Hodowla tkankowa Zarys historyczny

Transkrypt

1 Hodowla tkankowa Zarys historyczny Andrzej Wójcik Zakład Radiobiologii i Immunologii awojcik@gmx.net

2 Hodowla tkankowa Literatura Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique R. Ian Freschney Hodowla komórek i tkanek Redakcja naukowa: Stanisława Stokłosowa Wydawnictwo Naukowe PWN 2006 Dorota M. Olszewska-Słonina i wsp. HODOWLA KOMÓREK, INŻYNIERIA TKANKOWA I MEDYCYNA REGENERACYJNA. CZĘŚĆ Ii CZĘŚĆ II Wiadomości Lekarskie 2006, LIX, 7 8; 9-10 Dostępne w internecie

3 Hodowle tkankowe hodowle komórkowe Hodowle tkanek ssaczych Hodowle komórek ssaczych Hodowle komórek / tkanek roślinnych Hodowle bakteryjne

4 Hodowle tkankowe kultury tkankowe Kultura (z łac. colere = "uprawa, dbać, pielęgnować, kształcenie") termin wieloznaczny, pochodzący początkowo od łac. cultus agri ("uprawa ziemi"), interpretowany w różny sposób przez przedstawicieli różnych nauk. Kulturę można określić jako ogół wytworów ludzi, zarówno materialnych, jak i niematerialnych: duchowych, symbolicznych (takich jak wzory myślenia i zachowania). Culture (from the Latin cultura stemming from colere, meaning "to cultivate") is difficult to define. For example, in 1952, Alfred Kroeber and Clyde Kluckhohn compiled a list of 164 definitions of "culture" in Culture: A Critical Review of Concepts and Definitions. However, the word "culture" is most commonly used in three basic senses: excellence of taste in the fine arts and humanities an integrated pattern of human knowledge, belief, and behavior that depends upon the capacity for symbolic thought and social learning the set of shared attitudes, values, goals, and practices that characterizes an institution, organization or group. Plant culture = uprawa roślin Soil culture = uprawa ziemi Animal culture = hodowla zwierząt Tissue culture = hodowla tkankowa

5 Pożywka - medium (ang.) tissue culture medium = (pl.) pożywka W języku polskim słowo medium oznacza osobę zdolną do nawiązania kontaktu z zaświatem

6 Historia hodowli tkankowej Robert Koch Hodowle bakterii na szalce Petriego Podłoże: pierwotnie wydzielina z oka krowy później- bulion odżywczy: agar z wodnym wyciągiem mięsnym

7 Historia hodowli tkankowej Peyton Rous ( ) 1916: opracował metodę izolowania komórek z tkanki łącznej przez traktowanie trypsyną Nagroda Nobla w 1966 za badania nad wirusami wywołującymi nowotwory

8 Historia hodowli tkankowej Ross Harrison : hodowla wycinka struny nerwowej kijanki w wiszącej kropli żabiej limfy. Czas obserwacji: kilka dni Ross Harrison. The outgrowth of the nerve fiber as a mode of protoplasmic movement. Journal of Experimental Zoology 9: , 1910.

9 Ross Harrison. The outgrowth of the nerve fiber as a mode of protoplasmic movement. Journal of Experimental Zoology 9: , 1910.

10 Historia hodowli tkankowej Alexis Carrel ( ) chirurg francuski Laureat nagrody Nobla 1912 hodowla tkanki sercowej wyizolowanej z 18-dniowego zarodka kurczaka do Hodowla w osoczu krwi zwierzęcej Scientific Amercian January 1942

11 Alexis Carrel ( ) Carell zakładał, że komórki wyizolowane z organizmu stają się nieśmiertelne Wprowadził technikę mikrokinematografii Wprowadził technikę szwu chirurgicznego naczyń krwionośnych Wielki zwolennik eugeniki Historia hodowli tkankowej Carrel flasks naczynia hodowlane Carrela

12 Historia hodowli tkankowej George Gey ( ) 1933: opracował metodę hodowli tkanek w rotujących próbówkach roller tube technique Zalety metody: dobra wymiana gazowa brak zakrzepów pożywki możliwość zbierania komórek z pożywki CO C New Brunswick Scientific Roller Drums

13 Lata w USA: kampania zwalczania poliomyelitis Zainicjowana przez Franklin D. Roosevelta 1938: The National Foundation for Infantile Paralysis March of Dimes (marsz dziesiątek) March 29, 1954

