Metaloproteinazy macierzy zewn¹trzkomórkowej charakterystyka biochemiczna i kliniczna wartoœæ oznaczania u chorych na raka piersi

Transkrypt

1 Wspó³czesna Onkologia (2005) vol. 9; 8 ( ) Metaloproteinazy (MMP) stanowi¹ grupê zale nych od cynku endopeptydaz, których podstawow¹ funkcj¹ jest przebudowa sk³adników macierzy zewn¹trzkomórkowej. Enzymy te syntetyzowane s¹ w komórkach i uwalniane do przestrzeni zewn¹trzkomórkowej w formie nieaktywnej (prommp). Aktywacja enzymu nastêpuje przez proteolityczne ciêcie w rejonie propeptydu. Aktywnoœæ metaloproteaz jest precyzyjnie regulowana na poziomie transkrypcji, translacji oraz poprzez endogenne inhibitory, takie jak α2-makroglobulina i tkankowe inhibitory metaloproteinaz (TIMP). W warunkach fizjologicznych metaloproteinazy macierzy zewn¹trzkomórkowej uczestnicz¹ w procesach, takich jak embriogeneza, angiogeneza, gojenie ran, bior¹ udzia³ tak e w agregacji p³ytek, reguluj¹ metabolizm jonów. Zmiany aktywnoœci metaloproteinaz zaobserwowano w wielu stanach patologicznych, takich jak procesy zapalne, choroby degeneracyjne oraz w nowotworach. Metaloproteinazy odgrywaj¹ istotn¹ rolê w progresji nowotworu, poprzez pobudzanie wzrostu komórek raka, migracjê, inwazjê, tworzenie przerzutów i nowych naczyñ krwionoœnych. Wydzielanie i aktywnoœæ MMP jest zwiêkszone prawie we wszystkich typach nowotworów u ludzi i koreluje ze stopniem zaawansowania, wiêksz¹ inwazyjnoœci¹, zdolnoœci¹ do dawania przerzutów, a tak e z krótszym okresem prze ycia. Poœród ró nych MMP szczególnie MMP-2 ( elatynaza A) i MMP-9 ( elatynaza B) odgrywaj¹ wa n¹ rolê w procesie inwazji nowotworów, poniewa maj¹ zdolnoœæ do degradacji kolagenu typu IV, g³ównego sk³adnika b³ony podstawnej. S³owa kluczowe: metaloproteinazy macierzy zewn¹trzkomórkowej, MMP, rak piersi. Metaloproteinazy macierzy zewn¹trzkomórkowej charakterystyka biochemiczna i kliniczna wartoœæ oznaczania u chorych na raka piersi Matrix metalloproteinases biochemical characteristics and clinical value determination in breast cancer patients Izabela Œliwowska, Zygmunt Kopczyñski Zak³ad Diagnostyki Laboratoryjnej, Katedra Onkologii, Akademia Medyczna im. Karola Marcinkowskiego, Poznañ Wstêp Rak gruczo³u piersiowego jest obecnie najczêœciej wystêpuj¹cym nowotworem u kobiet, zw³aszcza w krajach Unii Europejskiej i w Stanach Zjednoczonych, gdzie rocznie na raka piersi zapada 6 7 proc. kobiet. W krajach tych obserwuje siê spadek liczby zgonów z powodu raka piersi, mimo e wspó³czynniki zachorowania nie uleg³y zmianie [1]. W Polsce rak piersi zajmuje równie pierwsze miejsce zarówno pod wzglêdem zachorowalnoœci, jak i umieralnoœci wœród kobiet [2]. Wyzwaniem dla ochrony zdrowia staje siê usprawnienie wczesnej diagnostyki choroby nowotworowej i wdro enie skuteczniejszego leczenia. Obok zabiegu operacyjnego stosuje siê leczenie uzupe³niaj¹ce, najczêœciej chemio-, hormono- lub radioterapiê. W zwi¹zku z ograniczon¹ efektywnoœci¹ leczenia uzupe³niaj¹cego, du e nadzieje wi¹ e siê z nowymi lekami, które ogranicz¹ rozwój przerzutów raka piersi. Rak piersi ma du e sk³onnoœci do rozsiewu drog¹ naczyñ krwionoœnych. Ogniska przerzutów odleg³ych raka piersi najczêœciej spotyka siê w koœciach, p³ucach, w¹trobie i mózgu [3]. Warunkiem niezbêdnym do zapocz¹tkowania procesu tworzenia przerzutu jest nabycie przez komórkê nowotworow¹ fenotypu inwazyjnego. Determinuje on zdolnoœæ komórek nowotworowych do przemieszczania siê, naciekania otaczaj¹cych tkanek i tworzenia przerzutów w miejscach odleg³ych od ogniska pierwotnego. W procesie progresji komórki nowotworowe musz¹ pokonaæ bariery w postaci b³ony podstawnej (basement membrane BM), macierzy zewn¹trzkomórkowej (extracellular matrix EM) i œciany naczyñ krwionoœnych [4]. W procesie inwazji komórek nowotworowych szczególn¹ rolê spe³niaj¹ sk³adniki macierzy zewn¹trzkomórkowej, takie jak glikoproteiny, wp³ywaj¹ce na adhezjê komórek, kolageny i elastyna, tworz¹ce w³ókniste rusztowanie macierzy zewn¹trzkomórkowej oraz proteoglikany, u³atwiaj¹ce migracjê komórek. Aby komórki mog³y przejœæ przez gêst¹ sieæ elementów strukturalnych macierzy zewn¹trzkomórkowej, niezbêdna jest proteoliza poszczególnych sk³adników EM. Klasycznym przyk³adem proteolizy pod³o a jest przemieszczanie siê komórek przez b³onê podstawn¹, która jest jedn¹ z form macierzy zewn¹trzkomórkowej i jednoczeœnie wa n¹ barier¹ dla migruj¹cych komórek [4]. Istotne ubytki w b³onie podstawnej s¹ zwi¹zane z inwazj¹ komórek rakowych i s¹ cech¹ charakterystyczn¹ wszystkich typów nowotworów, podczas gdy nieinwazyjne guzy maj¹ nienaruszon¹ BM [5]. W migracji komórek prawid³owych oraz w procesie powstawania przerzutów nowotworowych wa n¹ rolê pe³ni¹ enzymy z grupy metaloproteinaz (matrix metalloproteinases MMPs) [4, 6 9].

