WIELKOSC I JAKOSĆ PRÓBY PSZCZÓŁ W BADANIACH TOKSYCZNOSCIPESTCYDÓW

Transkrypt

1 p s Z:C z E L N C Z E ZESZYTY NAUKOWE ROK XX 1979, WELKOSC JAKOSĆ PRÓBY PSZCZÓŁ W BADANACH TOKSYCZNOSCPESTCYDÓW Kazimierz Szczepański nstytut Sadownictwa w Skierniewicach Zofia Gromiszowa Pszczelniczy Zakład Doświadczalny Górna Niwa WPROWADZENE W okresie ostatnich lat dwudziestu powstała bogata literatura na temat badań toksyczności pestycydów dla pszczół. Te jednak badania cechuje duża dowolność metodyczna. Większość z nich była wykonana w warunkach laboratoryjnych i dotyczyła oznaczenia bezpośredniej toksyczności kontaktowej i żołądkowej. Na szczególną uwagę zasługują wieloletnie badania F. B e r a n a (1953,1955) w Szwajcarii, który stosował metody używane wówczas do określania toksyczności pestycydów dla Musca domestica i Drosophilia melonogaster. Przyjął on zasadę stosowania 4 do 5 powtórzeń, po 5 do 10 pszczół w każdym, zależnie od rodzaju badań. W swoich badaniach określił on toksyczność dla pszczół wielu insektycydów, fungicydów i herbicydów (B e r a n 1956). Zasady przyjęte przez Berana są do dziś stosowane w nstytucie Przemysłu Organicznego w Pszczynie, w badaniach toksyczności pestycydów dla pszczół. W wielu jednak przypadkach stwierdzono, że toksyczne działanie pestycydów może zależeć w dużym stopniu od temperatury otoczenia, wieku pszczół i ich rasy. To zobowiązało do prowadzenia badań uwzględniających wyżej wymienione czynniki. Dotąd jednak nie ma w literaturze publikacji traktującej o jakości i wielkości reprezentatywnej próby pszczół w tego rodzaju badaniach pestycydów. Wielkości zaś prób stosowanych przez B e r a n a (1956), na których wzorują się inni badacze wydaje się być zbyt mała w badaniach sprawdzających szkodliwość środków. Ponadto metodyka Berana przewiduje pobieranie pszczół z jednej tylko rodziny. Nie uwzględnia on istnienia wrodzonej i okresowo zmiennej wrażliwości rodzin pszczelich. Brak zaś pracy metodycznej powoduje, że poszczególni badacze stosują różne zasady postępowania. tak więc w badaniach z DDT, Łęski i Smolarzowa (1960) stosowali 3 powtórzenia po 20 pszczół w każdym, pobierając wszystkie próbki z jednej tylko rodziny. Taką samą wielkość 5

2 próbek przyjęła G r o m i s z o w a (1975, 1976a, 1976b) w badaniach szkodliwości pestycydów dla pszczół. Uwzględniła ona jednak wiek pszczół, rasę i rodzinę, pobierając zawsze próbki równolegle z 3 do 5 rodzin pszczelich. N i e m c z u k (1973) pobierał próbki po 50 pszczół z jednej tylko rodziny. Zdaniem zaś H a r a g s i m o w e j (1965) dopiero próbka o wielkości 100 pszczół jest reprezentatywna. Próbki ze 100 pszczołami stosowała także Z a m o r s k a (1967) w swoich badaniach. Zwiększanie wielkości próbek wynika, jak się wydaje, z chęci stworzenia pszczołom w doświadczeniu warunków jak najbardziej zbliżonych do życia gromadnego w rodzinie. Według bowiem G o e t z e i B e s- s l i n g' a (1959) pszczoły trzymane w klateczkach przystępują do budowy plastrów dopiero w próbkach o wielkości co najmniej 50 osobników. W tych warunkach uznano za celowe przeprowadzić badania metodyczne, na temat zasad pobierania reprezentatywnych prób, do oceny toksyczności pestycydów. Celem badań