MARCIN SAMIEC MARIA SKRZYSZOWSKA

Transkrypt

1 ROCZNIKI NAUKOWE ZOOTECHNIKI Monografie i Rozprawy MARCIN SAMIEC MARIA SKRZYSZOWSKA Zastosowanie metod przyżyciowej analizy fluorycytochemicznej do wykrywania symptomów śmierci apoptotycznej w komórkach-dawcach jąder oraz w zarodkach świni uzyskiwanych technikami klonowania somatycznego The use of the methods of intra vitam fluorocytochemical analysis for detection of apoptotic cell death in porcine nuclear donor cells and embryos generated by somatic cell cloning techniques INSTYTUT ZOOTECHNIKI PAŃSTWOWY INSTYTUT BADAWCZY KRAKÓW 2015

2 2 M. Samiec i M. Skrzyszowska Recenzenci monografii: dr hab. Daniel Lipiński, prof. nadzw. UP; Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu, Wydział Rolnictwa i Bioinżynierii, Katedra Biochemii i Biotechnologii, Zakład Diagnostyki Molekularnej dr hab. Wiesława Młodawska; Uniwersytet Rolniczy w Krakowie, Wydział Hodowli i Biologii Zwierząt, Instytut Nauk Weterynaryjnych, Zakład Weterynarii, Rozrodu i Dobrostanu Zwierząt Prezentowana praca uzyskała wsparcie finansowe z Narodowego Centrum Badań i Rozwoju (umowa nr INNOMED/I/17/NCBR/2014) ze środków Programu Operacyjnego Innowacyjna Gospodarka w ramach Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego. Opracowanie redakcyjne mgr Magdalena Bielska mgr Bogusława Krawiec

3 Przyżyciowa analiza apoptozy w komórkach-dawcach jąder i w klonalnych zarodkach świni 3 ROCZNIKI NAUKOWE ZOOTECHNIKI Monografie i Rozprawy INSTYTUT ZOOTECHNIKI PAŃSTWOWY INSTYTUT BADAWCZY 2015 KRAKÓW Nr 53

4 4 M. Samiec i M. Skrzyszowska REDAKCJA Redaktor naczelny dr hab. Dorota Kowalska, prof. IZ PIB Sekretarz redakcji mgr Magdalena Bielska Projekt okładki Beata Barszczewska-Wojda Adres redakcji Instytut Zootechniki Państwowy Instytut Badawczy, ul. Sarego 2, Kraków Copyright by Instytut Zootechniki PIB Druk: Instytut Zootechniki Państwowy Instytut Badawczy, Zespół Wydawnictw i Poligrafii, Balice k. Krakowa. Nakład 100 egz. PL ISNN ISBN

5 Przyżyciowa analiza apoptozy w komórkach-dawcach jąder i w klonalnych zarodkach świni 5 1. WSTĘP 1.1. Dwa oblicza śmierci komórek: aktywna śmierć fizjologiczna (apoptoza) i pasywna śmierć patologiczna (nekroza) Scenariusz śmierci apoptotycznej i nekrotycznej a różnice w komórkowym obrazie morfologicznym i ultrastrukturalnym, podłożu biochemicznym i biofizycznym oraz mechanizmach molekularnych i genetycznych Uruchomienie molekularnego scenariusza apoptozy w komórkach hodowanych in vitro zarodków klonalnych ssaków jest kluczowym elementem mechanizmu regulującego przedimplantacyjną fazę embriogenezy oraz śmiertelność zarodków w stadium blastocysty. W komórkach, które wkroczyły na drogę apoptozy, dochodzi do aktywacji szeregu procesów indukujących charakterystyczne zmiany ultrastrukturalne, morfologiczne i biofizyczne wykrywane metodami z zakresu mikroskopii fluorescencyjnej, cytobiochemii bądź cytometrii przepływowej. Jedną z pierwszych tego typu zmian jest osmotyczne kurczenie się komórek na skutek postępującego odwodnienia (dehydratacji) cytozolu. Proces ten prowadzi do kondensacji cytoplazmy, a także zmiany wielkości i kształtu komórek wskutek zmniejszenia ich objętości oraz stopniowego uwypuklania się/pofałdowania powierzchni plazmolemmy. Podczas apoptozy większość organelli (z wyjątkiem jądra komórkowego) i błona plazmatyczna komórek zachowują strukturalną integralność przez dłuższy okres. W obrębie jądra komórkowego zachodzi kondensacja i brzeżne ułożenie chromatyny, tj. jej marginalizacja pod otoczką jądrową. Transformacje te poprzedzają postępującą fragmentację jądra. W późniejszym etapie śmierci apoptotycznej, w wyniku dalszego zagęszczenia chromatyny i nukleoplazmy oraz całkowitej biodegradacji jądra komórkowego i cytoplazmy, tworzą się tzw. ciałka apoptotyczne, czyli obłonione fragmenty komórek zawierające morfologicznie niezmienione organelle komórkowe, szczątkowe struktury jądra i resztkowe składniki cytoplazmy. W warunkach in vivo, ciałka apoptotyczne są najczęściej wchłaniane przez sąsiadujące komórki bądź są eliminowane przez makrofagi. Z kolei, w warunkach pozaustrojowych, w przypadku zaawansowanych zmian późnoapoptotycznych w znacznej części populacji komórkowej i braku komórek fagocytujących w mikrośrodowisku hodowlanym, zmiany degradacyjne związane z utratą integralności błony komórkowej mogą być przejawem zachodzenia wtórnej nekrozy. Oprócz wi-

6 6 M. Samiec i M. Skrzyszowska docznych zmian morfologicznych, w komórkach apoptotycznych zachodzi szereg zmian biochemicznych: fragmentacja DNA z udziałem endonukleaz do odcinków oligonukleosomalnych, wzrasta wewnątrzkomórkowe stężenie jonów wapnia, następują procesy degradacji specyficznych białek jądrowych, obniżenie wewnątrzkomórkowego ph i spadek potencjału błon mitochondrialnych, a także pojawiają się zmiany biofizyczne, spowodowane translokacją cząsteczek fosfatydyloseryny w błonie plazmatycznej (Denecker i in., 2001; McCarthy i Evan, 1998; Gross i in., 1999; Kroemer 1997). W przeciwieństwie do apoptozy, w procesie nekrozy (martwicy) dochodzi do zwiększania się rozmiarów komórek, obrzęku organelli komórkowych, głównie mitochondriów i siateczki śródplazmatycznej. Obserwuje się późną degradację DNA i pyknotyczne jądra. Organelle komórkowe ulegają degeneracji, tworzą się wakuole, polisomy odłączają się od siateczki śródplazmatycznej. W dalszym etapie procesu martwicy obserwuje się destrukcję chromatyny, zanik jąder komórkowych, a ostatecznie całkowitą strukturalną dezintegrację komórek (Denecker i in., 2001; Kitanaka i Kuchino, 1999). Kryteria śmierci apoptotycznej i nekrotycznej (martwiczej), obejmujące zmiany biochemiczne i molekularne, wskazują, iż oba rodzaje śmierci pozostają we wzajemnej zależności. Jednym z czynników odgrywających istotną rolę w procesie śmierci jest wewnątrzkomórkowy poziom ATP. W wyniku uszkodzenia DNA, aktywowana jest polimeraza poli(adp-rybozy) [PARP], a poli- ADP-rybozylacja białek jądrowych prowadzi do zmniejszenia wewnątrzkomórkowej puli NAD/NADH i obniżenia poziomu ATP w komórce (Kim i in., 1999; Scovassi i Poirier, 1999). W utrzymaniu właściwego poziomu energetycznego komórek ważną rolę odgrywają mitochondria. W czasie śmierci komórkowej błonowy potencjał mitochondrialny, odpowiedzialny za syntezę ATP, ulega obniżeniu. Pozbawienie komórek energii może być bezpośrednią przyczyną ich śmierci, zatem poziom wewnątrzkomórkowych zasobów energetycznych decyduje o zachodzeniu apoptozy lub nekrozy. Podjęcie decyzji o destrukcji i eliminacji komórek wymaga aktywacji wielu komórkowych procesów, m.in. związanych z ekspresją genów, syntezą pro- i antyapoptotycznych białek, czy aktywacją wielu procesów enzymatycznych. Apoptoza i nekroza mogą być inicjowane przez te same receptory komórkowe. Apoptoza, w zależności od rodzaju czynnika indukującego, może przebiegać z udziałem różnych ewolucyjnie konserwatywnych mechanizmów molekularnych, odpowiedzialnych za przenoszenie sygnału zapoczątkowującego ten proces. Większość procesów proteolitycznych podczas apoptozy przebiega w obecności rodziny cysteinozależnych proteaz katalizujących hydrolizę białek za resztą kwasu asparaginowego zwanych kaspazami (ang. caspases; cysteine-dependent aspartate specific proteases). Poza kaspazami, w kolejnych etapach procesu apoptozy uczestniczą białka Bcl-2, które są produktami ekspresji protoonkogenów bcl-2, wykrytych w białaczkach i chłoniakach wywodzących się z limfocytów B (ang. B-cell leukemia/lymphoma) oraz białka p53, które są produktami ekspresji genów z grupy supresorów transformacji nowotworowej (Fadeel i in., 1999a; Gross

7 Przyżyciowa analiza apoptozy w komórkach-dawcach jąder i w klonalnych zarodkach świni 7 i in., 1999; Kroemer, 1997). Na decyzję o rodzaju zachodzącej śmierci komórkowej apoptozie lub nekrozie może wpływać poziom ekspresji białek Bcl-2, aktywacja kaspaz czy proteaz serynowych Charakterystyka trzech etapów w scenariuszu śmierci apoptotycznej komórek Etap pierwszy faza inicjacji apoptozy W przebiegu procesu genetycznie zaprogramowanej śmierci apoptotycznej komórek dochodzi do kaskady zdarzeń, które obejmują trzy fazy: 1. inicjacji, czyli wzbudzenia, 2. wykonawczą (efektorową) oraz 3. destrukcyjną, czyli zniszczenia (Kroemer, 1997). Najlepiej poznanym mechanizmem wzbudzenia apoptozy pozostaje indukcja spowodowana wiązaniem ligandów przez odpowiednie receptory śmierci. Uważa się, że aktywację kaspaz inicjujących poprzedzają zmiany morfologiczne w obrębie komórek somatycznych (Blankenberg i in., 2000). Dotyczą one m.in. formowania charakterystycznych pęcherzykopodobnych uwypukleń błony komórkowej (ang. blebbing). Niektórzy badacze uważają, że zjawisko pęcherzykowatości błon występuje w niektórych typach komórek równolegle z kondensacją chromatyny (Katsen i in., 1998). W czasie aktywacji kaspaz, komórki realizujące program śmierci sygnalizują o tym sąsiadującym komórkom przez eksponowanie fosfatydyloseryny (PS) na swojej powierzchni (Verhoven i in., 1995). Ten glicerofosfolipid wraz z innymi lipidami fosfatydyloetanoloaminą, fosfatydylocholiną i sfingomieliną są naturalnymi składnikami błony komórkowej. Skład lipidowy obu monowarstw błony cytoplazmatycznej żywych komórek jest bardzo różny. Zjawisko to nosi nazwę asymetrii składu lipidowego błony lub anizotropii w rozmieszczeniu fosfoglicerydów w obrębie obu monomolekularnych warstw lipidowych plazmolemmy. W błonie komórkowej obojętne glicerofosfolipidy zawierające w swojej strukturze chemicznej cholinę, do których należą fosfatydylocholina (PC) oraz sfingomielina (SM) znajdują się w zewnętrznej warstwie monomolekularnej, podczas gdy prawie wszystkie cząsteczki anionowych fosfolipidów glicerolowych zawierające terminalną grupę aminową, takie jak fosfatydyloetanoloamina (PE) i fosfatydyloseryna (PS) znajdują się w monowarstwie wewnętrznej. Ponieważ kwasy tłuszczowe fosfatydylocholiny i sfingomieliny są w ogólności bardziej nasycone niż kwasy tłuszczowe wchodzące w skład fosfatydyloetanoloaminy i fosfatydyloseryny, więc asymetrii rozmieszczania głów polarnych fosfolipidów towarzyszy asymetria dystrybucji kwasów tłuszczowych, która powoduje, że wewnętrzna monowarstwa lipidowa błony plazmatycznej jest nieco bardziej płynna. Z uwagi na fakt, iż ujemnie naładowana fosfatydyloseryna jest zlokalizowana po wewnętrznej stronie plazmolemmy, powoduje to występowanie dodatkowej różnicy ładunku pomiędzy obiema monowarstwami fosfolipidowymi. Utrzymująca się przez cały czas życia komórek asymetria

8 8 M. Samiec i M. Skrzyszowska składu błony cytoplazmatycznej, pomimo występowania ruchliwości translacyjnej cząsteczek lipidów typu dyfuzji transwersalnej z jednej monowarstwy do drugiej (ruchy flip-flop), świadczy o występowaniu w błonach wysoce specyficznych układów enzymatycznych, które są odpowiedzialne za istnienie zjawiska anizotropii rozmieszczenia fosfolipidów (Bratton i in., 1997, 1999). Ruchliwości transwersalnej amfipatycznych składników lipidowych między monomolekularnymi warstwami błony plazmatycznej musi towarzyszyć zmiana konformacji poszczególnych cząsteczek fosfoglicerydów, która dotyczy wzajemnej orientacji przestrzennej ich części polarnych ( głów ) i niepolarnych ( ogonów ). Uważa się, że duży transbłonowy gradient stężenia różnych składników lipidowych powinien powodować dyfuzję transwersalną i eliminację asymetrii. Udowodniono występowanie trzech klas transporterów fosfolipidów glicerolowych: 1. flipaz, w tym translokazy aminofosfolipidowej, transportujących aktywnie lipidy z monowarstwy zewnętrznej do wewnętrznej; 2. flopaz aktywnie transportujących lipidy w kierunku odwrotnym, do których należą białka oporności wielolekowej, oraz 3. transportujących biernie w obie strony błony cytoplazmatycznej skramblaz, do których należy m. in. skramblaza aktywowana przez kationy wapnia (Frasch i in., 2004; Fadeel i in., 1999b). W komórkach żywych rozmieszczenie aminofosfolipidów (PS i fosfatydyloetanoloaminy) ogranicza się zatem do warstwy wewnętrznej błony. Asymetryczna lokalizacja aminofosfolipidów jest utrzymywana dzięki aktywności ATP-zależnej translokazy zwanej flipazą, która wpompowuje je do wewnętrznej warstwy błony, a inne lipidy do zewnętrznej. Aktywacja kaspaz doprowadza do zakłócenia tego stanu, przyczyniając się do zablokowania funkcji translokazy i do aktywacji enzymu skramblazy/flopazy, którego aktywność wyrównuje rozmieszczenie lipidów wewnętrznej i zewnętrznej warstwy błony, powodując szybkie pojawienie się PS na powierzchni błony komórek apoptotycznych (Blankenberg i in., 2000; Martin i in., 1995a; Zwaal i Schroit, 1997). Rola asymetrii plazmolemmy nie jest do końca jasna. Przeważa pogląd, że różnorodność lipidów i ich anizotropia, tj. niejednakowy sposób ułożenia w warstwie dimolekularnej błony plazmatycznej mają zasadniczy wpływ na prawidłowe funkcjonowanie komórek. Wskazuje się tu na specyficzne oddziaływanie niektórych enzymów z subklasą lipidów, szczególnie fosfatydyloseryną, ulokowaną w konkretnym miejscu błony. Na przykład aktywność białkowej kinazy C zależy w dużym stopniu od stężenia PS. Również białka wiążące nukleotydy guaninowe (tj. białka G), a także amfitropowe i antykoagulacyjne białka błonowe wiążące jony Ca 2+ i fosfolipidy, czyli aneksyny, stanowiące całą rodzinę enzymów pełniących wiele funkcji w komórce, są enzymami zależnymi od PS. W przypadku autodestrukcyjnej śmierci fizjologicznej komórek następuje zwiększona ekspozycja fosfatydyloseryny do monowarstwy zewnętrznej, co jest sygnałem do wolnej od procesu zapalnego eliminacji komórki apoptotycznej przez makrofagi (Ferraro-Peyret i in., 2002; Martin i in., 1995a, b). Uważa się, że postępująca oksydacja translokazy aminofosfolipidowej, spowodowana przez wewnątrzkomórkową akumulację reaktywnych form tlenu, jest odpowiedzialna