2 Wspó³czesna Onkologia (2005) vol. 9; 8 ( ) The matrix metalloproteinases (MMPs) constitute a group of zinc-dependent endopeptidases, which primary function is remodelling of components in the extracellular matrix. These enzymes are synthetized in cells, and secreted to the extracellular space as an inactive form (prommp). Activation of the enzyme is followed by the cleavage in the propeptide region. The activity of metalloproteinases is strictly regulated at the transcriptional, translation levels and by endogenous inhibitors, including α2-macroglobulin and tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs). Under physiological conditions matrix metalloproteinases are involved in processes i. e. embryogenesis, angiogenesis, wound healing and in platelet aggregation, regulation of ion metabolism. There is evidence that matrix metalloproteinases activity changes in many pathological conditions, including inflammatory, degenerative disorders and in cancer. Metalloproteinases play an important role in tumor progression by increasing cancer-cell growth, migration, invasion, metastasis and angiogenesis. The expression and activity of MMPs are increased in almost every type of human cancer, and this correlates with tumor stage, increased invasion and potential metastasis, and shortened survival. Among the different MMPs, especially MMP-2 (gelatinase A) and MMP-9 (gelainase B) play an important role in cancer invasion because of their ability to degrade type IV collagen, a major component of basement membranes. Key words: matrix metalloproteinases, MMP, breast cancer. Metaloproteinazy odgrywaj¹ istotn¹ rolê zarówno w procesach fizjologicznych, jak i patologicznych w organizmie cz³owieka [4, 10, 11]. Enzymy te uczestnicz¹ w migracji komórek w czasie wzrostu, w budowie tkanki podporowej wszystkich narz¹dów wewnêtrznych, stymuluj¹ wzrost neurytów [12]. Bior¹ udzia³ w tworzeniu nowych naczyñ krwionoœnych, s¹ niezbêdne do prawid³owego rozwoju szkieletu oraz odnowy tkanki ³¹cznej. Warunkuj¹ cykliczne zmiany w endometrium oraz zmiany zachodz¹ce w czasie ci¹ y, podczas porodu i po³ogu [13, 14]. Metaloproteinazy umo liwiaj¹ migracjê komórek odpowiedzi zapalnej do uszkodzonych tkanek, uwalniaj¹ cytokiny i ich receptory z b³on komórkowych, dziêki czemu dochodzi do gojenia ran i tworzenia blizn [4, 5, 14, 15]. Reguluj¹ tak e czynnoœæ p³ytek krwi, metabolizm jonu chlorkowego w komórkach nab³onkowych dróg oddechowych [10, 16]. Metaloproteinazy i ich inhibitory uczestnicz¹ w powstawaniu zawa³u miêœnia sercowego oraz têtniaków aorty [17, 18]. Inne jednostki chorobowe, w których stwierdzono nieprawid³owe aktywnoœci metaloproteinaz to m.in. choroby autoimmunologiczne, choroba Alzheimera, stwardnienie rozsiane, stwardnienie zanikowe boczne, szpiczak mnogi, czerniak z³oœliwy i marskoœæ w¹troby [12, 19]. Metaloproteinazy macierzy zewn¹trzkomórkowej harakterystyka biochemiczna Metaloproteinazy macierzy zewn¹trzkomórkowej, nazywane równie kolagenazami lub matryksynami, stanowi¹ grupê metalozale nych enzymów proteolitycznych, nale ¹cych do endopeptydaz. Enzymy te: s¹ zdolne do degradacji co najmniej jednego sk³adnika macierzy, zawieraj¹ atom cynku (Zn 2+ ), który pe³ni rolê katalityczn¹ i strukturaln¹ w cz¹steczce enzymu, syntetyzowane s¹ w komórkach w formie preproenzymu i uwalniane do przestrzeni zewn¹trzkomórkowej jako proenzymy, inaktywowane s¹ przez tkankowe inhibitory metaloproteinaz (tissue inhibitors of metaloproteinases TIMP) [4, 20, 21]. Dotychczas zidentyfikowano, opisano i przypisano odpowiedni numer klasyfikacyjny 28 metaloproteinazom, z których 22 MMPs wystêpuj¹ u ludzi. Substratami dla metaloproteinaz s¹ bia³ka macierzy zewn¹trzkomórkowej, np. fibronektyna, witronektyna, laminina, ró ne typy kolagenu, entacyna, tenascyna, agrecan [4, 9, 22]. Metaloproteinazy s¹ aktywne w obojêtnym lub lekko zasadowym ph w obecnoœci jonów wapnia oraz wykazuj¹ du y stopieñ podobieñstwa strukturalno-czynnoœciowego, s¹ zdolne do degradacji i przebudowy bia³ek przestrzeni pozakomórkowej i b³ony podstawnej, tj. kolagenu, lamininy, fibronektyny, elastyny i proteoglikanów [9, 22]. Jako jedyne trawi¹ kolagen typu IV, stanowi¹cy szkielet b³ony podstawnej naczyñ. Poprzez uszkodzon¹ b³onê podstawn¹ macierzy mog¹ przedostawaæ siê komórki œródb³onka oraz komórki nowotworowe, które s¹ Ÿród³em ognisk przerzutowych [4, 5, 9]. Metaloproteazy s¹ syntetyzowane przez fibroblasty i inne typy komórek tkanki ³¹cznej, leukocyty, monocyty i makrofagi, granulocyty obojêtnoch³onne, komórki œródb³onka i komórki nowotworowe [4, 23, 24]. Wykazano, e MMP-7 wydzielana jest przez komórki raka o³¹dka, piersi, p³uc [25], MMP-8 przez komórki raka p³askonab³onkowego (squamos cell carcinoma S) [26], a MMP-2, MMP-9 i MMP-14 mog¹ byæ produkowane przez komórki nab³onkowe ró nych nowotworów [27]. Niektórzy badacze uwa aj¹, e metaloproteinazy w tkankach nowotworowych wytwarzane s¹ w du ych iloœciach przez pobudzone komórki zrêbu otaczaj¹cego nowotwór [27]. Wydzielanie metaloproteinaz przez komórki inicjuj¹ m.in. œródb³onkowy czynnik wzrostu (vascular-endothelial growth factor VEGF), czynnik martwicy nowotworu alfa (tumor necrosis factor-α TNF-α), interleukina-1, prostaglandyny D 2, E 2 F 2 α oraz fagocytoza, natomiast hamuj¹ ich wydzielanie hormony steroidowe i transformuj¹cy czynnik wzrostu beta (transforming growth factor-β TGF-β) [23, 24]. Komórki nowotworowe i niektóre komórki prawid³o-