było określenie nie tylko wielkości próby, ale i jakości populacji, z której należy pobierać pszczoły do badań. MATERAŁ METODY Badania wykonano w sezonie pszczelarskim 1977 roku w Puławach. Do badań użyto pszczół rasy krajowej hodowli Oddziału Pszczelnictwa nstytutu Sadownictwa. Badano toksyczność insektycydu Zolone. Doświadczenie wykonano w układzie metody bloków losowych z 12 powtórzeniami, 3 rodziny pszczele X 4 serie (24.V, 30.V, 8.V i 14.V). Badano 4 wielkości próbek, po 10, 15, 20, i 25 pszczół na tle 4 stężeń insektycydu Zolone i czystego syropu (kontrola). Stosowano stężenia 0, /0,0,0500/0,0,075%, 0,1 % Do badań wybrano rodziny pszczele o wyrównanym stopniu rozwoju. Doświadczenie wykonano w klateczkach o wymiarach 13 X 11 X 4,5 cm. Jedną boczną ściankę klateczki stanowiła siatka druciana, drugą - ruchoma płytka szklana, która umożliwiała usuwanie martwych pszczół w czasie prowadzenia obserwacji (ryc. 1). Górna ścianka klateczki miała otwór, przez który wprowadzono pszczoły bez ich usypiania i w którym umieszczano probówkę z pokarmem. Pszczoły pobierały pokarm przez maleńki otworek przepalony w dnie probówki. Do badań pobierano pszczoły bezpośrednio z ula,z pierwszej w gnieździe ramki mającej zapasy miodu. Po wprowadzeniu pszczół do klateczek podano im zaraz czysty syrop cukrowy w stężeniu 1:1. Pszczoły karmiono nim przez 4 godziny, następnie głodzono przez 2 godziny, po czym podano im w nowych probówkach syrop cukrowy skażony insektycydem Zalone. Grupa pszczół kontrolna otrzymała czysty syrop cukrowy. Wszystkie klateczki wstawiono następnie do dwóch cieplarek biologicznych o wyrównanej temperaturze 25 C i 7()1l/0wilgotności względnej. Po 24 godzinach karmienia pszczół syropem skażonym probówki wycofywano, dając na ich miejsce inne, z czystym syropem cukrowym. 6

3 Ryc. 1. Klateczka do przetrzymywania pszczół w czasie doświadczenia Czas obserwacji pszczół wynosił 72 godziny w każdej serii. Pszczoły martwe w klateczkach liczono kolejno po 6, 12, 18, 24, 32, 40, 48 i 72 godzinach, licząc od chwili podania syropu skażonego pestycydem. Pszczoły zaczęły ginąć już w pierwszych godzinach pobierania syropu skażonego. Wycofanie jego po 24 godzinach nie przerwało zaraz. wymierania pszczół. Trwało ono jeszcze przez kilka godzin, w okresie następnych 8 godzin obcerwacji. To zdecydowało, że za miarę toksyczności insektycydu przyjęto liczbę pszczół, jakie padły w okresie 32 godzin, licząc od chwili wstawienia do klateczek probówek z syropem skażonym. Wyniki badań opracowano statystycznie metodą analizy wariancji, a istotność różnic oceniano testem t-duncana. Całą analizę statystyczną wykonano na wartościach przekształconych według transformacji Freeman'a-Tukey'a: twych po 32 godzinach, w przeliczeniu na 10 pszczół w próbie. x = y'n + lu + 1, gdzie n oznacza liczbę pszczół mar- WYNK Wymieranie pszczół w czasie, z powodu szkodliwego działania insektycydu Zolone, przebiegało z taką samą prawidłowością dla wszystkich stężeń i we wszystkich terminach badań. W związku z tym, dynamikę wymierania pszczół (ryc. 2) przedstawiono przykładowo tylko na wynikach dwóch skrajnych stężeń (0,025,% i 0,1010) z drugiego i trzeciego terminu badań (3D.V. i 