9 Przyżyciowa analiza apoptozy w komórkach-dawcach jąder i w klonalnych zarodkach świni 9 za utratę asymetrii lipidów w plazmolemmie komórek będących w fazie inicjatorowej i wykonawczej apoptozy (Arroyo i in., 2002; Tyurina i in., 2004a, b). Wyniki badań przeprowadzonych przez Deneckera i in. (2001) wskazują, że przemieszczanie PS stanowi jedno z wcześniejszych wydarzeń w szlaku apoptotycznym, zachodzącym przed spadkiem potencjału transbłonowego mitochondriów oraz uwalnianiem cytochromu c z przestrzeni międzybłonowej tych struktur. Przemieszczenie PS na powierzchnię komórek można łatwo monitorować poprzez wiązanie tego fosfolipidu za pomocą aneksyny V związanej z fluoresceiną (Martin i in., 1995a; Fadok i in., 1992a, b). Aktywacja kaspaz inicjujących doprowadza do pierwszych proteolitycznych cięć niektórych składników cytoszkieletu (m.in. aktyna, fodryna) (Martin i in., 1995b; Vanags i in., 1996) Etap drugi faza wykonawcza apoptozy i jej kontrolny punkt nieodwracalności Stymulacja aktywności kaspaz wykonawczych i przemieszczanie PS w błonie komórek jest sygnałem rozpoczęcia fazy efektorowej, która wydaje się być wspólnym etapem wiodącym do śmierci komórek wzbudzanych przez poszczególne ścieżki apoptotyczne (Medema i in., 1997a; Huppertz i in., 1999). W tej fazie dochodzi do ostatecznego włączenia programu śmierci, precyzyjnie kontrolowanego przez produkty genów, które mogą aktywować czy blokować bądź opóźniać apoptozę przez hamowanie kaspaz wykonawczych. Centralnym punktem skupiającym różne sygnały apoptotyczne, charakterystyczne dla fazy inicjatorowej są zatem proteazy cysteinowe z podrodziny kaspaz wykonawczych (Bedner i in., 2000). Aktywacja kaspaz wykonawczych przez kaspazy inicjujące, czy inne białka (np. proteaza serynowa GrB) stanowi etap, punkt kontrolny/restrykcyjny, od którego nie ma już odwrotu w apoptozie (ang. point of no return) i podlega precyzyjnej regulacji przez białka rodziny Bcl-2 (ang. B-cell leukemia/lymphoma-2) oraz IAP (ang. inhibitory apoptosis proteins) (Renvoize i in., 1997). Czas ich aktywacji wynosi od kilku minut do kilku godzin i zależy od typu oraz stanu funkcjonalnego komórek. Zaktywowane kaspazy wykonawcze (np. kaspaza-3) bezpośrednio albo w kaskadzie kaspaz dokonują proteolizy wielu białek krytycznych dla życia komórek, wśród których znajdują się m.in. białka cytoszkieletu, otoczki jądrowej, białka odpowiedzialne za organizację przestrzenną DNA i jego naprawę, enzymy zaangażowane w relaksację α- heliksu DNA oraz w anafazowy rozdział chromosomów podczas mitozy. Obok najlepiej poznanych proteaz kaspaz, zaangażowanych w realizację programu fazy efektorowej samobójczej śmierci komórek, wymienia się inne proteazy, zarówno cysteinowe (izoformy kalpain, katepsyny B i L), asparaginianowe (katepsyna D), jak i serynowe (granzym B, proteaza AP24) (Fadeel i in., 2000; Squier i in., 1994; Wright i in., 1997; Yamashima, 2000). Kalpainy, które pod względem biochemicznym stanowią zależne od jonów wapnia, obojętne endopeptydazy wewnątrzkomórkowe, zawierające w swoim centrum katalitycznym

10 10 M. Samiec i M. Skrzyszowska cysteinę i histydynę, występują w dwóch izoformach, tj. m i μ, oznakowanych również odpowiednio jako II i I. Wspomniane izoformy różnią odmienne wymagania w stosunku do ich aktywatora jonów Ca 2+ milimolowe, w przypadku m-kalpainy, i mikromolowe dla μ-kalpainy, które opisuje się również, odpowiednio, jako m- i μ-canps/cls (ang. calcium-activated neutral proteases/calpains) (Tagliarino i in., 2003). Kalpainy występują w cytozolu oraz różnych organellach komórkowych i aktywowane są m.in. przez fosfolipidy oraz białka jądrowe histony. Znanym inhibitorem komórkowym kalpain jest kalpastatyna (Sanges i in., 2006). Kalpainy rozszczepiają wiązania peptydowe wewnątrz łańcucha białkowego i nie wykazują specyficzności substratowej wobec aminokwasów. Ponadto, cząsteczki kalpain dokonują proteolitycznego cięcia wielu białek w komórkach ulegających apoptozie zwykle w innych miejscach łańcucha aniżeli kaspazy. W wyniku działania kalpain powstają duże fragmenty polipeptydowe, które ulegają dalszej proteolizie katalizowanej przez inne enzymy komórkowe np. kaspazy (Friedrich i in., 2001; Wang, 2000; Squier i Cohen, 1997). Stwierdzono, że wzrost aktywności kalpain wyprzedza zmiany morfologiczne typowe dla komórek apoptotycznych oraz fragmentację DNA. Wyniki badań przeprowadzonych przez Squiera i in. (1994) oraz Squiera i Cohena (1997) udokumentowały, że w wielu typach komórek włączających program śmierci samobójczej wywołany różnymi czynnikami dochodzi do rozchwiania homeostazy jonów Ca 2+ (izokalcemii), co prowadzi do aktywacji izoform kalpainy. Substratami kalpain w komórkach apoptotycznych są białka cytoszkieletowe, m.in białka wiążące aktynę (fodryna/spektryna, talina, filamina, α-aktynina), białka związane z mikrotubulami (MAP-2), oraz białka wiążące się z kalmoduliną, kinazy białkowe takie jak np. kinaza białkowa C (PKC), zależna od jonów Ca 2+ i kalmoduliny kinaza białkowa typu II i IV (CaM-PK-II/IV), kinaza łańcucha lekkiego miozyny, a także enzym PARP, proapoptotyczne białko Bax z rodziny Bcl-2, fosfolipaza C, czynniki transkrypcyjne (c-fos, c-jun), białka receptorowe (np. receptory epidermalnego czynnika wzrostu), błonowe transportery jonowe (Ca 2+ -ATPaza), kanały wapniowe, cytokiny (interleukina 1α) i kilka enzymów istotnych w sygnalizacji komórkowej (Mandic i in., 2002; McGinnis i in., 1998). Na podkreślenie zasługuje obserwacja, że katalityczne rozszczepienie wielu białek następuje w innych miejscach niż w przypadku kaspazy-3. Pojawiły się przypuszczenia, że być może aktywność proteolityczna kalpainy i kaspazy-3 jest uporządkowana hierarchicznie. Zaobserwowano, że kalpaina aktywuje (poprzez rozszczepienie proteolityczne) kaspazę-3, -7 i -9 (Fadeel i in., 2000; Neumar i in., 2003). Odnotowano także aktywację kalpainy przez kaspazę-3 (Wood i Newcomb, 1999; Sharma i Rohrer, 2004). Niewykluczone również, że kaspaza-3 (ale również -1 i -7) może być odpowiedzialna za proteolizę kalpastatyny, powodując tym samym aktywację kalpainy (Graves i in., 2001; Kato i in., 2000a; Pörn-Ares i in., 1998; Wang i in., 1998). Ponadto, w czasie apoptozy translokacja kalpain do jąder komórkowych prowadzi do interakcji z białkiem p53, aktywującym proapoptotyczny gen kodujący białko Bax

11 Przyżyciowa analiza apoptozy w komórkach-dawcach jąder i w klonalnych zarodkach świni 11 z rodziny genów bcl-2 (Choi i in., 2001). We wczesnych etapach fazy wykonawczej apoptozy, przed punktem nieodwracalności, należy podkreślić rolę m.in. białek rodziny Bcl-2, których aktywność warunkuje przepuszczalność błon mitochondrialnych, wypływ czynników proapoptotycznych oraz stymuluje bądź hamuje aktywność kaspaz (Adams i Cory, 1998; Green i Reed, 1998). Białka tej rodziny, głównie inhibitory apoptozy, np. białko Bcl-2, kontrolują uwalnianie jonów Ca 2+ z komórkowych zapasów siateczki śródplazmatycznej czy mitochondriów (Lam i in., 1994). Kationy wapnia odgrywają ważną rolę w transmisji sygnału apoptotycznego w komórkach (Squier i in., 1994; Squier i Cohen, 1997). Ostatnio doniesiono, że aktywowane przez te jony cząsteczki kalpain są zaangażowane w proteolizę cytozolowego, proapoptotycznego białka Bax w N- końcu jego cząsteczki w komórkach, w których czynna autodestrukcja była indukowana poprzez działanie etopozydu bądź staurosporyny (Cao i in., 2003; Gao i Dou, 2000). Skrócone białko Bax o masie molekularnej 18 kda, opisywane jako Bax/p18, po translokacji do mitochondriów inicjuje uwalnianie cytochromu c, promującego tworzenie apoptosomu wielopodjednostkowego kompleksu białkowego niezbędnego do aktywacji proteolitycznej inicjatorowej prokaspazy-9 i przekroczenia przez komórki kontrolnego punktu nieodwracalności procesu apoptozy (Cain i in., 2000; Zou i in., 1999). Jony Ca 2+ są również nieodzowne do aktywacji niektórych enzymów dokonujących przeorganizowania kompleksu chromatynowego i jego dostępności na atak nukleolityczny, a także wpływają, bezpośrednio lub pośrednio, na indukcję ekspresji (inicjację aktywności transkrypcyjnej) genów związanych z realizacją programu śmierci (Nicotera i Rossi, 1994). Wright i in. (1997) zidentyfikowali apoptotyczną proteazę serynową o masie cząsteczkowej 24 kda (AP24; ang. 24kDa apoptotic protease), której aktywność jest uwarunkowana wzrostem stężenia kationów wapniowych w cytozolu i nukleoplazmie oraz wpływa na fragmentację DNA jądrowego. Wydaje się, że aktywacja kaspazy-3 jest czynnikiem niewystarczającym do rozpoczęcia apoptotycznej fragmentacji DNA w komórkach, w których zablokowano aktywność proteazy AP24 (Wright i in., 1998; Altairac i in., 2003). Kolejną proteazę zależną od jonów Ca 2+, oznakowaną symbolem NS (ang. nuclear scaffold) ze względu na lokalizację w szkielecie jądrowym (lub asocjację z nukleoszkieletem), wykryto w komórkach apoptotycznych jako enzym odpowiedzialny za proteolizę lamin (Zhivotovsky i in., 1997). Inhibitory tego enzymu hamują degradację laminów, obkurczanie komórek, a także fragmentację DNA. Wśród ścieżek sygnalizacyjnych apoptozy wymienia się tzw. szlak pseudoreceptorowy, opisywany najczęściej w krwinkach białych szeregu limfocytarnego (limfocyty T cytotoksyczne oraz komórki NK). Komórki te syntetyzują i wydzielają białko perforynę oraz alkaliczne białko glikoproteinowe o funkcji enzymatycznej (proteazę serynową), określane mianem granzymu B (GrB). To ostatnie białko określane jest również jako fragmentyna-2. Zarówno perforyna, jak i granzym B są kierowane do komórek uśmiercanych (Frazer i Evan, 1996; Greenberg, 1996; Thornberry i in., 1997). Perforyna tworzy w błonach plazma-

12 12 M. Samiec i M. Skrzyszowska tycznych takich wczesnoapoptotycznych komórek mikrokanały, przez które wnika proteaza serynowa GrB, indukująca śmierć dwiema drogami (Scharif- Askari i in., 2001). W tzw. drodze cytozolowej GrB, podobnie jak kaspazy, dokonuje cięć substratów między resztą kwasu asparaginowego a kolejnym aminokwasem, aktywując w pierwszej kolejności kaspazę-3. Ta z kolei usuwa prodomenę kaspazy-7, czyniąc ją aktywną w uruchomieniu enzymatycznej kaskady kaspaz, której działanie prowadzi do autodestrukcji komórki (Yang i in., 1998). Natomiast, mniej wyjaśniona droga jądrowa, z udziałem GrB, prawdopodobnie angażuje białka regulujące cykl komórkowy (Estébanez- Perpiñá i in., 2000). Granzym B może również usuwać inhibitor endonukleazy DFF45/ICAD (ang. DNA fragmentation factor 45 kda/inhibitor of caspaseactivated deoxyribonuclease), a także dokonywać proteolitycznego cięcia białka Bid (Estébanez-Perpiñá i in., 2000; Medema i in., 1997b). Ostatnio udowodniono, że GrB i kaspaza-3 rozszczepiają w tym samym miejscu endonukleazę DFF40/CAD (ang. DNA fragmentation factor 40 kda/caspase-activated deoxyribonuclease), powodując uwalnianie polipeptydu o masie molekularnej 28 kda, co wydaje się istotne dla fragmentacji DNA w komórkach apoptotycznych, nie wykorzystujących kaspaz w szlaku przekaźnictwa sygnału śmierci (Scharif- Askari i in., 2001). Formowanie przez białka z grupy perforyn mikrokanałów lub mikroporów w błonach cytoplazmatycznych komórek znajdujących się prawdopodobnie we wczesnych fazach śmierci apoptotycznej (stadium wzbudzenia oraz stadium efektorowe prawdopodobnie przed przekroczeniem kontrolnego punktu nieodwracalności apoptozy) można wykrywać przy zastosowaniu przyżyciowych metod fluorycytochemicznych z użyciem małocząsteczkowego barwnika specyficznie wiążącego się z DNA YO-PRO-1 (Daly i in., 1997; Estaquier i in., 1995, 1996; Idziorek i in., 1995; Samiec i Skrzyszowska, 2012a, 2013; Samiec i in., 2013a). Podczas fazy wykonawczej zaprogramowanej genetycznie śmierci samobójczej dochodzi do wybiórczego gromadzenia się włókien spolimeryzowanej aktyny fibrylarnej, tj. aktyny F, w centralnej części komórek apoptotycznych, zaś monomerycznych cząsteczek aktyny globularnej, tj. aktyny G obwodowo, w miejscu formowania pęcherzykowatych uwypukleń błony komórkowej (ang. blebbing) (Asumendi i in., 2000). Taka polaryzacja w rozmieszczeniu cząsteczek aktyny F i G wiąże się z przeorganizowaniem sieci mikrofilamentów aktynowych i wydaje się niezbędna do późniejszego tworzenia ciałek apoptotycznych w komórkach. W tym samym czasie dochodzi do zaburzeń ultrastrukturalnych w mikrotubulach i ich rozpadu w następstwie rozszczepienia cząsteczek tubuliny α i tubuliny β. Zmianom tym towarzyszy zapoczątkowanie proteolizy włókien aktynowych cytoszkieletu. Na obecnym etapie badań sugeruje się, że utrzymywanie integralności części mikrofilamentów aktynowych i mikrotubuli, a także ich częściowa, wybiórcza proteoliza przygotowuje komórki apoptotyczne do ich ostatecznego zniszczenia. Należy zwrócić uwagę, że również enzymy lizosomalne uczestniczą w przebiegu wczesnych etapów fazy wykonawczej apoptozy, przed przekrocze-

