Immunoekspresja metaloproteinazy b³onowej typu 1 w raku p³askonab³onkowym krtani korelacja z cechami morfologicznymi guza

Transkrypt

1 Starska K, Osiatyñska Otorynolaryngologia, O, ukomski M, Lewy-Trenda 2006, 5(4), 5(3), I. Immunoekspresja metaloproteinazy b³onowej matrix ARTYKU Y typu 1 (MT1-MMP) Y ORYGINALNE Otorynolaryngologia, 2006, 5(4), Immunoekspresja metaloproteinazy b³onowej typu 1 w raku p³askonab³onkowym krtani korelacja z cechami morfologicznymi guza Membrane type 1 matrix metalloproteinase immunoexpression in squamous cell carcinoma of the larynx ynx - correlation with morphological tumor features KATARZYNA STARSKA 1/, OLGA OSIATYÑSKA 2/, MAREK UKOMSKI 1/, IWONA LEWY-TRENDA 2/ 1/ Katedra Otolaryngologii, Uniwersytet Medyczny w odzi 2/ Katedra Patomorfologii, Uniwersytet Medyczny w odzi Wstêp. Metaloproteinazy b³onowe (MMPs) maj¹ zdolnoœæ degradowania sk³adników matrix zewn¹trzkomórkowego, pe³ni¹c istotn¹ rolê w inwazji i progresji procesu nowotworowego oraz powstawaniu przerzutów wêz³owych. MMPs s¹ oznaczane w wielu guzach ró nego pochodzenia, równie w rakach p³askonab³onkowych regionu g³owy i szyi. Cel pracy. Celem pracy by³a ocena korelacji ekspresji MMP typu 1 (MT1-MMP) w raku p³askonab³onkowym krtani z cechami morfologicznymi guza nowotworowego i wêz³ów ch³onnych oraz 3- i 5-letnim czasem prze ycia pacjentów. Materia³ i metody. Oceniono ekspresjê MT1-MMP u 22 pacjentów z rakiem krtani leczonych operacyjnie w latach Odczyny immunohistochemiczne wykonano z u yciem przeciwcia³ pierwotnych monoklonalnych anty-mt1-mmp. Wyniki. Pozytywn¹ ekspresjê matrix MT1-MMP w utkaniu nowotworowym uzyskano w 68,2% pobranych do badañ wycinków krtani. Immunoekspresja MT1-MMP w raku krtani okaza³a siê istotnym wskaÿnikiem 3-letniego czasu prze ycia u pacjentów z zaawansowanymi zmianami nowotworowymi. Wykazano, e stopieñ immunohistochemicznego wybarwienia komórek koreluje z liczb¹ figur podzia³u we froncie guza nowotworowego oraz nasileniem nacieku plazmatyczno-limfocytarnego w jego otoczeniu. Wnioski. Przedstawione wyniki wskazuj¹, e ocena ekspresji MT1-MMP w utkaniu raka krtani mo e byæ wartoœciowym czynnikiem prognostycznym w tej chorobie. S³owa kluczowe: front guza nowotworowego, immunohistochemia, prze ycie Introduction. Matrix metalloproteases (MMPs) are capable of degrading components of the extracellular matrix. MPPs have been implicated as playing an important role in cancer invasion and metastases. MMPs have been identified in various malignancies, including head and neck squamous cell carcinoma. Aim. This study was intended to investigate MT1-MMP expression in squamous cell carcinoma of the larynx and to relate expression to morphological features of the tumor and lymph nodes, as well as to 3- or 5-year survival time. Material and methods. We investigated immunoexpression of MT1-MMP in 22 patients with laryngeal cancer treated surgically in The expression was evaluated immunohistochemically using monoclonal anti- MT1-MMP antibodies. Results. Positive MT1-MMP expression was observed in 68.2% cases. Immunoexpression of MT1-MMP in advanced laryngeal carcinoma has proved to be a