8.V.). Terminy te wybrano dlatego, że były one sąsiednie a jednocześnie najbardziej różniły się pod względem ilości pszczół martwych. Śmiertelność pszczół określono procentem pszczół martwych, obliczonym łącznie dla trzech rodzin i czterech wielkości próbek (210 pszczół). Śmiertelność pszczół wykazała dużą zmienność we wszystkich terminach pomiarów i to niezależnie od wielkości próbek. Współczynnik zmienności (V'Ofo) dla liczby pszczół padłych w okresie 32 godzin przyjmował wartości około 30 % dla wszystkich czterech wielkości próbek. Bardzo duży wpływ na śmiertelność pszczół miały oba czynniki losowe, rodzina pszczela i termin badania. Obrazują to dane z ryciny 2 i tabela 2. 7

4 %.' ,, r', " ". """,,,,,,,,", " -----', SitT~.-_ Sit T2 "" SiT!> xsot qod.zlnlj Ryc. 2. Procent martwych pszczół po T godzinach. SoT 2 i SoT 3 - kontrola w. drugim (T 2 ) i trzecim (T 3 ) terminie badań. SlT 2 i SlT 3 - stężenie pestycydu 0,025% dla T 2 i T 3 S4T2 i S4T3 - stężenie pestycydu 0,1% dla T 2 i T 3 Tabela 1 Analiza zmienności dla liczby martwych pszcz6ł po 32 godzinach, wykonana na wartościach przekształconych wg transformacji Freeman'a- Tukey'a (pierwiastkowej) Źródło zmienności L. st. swobody Średni kwadrat Fe Rodzina Termin er) et) RxT Wiełkość pr6by ew) Stężenie Nieścisłości Nieścisłości Nieścisłości (S) WxS RxW RxS RxWxS TxW TxS TxWxS ,835 17,757 0,648 3,617 13,079 0,487 0,734 0,686 1,558 0,792 0,692 0,345 1,131 0,678 0,746 78,42*** 27,39*** ,93** 17,82*** 0,66 0,99 2,25* 1,15 0,46 1,52 0,91 Objaśnienie: (* - istotność przy <X ~ 0,05 (U) _ " <X ~ 0,01 (***) - " <X ~ 0,001 Różnice wynikające z wpływu tych czynników były tak duże, jak rozmce powodowane działaniem trującego środka w najwyższym stężeniu. Sposób rozpatrywania wyników i wpływy badanych czynników obrazują dane analizy zmienności (tab. 1). Między innymi wykazują one istotność wpływu wielkości próby i niezależności tego wpływu od stężeń 8

5 środka i od obu czynników losowych rodziny pszczelej i terminu badań (nieistotność wszystkich współdziałań z wielkością próbek). To dowodzi, że różnice wynikające z wpływu wielkości próbek kształtowały się mniej więcej jednakowo we wszystkich przypadkach wymienionych współdziałań. Tabela 2 Liczba pszczół martwych po 32 godzinach, przeciętna dla 4-ech stężeń i 4-echwielkości prób, w odniesieniu do 10 robotnic w próbie ~ Rodzina badań 2l.V 30.V 8.V l4.v Przeciętnie Rl 1,7 1,9 4,1 3,2 2,7b R. 1,9 1,8 4,5 2,3 2,6b R3 0,1 0,2 1,2 0,9 0,6a Przeciętnie 1,2a 1,3a 3,2c 2,2b Objaśnienie: litery a, b, e, odpowiadają wartościom średnim, które istotnie (X = 0,05) różnią się między sobą. Tabela 3 Liczba pszczół martwych po 32 godzinach, przeciętna dla trzech rodzin i czterech stężeń, w odniesieniu do 10 robotnic w próbie (0/ ) /0 Stężenie ~ (szt.) Przeciętnie 0,025 1,4 1,2 0,9 0,9 1,la 0,050 1,7 1,4 1,1 1,1 1,3a 0,075 2,4 2,4 1,5 1,5 1,9b 0,1 3,5 3,5 2,7 2,1 2,9c Przeciętnie 2,2b 2,Ob 1,5a l,.4a Obiaśnicuie: litery a, b, c, odpowiadają wartościom średnim, które istotnie (X = 0,05) różnią się między sobą. o wielkości i znaku tych różnic informują dane tabeli 3. Wykazują one, że w próbach większych była zwykle mniejsza śmiertelność pszczół, niezależnie od stężenia