3 Metaloproteinazy macierzy zewn¹trzkomórkowej charakterystyka biochemiczna i kliniczna wartoœæ oznaczania u chorych na raka piersi 329 we produkuj¹ specyficzny czynnik stymuluj¹cy syntezê metaloproteinaz przez fibroblasty (extracellular matrix metalloproteinase inducer EMMPRIN) [9, 28]. z¹steczka EMMPRIN jest zlokalizowana na powierzchni komórki nowotworowej i stymuluje znajduj¹ce siê w pobli u fibroblasty do produkcji kolagenaz, elatynazy A i stromielizyny 1 [9]. EMMPRIN zwiêksza tak e produkcjê aktywatorów pro elatynazy A, MT-1-MMP oraz MT-2-MMP w miejscu, gdzie komórka nowotworowa kontaktuje siê z fibroblastem, EMMPRIN stymuluje oko³okomórkow¹ proteolizê EM poprzez aktywacjê pro elatynazy A na powierzchni komórki. Zwiêkszon¹ iloœæ EMMPRIM stwierdzono na powierzchni komórek nowotworowych w pêcherzu moczowym, piersiach, p³ucach i przewodzie pokarmowym [9]. W budowie chemicznej metaloproteinaz mo na wyró niæ charakterystyczne domeny, wspólne dla ca³ej rodziny oraz domeny decyduj¹ce o odmiennych w³aœciwoœciach poszcze- Ryc. 1. Schemat budowy metaloproteinaz w formie latentnej [4, 32] Fig. 1. Structure of metalloproteinases as latent zymogene [4, 32]

4 330 wspó³czesna onkologia gólnych enzymów. Budowa oraz swoistoœæ substratowa by³y podstaw¹ wczeœniej stosowanego podzia³u metaloproteinaz na kilka grup, tj. kolagenazy, elatynazy, stromielizyny, matrylizyny [4, 6, 21, 24, 29]. Wszystkie metaloproteinazy zawieraj¹ peptyd sygna³owy, propeptyd oraz domenê katalityczn¹ (ryc. 1.). Sekwencja sygna³owa, która znajduje siê na koñcu ³añcucha z grup¹ aminow¹, decyduje o sekrecji proenzymu z siateczki œródplazmatycznej do macierzy zewn¹trzkomórkowej i ulega proteolizie na b³onie komórkowej. Propeptyd liczy ok. 80 aminokwasów i zbudowany jest z sekwencji PRG(V/N)PD. Znajduj¹ca siê wewn¹trz tej sekwencji cysteina wi¹ e atom cynku i utrzymuje enzym w stanie nieaktywnym. Kolejna domena, zwana domen¹ katalityczn¹, sk³ada siê z ok. 170 aminokwasów. W obrêbie tej domeny znajduje siê miejsce aktywne, zawieraj¹ce sekwencjê aminokwasów (HEXXHXXGXXH), w której obecne 3 cz¹steczki histydyny (H) wi¹ ¹ atom cynku (ryc. 1.) [4, 9, 24]. Metaloproteinazy o najkrótszym ³añcuchu polipeptydowym (MMP-7, MMP-28) sk³adaj¹ siê tylko z peptydu sygna- ³owego, domeny katalitycznej i propeptydu. Pozosta³e metaloproteinazy zawieraj¹ dodatkowo domenê zakoñczon¹ grup¹ karboksylow¹ przypominaj¹c¹ budow¹ hemopeksynê (globulinê wi¹ ¹c¹ hem i jego pochodne). Domena ta liczy ok. 210 aminokwasów i decyduje o wi¹zaniu bia³ek macierzy zewn¹trzkomórkowej, uczestniczy w procesie aktywacji i inhibicji enzymu [4, 30]. Pomiêdzy domen¹ -koñcow¹ i domen¹ katalityczn¹ znajduje siê ró nej d³ugoœci fragment polipeptydowy, zwany regionem zawiasowym, który pe³ni funkcjê ³¹cznika i decyduje o specyficznoœci substratowej eznymów (ryc. 1.) [4, 9, 22]. elatynazy (MMP-2, MMP-9) w obrêbie domeny katalitycznej zawieraj¹ fragment podobny do fibronektyny, czyli trzy powtórzone sekwencje aminokwasów wi¹ ¹ce enzym z kolagenem i elastyn¹. elatynaza B posiada tak e domenê kolagenu typu V [4, 22]. Natomiast stromielizyna 3 (MMP-11), MMP-23, MMP-28 i metaloproteinazy typu b³onowego zawieraj¹ dodatkowo sekwencjê rozpoznawan¹ przez furynê, enzymy konwertuj¹ce, co prowadzi do aktywacji enzymu jeszcze przed jego sekrecj¹ [4, 22]. W cz¹steczce metaloproteinaz b³onowych wystêpuje równie domena transb³onowa (ryc. 1.) [4, 21 23, 31, 32]. Aktywacja metaloproteinaz Aktywnoœæ metaloproteinaz w warunkach fizjologicznych kontrolowana jest na kilku poziomach, m.in. na poziomie transkrypcji genów, translacji i aktywacji proenzymów oraz poprzez inhibitory tkankowe [4, 19, 29, 33]. W badaniach in vitro wykazano stymulacje transkrypcji genów wielu metaloproteinaz przez czynniki wzrostu, cytokiny, estry forbolu oraz onkogeny, które indukuj¹ ekspresjê protoonkogenów fas i jun. Produkty tych genów tworz¹ czynniki transkrypcyjne AP-1, które ³¹cz¹ siê ze specyficzn¹ sekwencj¹ DNA w rejonie promotorowym genu i stymuluj¹ proces transkrypcji genu metaloproteinazy [19, 29, 33]. Kolejnym poziomem kontroli aktywnoœci metaloproteinaz jest aktywacja proenzymu pod wp³ywem enzymów proteolitycznych, plazminy, jonów metali, oksydantów, detergentów [4, 