13 Przyżyciowa analiza apoptozy w komórkach-dawcach jąder i w klonalnych zarodkach świni 13 niem przez ten proces restrykcyjnego punktu nieodwracalności. W opinii Stoka i in. (2001), proteazy uwalniane z lizosomów w niewielkim stopniu wpływają na aktywację kaspaz wykonawczych, natomiast ich funkcję wiąże się z proteolizą białka proapoptotycznego Bid, która jest dokonywana w pozycji Arg 65, a zatem w innym miejscu niż tnie inicjatorowa kaspaza-8 (Asp 59 ). Proteoliza białka Bid prowadzi do jego konwersji w formę łatwiej przemieszczającą się do mitochondriów, w których przyczynia się ona do wypływu cytochromu c (Csordás i in., 2002; Mandic i in., 2002) Udział mitochondriów w scenariuszu śmierci apoptotycznej główne czynniki i kluczowe mechanizmy warunkujące przebieg fazy wykonawczej apoptozy w wewnątrzmitochondrialnym i cytoplazmatycznym przedziale komórkowym Niezwykle istotnym powodem, dla którego mitochondriom przypisuje się najważniejszą rolę w fazie wykonawczej procesu apoptozy, jest występowanie w błonie zewnętrznej oraz w przestrzeni międzybłonowej tych organelli wielu krytycznych aktywatorów i efektorów apoptotycznej śmierci komórek. W błonie zewnętrznej mitochondriów znajdują się białka rodziny Bcl-2 (Nouraini i in., 2000; Dejean i in., 2005). W przestrzeni międzybłonowej zlokalizowane są: 1. proapoptotyczne białko AIF (ang. apoptosis inducing factor) o masie molekularnej 57 kda, należące do grupy flawoprotein; 2. cytochrom c, określany również mianem drugiego czynnika aktywującego kaskadę proteaz apoptotycznych (Apaf-2; ang. apoptosis protease activating factor-2); 3. białko Smac/DIABLO określane także jako drugorzędowy/wtórny aktywator kaspaz pochodzenia mitochondrialnego lub białko o niskiej wartości punktu izoelektrycznego, inaktywujące białkowe czynniki inhibitorowe procesu apoptozy poprzez ich bezpośrednie wiązanie [ang. second mitochondrial activator of caspases/direct IAP (inhibitor of apoptosis protein)-binding protein with low pi], a także 4. prokaspazy-2, -3 i -9, czyli zymogeny kaspaz należących do inicjatorów fazy wykonawczej (-2, -9) oraz efektorów fazy wykonawczej apoptozy (-3) (Sanges i Marigo, 2006; Sanges i in., 2006; Ruiz-Vela i in., 2005). W zależnym od mitochondriów szlaku transdukcji sygnału apoptotycznego, rolę enzymu inicjującego kaskadę reakcji proteolitycznych pełni głównie kaspaza-9, a cały ten wielostopniowy proces jest regulowany przez rodzinę białek Bcl-2. W komórkach o niskiej aktywności inicjatorowej kaspazy-8, enzym ten nie aktywuje bezpośrednio efektorowej prokaspazy-3, ale oddziałuje z proapoptotycznym białkiem Bid, dokonując jego proteolitycznego cięcia do formy skróconego polipeptydu o masie cząsteczkowej 15 kda (Bid/p15), określanego także mianem tbid (ang. truncated Bid). Polipeptyd tbid, reagując z innym proapoptotycznym białkiem Bax, rozpoczyna kaskadę reakcji z udziałem mitochondriów, których efektem są zmiany w przepuszczalności błon tych organelli, intensywny wyciek cytochromu c oraz aktywacja kaspaz (Csordás i in., 2002; Anto i in., 2002). Aktywacja prokaspaz z udziałem mitochondriów rozpoczyna się od wycieku cytochromu c z przestrzeni międzybło-

14 14 M. Samiec i M. Skrzyszowska nowej do cytozolu. Uwolnione cząsteczki cytochromu c, wspólnie z datp/atp, przyłączają się do pierwszego czynnika aktywującego apoptotyczne proteazy (Apaf-1; ang. apoptosis protease activating factor-1). W tym ostatnim procesie, cytochrom c i ATP pełnią rolę kofaktorów i stymulują oligomeryzację Apaf-1. Zmiany konformacyjne czynnika Apaf-1 znacznie ułatwiają jego połączenie z prokaspazą-9. Utworzony kompleks: cytochrom c-datp/atp-apaf-1- prokaspaza-9 znany jest jako apoptosom. Następstwem powyższych zmian jest uwolnienie aktywnej kaspazy-9, która proteolitycznie aktywuje efektorowe kaspazy-3, -6 i -7. Uwalnianie cytochromu c, jak i powstawanie apoptosomu, są kontrolowane przez białka rodziny Bcl-2, transportowane do zewnętrznej błony mitochondrialnej (Shimizu i in., 1999; Harris i Thompson, 2000). Obecność w mitochondriach takich białek proapoptotycznych należących do rodziny Bcl-2 jak: Bik, Bak, Bax, Bid, Bad, Bim ułatwia zatem wyciek cytochromu c i innych czynników apoptogennych do cytozolu poprzez wzrost przepuszczalności błony zewnętrznej, a tym samym przyśpiesza autodestrukcyjną (samobójczą) śmierć komórek (Nutt i in., 2002 a,b). Z kolei, nadekspresja w komórkach białek Bcl-2 o aktywności antyapoptotycznej zapobiega uwalnianiu cytochromu c oraz hamuje proces tworzenia apoptosomu i aktywacji kaspaz efektorowych (Murphy i in., 2000). Wyciek cytochromu c, prokaspaz-2, -3 i -9 oraz białek AIF i Smac/DIABLO prawdopodobnie odbywa się za pośrednictwem kanałów oraz porów obecnych, bądź powstających w błonie mitochondrialnej podczas apoptozy (Desagher i Martinou, 2000; Du i in., 2000; Reed, 1997; Verhagen i in., 2000). W komórkach apoptotycznych mogą to być kanały utworzone w zewnętrznej błonie tylko przez białka rodziny Bcl-2 albo kanały chimerowe powstałe po przyłączeniu białka proapoptotycznego Bax lub Bak do kanałów jonowych zależnych od napięcia oraz natężenia pola elektrostatycznego lub od potencjału elektrochemicznego (Zheng i in., 2004; Zalk i in., 2005). Obecne w mitochondriach białka Bcl-2 mogą też prowadzić do destabilizacji błony i powstania tzw. dziur lipidowych. Istnieją również przypuszczenia, że czynniki indukujące apoptozę bezpośrednio oddziałują z porami mitochondrialnymi (PM), powodując ich otwarcie, a w kolejnych etapach depolaryzację mitochondriów, pęcznienie matriks oraz rozerwanie zewnętrznej błony mitochondrialnej (De Giorgi i in., 2002). Pory mitochondrialne, zwane także megakanałami, zbudowane są z trzech różnych składników: napięciowo-zależnego kanału jonowego w zewnętrznej błonie mitochondrialnej, translokazy nukleotydów adeninowych w błonie wewnętrznej oraz z mitochondrialnego receptora benzodiazepiny (Dahlem i in., 2006; Wang i in., 2005; Shimizu i in., 2000). Proces otwierania porów regulowany jest zarówno przez potencjał błony mitochondrialnej (ΔΨ m ), jak i ph macierzy mitochondrialnej. Prawdopodobieństwo otwarcia PM wzrasta wraz ze spadkiem ΔΨ m oraz maleje poniżej ph 7 (Desagher i Martinou, 2000; Castedo i in., 1996; Lam i in., 1994; Zamzami i in., 1995, 1996). Uwolnione zatem, przez otwarte megakanały, z przestrzeni międzybłonowej mitochondriów do cytozolu czynniki apoptogenne, takie jak: cytochrom c oraz białka

15 Przyżyciowa analiza apoptozy w komórkach-dawcach jąder i w klonalnych zarodkach świni 15 Smac/DIABLO i AIF uczestniczą, bezpośrednio lub pośrednio, w procesach aktywacji kaspaz inicjatorowych i wykonawczych we wczesnych etapach samobójczej śmierci komórek. Wtórny mitochondrialny aktywator kaspaz Smac/DIABLO jest odpowiedzialny za inaktywację inhibitorów wielu kaspaz inicjujących (-8, -10) i wykonawczych procesu apoptozy (-3, -6, -7) poprzez ich bezpośrednie wiązanie. Z kolei, czynnik indukujący apoptozę AIF wykazuje znaczną homologię do oksydoreduktaz oraz zdolność aktywacji prokaspazy-3. Obecnie wiadomo, że po uwolnieniu czynnika AIF z mitochondriów do cytoplazmy ulega on translokacji do jąder komórek apoptotycznych, gdzie staje się sygnałem do uruchomienia kaspazo-niezależnej ścieżki kondensacji chromatyny i fragmentacji DNA na odcinki o długości 50 kpz (Susin i in., 1999). Mechanizm stymulacji kondensacji chromatyny z udziałem flawoproteiny AIF jest wciąż niewyjaśniony. Uważa się, że po przekroczeniu punktu nieodwracalności w fazie efektorowej śmierci apoptotycznej komórek, poza obniżeniem potencjału transbłonowego mitochondriów, otwarciem megakanałów mitochondrialnych, oraz zakłóceniem mitochondrialno-cytozolowej homeostazy stężeniowej jonów Ca 2+ (izokalcemii), dochodzi również do fragmentacji mitochondrialnego DNA, która zwykle poprzedza fragmentację DNA jądrowego. Ponadto, wykonawcza kaspaza-3, stymulowana proteolitycznie przez uwolnioną z apoptosomu aktywną formę inicjatorowej kaspazy-9, dokonuje aktywacji i rozszczepienia heterodimerycznego czynnika fragmentacji DNA jądrowego DFF/CAD (ang. DNA fragmentation factor/caspase-activated deoxyribonuclease) (Liu i in., 1997, 1998, 1999). Czynne kaspazy efektorowe (-3, -6, -7) aktywują także różne enzymy modyfikujące białka i DNA wewnątrz jądra komórkowego (Huppertz i in., 1999; Robertson i in., 2000; Song i in., 1996), a także białko Acinus (ang. apoptosis chromatin condensation inducer in the nucleus), którego funkcja związana jest z indukcją kondensacji chromatyny (Sahara i in., 1999) Udział jądra komórkowego w scenariuszu śmierci apoptotycznej główne czynniki i kluczowe mechanizmy determinujące przebieg fazy wykonawczej apoptozy w wewnątrzjądrowym przedziale komórkowym Do najważniejszych apoptotycznych zmian w jądrze komórkowym należą: kondensacja chromatyny, fragmentacja jądra oraz fragmentacja DNA. Spośród uszkodzeń DNA indukowanych podczas apoptozy najwcześniej notowane są pojedyncze pęknięcia. Produktami tych reakcji są duże fragmenty DNA od 300 kpz do 1 Mpz, fragmenty średniej długości ( kpz) oraz fragmenty internukleosomalne (około 200 pz). Z kolei, produktami podwójnych pęknięć DNA są fragmenty od kpz oraz fragmenty internukleosomalne ( pz lub ich wielokrotności) (Robertson i in., 2000; Zhivotovsky i in., 1994). Wiadomo, że proces nukleolitycznego trawienia DNA genomowego podczas apoptozy obejmuje dwie fazy: 1. doprowadzającą do powstania fragmentów genomu o odcinkach liczących i kpz (Earnshaw, 1995), określanych jako wielkocząsteczkowy DNA lub DNA o wysokiej masie molekularnej

16 16 M. Samiec i M. Skrzyszowska (HMW DNA; ang. high molecular weight DNA) oraz 2. doprowadzającą do utworzenia odcinków odpowiadających długości nukleosomowego DNA (rzędu około pz) lub jego wielokrotności (Earnshaw, 1995), oznakowanych jako drobnocząsteczkowy DNA lub DNA o niskiej masie molekularnej (LMW DNA; ang. low molecular weight DNA) (Robertson i in., 2000; Walker i in., 1994). W procesie apoptotycznej degradacji DNA uczestniczą różnego typu endonukleazy. Enzymy te występują w różnych strukturach subkomórkowych. Pod wpływem sygnałów apoptotycznych endonukleazy zmieniają swoją lokalizację i wszystkie przemieszczają się do jądra. W wielu przypadkach endonukleazy aktywowane są przez kaspazy efektorowe. Ze względu na pełnione funkcje oraz wrażliwość na jony, enzymy podzielono na trzy grupy: endonukleazy zależne zarówno od jonów Ca 2+, jak i jonów Mg 2+ (Ca 2+ /Mg 2+ -endonukleazy), endonukleazy zależne tylko od jonów Mg 2+ (Mg 2+ -endonukleazy) oraz endonukleazy kationoniezależne (nukleazy kwaśne) (Earnshaw, 1995; Robertson i in., 2000; Zhivotovsky i in., 1994). Do pierwszej grupy enzymów należy DNaza I. Wykryto ją w retikulum endoplazmatycznym, aparacie Golgiego i małych pęcherzykach wydzielniczych. Endonukleaza ta uczestniczy głównie w powstaniu pojedynczych pęknięć DNA po uprzedniej aktywacji przez kaspazy oraz proteazy serynowe. Do Mg 2+ -endonukleaz należy DNaza aktywowana przez kaspazy (CAD; ang. caspase-activated deoxyribonuclease), która określana jest również mianem czynnika fragmentacji DNA o masie cząsteczkowej 40 kda (DFF40; ang. DNA fragmentation factor 40 kda) (Liu i in., 1997). Deoksyrybonukleaza DFF40/CAD odpowiedzialna jest za podwójne pęknięcia DNA w regionach bogatych w pary zasad adenina-tymina (A/T) (Enari i in., 1998; Halenbeck i in., 1998; Liu i in., 1998). Enzym ten katalizuje reakcje cięć DNA między nukleosomami, tworząc fragmenty LMW. Jego aktywność nukleazową stymuluje obecność histonu H1, niehistonowych białek o wysokiej ruchliwości elektroforetycznej (HMG-1 i HMG-2; ang. high mobility group-1/2 proteins) oraz topoizomerazy II (Liu i in., 1999; Widlak i in., 2000). Z badań Sakahira i in. (1999) wynika, że enzymatyczny czynnik DFF40/CAD jest odpowiedzialny za degradację DNA zarówno do odcinków LMW, jak i do dużych fragmentów genomu. Atak nukleolityczny dotyczy DNA zakotwiczonego w szkielecie jądrowym, w miejscach wzbogaconych w se-kwencje adenina-tymina (AT), preferowanych przez tę endonukleazę. Nacięcie przez enzym w pierwszej kolejności takich miejsc może rozwijać kompleks chromatynowy, w którym odsłonięte zostaną regiony łącznikowe między nukleosomami do dalszego trawienia nukleolitycznego, formując odcinki odpowiadające długością DNA nukleosomów lub ich wielokrotności (Nagata, 2000). W komórkach nieulegających apoptozie endonukleaza DFF40/CAD występuje jako nieaktywny heterodimer w kompleksie z inhibitorem o masie molekularnej 45 kda (DFF45/ICAD; ang. DNA fragmentation factor 45 kda/inhibitor of CAD). Natomiast w komórkach późnoapoptotycznych kaspaza-3 (oraz w mniejszym stopniu kaspaza-7) uwalnia przez proteolityczne cięcie czynnik inhibitorowy DFF45/ICAD, umożliwiając