badanego insektycydu. Największa jednak różnica wystąpiła między próbkami pośredniej wielkości, z 15 i 20 pszczołami. Najwyraźniej to widać na wartościach przeciętnych ze wszystkich stężeń. Ze współdziałań między wielkością próbek i stężeniami pestycydu (tab- 1: W X S, W X S X R, W X S X T) wynikają także informacje o reprezentatywności próbek. Ponieważ te współdziałania 'okazały się nieistotne, dowodzi to, że różnice między stężeniami w ilości pszczół martwych były zawsze podobne we wszystkich 'próbkach różnej wielkości. Co więcej, powtarzały się one z taką samą.prawidłowością u wszystkich rodzin

6 i we wszystkich terminach badań. Można zatem przyląc, że wszystkie czter~ wielkości próbek określały różnice między stężeniami w toksyczności środka z jednakową mniej więcej dokładnością. Za równą reprezentatywnością próbek przemawiało także duże podobieństwo zmienności błędu. Licząc ją oddzielnie dla każdej wielkości próbki, uzyskano dla współczynnika zmienności VO/o/ prawie identyczne wartości, około Wbrew oczekiwaniu, ze wzrostem wielkości próbek, od 10 do 25 pszczół, nie malała zmienność błędu (VO/o/ lezona względem średniej śmiertelności pszczół. Wynika stąd, że wszystkim próbkom a wielkości pszczół odpowiada taka sama liczba powtórzeń, jaką należy stosować w badaniach toksyczności pestycydów. Liczbę tych powtórzeń łatwo daje się obliczyć z nierówności Studenta: n ~ 2(t V: d)", gdzie t - tablicowa wartość testu Studenta, V - wartość współczynnika zmienności, d - pożądana dokładność (0/}) oceny różnic między średnimi. Dla orientacji obliczana i zestawiono w tabeli 4 odpowiednie liczby powtórzeń, jakie co najmniej należałoby stosować przy poziomie ufności p = 0,95. Podane w tabeli liczby określają ilość próbek jednakowej wielkości, od 10 do 25 pszczół, jaką należy pobrać łącznie z kilku rodzin i w kilku terminach, aby uzyskać próbę reprezentatywną w badaniach toksyczności pestycydów. OMOWENE WYNKOW W omawianych badaniach istniały trzy źródła zmienności losowej: okresowa wrażliwość pszczół, wrodzona odporność rodzin i zmienność osobnicza wewnątrz rodzin. Ze względu na charakter pracy uznono za celowe pokrótce je omówić.. Śmiertelność pszczół w 3 i 4 terminie była 2-3 razy większa niż w pierwszym i drugim terminie badań. Tak duży i gwałtowny wzrost śmiertelności jest trudny da wyjaśnienia. Mogły to spowodować różne czynniki, jak zwiększona okresowa wrażliwość pszczół, zmiana pożytku w terminie, a także masowo stosowane w tym okresie na polach środki chwastobójcze i insektycydy przeciwko stonce ziemniaczanej. Ewentualność podtrucia pszczół tymi środkami wydaje się być bardzo prawdopodobna. Niezależnie jednak od przyczyn należy przyjąć, że populacje pszczół w ostatnich dwóch terminach badań były kilkakrotnie bardziej wrażliwe niż w dwóch pierwszych terminach. Jedna z rodzin pszczelich wykazywała 'Szczególnie dużą odporność na badany preparat. Śmiertelność jaj pszczół była zawsze 2-3 razy mniejsza niż dwóch pozastałych rodzin. Wydaje się, że ta duża odporność pochodziła przypadkowo z genetycznej odrębności rodziny pszczelej. Oba omówione wyżej czynniki losowe miały ogromny wpływ na śmiertelność pszczół. Jest zatem konieczne, aby w badaniach szkodliwości pestycydów uwzględniać zawsze oba te czynniki, rodziny pszczele 10