23]. Aktywnoœæ proteolityczna metaloproteinaz zale y tak e od specyficznoœci substratowej, ph œrodowiska oraz obecnoœci endogennych inhibitorów z rodziny tkankowych inhibitorów metaloproteinaz TIMP oraz inhibitorów proteaz serynowych [4, 6, 9]. Metaloproteinazy s¹ syntetyzowane w postaci pre-proenzymu. Odciêcie domeny sygna³owej powoduje uwolnienie MMP w formie zymogenu do przestrzeni zewn¹trzkomórkowej. Dziêki domenie propeptydowej metaloproteinazy utrzymywane s¹ w formie nieaktywnej (proenzym, forma latentna) i w takiej formie znajduj¹ siê we wszystkich tkankach organizmu. W proenzymie cynk w centrum aktywnym zablokowany jest wi¹zaniem koordynacyjnym przez cysteinê N-koñcowej czêœci ³añcucha bia³kowego [4, 9]. Aktywacja metaloproteinaz zwana cystein-switch, polega na odciêciu propeptydu i ods³oniêciu miejsca aktywnego poprzez rozerwanie wi¹zania miêdzy grup¹ tiolow¹ cysteiny i atomem cynku. Proces ten powoduje zmiany konformacyjne cz¹steczki metaloproteinaz, grupa SH cysteiny zostaje zast¹piona cz¹steczk¹ wody. Nastêpnie dochodzi do usuniêcia propeptydu w wyniku autokatalizy lub proteolizy przy udziale innych enzymów i ods³oniêcia centrum aktywnego z atomem Zn (ryc. 2.). W ten sposób powstaje enzym o mniejszej masie cz¹steczkowej (o ok. 10 kda) od formy latentnej [9, 21, 23]. Aktywacja MMPs mo e tak e zachodziæ przy udziale aktywnych form metaloproteinaz oraz pod wp³ywem proteinaz serynowych obecnych w œrodowisku pozakomórkowym, np. proteinazy systemu aktywacji plazminogenu do plazminy, elastazy leukocytarnej, kalikreiny, katepsyny G oraz trypsyny wydzielanej przez komórki nowotworowe (ryc. 2.) [5, 9, 23]. Proces aktywacji prommp poprzez zmiany konformacyjne poprzedzaj¹ce od³¹czenie peptydu regulatorowego mo- e zachodziæ w wyniku dzia³ania ró nych zwi¹zków nieorganicznych (cyjanku, jodku potasowego, siarczanu dodecylu sodu), zwi¹zków organicznych zawieraj¹cych rtêæ (octan 4-aminofenylortêciowy APMA), mocznika oraz pod wp³ywem stresu oksydacyjnego (ryc. 2.) [23, 34]. Wykazano, e MMP-2 i MMP-13 mog¹ ulegaæ aktywacji pod wp³ywem metalopoteinaz b³onowych (membrane type metalloproteinases MT-MMP) [9, 35 38]. Jednak ten sposób aktywacji mo liwy jest tylko w przypadku niskiego stê enia tkankowego inhibitora metaloproteinaz. Wysokie stê enie TIMP-2 blokuje wszystkie cz¹steczki metaloproteinaz b³onowych i hamuje aktywacjê proenzymów. Degradacja tkanek w chorobach przebiegaj¹cych ze zwiêkszon¹ aktywnoœci¹ metaloproteinaz czêsto jest wynikiem zachwiania równowagi pomiêdzy aktywnoœci¹ MMP i tkankowych inhibitorów metaloproteinaz [4, 9, 37]. Obni enie aktywnoœci MMP mo na uzyskaæ poprzez zablokowanie genów odpowiedzialnych za wytwarzanie odpowiednich metaloproteinaz lub genów odpowiedzialnych za wytwarzanie TIMPs [39]. Dotychczas poznano 4 geny koduj¹ce bia³ka zwane tkankowymi inhibitorami metaloproteinaz (TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3 oraz TIMP-4) [4, 6, 40]. Tkankowe inhibitory metaloproteinaz zbudowane s¹ z dwóch domen. Domena N-koñcowa identyczna u wszyst-

5 Metaloproteinazy macierzy zewn¹trzkomórkowej charakterystyka biochemiczna i kliniczna wartoœæ oznaczania u chorych na raka piersi 331 kich inhibitorów, wi¹ e siê z centrum aktywnym metaloproteinaz blokuj¹c ich aktywnoœæ. Natomiast domena -koñcowa wp³ywa na po³¹czenie inhibitora z fragmentem podobnym do hemopeksyny metaloproteinaz [41]. Tkankowe inhibitory metaloproteinaz reguluj¹ degradacjê macierzy zewn¹trzkomórkowej zarówno przez eliminacjê proteinaz, jak i hamowanie aktywacji MMP, tworz¹c wi¹zania niekowalencyjne z aktywnymi lub latentnymi formami metaloproteinaz w stosunku molowym 1:1 [4, 6, 22, 40]. Mechanizm hamowania aktywacji metaloproteinaz polega na zablokowaniu przez TIMP mo liwoœci od³¹czenia N-koñcowego fragmentu metaloproteinazy [22, 23, 41]. G³ównymi inhibitorami metaloproteinaz s¹: TIMP-1 rozpuszczalna glikoproteina o masie cz¹steczkowej 28 kda, produkowana przez wiêkszoœæ komórek oraz TIMP-2 rozpuszczalne bia³ko o masie 21 kda, produkowane przez fibroblasty i komórki endotelialne. Wykazano, e cz¹steczka TIMP-2 ma wiêksze powinowactwo do MMP-2, a TIMP-1 do MMP-9 [22, 23]. Tkankowe inhibitory metaloproteinaz odgrywaj¹ wa n¹ rolê w ustaleniu równowagi pomiêdzy procesem degradacji i syntezy macierzy zewn¹trzkomórkowej. Podczas nadmiernego wydzielania MMP, np. przez komórki nowotworów z³oœliwych obserwuje siê tak e zwiêkszone wydzielanie TIMP. Nadmierna synteza metaloproteinaz w porównaniu do inhibitorów tkankowych powoduje nasilenie procesów degradacyjnych i tym samym prowadziæ mo e do migracji komórek nowotworowych. Wykazano, e inhibitory tkankowe metaloproteinaz oprócz hamowania MMPs, mog¹ tak e stymulowaæ rozwój nowotworów, a podwy szony poziom TIMP-1 i TIMP-2 w tkance nowotworowej pogarsza rokowanie u chorych na raka pêcherza moczowego i raka