14 1949: hodowla wirusa polio w komórkach embrionalnych kurczaka hodowanych w rotujących próbówkach Geya. Później: hodowla wirusa w napletkach. Nagroda Nobla 1954 John Enders ( ) Thomas Weller ( ) Frederick Robbins ( )

15 1951: pierwsza stała linia komórkowa HeLa Założona przez George a i Margaretę Gey Wyizolowana z wycinka nowotworu szyjki macicy Henrietty Lacks Komórki HeLa

16 Standaryzacje linii komórkowych i warunków hodowli The Tissue Culture Association (TCA) was founded on November 13, 1946 in Hershey, Pennsylvania and incorporated in the District of Columbia in Initially called the Tissue Culture Commission, the organization s aims were twofold: to prepare media needed by workers in the field and make them available at a reasonable cost and to publish a bibliographic index of tissue culture methods. Early on TCA began offering methods based classes intended to provide training for those working in labs across the country. This education program became so successful that by 1971 the W. Alton Cell Science Center was opened as a permanent home for TCA s educational programs. In addition to the popular Index, the organization published a journal, In Vitro, a newsletter, and a variety of publications related to their educational programs and interests. In 1994 the membership voted to change the name of the organization to the Society for In Vitro Biology. The American Type Culture Collection (ATCC) is a private, not-for-profit biological resource center whose mission focuses on the acquisition, authentication, production, preservation, development and distribution of standard reference microorganisms, cell lines and other materials for research in the life sciences. Established in 1914 and originally incorporated by scientists in 1925 to serve as a worldwide repository and distribution center for cultures of microorganisms, the ATCC has developed into the global leader in research and development expertise for identifying, characterizing, preserving and distributing a wide range of cell lines and microbes.

17 Hodowla pojedynczych komórek pożywka kondycjonowana 1948: Katherine Sanford, Wilton Earle, Gwendolyn Likely z National Cancer Institute (NCI) Hodowla pojedynczych komórek L w kapilarach Odkrycie, że komórki uzdatniają pożywkę pożywka kondycjonowana Komórki L w szklanej kapilarze Komórki L wyrastające z kapilary

18 Hodowla komórek na inaktywowanych komórkach odżwyczych ( feeder cells ) ~1950: Theodore Puck, Philip Marcus Klonowanie komórek w pożywce kondycjonowanej przez komórki feeder Komórki HeLa inaktywowane wysoką dawką promieniowania jonizującego (nie dzielą się) Komórki klonowane (niekoniecznie HeLa) Kondycjonowana pożywka Dzisiejsze pożywki pozwalają na klonowanie większości komórek bez konieczności kondycjonowania pożywki!

19 Test klonogennej przeżywalności komórek - metoda Pucka i Marcusa Test przeżywalności - schemat eksperymentu komórki w hodowli trypsyna 0 Gy 1 Gy 2 Gy 3 Gy rozsianie zawiesina komórek frakcja przeżywalności (SF) inkubacja: 1-2 tygodnie SF = liczba kolonii liczba komórek x PE/100 PE = wydajność klonowania liczba kolonii: wydajność klonowania: frakcja przeżywalności: 70 70% , , ,14

20 Pierwsza krzywa przeżywalności Komórki HeLa napromienione różnymi dawkami promieniowania jonizującego i hodowane na komórkach typu feeder Puck i Markus, 1956

21 Problem zamrażania i rozmrażania żywych komórek Christopher Polge przypadkowo odkrywa, że plemniki kurze przeżwają zamrożenie w obecności 5-10% glicerolu. Późniejsze badania wykazały, że innym dobrym krioprezerwatorem jest dimetylosulfotlenek - DMSO Mechanizmy krioprezerwacji nie są do końca wyjaśnione. Uważa się, że: Glycerol: podczas powolnego zamrażania powoduje odwodnienie komórki co zapobiega tworzeniu kryształów wody. DMSO: podczas powolnego zamrażania chelatuje metale białkowe co przeciwdziała denaturacji białek. Dodatkowo DMSO obniża temperaturę mrożenia co przeciwdziała tworzeniu kryształów lodu. Glycerol Nie przenika przez błonę komórkową DMSO dimetylosulfotlenek Przenika przez błonę komórkową