7 i terminy. Wydaje się także wskazane, aby terminy badań dobierać w okresach przewidzianego stosowania danych środków w ochronie roślin. Całość zaś badań należałoby prowadzić przynajmniej na 5 rodzinach i w 3-4' terminach. Miarą zmienności wewnątrz rodzin była powtarzalność śmiertelności pszczół w grupach różnej wielkości na tle różnych stężeń insektycydu. Powtarzalność ta okazała się stosunkowo mała i była jednakowa dla wszystkich wielkości próbek. Świadczą o tym podobne wartości współczynnika zmienności, V F::,j 3('/J/o. To wyrównanie zmienności względnej (względem wartości średnich) dowodzi, że przez zwiększenie wielkości próbek od 10 do 25 pszczół, nie osiąga się jeszcze większej powtarzalności (mniejszej zmienności). Prawdopodobnie następuje to dopiero przy próbkach znacznie większych. Śmiertelność pszczół w próbkach małych, po 10 lub 15 pszczół była wyrażnie większa niż w próbkach z 20 lub 25 pszczołami. Pomimo to wszystkie wielkości próbek określały z jednakową precyzją szkodlwe działanie wzrasetających stężeń insektycydu (podobieństwo zmienności VO/o i nieistotność wszystkich współdziałań WXS). Niewiadomo tylko przy której wielkości była najlepiej oceniona prawdziwa szkodliwość badanego środka, jaką miałby on praktycznie przy stosowaniu go w polu. Na to jednak pytanie nie da się odpowiedzieć na podstawie doświadczeń laboratoryjnych. Biorąc bowiem pod uwagę stwierdzenie Goetze i Bessling'a (1959) należy przyjąć, że warunki życia gromadnego pszczół w próbkach wszystkich wielkości daleko odbiegały od warunków normalnego życia rodziny pszczelej i że to na pewno miało jakiś wpływ na śmiertelność pszczół w klateczkach doświadczalnych. Ostatecznie należy przyjąć, że próbki wszystkich wielkości wykazały równorzędną zdolność w określaniu toksyczności insektycydu Zolone. Można też przypuszczać, że tę właściwość miałyby 'one także przy ocenie szkodliwości innych pestycydów. Z omawianej zaś równorzędności próbek wynika, że w badaniach toksyczności pestycydów można stosować próbki małe, nawet z 10 tylko pszczołami, nie tracąc nic na precyzji oceny środka. Można jedynie przypuszczać, że ocena taka będzie nieco zawyżona, ale to tym epiej dla gospodarczej przydatności środjka. Wyniki przeprowadzonych badań można by streścić w następującym wniosku ogólnym. Badania toksyczności pestycydów należy prowadzić na pszczołach kilku rodzin wyrównanych biologicznie i w okresie przewidzianego stosowania badanych pestycydów w ochronie roślin. Jest konieczne, aby prowadzić je na co najmniej 5 rodzinach pszczelich, badanych w 4 seriach (powtórzenia w czasie) w odstępach 5-8 dni. Pszczoły do badań należy pobierać zawsze z pierwszej w gnieździe ramki, mającej zapasy miodu, po 10 pszczół do klateczki. Wystarczy pobierać po jednej próbce (10 pszczół) z rodziny do każdej kombinacji. O wielkości próby (10 X liczba rodzin X liczba serii) decyduje pożądana dokładność (cfj/o) oceny różnic między kombinacjami. Całkowita liczba powtórzeń (próbek) każdej kombinacji powinna być co najmniej taka, jaką podano w tabeli 4. 11