o³¹dka [42, 43]. Niespecyficznym, naturalnym inhibitorem wszystkich MMP jest α2-makroglobulina. Jednak du e rozmiary tej cz¹steczki ograniczaj¹ zdolnoœæ jej penetracji pozanaczyniowej i tym samym zmniejszaj¹ efekt hamowania metaloproteinaz [44]. Syntezê metaloproteinaz hamuj¹ tak e cytokiny przeciwzapalne interferon gamma (IFN-γ), interleukina-4 (IL-4) oraz Dexamethason i Indometacyna. Zwi¹zki te zmniejszaj¹ syntezê substancji poœrednicz¹cych w wytwarzaniu MMP, takich jak prostaglandyna E 2 (prostaglandin E 2 PGE 2 ) i cykliczny adenozynomonofosforan (cyclic adenosine monophosphate camp) [4, 33]. Pozaustrojowymi inhibitorami metaloproteinaz s¹ antybiotyki nale ¹ce do grupy tetracyklin (doxycyklina, oksytetracyklina, minocyklina) podawane w niskich dawkach, a tak- e chlorheksydyna [45, 46]. Z inhibitorów syntetycznych batimastat (BB-94) i marimastat (BB-2516), zwi¹zki zbli one budow¹ do kolagenu, s¹ w fazie prób klinicznych [47]. Zwi¹zki hamuj¹ce aktywnoœæ MMPs to tak e: Trochate (Ro ), AG 3340, BAY oraz antybiotyki, g³ównie pó³syntetyczne pochodne tetracyklin i antybiotyki antracyklinowe [23, 48, 49]. Dodatkowe badania na zwierzêtach wykaza³y, e syntetyczne inhibitory stosowane we wczesnych stadiach zaawansowania choroby nowotworowej, ³¹cznie z konwencjonalnymi metodami leczenia lub jako uzupe³niaj¹ce leczenie pooperacyjne zapobiegaj¹ powstawaniu mikroprzerzutów, prowadz¹cych do rozsiewu i nawrotu choroby [4]. Du e nadzieje wi¹ e siê ze zwi¹zkiem BMS niebia³kowym, doustnym inhibitorem metaloproteinaz o szerokim zakresie dzia³ania, który nie wykazuje toksycznego SH Zn O H ys H Proteinazy N MMPs Propeptyd MMP forma poœrednia SH Domena katalityczna Zn prommp S ys N ys Zn O H H MMP (aktywne) Odczynniki zawieraj¹ce grupê SH, zwi¹zki rtêci, mocznik, SDS, HOl MMPs S X S X S X Zn ys H O H N Zn ys O ys H N Zn O H N Zaktywowane prommps MMP forma poœrednia N Ryc. 2. Aktywacja metaloproteinaz [9, 23] Fig. 2. Activation of metalloproteinases [9, 23]

6 332 wspó³czesna onkologia oddzia³ywania na miêœnie szkieletowe [50]. Naturalnie wystêpuj¹cym czynnikiem przeciwnowotworowym jest zwi¹zek otrzymywany z chrz¹stek rekina Neovastat (AE-941), który hamuje aktywnoœæ MMP-2, MMP-9 i MMP-12 oraz hamuje wi¹zanie œródb³onkowego czynnika wzrostu do komórek œródb³onka i fosforylacjê tyrozyny [51]. Udzia³ metaloproteinaz w procesie powstawania przerzutów nowotworowych Wiêkszoœæ pacjentów, u których stwierdzono nowotwór z³oœliwy, umiera z powodu przerzutów. Du e rozproszenie anatomiczne umiejscowienia przerzutów i ich ró norodny sk³ad komórkowy uniemo liwia ca³kowite usuniêcie chirurgiczne zmian oraz zmniejsza odpowiedÿ na ogólnoustrojowe czynniki przeciwnowotworowe. Z tego wzglêdu wa nym zadaniem oœrodków naukowych sta³o siê ulepszenie metod pozwalaj¹cych okreœliæ stopieñ agresywnoœci komórek nowotworowych oraz identyfikuj¹cych mikroprzerzuty, niedaj¹ce jeszcze objawów klinicznych. W inwazji nowotworu i procesie powstawania przerzutów istotn¹ rolê odgrywa migracja komórek nowotworowych. Warunkiem niezbêdnym w migracji komórek jest degradacja macierzy zewn¹trzkomórkowej przez metaloproteinazy. Migracja komórek nowotworowych mo e byæ wzmo ona poprzez nadekspresjê MMP, podczas gdy nadekspresja TIMP lub zastosowanie inhibitorów MMP powoduje zmniejszenie migracji [9]. Regulacja wydzielania i lokalizacja MMP zale y od typu migracji komórek nowotworowych. Istniej¹ 2 typy migracji komórek: przemieszczanie siê pojedynczych komórek lub w grupie [9]. Pierwszy typ migracji obserwowany jest podczas inwazji nowotworów hematopoetycznych, takich jak bia³aczka lub ch³oniak, a tak- e w przypadku miêsaka. Natomiast migracja grupy komórek nowotworowych utrzymuj¹cych kontakt pomiêdzy sob¹ obserwowana jest czêsto w czasie inwazji komórek nowotworowych dobrze lub umiarkowanie zró nicowanych, np. raka szyjki macicy, czerniaka z³oœliwego [9]. Proces powstawania przerzutów nowotworowych zwi¹zany jest z proteoliz¹ b³ony podstawnej naczyñ oraz sk³adników macierzy zewn¹trzkomórkowej, regulacj¹ wzrostu guza zarówno w miejscu pierwotnym, jak i w miejscu powstania przerzutu. W rozwoju nowotworu i w powstawaniu odleg³ych przerzutów niezwykle wa n¹ rolê spe³nia proces angiogenezy, czyli tworzenia nowych naczyñ krwionoœnych. Wykazano, e nowotwór bez dodatkowych naczyñ krwionoœnych mo e osi¹gn¹æ œrednicê ok. 1 2 mm, natomiast do dalszego wzrostu miejscowego i do rozsiewu potrzebuje sk³adników od ywczych dostarczanych przez naczynia krwionoœne. Angiogeneza jest œciœle regulowana przez uk³ad stymulatorów i ihibitorów, a rozpoczyna siê od uwolnienia proteaz rozk³adaj¹cych b³onê podstawn¹ oraz macierz zewn¹trzkomórkow¹. Nastêpnie dochodzi do migracji komórek œródb³onka do przestrzeni oko³onaczyniowej oraz ich proliferacji. Namna aj¹ce siê komórki œródb³onka tworz¹ nowe naczynia krwionoœne. Najwa niejszym