17 Przyżyciowa analiza apoptozy w komórkach-dawcach jąder i w klonalnych zarodkach świni 17 formowanie aktywnych homooligomerów przez nukleazę DFF40/CAD (Halenbeck i in., 1998; Sakahira i in., 1998). Produkty działania aktywnej formy DFF40/CAD można uwidocznić w żelu agarozowym lub poliakryloamidowym w formie charakterystycznej drabinki, uznawanej za marker molekularny apoptozy wielu komórek. Przedstawicielem enzymów należących do trzeciej grupy endonukleaz niezależnych od jonów metali jest lizosomalna DNaza II (L- DNaza II). W procesie apoptozy L-DNaza II przenoszona jest z cytozolu do jądra komórkowego. Deoksyrybonukleaza ta indukuje kondensację chromatyny jądrowej oraz jej degradację do fragmentów wielkości nukleosomów (Altairac i in., 2003; Brossas i in., 2004; Torriglia i in., 2000). W degradacji DNA mogą uczestniczyć również inne białka. W mitochondriach występuje endonukleaza G. Podczas apoptozy enzym ten, niezależnie od aktywności kaspaz, powoduje degradację DNA mitochondrialnego (mtdna) na fragmenty mononukleosomalne (Li i in., 2001). Za kondensację chromatyny oraz internukleosomalną fragmentację DNA odpowiedzialne są także endonukleaza γ i katepsyna B (Earnshaw, 1995; Nagata, 2000; Robertson i in., 2000). Obydwa białka podczas programowanej śmierci komórek uwalniane są z lizosomów. Znaczący udział zarówno w procesie degradacji DNA, jak i w kondensacji chromatyny ma również wspomniany już wcześniej czynnik indukujący apoptozę (AIF; ang. apoptosis inducing factor) (Sanges i in., 2006) Etap trzeci faza destrukcyjna apoptozy Szybkość progresji procesu apoptozy komórek w fazę ich zniszczenia zależy m.in. od typu komórek, rodzaju i siły bodźca apoptotycznego, które to czynniki z kolei determinują tempo aktywacji oraz wewnątrzkomórkowe stężenie zaktywowanych kaspaz wykonawczych, katalizujących proteolityczne rozszczepianie strukturalnych, enzymatycznych i innych regulatorowych białek cytoplazmatycznych oraz jądrowych (Dynlacht i in., 2000; Hengartner, 2000; Huppertz i in., 1999; Kidd i in., 2000). Substratami kaspaz wykonawczych w fazie destrukcyjnej apoptozy są m.in. takie białka strukturalne jak: β-katenina, α-fodryna, aktyna, cytokeratyna-18, gelsolina, laminy jądrowe oraz białka regulacyjne, do których należą: kinaza Fak (ang. focal adhesion kinase), cytoplazmatyczna fosfolipaza A 2, białko Mdm2 (ang. mouse double minute 2) hamujące aktywność białka supresora transformacji nowotworowej p53 i decydujące o jego proteolitycznej degradacji w proteasomie 26S, kinaza PAK (ang. p21-activated kinase), czyli kinaza z rodziny MAPKKK/MKKK aktywowana małym białkiem G o masie cząsteczkowej 21 kda (p21), antyapoptotyczne białka z rodziny Bcl-2 (takie jak: Bcl-2, Bcl-X L ), a także enzymy związane z topologią, stabilizacją struktury przestrzennej, metabolizmem i naprawą kwasów nukleinowych (m.in. PARP, topoizomerazy) (Jänicke i in., 1998; Kim i in., 1999, 2000; Scovassi i Poirier, 1999; Wen i in., 1997). Powszechnie akceptowany jest pogląd, że aktywowana za pośrednictwem kaspaz efektorowych (głównie kaspazy-3 i -7) topoizomeraza II uczestniczy we wstępnej fragmentacji DNA do

18 18 M. Samiec i M. Skrzyszowska odcinków HMW i wiąże się z chromatyną w odstępach około 300 kpz. Z kolei, lamin B substrat kaspazy-6 wiąże się wybiórczo z motywami DNA opisywanymi jako regiony zasocjowane z macierzą jądrową (MAR; ang. matrix attachment regions) w odstępach około kpz. Natomiast histon H1, kolejny substrat proteaz cysteinozależnych (kaspaz) i/lub serynowych, jest rozmieszczony w odstępach odpowiadających odcinkom o długości rzędu pz (Robertson i in., 2000). Rozszczepienie proteolityczne topoizomerazy I i II pod wpływem działania kaspaz wykonawczych przyczynia się do wstępnej fragmentacji DNA jądrowego do odcinków o długości około 300 kpz. Postępująca w późnej fazie zniszczenia komórki apoptotycznej degradacja DNA do odcinków zawierających kpz, które podlegają dalszej nukleolizie do fragmentów będących wielokrotnością około pz tzw. LMW DNA, jest ściśle uzależniona od biokatalitycznej funkcji endonukleaz jądrowych (m.in. DFF40/CAD), uwarunkowanej aktywnością kaspaz efektorowych (Liu i in., 1997; Robertson i in., 2000; Zhivotovsky i in., 1994). Fragmentacja DNA doprowadza do zmian struktury kompleksu chromatynowego, które mogą zwiększać dostępność odcinków DNA na atak nukleolityczny. Cięcie wiązań fosfodiestrowych jest dokonywane w ten sposób, że reszta fosforanowa pozostaje po stronie 5, zaś grupa hydroksylowa po stronie 3 łańcucha DNA. Uwolnione fragmenty DNA zakończone 3 -OH można łatwo zidentyfikować metodą TUNEL (ang. terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dutp nick-end labeling), w której stosuje się terminalną deoksynukleotydylotransferazę (TdT). Ten unikatowy enzym nie wymaga do działania matrycy i wykazuje zdolność wbudowywania znakowanych (np. barwnikiem fluoresceiną/izotiocyjanianem fluoresceiny) nukleotydów (najczęściej dutp; deoksyurydyno-5 -trifosforanu) w miejscu pęknięcia DNA (Gavrieli i in., 1992; Otsuki, 2000). W kolejnym etapie fazy destrukcyjnej apoptozy ma miejsce proces niezależnej bądź zależnej od enzymatycznej funkcji kaspaz kondensacji sfragmentowanej chromatyny jądrowej, za który odpowiedzialne są odpowiednio: białka AIF oraz Acinus. W wyniku działania białka Acinus, chromatyna przyjmuje postać zbitych grudek na obrzeżach jądra komórkowego (acinus łac. winogrono, jagoda). Ostatnio udowodniono, że kondensacja chromatyny jądrowej w komórkach apoptotycznych zachodzi niezależnie bądź wyprzedza cięcie nukleolityczne DNA (Allera i in., 1997; Huppertz i in., 1999; Robertson i in., 2000). Hendzel i in. (1998) uzyskali wyniki wskazujące, że apoptotyczna kondensacja chromatyny jest wynikiem utraty strukturalnej integralności jej samej oraz szkieletu jądrowego, co umożliwia następczą agregację heterochromatyny i jej nukleolizę. Ostatecznie dochodzi do przerwania ciągłości wewnętrznej i zewnętrznej błony otoczki jądrowej i tworzenia ugrupowań porów jądrowych (ang. clustering), czemu towarzyszy dezintegracja nukleo- i cytoszkieletu powodująca zmiany kształtu jądra i komórki z ich następczym rozpadem (Kerr i in., 1995; Morishima, 1999). W fazie zniszczenia komórki ulegają ogólnemu obkurczaniu w wyniku przeorganizowania nukleo- i cytoszkieletu oraz przez wypompowywanie jonów (K +, Cl -, organicznych osmolitów), co ułatwia ich pochłanianie przez sąsiadujące

19 Przyżyciowa analiza apoptozy w komórkach-dawcach jąder i w klonalnych zarodkach świni 19 komórki czy fagocyty (Bortner i Cidlowski, 1999; Huang i in., 1997). Pofałdowana powierzchnia błony plazmatycznej komórek późnoapoptotycznych, która tworzy liczne uwypuklenia, ulega w wielu miejscach przerwaniu, otaczając fragmenty cytoplazmy i zagęszczonej chromatyny, a także prawie niezmienione organelle (lizosomy, mitochondria). W ten sposób formowane są ciałka apoptotyczne. Struktury te są otoczone silnie utkaną błoną komórkową stabilizowaną dzięki osłonie utworzonej przez aktywną transglutaminazę II (Fesus i in., 1996). Uważa się, że czynnikiem rozpoznawczym umierających komórek jest m.in. fosfatydyloseryna, eksponowana na ich powierzchni i rozpoznawana przez receptor PSR (ang. phosphatidylserine receptor) makrofagów czy innych komórek fagocytujących, przyczyniając się do szybkiego ich usuwania (Fadok i in., 2000; Savill, 1998) Strategie wykrywania symptomów śmierci apoptotycznej i nekrotycznej w komórkach Spośród dostępnych obecnie metod analizy śmierci apoptotycznej i nekrotycznej na szczególną uwagę zasługują techniki mikroskopowe i cytometryczne. Metody te są oparte na wykrywaniu zmian morfologii komórki, zmian struktury chromatyny, procesów degradacji DNA, a także na detekcji zmian struktury i funkcji transportowej błony komórkowej, zmian w aktywności organelli komórkowych, zmian w ekspresji genów, zmian w poziomie stężenia białek strukturalnych, regulatorowych i biokatalitycznych oraz w aktywności enzymów odgrywających zasadniczą rolę w szlakach metabolicznych apoptozy i nekrozy (Darzynkiewicz i Traganos, 1998; Darzynkiewicz i in., 2001a). Zmiany zachodzące w komórkach ulegających śmierci można analizować albo przyżyciowo, albo po odpowiednim utrwaleniu. Przyżyciowo określa się zazwyczaj integralność błony plazmatycznej, asymetryczne zmiany fosfolipidów zachodzące w błonie plazmatycznej, wewnątrzkomórkowe ph, poziom Ca 2+ i innych jonów, transbłonowy potencjał mitochondrialny (ΔΨm). Po utrwaleniu komórek oznacza się m.in. zawartość DNA genomowego i fazę komórek w cyklu mitotycznym, fragmentację DNA i obecność pęknięć nici DNA, kondensację chromatyny, ekspresję protoonkogenów (bcl-2, bax, czy c-myc), czy genów supresorów transformacji nowotworowej (p53), aktywację kaspaz wykrywanych immunocytochemicznie, proteolityczne rozszczepianie cząsteczki PARP, a także zmiany w morfologii jądra komórkowego (stopień jego fragmentacji) (McCarthy i Evan, 1998; Otsuki, 2000; Stadelmann i Lassmann, 2000). Rosnące zainteresowanie apoptozą komórek i mechanizmami regulacji tego procesu sprawiło, że powstają coraz to nowsze metody wykrywania apoptozy, wśród których znaczącą większość stanowią metody fluorescencyjne. Brak skutecznych procedur detekcji symptomów charakterystycznych dla fazy inicjatorowej oraz wczesnej fazy efektorowej apoptozy stał się bodźcem do opracowania nowych, alternatywnych metod pozwalających na stosunkowo wczesną

20 20 M. Samiec i M. Skrzyszowska diagnostykę śmierci fizjologicznej. Cechą charakterystyczną wczesnych stadiów apoptozy jest niewielka zmiana w przepuszczalności błony komórkowej. Mikropory powstające w zewnętrznej warstwie plazmolemmy można identyfikować przy wykorzystaniu fluorochromu YO-PRO-1 (Idziorek i in., 1995; Samiec i Skrzyszowska, 2012a, 2013). Metodą pozwalającą również na relatywnie wczesną diagnostykę apoptozy jest wykrywanie reszt fosfatydyloseryny na powierzchni błony cytoplazmatycznej za pomocą aneksyny V sprzężonej z izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC, ang. fluorescein isothiocyanate; metoda z reguły nieprzyżyciowa, często wymagająca utrwalania komórek) lub z białkiem intensywnej zieleni fluorescencyjnej (egfp, ang. enhanced green fluorescent protein; metoda przyżyciowa) (Martin i in., 1995a; Darzynkiewicz i in., 2001b; Martínez i Freyssinet, 2001; Samiec i Skrzyszowska, 2013, 2014; Samiec i in., 2013a; Skrzyszowska i in., 2006). W czasie apoptozy zachodzi translokacja fosfatydyloseryny z powierzchni wewnątrzkomórkowej na powierzchnię zewnątrzkomórkową. Antykoagulacyjne, niskocząsteczkowe białko amfitropowe aneksyna V (o masie molekularnej 35,8 kda), w obecności jonów Ca 2+, łączy się preferencyjnie z ujemnie naładowanymi fosfolipidami, takimi jak: fosfatydyloseryna, dzięki czemu stosuje się ją jako marker apoptozy. Podczas apoptozy komórki reagują z aneksyną V zaraz po rozpoczęciu kondensacji chromatyny, ale jeszcze przed utratą zdolności błony do wykluczania jodku propidyny (PI; ang. propidium iodide) (Blankenberg i in., 1999; Martin i in., 1996; Tait i in., 2006). Oznaczanie eksponowanych na powierzchni plazmolemmy komórek reszt PS przy użyciu aneksyny V sprzężonej np. z izotiocyjanianem fluoresceiny (ang. annexin V- fluorescein isothiocyanate/fitc) oraz weryfikacja stopnia przepuszczalności błony plazmatycznej dla PI, barwiącego DNA i RNA komórek o zaburzonej integralności błony, umożliwia odróżnienie komórek żywych, nieapoptotycznych (aneksyna V-FITC - /PI - ) od komórek wczesnoapoptotycznych (aneksyna V- FITC + /PI - ) oraz komórek późnoapoptotycznych i nekrotycznych (aneksyna V- FITC + /PI + ), a także od komórek martwych (aneksyna V-FITC - /PI + ), uszkodzonych w trakcie przygotowywania zawiesiny komórkowej do analizy. Wyznakowane koniugatem aneksyny V-FITC komórki, które emitują zieloną fluorescencję i/lub komórki barwiące się jodkiem propidyny, które emitują czerwoną fluorescencję, można analizować w cytometrze przepływowym i obserwować w mikroskopie fluorescencyjnym (Fadok i in., 1993; Griffith i in., 1995; Martin i in., 1996). Analizując apoptozę i nekrozę, należy wziąć pod uwagę, iż czas trwania śmierci komórkowej, począwszy od momentu zainicjowania do całkowitej dezintegracji i zniknięcia komórki, może być różny. Również liczba obserwowanych komórek apoptotycznych i nekrotycznych może się różnić w zależności od zastosowanej metody badawczej oraz przedziału czasowego upływającego pomiędzy zainicjowaniem śmierci i jej analizą. Ogólnie przyjmuje się, że apoptoza trwa krótko, najczęściej krócej niż mitoza. Wczesne etapy apoptozy zachodzą zwykle między trzecią a ósmą godziną po wzbudzeniu