8 Tabela 4 Najmniejsza liczba powtórzeń dla probek wielkości pszczół, w badaniach toksyczności pestycydów; p = 0,95 Dokładność (d%) Liczba powtórzeń Objaśnienie: dla zmienności przyj~o V ~ 30% LTERATURA B e r a n F. (1953) - Ein Beltrag zur Methodik der nsektizid - priifungen. Pflanzenschutzberichte, 11 (9-10) : B e r a n F., Ne u rur e r J. (1955, 1956) - Zur Kenntnis der Wirkung von Pflanzenschutzmitteln auf die Honigbiene (Apis melufica L.). u Mitteilung Pflanzenschutzberichte 15 (7-15) : , 17 (8-12): G o e t z e G., B e ss l i n g B. K. (1959) - Die Wirkung verschidener Fiitterung der Honigbiene auf Wachserzeugung und Baiitatigkeit. Zeitschrift f. Bienenforsch, 4 (10) : G r o m i s z Z. (1975) - Wrażliwość pszczół na działanie preparatu Pirimor. Pszczelo Zesz. Nauk., 19: G r o m i s z Z.,(1976 a) - Obserwacje nad szkodliwością Galecronu EC50 dla pszczół. Pszczelo Zesz. Nauk., 20: G r o m i s z Z., G r o m i s z M. (1976 b) -- Wrażliwość pszczół różnego wieku i roznych ras na szkodliwe działanie Pirimoru i Galecronu EC50. Pszczelo Zesz. Nauk.., 20: H a r a g s i m o v' a L. (1965) - Nekterć metody zjistovani ucinku pesticidu na vcelu medonosnoi, Vedecke prace Vyzkumneho ustavu vcelarskeho v Dole. Ł ęs k i R., S m o l a r z o w a Sto (1960) - Wpływ temperatury na toksyczność DDT dla pszczół Pszczelo Zesz. Nauk., 4 (1) : N i e m c Z.U k R. (1973) - Działanie niektórych herbicydów na pszczoły. Pszczelo Zesz. Nauk., 17: Z a m o r s k a E. (1967) -- Warunki rozwoju i próby zwalczania niektórych j:(rzybów występujących na sztucznie wychowanym czerwiu. Praca Magisterska SGGW-- AR, wykonana pod kierunkiem Prof. dr J. Woyke. BEllHYHHA H KAYECTBO neos nyell B HCCllE.lJ,OBAHHSlX TOKCHYHOCTH necthuh.lj,ob ' K. 1l e n Hb CK"', 3. r p o M '" W o B Pe31OM,e ;lccneaobahm}npobeaeho Ha n4enax OTe4eCTBeHHOH_nopoAb, nomel1\all HX a Kne- T04Kax no 10, 15, 20 '" 25 WTyK. n4enam Aaaan", B caxaphom cxpone "'HceKT"'4"'A Zolone c KOH4eHTpa4"'"MH: 0,0250/0, 0,05%, 0,0758/0~ 0,1 % ; i<ohctat"'pobaho 3Ha4"'TenbHO MeHbwylO cweprxocr), -n4en B' 60nbWHX np06ax He3aB"'C"'MO' OT KOH4eHTpa4"'''' nect"'4haa. OAHKO ace len"'4hhbl np06 nxen npollanlln", OAHHaKollylOcnoc06HOCTb B onpeaenehhh TOKCH4HOCTHYBen"'4HaaO1\MXCA03 necth4ma. 04eHb, 60nbwoe anl1l1,hheha CMepTHOCTb n4en OKa3blBan", CTHX"'HHbleycnoB"'", n4en"'hall CeMbJl H,CpOKHccneAOBaHHH.Onpenerie- H",e crenea«tokch4hoct'" cneayet BeCTH XOT6bl Ha 5 n4en"'hblx'cembllx H B 4 cepasx (nolltopehhjlx110pemehh). 12

9 SZE AND QUALTY OF HONEYBEE WORKER SAMPLES TONS OF PESTCDE TOXCTY N THE NVESTGA- K. S z c z e p a ń s k i, Z. G r o m i s z o w a Summary The sampies of 10, 15, 20, and 25 worker bees Apis mellifica mehifica L. were placed in cages and fed sugar solution with 0,025, 0,050, 0,075 and 0,1% of insecticide Zolone. The mortallity of bees was sigmficanbly smaller in larger sampes, indopendently from the concentration of the inseoticide.. The sarnp1es of all sizes however, showed equall capa city to determi!!le the toxicity of increasing pestioide doses. mportant influence on the mortality of worker bees had the chance factors, the colony and date of the test. The toxicity test of pesticides should be performed using bees from at least 5 colonies in 4 replications durdng the season.