good indicator for 3-year survival. In addition, levels of staining correlated with the number of mitoses in tumor front and with the intensity of the plasmocytolymphatic infiltration in its environment. Conclusion. The expression of MT1-MMP in tumor front appears to play an important role in determining the prognosis for patients with carcinoma of the larynx. Key words: tumor front, immunohistochemistry, overall survival Praca finansowana z funduszy Komitetu Badañ Naukowych w ramach projektu KBN 3P05 C Nades³ano: Oddano do druku: Adres do korespondencji / Address for correspondence Katarzyna Starska Katedra Otolaryngologii UM, ul. Kopciñskiego 22, ódÿ katarzyna.starska@op.pl WSTÊP Matrix metaloproteinazy b³onowe (MMPs) s¹ enzymami proteolitycznymi nale ¹cymi do endopeptydaz, które maj¹ zdolnoœæ degradowania sk³adników matrix zewn¹trzkomórkowego (ECM) m.in. kolagenu typu I, elastyny, fibronektyny i gelatyny oraz sk³adników b³ony podstawnej [1,2]. Matrix metaloproteinza b³onowa typu 1 jest jednym z aktywatorów zymogenu MMP-2 ( elatynazy A o m.cz. 72kD tj. kolagenu typu IV), tzn. pro-mmp-2 (pro elatynazy A) i odgrywa kluczow¹ rolê w destrukcji ECM [3]. MMPs s¹ inaktywowane przez

2 172 Otorynolaryngologia, 2006, 5(4), specyficzne tkankowe inhibitory (TIMPs), które hamuj¹ dzia³anie MMPs poprzez tworzenie z ich cz¹steczkami niekowalencyjnych wi¹zañ [4,5]. Liczne prace opisuj¹ próby zastosowania TIMPs w terapii przeciwnowotworowej (badania kliniczne III fazy) u pacjentów z zaawansowanymi guzami p³uc, prostaty, trzustki i mózgu, niestety bez istotnych wyników klinicznych [6,7]. W dostêpnym piœmiennictwie wielu autorów podkreœla znaczenie ekspresji MMPs w ocenie inwazji i progresji procesu nowotworowego, powstawaniu przerzutów wêz³owych oraz ich wartoœæ rokownicz¹ w przewidywaniu czasu prze ycia chorych z ró nego typu nowotworami pochodzenia nab³onkowego i nienab³onkowego, równie w rakach p³askonab³onkowych regionu g³owy i szyi [1,3,5,6,8-15]. Celem przeprowadzonych badañ by³o okreœlenie ekspresji metaloproteinazy b³onowej typu 1 (MT1-MMP) w utkaniu raka p³askonab³onkowego krtani oraz analiza korelacji z cechami morfologicznymi guza nowotworowego i wêz³ów ch³onnych oraz 3- i 5-letnim okresem prze ycia pacjentów. MATERIA I METODY Badania przeprowadzono u 22 chorych, którzy zostali poddani ca³kowitemu usuniêciu krtani i selektywnej lub radykalnej operacji wêz³owej z powodu raka p³askonab³onkowego krtani w Klinice Laryngologii i Onkologii Laryngologicznej UM w odzi w latach W ocenie morfologicznej zaawansowania zmian nowotworowych uwzglêdniono kryteria klasyfikacji TNM (2001), jak równie wyk³adniki frontu guza nowotworowego (tumor front grading TFG). Materia³ tkankowy by³ utrwalany w roztworze 10% zbuforowanej formaliny. Wycinki z guza pierwotnego i wêz³ów do badania mikroskopowego pobierane by³y standardowo, zatapiane w bloczki parafinowe i rutynowo krojone na skrawki gruboœci 4-5µm (zwykle 3-4 skrawki z guza pierwotnego i ka dego wêz³a ch³onnego). Nastêpnie przyklejane na szkie³ka podstawowe, dalej poddane procedurze stosowanej rutynowo w ka dej pracowni histopatologicznej i zakoñczone barwieniem