czynnikiem reguluj¹cym angiogenezê jest naczyniowo-œródb³onkowy czynnik wzrostu VEGF [52]. W procesie angiogenezy metaloproteinazy uczestnicz¹ w przebudowie EM, kontroluj¹ aktywnoœæ czynników bior¹cych udzia³ we wzroœcie komórek œródb³onkowych, ich ró nicowaniu i apoptozie, wp³ywaj¹ na wydzielanie lub aktywacjê czynników proangiogennych [32, 53]. Metaloproteinazy uczestnicz¹ w procesie przechodzenia komórek nowotworowych przez bariery macierzy zewn¹trzkomórkowej, a tak e w modulowaniu sygna³ów oddzia- ³uj¹cych na transformacje komórek, czynniki wzrostu, angiogenezê i apoptozê. Pocz¹tkowo uwa ano, e kolagenazy typu IV uczestnicz¹ w inwazji nowotworu poprzez niszczenie b³ony podstawnej. Kolejne badania wykaza³y, e hamowanie migracji komórek nowotworowych poprzez inhibitory MMP i proteinazy serynowe nie eliminuje zdolnoœci komórek raka do migracji [7, 8]. Metaloproteinazy poprzez ³¹czenie siê z bia³kiem wi¹ ¹cym insulinopodobny czynnik wzrostu (insulin-like growth factor-binding protein IGF-BP), uwalniaj¹ sam czynnik (insulin-like growth factor IGF), wp³ywaj¹ na wydzielanie transmembranowych czynników wzrostu. Z drugiej strony MMP mog¹ hamowaæ wzrost komórek raka uwalniaj¹c czynnik TGF-β [4, 6]. Metaloproteinazy hamuj¹ tak e reakcjê immunologiczn¹ organizmu przeciwko komórkom nowotworowym poprzez niszczenie receptorów dla interleukiny-2 na limfocytach T [4]. Zdolnoœæ przerzutowania i inwazji tkanek zdrowych jest wyznacznikiem z³oœliwoœci nowotworu. echy markerów przerzutowania wykazuj¹ tak e metaloproteinazy, a wœród nich elatynazy [4, 7, 8, 40]. Wartoœæ oznaczania aktywnoœci metaloproteinaz w diagnostyce laboratoryjnej raka piersi doœwiadczenia w³asne Oznaczanie aktywnoœci elatynaz ze wzglêdu na z³o onoœæ procedur analitycznych nie zosta³o wdro one do rutynowej diagnostyki laboratoryjnej. Stê enie bia³ek elatynaz i/lub ich aktywnoœæ mo na oznaczaæ przy u yciu metod immunohistochemicznych, immunoenzymatycznych, hybrydyzacji in situ, reakcji ³añcuchowej polimerazy (PR) oraz metod elektroforetycznych, takich jak zymografia elatynaz i Western blotting [54, 55]. Ka da z tych technik wykazuje pewne ograniczenia. Za pomoc¹ przeciwcia³ u ywanych w badaniach immunohistochemicznych nie mo na odró - niæ form aktywnych od proform i chocia udaje siê zlokalizowaæ bia³ka metaloproteinaz oraz ich inhibitory w tkance, nie mo na jednak okreœliæ ich aktywnoœci enzymatycznej [55]. Bardziej kosztownymi metodami immunoenzymatycznymi, w zale noœci od rodzaju zastosowanych przeciwcia³ mo na odró niæ aktywne formy elatynaz od nieaktywnych. W wielu oœrodkach oceniano wartoœæ diagnostyczn¹ i/lub prognostyczn¹ testów immunoenzymatycznych do oznaczania stê enia bia³ka metaloproteinaz w surowicy, osoczu i innych p³ynach ustrojowych pacjentów chorych na nowotwory [56 58]. Wyniki tych prac wykaza³y, e metaloproteinazy s¹ istotnymi czynnikami progresji nowotworów, ich poziom koreluje z agresywnoœci¹ choroby, ryzykiem wznowy miejscowej oraz ryzykiem zgonu [56 59]. Ostatnie prace Talvensaari-Mattila i wsp. wykaza³y, e przedoperacyjny poziom MMP-9 oznaczany metod¹ immunoenzymatyczn¹ u chorych na pierwotnego raka piersi koreluje z wynikami klinicznymi. W grupie chorych na raka piersi poddanych

7 Metaloproteinazy macierzy zewn¹trzkomórkowej charakterystyka biochemiczna i kliniczna wartoœæ oznaczania u chorych na raka piersi letniej obserwacji tylko u 43 proc. badanych z niskim poziomem MMP-9 nie stwierdzono wznowy, podczas gdy u osób z podwy szonym stê eniem MMP-9 wznowa nie wyst¹pi³a a u 76 proc. [60]. Leppa i wsp., natomiast, oznaczaj¹c MMP-2 metod¹ immunoenzymatyczn¹ (enzyme-linked immunosorbent assay ELISA) u chorych na raka piersi z przerzutami do wêz³ów ch³onnych nie stwierdzili ró nic statystycznie istotnych pomiêdzy poziomem MMP-2 a wiekiem chorych, obecnoœci¹ receptorów estrogenowych i wielkoœci¹ guza. Obserwacje 5-letnie chorych na raka piersi wykaza³y, e niski poziom MMP-2 korelowa³ z d³u szym okresem prze ycia ca³kowitego i prze ycia bez wznowy. Na podstawie uzyskanych wyników badacze stwierdzili, e pooperacyjny poziom MMP- 2 jest niezale nym czynnikiem prognostycznym u chorych na raka piersi z przerzutami do wêz³ów ch³onnych. Pomiar MMP-2 u tych chorych pozwoli³ wy³oniæ grupê pacjentów z gorszym rokowaniem, kwalifikuj¹cych siê do terapii adjuwantowej [61]. W dostêpnym piœmiennictwie niewiele jest danych dotycz¹cych aktywnoœci enzymów metaloproteinaz u chorych na nowotwory. Aktywnoœæ metaloproteinaz, np. elatynazy A (MMP-2) i elatynazy B (MMP-9) mo na oznaczyæ metod¹ zymografii, czyli pionowej elektroforezy w elu polikrylamidowym zawieraj¹cym elatynê [62, 63]. Metod¹ zymografii mo na oznaczyæ aktywnoœæ MMP-2 i MMP-9 zawartych w homogenatach komórek nowotworowych, w surowicy, osoczu krwi lub w innych p³ynach ustrojowych [55, 64, 65]. W przypadku homogenizacji