21 Przyżyciowa analiza apoptozy w komórkach-dawcach jąder i w klonalnych zarodkach świni 21 autodestrukcyjnej śmierci komórki. Identyfikacja komórek apoptotycznych polega na określaniu pewnych charakterystycznych cech apoptozy, należy więc brać pod uwagę moment pojawienia się i czas trwania pewnych zmian, niektóre z nich są krótkotrwałe i przejściowe, a inne trwają dłużej (Denecker i in., 2001; Kitanaka i Kuchino, 1999). Jedną z cech umożliwiających odróżnienie komórek umierających od komórek żywych jest stopniowa utrata funkcji transportowych i przerwanie ciągłości monowarstw lipidowych błony komórkowej. Niezmieniona strukturalnie i właściwie funkcjonująca błona plazmatyczna normalnych, żywych komórek i błona komórek wczesnoapoptotycznych wykazują zdolność wykluczania lub, innymi słowy, są nieprzepuszczalne dla dodatnio naładowanych cząsteczek barwników, takich jak: błękit trypanu, jodek propidyny, jodek lub bromek etydyny, monoazydek etydyny, czy D-7-aminoaktynomycyna. Z kolei, komórki późnoapoptotyczne i komórki nekrotyczne w różnym stopniu wybarwiają się tymi fluorochromami na skutek zahamowania zjawiska selektywnej przepuszczalności plazmolemmy dla wielu niskocząsteczkowych związków organicznych (Baskić i in., 2006; Darzynkiewicz i Traganos, 1998). Do monitorowania procesu apoptozy można wykorzystywać wiele metod, które obejmują techniki umożliwiające diagnozowanie zarówno przebiegu śmierci fizjologicznej w obrębie populacji komórek, jak i jej przebiegu w obrębie pojedynczych komórek. Apoptozę można również analizować w zależności od stadium procesu, przy czym badania związane z detekcją zmian biochemicznych DNA są charakterystyczne dla późniejszych etapów (faza efektorowa po przekroczeniu punktu nieodwracalności przez molekularne szlaki przekaźnictwa sygnałów proapoptotycznych oraz faza destrukcyjna) (Otsuki, 2000; Stadelmann i Lassmann, 2000). Analiza TUNEL, stosowana do identyfikacji międzynukleosomowych pęknięć nici DNA w wyniku reakcji enzymatycznej z użyciem terminalnej transferazy deoksynukleotydowej (TdT), katalizującej łączenie znakowanych izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) nukleotydów z wolnymi końcami 3 -OH, pozwala na wyróżnienie komórek późnoapoptotycznych w mikroskopie fluorescencyjnym. Z kolei, w wariancie immunofluorescencyjnym tej metody wykorzystuje się terminalną deoksynukleotydową transferazę do przyłączania np. trifosforanu bromodeoksyurydyny Br-dUTP do wolnego końca 3 -OH w miejscu pęknięcia nici DNA oraz przeciwciało anty-brdu znakowane fluorochromem FITC. Do określenia całkowitej zawartości komórkowego DNA używa się jodku propidyny (Darzynkiewicz i in., 2001a; McCarthy i Evan, 1998).

22 22 M. Samiec i M. Skrzyszowska 2. CEL, UZASADNIENIE PODJĘCIA ORAZ ZAKRES BADAŃ Celem przeprowadzonych badań było określenie częstości występowania biochemicznych i biofizycznych zmian apoptotycznych w błonie plazmatycznej komórek blastocyst świni rozwijających się z oocytów rekonstytuowanych różnymi technikami klonowania somatycznego. Stosowane w procedurze klonowania somatycznego inwazyjne metody rekonstrukcji oraz sztucznej aktywacji oocytów mogą indukować procesy apoptozy w komórkach zarodków. W przypadku rekonstrukcji oocytów przy wykorzystaniu metod elektrofuzji kompleksów ooplast-komórka somatyczna lub doooplazmatycznej iniekcji karioplastów lub całych komórek dawców jąder, przyczyną śmierci apoptotycznej może być przejściowe naruszenie integralności błony plazmatycznej i dezorganizacja sieci mikrofilamentów aktynowych membranoszkieletu oraz cytoszkieletu strefy kortykalnej. Apoptoza może być również inicjowana w wyniku transmisji przedwczesnego sygnału aktywacyjnego podczas zabiegu wprowadzania jądra komórki somatycznej do środowiska cytoplazmatycznego oocytu-biorcy. Natomiast w przypadku aktywacji rekonstytuowanych oocytów przy użyciu czynników fizycznych (impulsy elektryczne) lub chemicznych (antybiotyki jonoforowe takie jak: jonofor wapnia A23187/kalcymycyna lub jonomycyna wapnia), bezpośrednim powodem uruchomienia programowanej śmierci komórkowej może być drastyczne naruszenie homeostazy wapniowej (izokalcemii) oocytu pod wpływem zjawiska ekscytotoksyczności jonów wapnia, indukowanego wszelkimi odchyleniami od oscylacyjnego sposobu wynurzania się fal przyrostu jonów Ca 2+ w cytoplazmie. Dlatego też podjęto badania zmierzające do wyjaśnienia roli potencjalnie apoptogennych czynników, jakimi mogą być zarówno metody rekonstrukcji, jak i sztucznej aktywacji oocytów, w inicjowaniu śmierci apoptotycznej w komórkach blastocyst klonalnych świni. Określenie roli metod rekonstrukcji i sztucznej aktywacji oocytów w uruchomieniu procesów apoptozy w komórkach zarodków klonalnych świni ma zatem decydujące znaczenie dla oceny ich potencjału rozwojowego zarówno w przed-, jak i poimplantacyjnej fazie embriogenezy, a następnie fetogenezy. Oszacowanie częstości występowania proapoptotycznych transformacji w błonie plazmatycznej komórek węzła zarodkowego i/lub trofoblastu blastocyst klonalnych jest z kolei pośrednim wskaźnikiem kondycji strukturalno-funkcjonalnej (jakości biochemicznej i biofizycznej) przedimplantacyjnych zarodków. Zastosowane metody przyżyciowego wykrywania biochemicznych i biofizycznych

23 Przyżyciowa analiza apoptozy w komórkach-dawcach jąder i w klonalnych zarodkach świni 23 symptomów śmierci apoptotycznej komórek w blastocystach klonalnych, z użyciem markerów testowych: aneksyny V sprzężonej z białkiem egfp oraz YO-PRO-1, zostały po raz pierwszy wykorzystane w badaniach nad klonowaniem somatycznym świń. Te metody diagnostyczne pozwalają na oznaczanie takich objawów apoptozy, jak: 1. eksternalizacja reszt fosfatydyloseryny na powierzchni plazmolemmy, 2. utrata asymetrii składu aminofosfolipidowego i formowanie mikroporów/mikrokanałów w dwuwarstwie lipidowej błony plazmatycznej oraz 3. powstawanie megakanałów ( dziur lipidowych ) w błonach mitochondrialnych. Niski stopień inwazyjności przyżyciowych metod analizy fluorycytochemicznej komórek blastocyst klonalnych zwiększa ich wartość aplikacyjną w ocenie jakości morfologicznej, biochemicznej i biofizycznej zarodków w tej fazie rozwoju przedimplantacyjnego. Metody te mogą mieć więc duże znaczenie dla prognozowania poimplantacyjnych zdolności rozwojowych zarodków klonalnych świni, ze względu na możliwość dokonywania selekcji blastocyst o wysokiej kondycji strukturalno-funkcjonalnej, która wynika z braku obecności komórek apoptotycznych lub z ich niewielkiego udziału w całkowitej liczbie komórek zarodkowych (tj. niskiej wartości indeksu apoptotycznego). Zmiany proapoptotyczne w komórkach hodowanych in vitro zarodków ssaków prowadzą do obniżenia ich jakości i przedimplantacyjnego potencjału rozwojowego. Efektem końcowym podjętego kierunku badań było zatem wskazanie powodów niskiej efektywności klonowania somatycznego świń i innych gatunków ssaków. To z kolei wymusiło potrzebę poszukiwania sposobów optymalizacji metod rekonstrukcji i sztucznej aktywacji oocytów, co przyczyniło się do zwiększenia zarówno jakości, jak i zdolności rozwojowych zarodków klonalnych. W ramach realizacji badań wyprowadzone zostały linie klonalne (szczepy komórkowe) fibroblastów z fragmentów tkanki skórno-powłokowej dorosłych osobników (loch i knurów), a także płodów. Przed wykorzystaniem w procedurze klonowania somatycznego, linie komórek fibroblastycznych, które hodowano in vitro do osiągnięcia stanu pełnej konfluencji, poddawane były synchronizacji cyklu mitotycznego w fazach G1/G0 metodą inhibicji kontaktowej migracji i proliferacyjnego wzrostu. Oocyty pozyskiwane z jajników loszek lub loch rzeźnych hodowane były in vitro na potrzeby klonowania somatycznego, aż do osiągnięcia stanu dojrzałości jądrowej i cytoplazmatycznej w stadium metafazy II podziału mejotycznego. Schemat pierwszej serii doświadczeń obejmował uzyskiwanie zarodków klonalnych świni z dojrzałych in vitro oocytów zrekonstruowanych metodą elektrofuzji kompleksów ooplast-komórka somatyczna. Z kolei, do stymulacji zarodkowego programu rozwojowego zrekonstytuowanych w wyniku elektrofuzji oocytów (cybryd klonalnych) zastosowano trzy protokoły sztucznej aktywacji: 1. jednoczesnej fuzji i aktywacji fizycznej (elektrycznej), 2. sekwencyjnej aktywacji fizykochemicznej oraz 3. pseudofizjologicznej/biologicznej post-aktywacji transkomplementarnej (transcytoplazmatycznej; oryginalna, nowatorska strategia) (Samiec i Skrzyszowska, 2014; Sa-

24 24 M. Samiec i M. Skrzyszowska miec i in., 2012). W kolejnej serii doświadczeń, do rekonstrukcji enukleowanych oocytów wykorzystano metodę docytoplazmatycznej iniekcji karioplastów lub całych komórek-dawców jąder. Sztuczna stymulacja rozwoju zarodkowego cybryd klonalnych, które zrekonstytuowano w następstwie bezpośredniej mikroiniekcji całych komórek fibroblastycznych lub wyizolowanych z nich karioplastów, przeprowadzona była w wyniku użycia trzech protokołów doświadczalnych: 1. opóźnionej aktywacji (post-aktywacji) ele-ktrycznej, 2. sekwencyjnej aktywacji fizykochemicznej oraz 3. pseudofizjologicznej post-aktywacji transkomplementarnej (Samiec i Skrzyszowska, 2014; Samiec i in., 2012). Ponadto, uzyskane w wyniku hodowli in vitro zarodków klonalnych blastocysty oceniane były przyżyciowo w kierunku wykrywania symptomów śmierci apoptotycznej przy wykorzystaniu metod analizy fluorycytochemicznej (za pośrednictwem koniugatu diagnostycznego aneksyny V-eGFP oraz fluorochromu YO-PRO-1). Równocześnie, przeprowadzana była przyżyciowo ilościowa analiza kondycji strukturalnej (jakości morfologicznej) uzyskanych blastocyst klonalnych na podstawie całkowitej liczby komórek zarodkowych (sumarycznej liczby komórek węzła zarodkowego i komórek trofoektodermalnych).

25 Przyżyciowa analiza apoptozy w komórkach-dawcach jąder i w klonalnych zarodkach świni METODYKA BADAŃ 3.1. Uzyskiwanie zarodków świni technikami klonowania somatycznego Pozyskiwanie i dojrzewanie mejotyczne in vitro oocytów-biorców egzogennych jąder komórkowych Źródłem oocytów były jajniki loszek i loch uzyskiwane w lokalnej rzeźni. Niedojrzałe oocyty świni (w stadium pęcherzyka zarodkowego/gv; ang. germinal vesicle, czyli diktiotenu profazy I podziału mejotycznego) pozyskiwane były metodą aspiracji z antralnych pęcherzyków jajnikowych o średnicy 2 6 mm. Ocena jakości oocytów dokonywana była na podstawie obecności i wyglądu otaczających je komórek wzgórka jajonośnego oraz stanu morfologicznego cytoplazmy. Do oocytów morfologicznie prawidłowych, tj. przydatnych do hodowli in vitro, były zaliczane oocyty otoczone dużym kompleksem komórek wzgórka jajonośnego, złożonym minimum z trzech zwartych warstw, przylegających ściśle zarówno do siebie, jak i do wieńca promienistego oraz posiadające ciemno zabarwioną, jednolicie granulowaną cytoplazmę, niewykazującą zmian degeneracyjnych (nekrotycznych lub apoptotycznych). Wyselekcjonowane do dojrzewania mejotycznego (IVM; ang. in vitro maturation) oocyty hodowane były w 500 µl pożywki, która sporządzona była na bazie zbuforowanej 25 mm L -1 kwasu N-2-hydroksyetylopiperazyno-N -2-etanosulfonowego (HEPES) i 26,2 mm L -1 NaHCO 3 pożywki TCM-199 (ang. Tissue Culture Medium-199; Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis; MO, USA). Hodowla oocytów przeprowadzana była w inkubatorze o ściśle określonych warunkach termicznoatmosferycznych (39 C, 5% CO 2 w powietrzu, maksymalna wilgotność względna). Pożywka do IVM, którą nawarstwiono lekkim olejem mineralnym, uzupełniona była 1 mm L -1 cyklicznego dibutyryloadenozynomonofosforanu (dwumaślan camp/bukladezyna; db-camp; Sigma-Aldrich) oraz mieszaniną 10 IU ml -1 gonadotropiny kosmówkowej źrebnych klaczy (ecg/pmsg; Sigma- Aldrich) i 10 IU ml -1 ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej (hcg; Sigma- Aldrich). Ponadto pożywka hodowlana wzbogacona była dodatkiem 4 mg ml -1 frakcji V albuminy surowicy bydlęcej (BSA-V; Sigma-Aldrich), 10% płynu wyizolowanego z antralnych pęcherzyków jajnikowych świni (pff), 0,6 mm L -1 L-cysteiny (Sigma-Aldrich) oraz 10 ng ml -1 rekombinowanego epidermalnego czynnika wzrostowego człowieka (rhegf; Sigma-Aldrich). Po około 20 godzinach hodowli oocyty były przenoszone do tej samej pożywki, lecz pozbawionej