H&E. Oceniono nowotwór wg klasycznych kryteriów histopatologicznych zalecanych przez ekspertów WHO (ptnm), bior¹c przy tym pod uwagê obecnoœæ mikroprzerzutów wêz³owych oraz analizowano wyk³adniki skali TFG, uwzglêdniaj¹cej 6 parametrów opisuj¹cych cechy histopatologiczne nowotworu (stopieñ rogowacenia, pleomorfizm j¹der, figury podzia³u) oraz rodzaj reakcji guz - tkanki otaczaj¹ce (typ i g³êbokoœæ naciekania, obecnoœæ nacieku limfoidalnego). Preparaty oceniano w mikroskopie œwietlnym (pow. 200x; liczba mitoz pow. 400x), kieruj¹c siê miejscami o najg³êbszym naciekaniu nowotworu do otaczaj¹cych tkanek. Ocena guza zosta³a przedstawiona jako suma uzyskanych punktów. Wykonano odczyny immunohistochemiczne dla okreœlenia ekspresji matrix metaloproteinazy b³onowej typu 1 w tkaniu guza. Odczyny immunohistochemiczne z przeciwcia³ami pierwotnymi monoklonalnymi (Mouse Anti-Human MT1-MMP, Chemicon) wykonano na 2-3 ró nych skrawkach wg instrukcji do³¹czonej do przeciwcia³a przez producenta. W ocenie ekspresji MT1-MMP w utkaniu guza wykorzystano indeks imunohistochemiczny, przyjmuj¹c skalê: 0 brak ekspresji, 1 s³aba ekspresja (<10% dodatnio wybarwionych komórek), 2 œrednia ekspresja (<50%), 3 du a ekspresja ( 50%). Obecnoœæ mikroprzerzutów wêz³owych tj. ognisk komórek nowotworowych o œrednicy 2mm, oceniono na podstawie badañ immunohistochemicznych z wykorzystaniem przeciwcia³ poliklonalnych (NCL-C11 Multi-Cytokeratin 4/5/ 6/8/10/13/18, Novocastra). Uzyskane wyniki ekspresji MT1-MMP zestawiono z cechami morfologicznymi guza pierwotnego i wêz³ów ch³onnych. W analizie statystycznej zastosowano test korelacji rang Spearmana (dla poziomu istotnoœci p=0,05 i wskaÿniku korelacji R=0,3). WYNIKI Badan¹ grupê stanowi³o 17 mê czyzn (77,3%) i 5 kobiet (22,7%), w wieku lat (œr. 63±5lat), g³ównie z III i IV stopniem zaawansowania procesu nowotworowego 20 chorych (90%), u których laryngektomiê ca³kowit¹ poszerzono o wykonanie operacji wêz³owej. U 16 chorych (72,7%) wykonano jednostronn¹ selektywn¹ operacjê wêz³ow¹, a u 2 radykaln¹ operacjê wêz³ów ch³onnych; u pozosta³ych 6 pacjentów (27,3%) obustronn¹ selektywn¹ operacjê wêz³ow¹. Analiza stopnia miejscowego zaawansowania procesu nowotworowego okreœlonego w badaniu patomorfologicznym (pt) wykaza³a, e guzy pierwotne pt4 stanowi³y najliczniejsz¹ grupê 63,6% (14 chorych), w 6 przypadkach rozleg³oœæ nowotworu okreœlono jako pt3 27,3% (6 pacjentów) i pt2 9,1% (2 chorych). Wykonane odczyny immunohistochemiczne na skrawkach z preparatów wêz³ów ch³onnych, z u yciem przeciwcia³ poliklonalnych anty-ck wykaza³y obecnoœæ mikroprzerzutów (pn1) w 50% przypadków. Dodatni¹ immunoekspresjê matrix metaloproteinazy MT1-MMP w utkaniu nowotworowym uzyskano w 15 (68,2%) przypadkach, w tym: w 20% (3 pacjentów) minimaln¹ ekspresjê (wybarwienie w pojedynczych komórkach wpw), w 53,3% (8 chorych) dodatni¹ ekspresjê w <10% komórek, w 13,3% (2 chorych) pozytywn¹ ekspresjê potwierdzono w <50% komórek i w 13,3% dodatnie wybarwienie dotyczy³o 50% komórek (ryc. 1). W badanej grupie 22 chorych w 54,5% przypadków (12 chorych) zanotowano 3-letni a w 31,8% (7 pacjentów) 5-letni okres prze ycia.