tkanek nie ma mo liwoœci zlokalizowania aktywnych metaloproteinaz w komórkach. Ponadto procedura przygotowywania próbek mo e aktywowaæ enzym lub doprowadzaæ do kontaktu enzymu z inhibitorami zlokalizowanymi w nieuszkodzonych tkankach lub komórkach. Metoda zymografii in situ, opisana po raz pierwszy w 1995 r. przez Galisa i wsp., pozwala zachowaæ struktury tkanek nieuszkodzone i umo liwia zlokalizowanie czystych aktywnych form MMP w komórkach [66]. Jednak komórki organizmu cz³owieka nie maj¹ zdolnoœci do magazynowania metaloproteinaz, dlatego ich aktywnoœæ we krwi jest podobna jak w tkankach, a nawet mo e byæ wy sza. Oznaczanie aktywnoœci elatynaz w surowicy lub osoczu krwi jest badaniem nieinwazyjnym i mo e byæ wykonywane wielokrotnie, a ich wyniki mog¹ byæ wykorzystane do monitorowania przebiegu choroby oraz do oceny skutecznoœci zastosowanego schematu leczenia [56, 67]. Za pomoc¹ zymografii mo na wykazaæ w surowicy obecnoœæ formy latentnej elatynazy A (pro-mmp-2) o masie cz¹steczkowej 72 kda oraz formy latentnej elatynazy B (pro-mmp- 9) o masie cz¹steczkowej 92 kda. La Rocca i wsp. oceniaj¹c aktywnoœæ elatynaz metod¹ zymografii w surowicy chorych na raka piersi wykazali korelacjê zwiêkszonej aktywnoœci metaloproteinaz z nadekspresj¹ c-erb-2 oraz ocenili wartoœæ diagnostyczn¹ oznaczania MMP-2 i MMP-9 u chorych na raka piersi [68]. Podobnie Ranuncolo i wsp., stosuj¹c metodê zymografii wykazali pozytywn¹ korelacjê aktywnoœci elatynazy B (MMP-9 o masie 92 kda) ze stanem klinicznym pacjentów chorych na raka piersi. Analiza prze yæ wykonana metod¹ Kaplana-Meiera wykaza³a, e im wy sza by³a aktywnoœæ MMP-9 w momencie diagnozy raka piersi, tym krótszy okres ca³kowitych prze yæ pacjentów z zaawansowanym rakiem piersi. Autorzy sugeruj¹ u ytecznoœæ oznaczania aktywnoœci MMP-9 jako czynnika pomocnego w prognozowaniu efektów terapii u chorych na raka piersi [69]. W Zak³adzie Diagnostyki Laboratoryjnej Akademii Medycznej im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu wykonano oznaczenia aktywnoœci elatynazy A i B metod¹ zymografii w surowicy kobiet chorych na raka piersi i kobiet z ³agodnymi zmianami w piersiach [70, 71]. W badaniach tych wykazano wzrost aktywnoœci elatynaz u kobiet z ³agodnymi zmianami w piersiach i chorych na raka piersi w porównaniu z grup¹ kobiet zdrowych. Im wy szy by³ stopieñ zaawansowania klinicznego choroby, tym wy sza by³a aktywnoœæ elatynazy A i elatynazy B w surowicy kobiet chorych na raka piersi [70, 71]. W badaniach w³asnych wykazano istotnie wy sze mediany aktywnoœci elatynazy A i B w surowicy chorych na raka piersi z zajêtymi wêz³ami ch³onnymi w stosunku do grupy chorych bez przerzutów. Istotny statystycznie wzrost aktywnoœci elatynazy A i B korelowa³ tak e z wielkoœci¹ guza piersi [71]. Najwiêksze mediany aktywnoœci elatynazy A i elatynazy B otrzymano w surowicy chorych z guzem o œrednicy powy ej 5 cm. U chorych tych mediana aktywnoœci elatynaz by³a ponad 2-krotnie wy - sza ni w grupie kobiet z guzem o najmniejszej œrednicy tj. 2 cm [71]. Dalsze badania w³asne wykaza³y prawie 2-krotnie wy - sz¹ medianê aktywnoœci elatynazy A oraz prawie 2,5-krotnie wy sz¹ aktywnoœæ elatynazy B w surowicy kobiet chorych na pierwotnie nieoperacyjnego raka piersi, w porównaniu z wartoœciami uzyskanymi u chorych na pierwotnie operacyjnego raka piersi [70, 72]. Nie obserwowano natomiast istotnych ró nic w aktywnoœci elatynazy A i elatynazy B po zastosowaniu chemioterapii indukcyjnej [71]. Analiza statystyczna dowiod³a, e czu³oœæ diagnostyczna oznaczania aktywnoœci elatynazy A i elatynazy B metod¹ zymografii wynosi³a kolejno 56 i 51 proc., a swoistoœæ diagnostyczna 75 proc. i 77 proc. Obliczona wartoœæ predykcyjna dodatnia oznaczania aktywnoœci elatynazy A i B metod¹ zymografii wynios³a 77 proc., natomiast wartoœæ predykcyjna ujemna dla elatynazy A by³a równa 53 proc. i dla elatynazy B 51 proc. Powierzchnie pola pod krzyw¹ RO dla aktywnoœci elatynazy A i B oznaczanej metod¹ zymografii wynosi³y odpowiednio 0,698 i 0,678 [71]. Zbyt niska czu³oœæ i swoistoœæ diagnostyczna okreœlona dla elatynazy A i B wyraÿnie ogranicza przydatnoœæ stosowania zymografii elatynaz w diagnostyce pierwotnego raka piersi oraz w ró nicowaniu raka od zmian ³agodnych w piersiach. Natomiast oznaczanie aktywnoœci elatynazy A i elatynazy B w surowicy jest badaniem pomocniczym w kwalifikacji chorych do zabiegu chirurgicznego a wzrost aktywnoœci tych enzymów œwiadczy o zaawansowaniu procesu nowotworowego [71, 72]. Podsumowanie Metoda zymografii oznaczania aktywnoœci elatynazy A i B, mimo e jest metod¹ czasoch³onn¹, to spe³nia wymagania stawiane metodom analitycznym stosowanym