26 26 M. Samiec i M. Skrzyszowska db-camp oraz liofilizowanych dodatków hormonalnych (ecg/pmsg i hcg). W tych warunkach fizykochemicznych oocyty były hodowane in vitro przez kolejne godziny, aż do czasu osiągnięcia dojrzałości jądrowej i cytoplazmatycznej. Dojrzałe in vitro oocyty z wyraźnie wyodrębnionymi ciałkami kierunkowymi (polocytami) I rzędu i jednolicie granulowaną cytoplazmą, niewykazującą symptomów pronekrotycznych lub proapoptotycznych, stanowiły źródło biorców dla jąder komórek somatycznych (fibroblastycznych) (Samiec i Skrzyszowska, 2010a, 2014) Wyprowadzenie linii komórek fibroblastycznych z tkanki skórnopowłokowej dorosłych osobników lub płodów Źródłem dawców jąder komórkowych w procedurze klonowania somatycznego były fibroblasty pochodzenia skórnego dorosłych osobników lub płodów (Samiec i Skrzyszowska, 2012a; Samiec i in., 2013a, b; Skrzyszowska i in., 2008). Pierwotne hodowle komórkowe wyprowadzane były z izolowanych fragmentów dermalnej tkanki usznej dojrzałych płciowo loszek/loch i knurów, a także z bioptatów tkankowych układu skórno-powłokowego płodów. Eksplanty tkankowe poddawane były dezagregacji mechanicznej, a następnie drobne skrawki tkanki skórno-powłokowej były trypsynizowane w celu rozproszenia komórek. Hodowle komórkowe prowadzone były w podstawowej pożywce Eagle a w modyfikacji Dulbecco (DMEM; ang. Dulbecco s Modified Eagle s Medium; Sigma-Aldrich). Pożywka DMEM wzbogacona była dodatkiem 10% surowicy płodów bydlęcych (FBS; ang. foetal bovine serum; Sigma-Aldrich), 5 ng ml -1 rekombinowanego zasadowego czynnika wzrostu fibroblastów człowieka (rh-bfgf; Sigma-Aldrich) i 2 mm L -1 mieszaniny aminokwasów endogennych (NEAA; Sigma-Aldrich). Ponadto, uzupełniona ona była 2 mm L -1 L- glutaminy (Sigma-Aldrich), 0,4 mm L -1 pirogronianu sodu (Sigma-Aldrich) oraz 1% mieszaniny antybiotyków i mykostatyków (AAS; Sigma-Aldrich). Hodowane komórki były pasażowane po zagęszczeniu do stanu pełnej konfluencji. Wyprowadzone linie klonalne (szczepy) komórek były zamrażane w ciekłym azocie. Po rozmrożeniu komórki danej subpopulacji były hodowane in vitro do osiągnięcia stanu pełnej konfluencji. W stanie 100% konfluencji szczepy komórkowe podlegały godzinnej inhibicji kontaktowej migracji i proliferacyjnego wzrostu, w celu synchronizacji cyklu mitotycznego fibroblastów w fazach G1/G0 przed wykorzystaniem ich jako dawców jąder w procedurze klonowania. Do klonowania somatycznego użyte były linie nieapoptotycznych/nienekrotycznych (tj. YO-PRO-1-negatywnych i/lub aneksynoujemnych) komórek fibroblastycznych, pochodzące z wczesnych (2-6) pasaży (Samiec i Skrzyszowska, 2012a, 2013; Samiec i in., 2013a; Skrzyszowska i in., 2006). Na potrzeby zabiegu klonowania poszczególne subpopulacje komórkowe fibroblastów były trypsynizowane i wirowane, w celu uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek.

27 Przyżyciowa analiza apoptozy w komórkach-dawcach jąder i w klonalnych zarodkach świni Przyżyciowa diagnostyka fluorescencyjna komórek-dawców jąder pod kątem zmian wczesnoapoptotycznych Przygotowanie komórek somatycznych do analizy w kierunku apoptozy Około minut przed zabiegiem klonowania somatycznego, subpopulacje hodowanych do stanu pełnej konfluencji fibroblastów, których cykl komórkowy został zsynchronizowany w stadiach G1/G0 w wyniku inhibicji kontaktowej migracji i proliferacyjnego wzrostu, poddawano standardowej trypsynizacji. Następnie uzyskane po energicznym pipetowaniu zawiesiny komórkowe w roztworze TCM-199/HEPES (Sigma-Aldrich) uzupełnionym 10% FBS były przenoszone do konikalnych probówek wirówkowych i wirowane w temperaturze pokojowej, ze względnym przyśpieszeniem odśrodkowym 300 g (odpowiadającym prędkości kołowej ω rzędu 246 obrotów/minutę) przez 10 minut. Po odwirowaniu próbek fibroblastów supernatant był zdekantowany. Natomiast w celu sporządzenia zawiesiny pojedynczych komórek przez wielokrotne pipetowanie i jej rozcieńczenia do uzyskania gęstości rzędu do komórek w przeliczeniu na 1 ml objętości płynu, zsedymentowany na dnie probówki wirówkowej osad komórkowy był przemywany 1 ml medium do manipulacji komórek somatycznych w warunkach atmosferycznych TCM- 199/HEPES/BSA-V lub 1 ml diagnostycznego roztworu buforującego (Becton, Dickinson and Co., BD Biosciences; CLONTECH Laboratories, Inc., East Meadow Circle, Palo Alto, CA, USA). W celu rozpoznania ultrastrukturalnych i cytobiochemicznych symptomów wczesnej apoptozy, komórki fibroblastyczne, które stanowiły źródło dawców jąder komórkowych w procedurze klonowania somatycznego, poddawane były przyżyciowej diagnostyce fluorescencyjnej z wykorzystaniem jednego z dwóch markerów testowych: 1) żółto-zielonego fluorochromu DNA YO-PRO-1 w rozpuszczalniku organicznym DMSO w stosunku objętościowym 1 μl roztworu diagnostycznego (Vybrant TM Apoptosis Assay Kit 4; Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA), o stężeniu 100 μm L -1 DMSO, do 1 ml zawiesiny komórek w pożywce TCM-199/HEPES/BSA-V; 2) aneksyny V sprzężonej z białkiem intensywnej zieleni fluorescencyjnej (egfp; białko fluorygeniczne wyizolowane z meduzy stułbiopława Aequorea victoria) w stosunku objętościowym 5 μl koniugatu diagnostycznego (ApoAlert TM Annexin V-EGFP Apoptosis Kit; Becton, Dickinson and Co., BD Biosciences; CLONTECH Laboratories, Inc., East Meadow Circle, Palo Alto, CA, USA) [ApoAlert TM Apo 2.7/Annexin V- EGFP Kit; CLONTECHniques], o stężeniu 40 μg ml -1 roztworu PBS, do 200 μl 1 stężonego buforu wiążącego nadmiar nieprzyłączonych preferencyjnie do ujemnie naładowanych reszt fosfatydyloseryny (PS) cząsteczek reagentu aneksyny V-eGFP. Diagnostyczny roztwór buforujący (bufor reakcyjny) o słabym odczynie alkalicznym (ph 7,4) stanowił

28 28 M. Samiec i M. Skrzyszowska mieszaninę 10 mm L -1 hydroksysoli sodowej kwasu N-2-hydroksyetylopiperazyno-N -2-etanosulfonowego (N-2-hydroksyetylopiperazyno-N -2-etanohydroksysulfonian sodu; HEPES/NaOH; C 16 H 35 N 4 NaO 8 S 2 ), 140 mm L -1 chlorku sodu (NaCl), 2 mm L -1 chlorku wapnia (CaCl 2 ), 5 mm L -1 chlorku potasu (KCl) oraz 1 mm L -1 chlorku magnezu (MgCl 2 ). W przypadku znakowania DNA genomowego komórek fluorochromem YO-PRO-1, fibroblasty płodowe lub fibroblasty tkanki skórnej dorosłych osobników były inkubowane w roztworze barwiącym przez minut, w warunkach atmosferycznych, w temperaturze pokojowej, przy całkowitym braku światła dziennego/białego (sztucznego i/lub naturalnego) (Samiec i Skrzyszowska, 2012a, 2013). Z kolei, w przypadku znakowania reszt PS błony cytoplazmatycznej komórek koniugatem aneksyny V oraz fluorygenicznego białka egfp, fibroblasty były inkubowane w roztworze barwiącym przez 5 15 minut, w warunkach atmosferycznych, w temperaturze pokojowej (Samiec i Skrzyszowska, 2013, Samiec i in., 2013a; Skrzyszowska i in., 2006). Od momentu umieszczenia komórek w roztworze barwiącym wszystkie czynności należy wykonywać w ciemności Fluorescencyjna detekcja apoptozy w komórkach fibroblastycznych Po wzbudzeniu (ekscytancji) kompleksów YO-PRO-1-DNA (fot. 1B, 2B) lub aneksyną V-eGFP-PS (fot. 3B, 4B) spolaryzowanym niebieskim pasmem falowym światła białego (o maksymalnej długości fali absorpcyjnej, czyli wzbudzającej λ ab/max =488 nm) w mikroskopie epi-fluorescencyjnym, analizowano 60 reprezentatywnych próbek losowych z różnych subpopulacji wybarwionych komórek fibroblastycznych, obserwując i oceniając poziom emitowanej przez apoptotyczne lub nekrotyczne komórki żółto-zielonej lub zielonej biochemiluminescencji (przy maksymalnym zakresie długości wysyłanej fali świetlnej λ em/max =530 nm) Ocena morfologiczna komórek-dawców jąder na podstawie cech charakterystycznych dla późnej apoptozy lub nekrozy (martwicy) Pozytywna selekcja nieapoptotycznych/nienekrotycznych komórek przeznaczonych na dawców jąder komórkowych w procedurze klonowania (ryc. 2) była prowadzona w komorze do mikromanipulacji nie tylko w oparciu o cytochemiczne metody fluorescencyjnego wykrywania oznak wczesnoapoptotycznych lub nekrotycznych w błonie cytoplazmatycznej, lecz także w oparciu o przyjęte kryteria morfologiczne, umożliwiające detekcję zewnętrznych zmian strukturalnych błony cytoplazmatycznej oraz zmian biofizycznych cytoplazmy towarzyszących molekularnemu scenariuszowi apoptozy lub nekrozy. Eliminowane były zatem komórki martwe, czyli uszkodzone w trakcie ich trypsynizacji i/lub późniejszego przygotowywania do analizy fluorescencyjnej, a także ko-

29 Przyżyciowa analiza apoptozy w komórkach-dawcach jąder i w klonalnych zarodkach świni 29 mórki wykazujące: 1) martwicze lub 2) późnoapoptotyczne symptomy morfologiczne, a wśród nich, odpowiednio: 1) komórki wykazujące takie zmiany degeneracyjne w obrębie cytoplazmy jak np. wakuolizacja, brak homogenności cytozolu, niejednolite lecz spolaryzowane rozmieszczenie ziarnistości cytoplazmatycznych, komórki pyknotyczne, czyli z objawami osmotycznego pęcznienia cytoplazmy i organelli wewnątrzkomórkowych lub 2) komórki obkurczone, niemające kształtu sferycznego i posiadające pofałdowaną powierzchnię plazmolemmy, pokrytą licznymi strukturami pęcherzyko-podobnymi (ang. blebbing), powstającymi w wyniku biodegradacji membranoszkieletu i cytoszkieletu oraz komórki ulegające fragmentacji na tzw. ciałka apoptotyczne (fot. 1A, 2A, 3A, 4A) Fot. 1A. Ocena morfologiczna znakowanych fluorochromem YO-PRO-1, konfluentnych fibroblastów płodowych świni dawców jąder w procedurze klonowania somatycznego pod kątem detekcji symptomów apoptozy lub nekrozy. 1 komórka późnoapoptotyczna (obkurczona, z pofałdowaną powierzchnią plazmolemmy); 2 komórka nekrotyczna (pyknotyczna, z objawami osmotycznego pęcznienia i wakuolizacji cytoplazmy). Obraz rzeczywisty, odwrócony w mikroskopie epi-fluorescencyjnym, w świetle białym (powiększenie: 200)

30 30 M. Samiec i M. Skrzyszowska Fot. 1B. Przyżyciowa analiza fluorescencyjna fibroblastów płodowych, poddanych barwieniu fluorochromem YO-PRO-1. YO-PRO-1-pozytywne komórki apoptotyczne lub nekrotyczne emitują zółto-zieloną chemiluminescencję po wzbudzeniu kompleksów YO-PRO-1-DNA niebieskim pasmem falowym światła białego (powiększenie: 200) Fot. 2A. Ocena morfologiczna barwionych fluorochromem YO-PRO-1, konfluentnych fibroblastów tkanki skórnej ucha dojrzałej płciowo loszki pod kątem detekcji oznak proapoptotycznych lub pronekrotycznych. 1 komórka późnoapoptotyczna (obkurczona, z pofałdowaną powierzchnią plazmolemmy); 2 komórka nekrotyczna (pyknotyczna, z objawami osmotycznego pęcznienia i wakuolizacji cytoplazmy). Obraz rzeczywisty, odwrócony w mikroskopie epi-fluorescencyjnym, w świetle białym (powiększenie: 200)

31 Przyżyciowa analiza apoptozy w komórkach-dawcach jąder i w klonalnych zarodkach świni 31 Fot. 2B. Analiza fluorycytochemiczna fibroblastów skóry loszki, poddanych barwieniu fluorochromem YO-PRO-1. YO-PRO-1-pozytywne komórki apoptotyczne lub nekrotyczne fluoryzują na żółto-zielono po absorpcji przez kompleksy YO-PRO-1-DNA światła niebieskiego (powiększenie: 200) Fot. 3A. Ocena morfologiczna znakowanych aneksyną V-eGFP, konfluentnych fibroblastów płodowych świni dawców jąder w procedurze klonowania somatycznego pod kątem wykrywania symptomów śmierci apoptotycznej lub śmierci nekrotycznej (martwiczej). 1 komórka późnoapoptotyczna (obkurczona, z pofałdowaną powierzchnią oraz pęcherzykowatością plazmolemmy); 2 komórka nekrotyczna (pyknotyczna, z objawami osmotycznego pęcznienia i wakuolizacji cytoplazmy). Obraz rzeczywisty, odwrócony w mikroskopie epifluorescencyjnym, w świetle białym (powiększenie: 200)

32 32 M. Samiec i M. Skrzyszowska Fot. 3B. Przyżyciowa analiza fluorescencyjna fibroblastów płodowych, poddanych znakowaniu aneksyną V-eGFP. Aneksynododatnie komórki apoptotyczne lub nekrotyczne emitują zieloną chemiluminescencję po wzbudzeniu kompleksów egfp-aneksyna V-PS spolaryzowanym pasmem niebieskim światła białego (powiększenie: 200) Fot. 4A. Ocena morfologiczna znakowanych aneksyną V-eGFP, konfluentnych fibroblastów tkanki skórnej ucha lochy pod kątem detekcji proapoptotycznych lub pronekrotycznych zmian w błonie plazmatycznej i cytozolu. 1 komórka późnoapoptotyczna (obkurczona, z pofałdowaną powierzchnią plazmolemmy); w analizowanej próbce losowej nie stwierdzono obecności komórek nekrotycznych. Obraz rzeczywisty, odwrócony w mikroskopie epifluorescencyjnym, w świetle białym (powiększenie: 200)

33 Przyżyciowa analiza apoptozy w komórkach-dawcach jąder i w klonalnych zarodkach świni 33 Fot. 4B. Analiza fluorycytochemiczna fibroblastów skóry lochy, poddanych znakowaniu koniugatem aneksyny V-eGFP. Aneksynododatnie komórki apoptotyczne (na podstawie oceny morfologicznej stwierdzono brak obecności komórek nekrotycznych) fluoryzują na zielono po absorpcji niebieskiego widma światła widzialnego (powiększenie: 200) Enukleacja (wyjądrzanie) oocytów Wyselekcjonowane do procedury klonowania somatycznego oocyty poddawano zabiegowi usunięcia DNA genomowego (ryc. 2) przy wykorzystaniu dwóch metod enukleacji: mikrochirurgicznej ślepej (mechaniczna eliminacja chromosomów matecznych bez ich fluorescencyjnego wybarwiania) (fot. 6A) lub mikrochirurgicznej wspomaganej chemicznie (ryc. 1, fot. 5A, B, C) Enukleacja mikrochirurgiczna ślepa Bezpośrednio przed zabiegiem enukleacji dojrzałe in vitro oocyty były inkubowane w temperaturze 39 C, przez minut, w pożywce TCM- 199/HEPES z dodatkiem 4 mg ml -1 BSA-V, uzupełnionej 7,5 μg ml -1 cytochalazyny B (CB; Sigma-Aldrich). Cytochalazyna B jest mykotoksyną wyizolowaną z Helminthosporium dermatoideum o wysokim współczynniku przenikalności przez błonę plazmatyczną komórek Eucaryota, która stosowana jest powszechnie jako odwracalny inhibitor polimeryzacji monomerycznej (globularnej) formy aktyny do postaci fibrylarnej, formującej mikrofilamenty cytoszkieletu i membranoszkieletu. Dlatego też stanowi ona czynnik indukujący przejściową relaksację cyto- i membranoszkieletu operowanego oocytu, która prowadzi z kolei do zwiększenia stopnia elastyczności plazmolemmy komórki-biorcy egzogennego DNA jądrowego oraz stopnia jej oporności na odkształcenia mechaniczne,

34 34 M. Samiec i M. Skrzyszowska spowodowane penetracją ooplazmy przez szklane mikroinstrumenty. Po wstępnej ekspozycji na działanie cytochalazyny B, oocyty były przenoszone do komory wypełnionej roztworem TCM-199/HEPES z dodatkiem 4 mg ml -1 BSA-V oraz 7,5 g ml -1 CB, w której dokonywane były mikromanipulacje. Wszystkie zabiegi z zakresu genetycznej inżynierii embrionalnej przeprowadzane były przy wykorzystaniu zestawu mikromanipulatorów firmy Leitz (Ernst Leitz Wetzlar GmbH, Niemcy), sprzężonego z epi-fluorescencyjnym mikroskopem odwróconym firmy Olympus IMT-2 (Tokyo, Japonia). Wyposażenie mikroskopu obejmowało: 1. płytkę grzejną (temp. 39 C); 2. kontrastowo-fazowy system optyczny Nomarskiego (tzw. kontrast dyferencyjno-interferencyjny; DIC, ang. differential interference contrast); 3. przystawkę fluorescencyjną ze zwierciadłem dichroicznym/dychromatycznym oraz 4. układ szeregowy/blok filtrów optycznych UV-2A dla widma nadfioletowego światła widzialnego (zakres długości fali wzbudzającej/absorpcyjnej wahający się od λ min =330 nm do λ max =380 nm) i dla niebieskiego pasma falowego światła białego (zakres długości fali wzbudzającej od λ min =420 nm do λ max =488 nm). Na prawym ramieniu mikromanipulatora zamontowana była pipeta przytrzymująca oocyty (ang. holding pipette), w której wielkość podciśnienia lub ciśnienia dodatniego regulowana była strumieniem powietrza, generowanym przez manualną mikropompkę pneumatyczną (CellTram Air System; Eppendorf, Molecular Technologies; Vision Park, Histon, Cambridge, Wielka Brytania). Na przeciwnym ramieniu mikromanipulatora umocowana była dwufunkcyjna pipeta manipulacyjna (enukleacyjna oraz iniekcyjna), w której poziom ciśnienia ujemnego lub dodatniego kontrolowany był strumieniem cieczy (lekkiego oleju mineralnego), generowanym przez ręczną mikropompkę hydrauliczną (CellTram Oil System; Eppendorf, Molecular Technologies; Vision Park, Histon, Cambridge, Wielka Brytania). W mikroskopie odwróconym weryfikowany był ostatecznie stan dojrzałości jądrowej i cytoplazmatycznej wyselekcjonowanych uprzednio oocytów (wstępna selekcja w mikroskopie stereoskopowym) i usuwane były obserwowane sporadycznie oocyty z prześwitującym przez ziarnistości cytoplazmatyczne pęcherzykiem zarodkowym (GV; ang. germinal vesicle). Unieruchomione przy pomocy pipety przytrzymującej oocyty poddawane były mikrochirurgicznemu zabiegowi eliminacji chromosomów ułożonych w płytce metafazowej wrzeciona II podziału mejotycznego. Pipeta enukleacyjna wprowadzana była pod osłonkę przejrzystą oocytu, a następnie metodą aspiracji usuwane było ciałko kierunkowe I rzędu wraz z fragmentem przylegającej cytoplazmy (maksymalnie do ok % objętości oocytu), zawierającym chromosomy metafazowe (fot. 6A, B) Wspomagana chemicznie enukleacja mikrochirurgiczna oocytów Przed zabiegiem eliminacji chromosomów matczynych (enukleacji), uwolnione z komórek wzgórka jajonośnego, dojrzałe in vitro oocyty były inkubowane przez 1 godzinę w wolnej od jonów Ca 2+ pożywce TCM-199/HEPES uzupełnionej 4 mg ml -1 BSA-V oraz mieszaniną 0,4 µg ml -1 demekolcyny/kolcemidu (DMCC; inhibitor polimeryzacji mikrotubuli wrzeciona kariokine-

35 Przyżyciowa analiza apoptozy w komórkach-dawcach jąder i w klonalnych zarodkach świni 35 tycznego; Sigma-Aldrich) oraz 0,05 M L -1 sacharozy (osmotycznie czynny disacharyd indukujący wzrost objętości przestrzeni okołożółtkowej; Sigma- Aldrich). Następnie oocyty z wyraźnie widocznym w przejściowo powiększonej przestrzeni okołożółtkowej stożkowatym uwypukleniem plazmolemmy, które zostało uformowane w pobliżu I ciałka kierunkowego w następstwie oddziaływania DMCC i sacharozy (fot. 5A, B), były przenoszone z roztworu hiperosmotycznego do komory mikromanipulacyjnej, wypełnionej izotonicznym roztworem pożywki TCM-199/HEPES z dodatkiem 4 mg ml -1 BSA-V oraz 7,5 µg ml - 1 CB. Niewielki fragment cytoplazmy oocytu (charakterystyczny stożek ooplazmatyczny), do którego nastąpiło indukowane chemicznie (za pośrednictwem DMCC) przemieszczenie płytki metafazowej wrzeciona II podziału mejotycznego, był usuwany mikrochirurgicznie wraz z polocytem I rzędu za pomocą pipety enukleacyjnej (mechaniczne oderwanie mostka cytoplazmatycznego pod wpływem indukowanego podciśnienia) (Samiec i Skrzyszowska, 2012b; Samiec i in., 2012; Samiec i in., 2015) (ryc. 1, fot. 5C). Ryc. 1. Schemat enukleacji dojrzałego mejotycznie oocytu (w stadium metafazy II; MII) przy zastosowaniu wspomaganej chemicznie metody mikrochirurgicznej. Zabieg eliminacji powstałego w wyniku działania demekolcyny i sacharozy stożka ooplazmatycznego, zawierającego zespół silnie skondensowanych chromosomów metafazowych, przy użyciu pipety enukleacyjnej Rekonstrukcja enukleowanych oocytów (transplantacja jąder komórek somatycznych do enukleowanych oocytów) Przygotowana wcześniej zawiesina pojedynczych komórek fibroblastycznych umieszczana była w komorze do mikromanipulacji, wypełnionej pożywką TCM-199/HEPES z dodatkiem 4 mg ml -1 BSA-V i 7,5 µg ml -1 CB. Do zabiegu transplantacji jąder komórkowych wybierane były nieapoptotyczne/nienekrotyczne (tj. YO-PRO-1-negatywne i/lub aneksynoujemne) komórki

36 36 M. Samiec i M. Skrzyszowska fibroblastyczne o średnicy wahającej się od 10 do 20 m, posiadające sferyczny kształt oraz gładką, niepofałdowaną błonę cytoplazmatyczną (fot. 7). W doświadczeniach zastosowane były dwie metody rekonstrukcji oocytów z jąder nieapoptotycznych/nienekrotycznych komórek fibroblastycznych. W pierwszej metodzie enukleowane oocyty (ooplasty) świni rekonstruowane były przy wykorzystaniu techniki fuzji indukowanej impulsami prądu stałego (elektrofuzja). Wyselekcjonowane, pojedyncze komórki fibroblastyczne wprowadzane były do przestrzeni okołożółtkowej ooplastów (przez tę samą szczelinę w osłonce przejrzystej, którą wydrążono w czasie enukleacji oraz przy wykorzystaniu tej samej pipety manipulacyjnej, jak w przypadku enukleacji) (ryc. 2, fot. 8A, B). W czasie zabiegu iniekcji komórki somatycznej pod osłonkę przejrzystą enukleowanego oocytu zwracano szczególną uwagę na to, aby zdeponowana w przestrzeni okołożółtkowej komórka fibroblastyczna, zaklinowana między osłonką przejrzystą a oolemmą, ściśle przylegała do zewnętrznej powierzchni błony cytoplazmatycznej ooplastu (fot. 8C). Uzyskane kompleksy cytoplastów/ooplastów oraz komórek-dawców jąder były przemywane w 500 μl mieszaniny pożywki TCM-199/HEPES/BSA-V oraz izotonicznego roztworu dielektryku w stosunku objętościowym 1:1, a następnie ekwilibrowane w temperaturze 39 C, przez 1 2 minuty, w czystym roztworze dielektryku, stanowiącym właściwe medium do elektrofuzji. Różnice w czasie przeprowadzania aktywacji zrekonstruowanych oocytów względem zabiegu fuzji elektrycznej ooplastów i komórek-dawców jąder determinowały skład chemiczny tego medium. W przypadku eksperymentalnego protokołu jednoczesnej fuzji i aktywacji elektrycznej (F E /A E ) roztwór o wysokim współczynniku przenikalności dielektrycznej był sporządzany na bazie 0,3 M D- mannitolu (osmolarność rzędu 280 mosm; Sigma-Aldrich) uzupełnionego 1,0 mm L -1 chlorku wapnia (CaCl 2 ; Sigma-Aldrich), 0,1 mm L -1 siarczanu (VI) magnezu (MgSO 4 ; Sigma-Aldrich) oraz 0,2 mg ml -1 wolnej od kwasów tłuszczowych frakcji albuminy surowicy bydlęcej (FAF-BSA; ang. fatty acid-free bovine serum albumin; Sigma-Aldrich). W przypadku zaś protokołu sekwencyjnej aktywacji fizykochemicznej (SA F-C ), złożonego z dwóch etapów: F E /A E oraz opóźnionej reaktywacji chemicznej, roztwór ten był przygotowywany na bazie 0,3 M D-mannitolu z dodatkiem 50 µm L -1 CaCl 2, 0,1 mm L -1 MgSO 4 i 0,2 mg ml -1 FAF-BSA. Wyselekcjonowane do zabiegu elektrofuzji kompleksy ooplastkomórka somatyczna były umieszczane w komorze do elektroporacji/elektropermeabilizacji błon cytoplazmatycznych, wypełnionej 2 3 ml roztworu tego samego dielektryku, między dwiema równoległymi w stosunku do siebie elektrodami. Odległość między elektrodami wynosiła 500 μm. Po manualnym ustawieniu kompleksów komórkowych w taki sposób, aby płaszczyzna styczności (adhezji) błon cytoplazmatycznych ooplastu i komórki fibroblastycznej była zorientowana jednocześnie w kierunku równoległym do przebiegu elektrod, natomiast prostopadłym do wektora linii sił pola elektrostatycznego, przy użyciu elektromanipulatora komórkowego (BTX Electro-cell Manipulator 200; San Diego, CA, USA) generowane były dwa następujące bezpośrednio po

37 Przyżyciowa analiza apoptozy w komórkach-dawcach jąder i w klonalnych zarodkach świni 37 sobie impulsy prądu stałego o natężeniu pola elektrostatycznego rzędu 1,2 kv cm -1 odległości między elektrodami (ryc. 2). Czas trwania każdego z dwóch impulsów elektrycznych wynosił 60 μsek (Samiec i Skrzyszowska, 2012a,b; Samiec i in., 2013b, 2015; Skrzyszowska i in., 2008). Po fuzjogennej stymulacji elektrycznej, adherentne kompleksy enukleowanych oocytów i komórek fibroblastycznych były pozostawiane jeszcze na okres 30 sekund do 1 minuty w roztworze dielektryku, a następnie przemywane w pożywce TCM-199/HEPES z dodatkiem 0,4% BSA-V. W kolejnym etapie rekonstytuowane oocyty były przenoszone na okres trwający od 30 minut do 1 godziny do ekwilibrowanych w inkubatorze CO 2 (nawarstwionych lekkim olejem mineralnym) 50-μL kropli wolnej od jonów Ca 2+ pożywki NCSU-23 (ang. North Carolina State University-23) uzupełnionej 4 mg ml -1 BSA-V, w celu stopniowego wchłonięcia struktury cytoszkieletu i membranoszkieletu komórki-dawcy jądra wraz z pozostałymi jej organellami do mikrośrodowiska cytoplazmatycznego oocytu. Po tym czasie w mikroskopie stereoskopowym weryfikowana była skuteczność procesu elektrofuzji komórek. Prawidłowo zrekonstruowane oocyty były hodowane in vitro (protokół jednoczesnej fuzji i aktywacji elektrycznej) lub poddawane działaniu chemicznych czynników aktywujących, a następnie hodowane in vitro (protokół dwustopniowej aktywacji fizykochemicznej), natomiast niezintegrowane pary cytoplastów i komórek-dawców jąder były albo eliminowane, albo re-fuzjowane i inkubowane ponownie około 0,5 godziny w pożywce NCSU-23/BSA-V, w celu powtórnej kontroli efektywności fuzjogennego zabiegu elektroporacji błon plazmatycznych. W drugiej metodzie rekonstrukcji oocytów z jąder komórek somatycznych wykorzystana była mikrochirurgiczna technika doooplazmatycznej iniekcji karioplastów wyizolowanych z dużych komórek somatycznych (o średnicy μm) (ryc. 2, fot. 9A, B) lub iniekcji małych komórek somatycznych (o średnicy μm) (ryc.2), która polegała na wprowadzeniu materiału genetycznego całej komórki somatycznej bezpośrednio do cytoplazmy enukleowanych oocytów (Samiec i Skrzyszowska, 2005a, b, 2010a, 2013, 2014; Samiec i in., 2012) Sztuczna aktywacja zrekonstruowanych oocytów Do aktywacji oocytów zrekonstytuowanych z jąder komórek fibroblastycznych (cybryd klonalnych/hybryd jądrowo-ooplazmatycznych) (ryc. 2) zastosowane były cztery protokoły eksperymentalne: 1) jednoczesnej fuzji i aktywacji fizycznej (elektrycznej); 2) opóźnionej aktywacji (post-aktywacji) elektrycznej; 3) sekwencyjnej aktywacji fizykochemicznej oraz 4) pseudofizjologicznej/biologicznej post-aktywacji transkomplementarnej (transcytoplazmatycznej). Protokół jednoczesnej fuzji/aktywacji elektrycznej (F E /A E ). Impulsy elektryczne, indukujące fuzję kompleksów ooplast-komórka somatyczna, były równocześnie bodźcami inicjującymi aktywację rekonstruowanych oocytów.