3 Starska K, Osiatyñska O, ukomski M, Lewy-Trenda I. Immunoekspresja metaloproteinazy b³onowej matrix typu 1 (MT1-MMP) Ryc. 1. Ekspresja matrix metaloproteinazy b³onowej typu 1 w utkaniu raka p³askonab³onkowego krtani. Odczyn immunohistochemiczny z przeciwcia³ami anty-mt1-mmp. Pow. 400x W przeprowadzonej analizie statystycznej wykazano wystêpowanie nastêpuj¹cych korelacji (R=0,3) ekspresji MT1-MMP z: - 3-letnim czasem prze ycia (R=-0,45), co oznacza, e wraz ze wzrostem ekspresji MT1-MMP w utkaniu nowotworowym zmniejsza siê odsetek pacjentów yj¹cych co najmniej 3 lata po zastosowanym leczeniu, - ze stopniem morfologicznej z³oœliwoœci guza G (R=-0,37; ale nie na poziomie istotnoœci statystycznej) co oznacza, e wraz z nasileniem wybarwienia komórek przeciwcia³ami anty-mt1-mmp istnieje tendencja zwiêkszania siê równie agresywnoœci wzrostu nowotworu, - z parametrami klasyfikacji TFG tj. liczb¹ mitoz w utkaniu raka (R=0,31) oraz intensywnoœci¹ nacieku plazmatyczno-limfocytarnego w otoczeniu guza (R=-0,32). Nie potwierdzono jednak wystêpowania korelacji ekspresji MT1-MMP z poni szymi cechami: - 5-letnim czasem prze ycia (R=-0,03), - obecnoœci¹ mikroprzerzutów w wêz³ach ch³onnych potwierdzonych immunoekspresj¹ filamentów cytokeratynowych (pn+) (R=0,05), - wyk³adnikami TFG tj. zró nicowaniem komórkowym (R=0,23), polimorfizmem j¹der (R=0,07), typach i g³êbokoœci¹ inwazji (R=-0,09, R=-0,05) (tab. I). DYSKUSJA Zdolnoœæ inwazji komórek nowotworowych i naciekania otaczaj¹cych tkanek jest jedn¹ z najwa niejszych cech progresji guza. Proteolityczne enzymy zwane matrix metaloproteinazy b³onowe (MMPs), posiadaj¹c zdolnoœæ niszczenia sk³adników matrix zewn¹trzkomórkowego (tj. kolagenu typu I, elastyny, fibronektyny i gelatyny), sk³adników b³ony podstawnej, degradacji czynników wzrostu oraz receptorów na powierzchni komórek guza [1,2,16] s¹ odpowiedzialne za ekspansjê nowotworu. MMPs zosta³y podzielone na podgrupy ze wzglêdu na zawartoœæ w cz¹steczce enzymów o aktywnoœci m.in. kolagenazy, stromielizyny i gelatynazy [1,5]. Matrix metaloproteinza b³onowa typu I (MT1-MMP) jest jednym z aktywatorów zymogenu MMP-2 (gelatynazy A) i odgrywa kluczow¹ rolê w destrukcji ECM [3]. MMPs wp³ywaj¹ na przebieg tumorgenezy, angiogenezy i charakteryzuj¹ siê wzmo on¹ ekspresj¹ w utkaniu wielu nowotworów pochodzenia nab³onkowego i nienab³onkowego [6,16,17]. W dostêpnym piœmiennictwie odsetek dodatniej ekspresji MMPs w ró nych guzach waha siê od 21% do 100% [11,18,19]. Wielu badaczy podkreœla znaczenie dodatniej ekspresji enzymów nale ¹cych do rodziny MT1-MMP w utkaniu guza jako istotnego wskaÿnika aktywacji inwazji procesu nowotworowego i powstawania przerzutów, jak równie gorszej prognozy u pacjentów z chorob¹ nowotworow¹ [6,16,18,20-22]. Nale y jednak podkreœliæ, e tylko nieliczni autorzy w ocenie prognostycznego znaczenia ekspresji b³onowych metaloproteinaz w rakach ró nego pochodzenia uwzglêdniaj¹ dok³adn¹ ocenê patomorfologiczn¹ guza. Wielu badaczy, analizuj¹c ekspresjê MMPs w utkaniu guza, nie wykaza³o wystêpowania zale noœci tej cechy i zaawansowania procesu nowotworowego pt [23-25]. Gorogh i wsp. [23] oceniaj¹c ekspresjê ró nych metaloproeinaz m.in. MMP- 1, 2, 9 i 10 w rakach p³askonab³onkowych regionu g³owy i szyi z zastosowaniem metody PCR, nie potwierdzili korelacji ekspresji z cech¹ T. Podobne wyniki otrzyma³ Kawata i wsp. [24,25] w przeprowadzonych badaniach dla raków g³owy i szyi, którzy nie zanotowali zale noœci statystycznej ekspresji MMP-9 oraz MMP-2 z zaawansowaniem miejscowym T zmian nowotworowych. Tylko nieliczni badacze stwierdzaj¹ istnienie Tabela I. Wyniki testu rang Spaermana dla cech morfologicznych nowotworu Cechy R Spaermana Poziom p t(n-2) pt 0,12 0,67 0,43 CK(pN) 0,05 0,85 0,19 G -0,38 0,17-1,47 TFG 0,02 0,94 0,08 Zró nicowanie komórkowe 0,23 0,41 0,84 Polimorfizm j¹der 0,07 0,79 0,27 Liczba figur podzia³u 0,30 0,27 1,15 Typ inwazji -0,09 0,73-0,35 G³êbokoœæ inwazji -0,05 0,85-0,19 Naciek plazmatyczno-limfocytarny -0,32 0,24-1,23 3-letni czas prze ycia -0,45 0,09-1,85 5-letni czas prze ycia -0,03 0,90-0,13 Wartoœci wspó³czynnika korelacji R=0,3 i poziomu istotnoœci p<0,05 zaznaczono pogrubion¹ czcionk¹

4 174 Otorynolaryngologia, 2006, 5(4), zale noœæ miejscowego zaawansowania nowotworu i ekspresji MMPs [20,26]. Wnioski dotycz¹ce znaczenia ekspresji MMPs w utkaniu raków p³askonab³onkowych, jak i guzów pochodzenia nienab³onkowego, w odniesieniu do wystêpowania przerzutów wêz³owych s¹ tak e niejednoznaczne. Imanishi i wsp. [17], analizuj¹c du ¹ grupê chorych z rakami p³askonab³onkowymi regionu g³owy i szyi, potwierdzili wystêpowanie zwi¹zku ekspresji MT1-MMP z zaawansowaniem zmian wêz³owych. Podobne wyniki otrzyma³ Shimada i wsp. [27] oceniaj¹c MMP-1, 2, 3, 7, 8, 9 i 13 w utkaniu raka p³askonab³onkowego jamy ustnej. Autorzy ci zanotowali istotny statystycznie wzrost ryzyka przerzutów wêz³owych w grupie raków z dodatni¹ ekspresj¹ b³onowej metaloproteinazy-1. Równie Shiomi i wsp. [22] zanotowali zale noœæ dodatniej immunoekspresji MMP-7 z wystêpowaniem przerzutów wêz³owych w raku endometrium i raku o³¹dka. Kawata i wsp. [25], którzy badali poziom ekspresji prommp-2 potwierdzili, podobnie jak Shimada i wsp. [27], Bassi i wsp. [28] oraz Luukkaa i wsp.[20], e stanowi on dla cechy N wskaÿnik rokowniczo negatywny. Zale noœæ wystêpowania przerzutów wêz³owych od poziomu ekspresji MT1 zosta³a potwierdzona równie przez Nakamura i wsp. [11] w innych rakach m.in. brodawczakowym raku tarczycy. Zanotowali oni wystêpowanie dodatniej korelacji miêdzy tymi cechami, uzyskuj¹c 100% wybarwienia komórek przy wykorzystaniu metody oceny ekspresji mrna w tkance guza. Liczni autorzy nie stwierdzaj¹ jednak wystêpowania zale noœci znamiennych statystycznie dla ekspresji MMPs w utkaniu nowotworowym i rozleg³oœci zmian wêz³owych N [18,23,24]. Gorogh i wsp. [23] oceniaj¹c aktywnoœæ b³onowych metaloproteinaz i ich inhibitorów (TIMPs) wykaza³, e ekspresja MMP-1, 9 i 10 pozostaje bez istotnego zwi¹zku z obecnoœci¹ przerzutów wêz³owych. Kawata i wsp. [24] w badaniach nad znaczeniem prognostycznym oznaczania MMP-9 w rakach regionu g³owy i szyi równie nie zanotowali znaczenia ekspresji dla cechy N. Stopieñ zró nicowania morfologicznego nowotworu G, wed³ug wielu badaczy, nie stanowi wyk³adnika istotnego dla oceny ekspresji MMPs i rokowania u chorych z rakami p³askonab³onkowymi [18,26]. Elnemr i wsp. [18] oceniali korelacjê MMP-13 w raku o³¹dka z ró nymi cechami morfologicznymi i nie potwierdzili zwi¹zku wybarwienia komórek z histologicznym typem nowotworu. Podobne wyniki otrzyma³ Culhaci i wsp.[1] analizuj¹c ekspresjê MMP-13 i TIMP-1 w rakach p³askonab³onkowych g³owy i szyi. Inni badacze podkreœlaj¹ wystêpowanie znamiennych zale noœci cechy G i wybarwienia komórek guza z zastosowaniem przeciwcia³ anty-mmps [15]. Yoshizki i wsp. [15] zanotowali istotny wzrost immunoekspresji MT1-MMP w utkaniu raków g³owy i szyi guzach ze œrednim (G2) i wysokim (G3) stopniem zró - nicowania komórkowego. Sposób naciekania i g³êbokoœæ inwazji nowotworowej s¹ innymi cechami morfologicznymi ocenianymi w badaniach nad znaczeniem ekspresji MMPs. W dostêpnym piœmiennictwie wiêkszoœæ autorów nie potwierdza jednak zwi¹zku tych parametrów z ekspresj¹ metaloproteinaz w komórkach guza [18,26]. Jedynie Culhaci i wsp. [1] wykazali znamienn¹ korelacjê dodatniej ekspresji MMP-13 w guzach regionu g³owy i szyi ze stopniem g³êbokoœci naciekania nowotworowego, ocenianym wed³ug zastosowanej przez nich trzystopniowej skali. Inne wyk³adniki oceny morfologicznej, ocenione w tej pracy, nie by³y dotychczas przedmiotem analiz innych autorów. Znaczenie kliniczne ekspresji MMPs w utkaniu nowotworowym w prognozowaniu czasu prze ycia pacjentów z ró nymi nowotworami zosta³o wykazane w wielu badaniach [18,20-22]. Elnemr i wsp. [18], oceniali rokownicze znaczenie ekspresji mrna MT1-MMP i MMP-13 w raku o³¹dka. Autorzy potwierdzili, e guzy z ujemn¹ ekspresj¹ MMP-1 i -13 charakteryzowa³y siê znacznie lepsz¹ prognoz¹. Luukkaa i wsp. [20] stwierdzili równie wystêpowanie istotnej statystycznie zale noœci ekspresji kolagenazy-3 (MMP-13) z gorszym rokowaniem w grupie 81 chorych z rakami regionu g³owy i szyi. Podobne wyniki uzyskali Shiomi i wsp. [22], którzy zanotowali korelacjê MMPs i ich inhibitorów (TIMPs) z prognoz¹ u chorych z rakiem jam ustnej, rakiem piersi oraz rakiem tarczycy. WNIOSKI 1. Liczba figur podzia³u we froncie guza nowotworowego oraz nasilenie nacieku plazmatyczno-limfocytarnego w jego otoczeniu s¹ wyk³adnikami skali TFG, które koreluj¹ ze stopniem immunohistochemicznego wybarwienia komórek przeciwcia³ami monoklonalnych anti-mt1-mmp. 2. Ocena MT1-MMP w matrix zewn¹trzkomórkowym guza nowotworowego jest istotnym wskaÿnikiem 3-letniego czasu prze ycia u pacjentów z rakiem p³askonab³onowym krtani. 3. Ocena immnoekspresji b³onowej metaloproteinazy matrix typu 1 (MT1-MMP) w utkaniu guza mo e byæ wartoœciow¹ metod¹ uzupe³niaj¹c¹ rutynow¹ ocenê morfologiczn¹ raka krtani.

