obecnością agregatów PLT, erytroblastów, dużych płytek krwi oraz opornością osmotyczna erytrocytów (np. u noworodków) [3].

37 Ryc. 5 Nieprawidłowa liza RBC typowa krzywa opornych osmotycznie erytrocytów [3] NIEPRAWIDŁOWA WYSOKOŚĆ PRZY GÓRNYM DYSKRYMINATORZE (WU): Krzywa nie kończy się na linii podstawy co spowodowane jest zaburzoną liniowością pomiaru, np. wysoką liczbą leukocytów (najczęściej gdy WBC > µl). Taką próbkę należy rozcieńczyć fabrycznym diluentem [3]. Ryc. 6 Krzywa nie zaczyna i nie kończy się na inii podstawy błąd rozdziału WBC [3] NIEPRAWIDŁOWA WARTOŚĆ DYSKRYMINATORA ŚRODKOWEGO GÓRNEGO, DOLNEGO lub OBU JEDNOCZEŚNIE: Brak możliwości precyzyjnego rozdzielenia poszczególnych populacji WBC, co spowodowane jest obecnością blastów lub innych nieprawidłowych form leukocytów. Konieczne jest zweryfikowanie oznaczenia przy pomocy ręcznego rozmazu krwi obwodowej [7].

38 NIEPRAWIDŁOWY ROZDZIAŁ POSZCZEGÓLNYCH POPULACJI WBC: Krzywa przebiega daleko od linii podstawy, a poszczególne frakcje nie są od siebie precyzyjnie oddzielone i mogą się ze sobą mieszać. Natomiast liczba WBC jest prawidłowa o ile krzywa dystrybucji zaczyna się i kończy na linii podstawy. Konieczne jest zweryfikowanie oznaczenia przy pomocy ręcznego rozmazu krwi obwodowej [3,5]. Stosunkowo częstą nieprawidłowością wczesnej ciąży jest wystąpienie ciąży bezzarodkowej Przy ocenie histogramu należy zwrócić uwagę na jego kształt, przebieg krzywej oraz jej rozpiętość. Wynik graficzny należy interpretować w odniesieniu do danych liczbowych morfologii krwi oraz do stanu klinicznego pacjenta. Należy pamiętać, że morfologia uzyskana dzięki rozdziałowi 3-diff jest podstawowym narzędziem diagnostycznym i w wielu przypadkach nie wyklucza konieczności wykonania innych badań, w tym ręcznego rozmazu krwi obwodowej. Piśmiennictwo: 1. Mazur B. Rola analizatorów hematologicznych w różnicowaniu krwinek białych. Przegl Med, 2012; 1: 13: Constantino T. B. The Red Cell Histogram and The Dimorphic Red Cell Population; LabMedicine: 42(2011), WBC Histogram Interpretations of 3-Part Differentation; Sysmex Xtra Online: July 2011: Platelet distribution curves: interpretation, potentials and limitations; Sysmex Xtra Online: June 2011: Ashraf S. Automated Hematology Cell Counters- Impedance. 6. Tatsumi N., Tsuda I., Takubo T. et al. Practical Use of Automated White Cell

39 Differential Analysis. 2002; Osaka CUMS 7. Interpretacja histogramu analizatory hematologiczne SYSMEX seria K ; materiały edukacyjne SYSMEX Corp: Kobe, Japonia Farmakoterapia a badanie ogólne moczu. Interferencje Na pewnym etapie życia leki stanowią nieodzowny element egzystencji wielu osób. Taka jest współczesna rzeczywistość. Nie było tak jednak zawsze. Przeciętna długość życia w czasach starożytnych wynosiła około 20 lat. W XIX wieku wydłużyła się ona do lat. Według European Community Heath Indicators (ECHI, 2012) średnia długość życia w Europie w 2012 roku wynosiła 80 lat. Szczególną długowiecznością cieszyli się mieszkańcy Szwajcarii, dożywając przeciętnie 83 lat. Średnia długość życia Polaków uległa także stopniowemu wydłużeniu, z 71 lat w 1990 roku do 77 lat w 2012 roku. Jednym z głównych czynników wspomagających długowieczność człowieka są leki. Tę hipotezę potwierdzają liczne dowody. Wiele chorób zakaźnych dziesiątkujących ludzkość w przeszłości zostało wyeliminowanych dzięki odkryciu szczepionek. Coraz mniej ludzi umiera na zakażenia bakteryjne dzięki zastosowaniu odpowiednich antybiotyków. Nie u każdej osoby z hipercholesterolemią i nadciśnieniem tętniczym piorunująco rozwija się miażdżyca. Mamy dostęp do środków farmakologicznych, które wspomagają nasze możliwości długiego życia.