38 38 M. Samiec i M. Skrzyszowska Kompleksy enukleowanych oocytów oraz komórek fibroblastycznych były poddawane elektroporacji błon plazmatycznych przy użyciu 2 generowanych bezpośrednio po sobie impulsów prądu stałego o natężeniu pola elektrostatycznego 1,2 kv cm -1 i czasie trwania 60 μsek każdy. Zabieg przeprowadzany był w roztworze izotonicznego dielektryku (0,3 M D-mannitolu) o podwyższonym do 1 mm L -1 stężeniu CaCl 2 (Samiec i Skrzyszowska, 2012b; Samiec i in., 2013a, b, 2015). Protokół post-aktywacji elektrycznej (A E ). Zrekonstytuowane oocyty podlegały działaniu impulsów prądu stałego (o takich samych parametrach technicznych jak wcześniej), w obecności 1 mm L -1 CaCl 2, 1 1,5 godziny po docytoplazmatycznej mikroiniekcji karioplastów lub całych komórek somatycznych (Samiec i Skrzyszowska, 2010a, 2013). Protokół sekwencyjnej aktywacji fizykochemicznej (SA F-C ). Zrekonstruowane oocyty poddawane były F E /A E lub A E w roztworze izotonicznego dielektryku (0,3 M D-mannitolu) uzupełnionym 50 µm L -1 CaCl 2. Dwustopniowa aktywacja chemiczna de novo cybryd klonalnych inicjowana była z 1,5 2- godzinnym opóźnieniem czasowym w stosunku do pierwszego etapu F E /A E lub A E rekonstytuowanych oocytów. Po 5 7-minutowej inkubacji w roztworze jonomycyny wapnia (Sigma-Aldrich; antybiotyk jonoforowy) o stężeniu 15 µm L -1, hybrydy jądrowo-cytoplazmatyczne umieszczane były na okres 2 godzin w pożywce z dodatkiem 10 µg ml -1 cykloheksimidu (CHXM; Sigma-Aldrich; niespecyficzny inhibitor syntezy białek/translacji hamujący m.in. resyntezę cykliny B, podjednostki regulatorowej czynnika dojrzewania mejotycznego/mpf) (Samiec i Skrzyszowska, 2010b, 2012a; Skrzyszowska i in., 2008). Protokół pseudofizjologicznej (biologicznej) post-aktywacji transkomplementarnej/transcytoplazmatycznej (PFA TK ). Założeniem systemu PFA TK było wykorzystanie zakumulowanych w cytoplazmie zygoty hipotetycznych czynników białkowych pochodzenia plemnikowego lub oocytarnego, wywołujących oscylacje wapniowe, które leżą u podstaw mechanizmu stymulacji zarodkowego programu rozwojowego. Komplementarne białka oscylogenne wprowadzane były do ooplazmy cybryd klonalnych świni w następstwie ich elektrofuzji z fragmentami obłonionej cytoplazmy (ksenogenicznymi cytoplastami, tzw. zygoplastami), wyizolowanymi z zygot królika uzyskanych w wyniku zapłodnienia in vivo. Fuzja cybryd klonalnych świni z zygoplastami królika inicjowana była 2 generowanymi bezpośrednio po sobie impulsami prądu stałego o natężeniu pola elektrostatycznego 1,2 kv cm -1 i czasie trwania 60 μsek każdy. Zarówno elektrofuzja kompleksów ooplast-komórka somatyczna, jak i elektrofuzja uzyskanych cybryd klonalnych z zygoplastami, która miała miejsce 1,5 2 godziny po zabiegu rekonstrukcji enukleowanych oocytów (metodami fuzji z komórkami-dawcami jąder lub docytoplazmatycznej iniekcji karioplastów/całych komórek-dawców jąder), przeprowadzane były w wolnym od jonów Ca 2+ medium do elektroporacji błon plazmatycznych (0,3 M D-mannitolu) (Samiec i in., 2012; Samiec i Skrzyszowska, 2014).

39 Przyżyciowa analiza apoptozy w komórkach-dawcach jąder i w klonalnych zarodkach świni Hodowla in vitro zarodków klonalnych Cybrydy klonalne zrekonstruowane z jąder nieapoptotycznych/nienekrotycznych (YO-PRO-1-negatywnych i/lub aneksynoujemnych) fibroblastów tkanki skórno-powłokowej dorosłych osobników lub płodów hodowane były w grupach liczących po sztuk, w nawarstwionych sterylnym olejem mineralnym 50-μL kroplach pożywki NCSU-23 z dodatkiem 0,4% BSA-V, w temperaturze 39 o C, w atmosferze 5% CO 2 i 100% H 2 O (g) w powietrzu. Po 3 4-dniowej inkubacji, dzielące się zarodki przenoszone były do pożywki uzupełnionej 10% FBS. W tych warunkach biochemicznych, zarodki klonalne hodowane były przez kolejne 3 dni, aż do osiągnięcia stadium moruli oraz blastocysty (Samiec i Skrzyszowska, 2012b, 2013; Skrzyszowska i in., 2008) (ryc. 2). Oocyt w stadium metafazy II uzyskany w wyniku mejotycznego dojrzewania in vitro - biorca jądra komórki somatycznej Hodowane in vitro komórki fibroblastyczne - dawcy jąder Wyprowadzenie hodowli pierwotnych i stabilnych linii komórek somatycznych z eksplantów tkanki skórno-powłokowej świni Enukleacja oocytu Iniekcja komórki-dawcy jądra do przestrzeni okołożółtkowej enukleowanego oocytu (ooplastu) Elektrofuzja kompleksu ooplast komórka-dawca jądra i sztuczna aktywacja zrekonstruowanego oocytu Selekcja nieapoptotycznej lub nienekrotycznej komórki-dawcy jądra do zabiegu rekonstrukcji enukleowanego oocytu Zrekonstruowany i aktywowany oocyt (cybryda klonalna) Doooplazmatyczna iniekcja karioplastu lub całej komórki somatycznej Hodowla in vitro zarodka klonalnego Blastocysta klonalna Ryc. 2. Schemat klonowania świń metodą transplantacji jąder komórek somatycznych do enukleowanych oocytów (ang. somatic cell cloning/somatic cell nuclear transfer)

40 40 M. Samiec i M. Skrzyszowska Fot. 5A. Unieruchomiony przy pomocy pipety przytrzymującej oocyt MII świni po inkubacji w roztworze demekolcyny i sacharozy. W przestrzeni okołożółtkowej oocytu widoczny jest charakterystyczny stożek cytoplazmatyczny, uwypuklający się na powierzchni oolemmy w pobliżu ciałka kierunkowego I rzędu (I c.k.). Obraz rzeczywisty, odwrócony w mikroskopie epi-fluorescencyjnym, w świetle białym (powiększenie: 200). Fot. 5B. Wizualizacja wybarwionej fluorochromem Hoechst płytki metafazowej w obrębie stożkowatego uwypuklenia błony komórkowej oocytu oraz poronnego wrzeciona mejotycznego ciałka kierunkowego. Po wzbudzeniu kompleksów DNA-fluorochom światłem nadfioletowym w mikroskopie odwróconym obserwowano niebieską fluorescencję, emitowaną zarówno przez silnie skondensowany zespół chromosomów, znajdujący się w stożku ooplazmatycznym, jak i przez I c.k. (powiększenie: 200)

41 Przyżyciowa analiza apoptozy w komórkach-dawcach jąder i w klonalnych zarodkach świni 41 Fot. 5C. Weryfikacja zabiegu enukleacji oocytu metodą mikrochirugiczną, wspomaganą chemicznie. Usunięty przy użyciu pipety enukleacyjnej stożek ooplazmatyczny oraz I c.k. emitują niebieską chemiluminescencję po absorpcji przez kompleksy DNA-fluorochrom nadfioletowego pasma falowego (powiększenie: 200) Fot. 6A. Enukleacja oocytu świni. Mikrochirurgiczny zabieg usunięcia ciałka kierunkowego I rzędu (I c.k.) wraz z fragmentem przylegającej ooplazmy zawierającym płytkę metafazową (powiększenie: 200)

42 42 M. Samiec i M. Skrzyszowska Fot. 6B. Weryfikacja zabiegu enukleacji w mikroskopie epi-fluorescencyjnym. Wizualizacja wybarwionej fluorochromem Hoechst płytki metafazowej (słabsza fluorescencja) oraz poronnego wrzeciona kariokinetycznego I c.k. (silniejsza fluorescencja) (powiększenie: 200) Fot. 7. Populacja fibroblastów płodowych świni w postaci zawiesiny pojedynczych komórek wewnątrz komory do mikromanipulacji, wypełnionej pożywką TCM-199/HEPES z dodatkiem 4 mg ml -1 BSA-V oraz 7,5 µg ml -1 cytochalazyny B. Selekcja komórki-dawcy jądra do zabiegu klonowania somatycznego (powiększenie: 200)

43 Przyżyciowa analiza apoptozy w komórkach-dawcach jąder i w klonalnych zarodkach świni 43 Fot. 8A. Rekonstrukcja enukleowanego oocytu świni. Mikroniekcja komórki fibroblastycznej do przestrzeni okołożółtkowej wyjądrzonego oocytu (etap pierwszy) (powiększenie: 200) Fot. 8B. Rekonstrukcja enukleowanego oocytu świni. Mikroiniekcja komórki fibroblastycznej do przestrzeni okołożółtkowej wyjądrzonego oocytu (etap drugi) (powiększenie: 200)

44 44 M. Samiec i M. Skrzyszowska Fot. 8C. Rekonstrukcja enukleowanego oocytu świni. Mikrochirurgiczne zdeponowanie całej komórki-dawcy jądra pod osłonką przejrzystą oocytu-biorcy jądra, z którego uprzednio usunięto matczyne chromosomy skonfigurowane w płytkę metafazową wrzeciona kariokinetycznego II podziału mejotycznego, prowadzi do utworzenia kompleksu ooplast-komórka somatyczna (powiększenie: 200) Fot. 9A. Karioplast wyizolowany z wyselekcjonowanej komórki fibroblastycznej w następstwie fizycznie sprowokowanej cytolizy wewnątrz pipety iniekcyjnej, której średnica jest o połowę mniejsza niż średnica komórki-dawcy jądra. Karioplast, uzyskany wskutek mechanicznie indukowanej lizy całej komórki somatycznej, stanowi żywą, obłonioną strukturę, zawierającą interfazowe jądro komórkowe lub chromosomy metafazowe, które otoczone są cienką warstewką resztkowej cytoplazmy wokółjądrowej (perinuklearnej) określanej mianem perikarionu (powiększenie: 200)

45 Przyżyciowa analiza apoptozy w komórkach-dawcach jąder i w klonalnych zarodkach świni 45 Fot. 9B. Rekonstrukcja enukleowanego oocytu (ooplastu) metodą docytoplazmatycznej mikroiniekcji karioplastu wyizolowanego z komórki-dawcy jądra. Wprowadzenie pipety iniekcyjnej do przestrzeni okołożółtkowej przez szczelinę uprzednio powstałą w osłonce przejrzystej w wyniku enukleacji oocytu. Po tym etapie następuje mikroperforacja oolemmy i mikrochirurgiczne zdeponowanie karioplastu bezpośrednio w cytoplazmie ooplastu (powiększenie: 200) 3.2. Cytologiczna ocena jakości morfologicznej blastocyst Po 6 7 dniach hodowli in vitro uzyskane blastocysty klonalne poddawane były ilościowej analizie kondycji strukturalnej (jakości morfologicznej) w oparciu o całkowitą liczbę komórek, tj. sumaryczną liczbę komórek węzła zarodkowego/embrioblastu (ICM; ang. inner cell mass) oraz komórek trofoblastycznych. Ocena jakości morfologicznej blastocyst dokonywana była w epifluorescencyjnym mikroskopie odwróconym Olympus IMT-2, po uprzednim wybarwieniu blastocyst fluorochromem Hoechst (bisbenzimid), specyficznie wiążącym się z DNA. W tym celu blastocysty umieszczane były na minut w roztworze barwnika Hoechst o stężeniu 5 μg ml -1 pożywki TCM-199/HEPES z dodatkiem 10% FBS, w temperaturze 39 o C, a następnie przenoszone były w μlitrowej kropli tej pożywki na szkiełko podstawowe (na kroplę nakładane było szkiełko nakrywkowe). Przyżyciowo wykonane preparaty delikatnie rozpłaszczonych pod ciężarem nacisku szkiełka nakrywkowego blastocyst klonalnych obserwowane były następnie w mikroskopie, po wzbudzeniu kompleksów DNA-fluorochrom spolaryzowanym pasmem nadfioletowym światła białego (o maksymalnym zakresie długości fali absorpcyjnej λ ab/max =340 nm). interfazowych jąder komórkowych i/lub metafazowych oraz anafazowych zespołów chromosomowych w okresie podziałowym

46 46 M. Samiec i M. Skrzyszowska cyklu mitotycznego była weryfikowana w każdej blastocyście dwukrotnie w oparciu o emisję przez kompleksy DNA-bisbenzimid niebieskiej fluorescencji (przy maksymalnej długości wysyłanej fali świetlnej λ em/max =488 nm). Na tej podstawie szacowane były wartości średnie całkowitej liczby komórek w analizowanych zarodkach (fot.10). Fot. 10. Fluorescencyjna ocena jakości morfologicznej blastocysty na podstawie całkowitej liczby komórek zarodkowych. Wybarwione fluorochromem Hoechst interfazowe jądra komórkowe oraz płytki metafazowe i anafazowe zespoły chromosomów emitują niebieską chemiluminescencję po absorpcji nadfioletowego pasma falowego (powiększenie: 200) 3.3. Przyżyciowa analiza fluorycytochemiczna blastocyst klonalnych w kierunku wykrywania objawów śmierci apoptotycznej komórek Uzyskane w dniu hodowli in vitro blastocysty klonalne poddawane były fluorescencyjnej diagnostyce w kierunku wykrywania biochemicznych i biofizycznych zmian w plazmolemmie wczesno- i późnoapoptotycznych komórek węzła zarodkowego i/lub trofoblastu. Oznaczanie symptomów towarzyszących wczesnym fazom apoptozy takich jak: 1) eksternalizacja reszt fosfatydyloseryny (PS) na powierzchni zewnątrzkomórkowej błony plazmatycznej, 2) utrata asymetrii składu aminofosfolipidowego w dwuwarstwie lipidowej błony oraz symptomów towarzyszących późnym fazom apoptozy, takich jak: 3) powstawanie tzw. dziur lipidowych w plazmolemmie i błonach mitochondrialnych, przeprowadzane było po minutowej inkubacji blastocyst w roztworze jednego z dwóch markerów testowych. Markerami tymi były odpowiednio: aneksyna V skoniugowana z fluorygenicznym białkiem egfp (oznaczanie