5 Starska K, Osiatyñska O, ukomski M, Lewy-Trenda I. Immunoekspresja metaloproteinazy b³onowej matrix typu 1 (MT1-MMP) Piœmiennictwo 1. Culhaci N, Metin K, Kopcu E, Dikicioglu E. Elevated expression of MMP-13 and TIMP-1 in head and Neck squamous cell carcinoma May reflect increased tumor invasiveness. BMC Cancer 2004; 4(42): Wang P, Nie J, Pei D. The hemopexin domain of membrane type matrix metalloproteinase-1 (MT1-MMP) is not required for its activation of prommp-2 on cell surface but is essential for MT1-MMP-mediated invasion in three-dimensional type I collagen. J Biol Chem 2004; 279, 14(3): Nakada M, Nakamura H, Ikeda E, Fujimoto J, Yamashita J, Sato H i wsp. Expression and Tissue Localisation of Membrane- Type 1,2 and 3 Matrix Metalloproteinases in Human Astrocytic Tumors. Am J Pathol 1999; 154(2): Thomas G, Lewis MP, Speight PM. Matrix metalloproteinases and oral cancer. Oral Oncol 1999; 35: Werner JA, Rathcke IO, Mandic R. He role of matrix metalloproteinases in squamous cell carcinoma of the head and neck. Clin Exp Metastases 2002; 19: Zucker S, Cao J, Chen WT. Critical appraisal of the use of matrix metalloproteinase inhibitors in cancer treatment. Oncogene 2000; 27, 19(56): Seiki M. Membrane-type 1 matrix metalloproteinase: a key enzyme for tumor invasion. Cancer Lett 2003; 8, 194(1): Fishman DA, Bafetti LM, Stack MS. Membrane-type matrix metalloproteinase-2 activation in primary human ovarian epithelial carcinoma cells. Invasion Metastasis 1996; 16,: Gilles C, Polette M, Piette J, Munaut C, Thompson EW, Birembaut P, Foidart JM. High level of MT-MMP expression in associated with invasiveness of cervical cancer cells. Int J Cancer 1996; 65: Johansson N, Airola K, Grenman R, Kariniemi AL, Saarialho- Kere U, Kahari VM. Expression of collagenase-3 (matrix metalloproteinase-13) in squamous cell carcinoma of the head and neck. Am J Pathol 1997; 151: Nakamura H, Ueno H, Yamashita K, Shimada T, Yamamoto E, Noguchi M i wsp. Enhanced production and activation of progelatinase A mediated by membrane-type 1 matrix metalloproteinase in human papillary thyroid carcinomas. Cancer Res 1999; 59(15): Nomura H, Sato H, Seiki M, Mai M, Okada Y. Expression of membrane-type matrix metaloproteinase in human gastric carcinoma. Cancer Res 1995; 55: Tomita T, Fujii M, Tokumaru Y, Imanishi Y, Kanke M, Yamashita T i wsp. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor upregulates matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) and membrane type-1 MMP (MT1-MMP) in human head and neck cancer cells. Cancer Lett 2000; 156(1): Yamamoto M, Mohanam S, Sawaya R, Fuller GN, Seiki M, Sato H i wsp. Differentia expression of membrane type matrix metalloproteinase and its correlation with gelatinase A activation in human malignant brain tumors in vivo and in vitro. Cancer Res 1996; 56: Yoshizaki T, Sato H, Maruyama Y, Murono S, Furukawa M, Park CS, Seiki M. Increased expression of membrane type 1- matrix metalloproteinase in head and neck carcinoma. Cnacer 1997; 79(1): Rosenthal EL, Matrisian LM. Matrix metalloproteinases in head and neck cancer. Head Neck 2006; 9(2): 28(7): Imanishi Y, Furii M, Tokumaru Y, Tomita T, Kanke M, Kanzaki J i wsp. Clinical significance of expression of membrane type 1 matrix metalloproteinase and matrix metalloproteinase-2 in human head and neck squamous cell carcinoma. Hum. Pathol. 2000, 31(8), Elnemr A, Yonemura Y, Bandou E, Kinoshita K, Kawamura T, Takahasi S i wsp. Expression of collagenase-3 (matrix metalloproteinase-13) in human gastric cancer. Gastric Cancer 2003; 6(1): Riedel F, Gotte K, Chwalb J, Hormann K. Serum levels of matrix metalloproteinase-2 and -9 in patients with head and neck squamous cell carcinoma. Anticancer Res 2000; 20(5A): Luukkaa M, Vihinen P, Kronqvist P, Vahlberg T, Pyrhonen S, Kahari VM, Grenman R. Association between high collagenase- 3 expression levels and poor prognosis in patients with head and neck cancer. Head Neck 2006; 28(3): O-Charoenrat P, Modjtahedi H, Rys-Evans P, Court VJ, Box GM, Eccles S.A. Epidermal growth factor-like ligands differentially upregulate matrix metalloproteinase 9 in head and neck squamous cell carcinoma. Cancer Res 2000, 15, 60(4), Shiomi T, Okada Y. MT1-MMP and MMP-7 in invasion and metastasis of human cancer. Cancer Metastasis 2003; 22(2): Gorogh T, Beier UH, Baumken J, Meyer JE, Hoffmann M, Gottschlich S, Marne S. Metalloproteinases and their inhibitors: Influence on tumor invasiveness and metastatis formation in head and neck squamous cell carcinomas. Head Neck 2006; 28(1): Kawata R, Shimada T, Maruyama S, Hisa Y, Takenaka H, Murakami Y. Enhanced production of matrix metalloproteinase- 2 in human head and neck carcinomas is correlated with lymph node metastasis. Acta Otolaryngol 2002; 122(1): Kawata R, Shinomiya T, Yasuda N, Takenaka H, Murakami Y. Matrix metalloproteinase-2 in squamous cell carcinoma of the head and neck and its clinical significance. Nip Jib Gak (Abs.) 1996; 99(2): O-Charoenrat P, Rys-Evans P, Eccles SA. Expression of matrix metalloproteinases and their inhibitors correlates with invasion and metastatsis in carcinoma of the head and neck. Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg 2001; 127(7): Shimada., Nakamura H, Yamashita K, Kawata R, Murakami Y, Fujimoto N i wsp. Enhanced production and activation of progelatinase A mediated by membrane-type 1 matrix metalloproteinase in human oral squamous cell carcinomas: implications for lymph node metastasis. Clin Exp Metastasis 2000; 18(2): Bassi DE, Mahloogi H, Al-Saleem L, Lopez De Cicco R, Ridge JA, Klein-Szanto AJ. Elevated furin expression in aggressive human head and neck tumors and tumor cell lines. Mol Carcinog 2001; 31(4):