8 334 wspó³czesna onkologia w rozpoznawaniu chorób nowotworowych. harakteryzuje siê du ¹ czu³oœci¹ analityczn¹ i liniowoœci¹. Zalet¹ zymografii jest równie to, e mo e byæ wykorzystana do oznaczania aktywnoœci elatynaz nie tylko w surowicy i osoczu krwi, ale tak e w homogenatach komórek nowotworowych. Mimo i rozwojowi raka piersi towarzyszy wzrost aktywnoœci elatynazy A i elatynazy B w surowicy krwi, z uwagi na umiarkowan¹ czu³oœæ i swoistoœæ diagnostyczn¹ pomiar aktywnoœci tych enzymów jest ma³o przydatny w diagnozowaniu raka piersi i w ró nicowaniu raka piersi od zmian ³agodnych. Przedstawione w pracy wyniki badañ w³asnych wykaza- ³y, e oznaczanie aktywnoœci elatynazy A i elatynazy B w surowicy jest wskazane do oceny stanu klinicznego chorych na raka piersi. Dodatnia zale noœæ aktywnoœci elatynazy A i elatynazy B z czynnikami rokowniczymi, takimi jak stan zaawansowania klinicznego choroby, stan wêz³ów ch³onnych pachowych i wielkoœæ guza uœciœla prognozowanie przebiegu choroby, wynikaj¹ce z oceny klasycznych czynników rokowniczych. Piœmiennictwo 1. Ferlay J, Bray F, Pisani P, Parkin DM. Globocan ancer Incidence, Mortality and Prevalence Worldwide, version 1.0. AR ancer Base No. 5, Lyon, IAR Press Krajowy rejestr nowotworów. Zak³ad Epidemiologii i Prewencji Nowotworów. entrum Onkologii Instytut im. Marii Sk³odowskiej-urie, Warszawa Pardela M. Wspó³czesne rozpoznawanie i leczenie guzów sutka u kobiet. Œl¹ska Akademia Medyczna, Katowice Egeblad M, Werb Z. New functions for the matrix metalloproteinases in cancer progression. Nat Rev ancer 2002; 2: Ray JM, Stetler-Stevenson WG. The role of matrix metalloproteases and their inhibitors in tumour invasion, metastasis and angiogenesis. Eur Respir J 1994; 7: Duffy MJ, Maguire TM, Hill A, McDermott E, O Higgins N. Metalloproteinases: role in breast carcinogenesis, invasion and metastasis. Breast ancer Res 2000; 2: Johansson N, Ahonen M, Kahari VM. Matrix metalloproteinases in tumor invasion. ell Mol Life Sci 2000; 57: Mcawley LJ, Matrisian LM. Matrix metalloproteinases: multifunctional contributors to tumor progression. Mol Med Today 2000; 6: Nabeshima K, Inoue T, Shimao Y, Sameshima T. Matrix metalloproteinases in tumor invasion: role for cell migration. Pathol Int 2002; 52: Sawicki G, Radomski MW. Nowe aspekty biologii metaloproteinaz przestrzeni miêdzykomórkowej (MMPs). Diag Lab 1999; 35: Emara M, WoŸniak M. Role of metalloproteinases in cancer cell invassivenss. Diag Lab 1999; 35: Yong VW, Power, Forsyth P, Edwards DR. Metalloproteinases in biology and pathology of the nervous system. Nat Rev Neurosci 2001; 2: Fishman DA, Bafetti LM, Stack MS. Membrane-type matrix metalloproteinase expression and matrix metalloproteinase-2 activation in primary human ovarian epithelial carcinoma cells. Invasion Metastasis 1996; 16: Tu FF, Goldenberg RL, Tamura T, Drews M, Zucker SJ, Voss HF. Prenatal plasma matrix metalloproteinase-9 levels to predict spontaneous preterm birth. Obstet Gynecol 1998; 92: Zucker S, Hymowitz M, onner, et al. Measurement of matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in blood and tissues. linical and experimental applications. Ann N Y Acad Sci 1999; 878: Sawicki G, Salas E, Murat J, Miszta-Lane H, Radomski MW. Release of gelatinase A during platelet activation mediates aggregation. Nature 1997; 386: Li YY, McTiernan F, Feldman AM. Interplay of matrix metalloproteinases, tissue inhibitors of metalloproteinases and their regulators in cardiac matrix remodeling. ardiovasc Res 2000; 46: Faxon DP, oats W, urrier J. Remodeling of the coronary artery after vascular injury. Prog ardiovasc Dis 1997; 40: Leppert D, Lindberg RL, Kappos L, Leib SL. Matrix metalloproteinases: multifunctional effectors of inflammation in multiple sclerosis and bacterial meningitis. Brain Res Brain Res Rev 2001; 36: Wojtowicz-Praga SM, Dickson RB, Hawkins MJ. Matrix metalloproteinase inhibitors. Invest New Drugs 1997; 15: Borkakoti N. Structural studies of matrix metalloproteinases. J Mol Med 2000; 78: Sternlicht MD, Werb Z. How matrix metalloproteinases regulate cell behavior. Annu Rev ell Dev Biol 2001; 17: Nagase H. Activation mechanisms of matrix metalloproteinases. Biol hem 1997; 378: Nagase H, Woessner JF Jr. Matrix metalloproteinases. J Biol hem 1999; 274: Wilson L, Matrisian LM. Matrilysin: an epithelial matrix metalloproteinase with potentially novel functions. Int J Biochem ell Biol 1996; 28: Moilanen M, Pirila E, Grenman R, Sorsa T, Salo T. Expression and regulation of collagenase-2 (MMP-8) in head and neck squamous cell carcinomas. J Pathol 2002; 197: oussens LM, Fingleton B, Matrisian LM. Matrix metalloproteinase inhibitors and cancer: trials and tribulations. Science 2002; 295: Tang Y, Nakada MT, Kesavan P, Mcabe F, Millar H, Rafferty P, Bugelski P, Yan L. Extracellular matrix metalloproteinase inducer stimulates tumor angiogenesis by elevating vascular endothelial cell growth factor and matrix metalloproteinases. ancer Res 2005; 65: Singh S, Barrett J, Sakata K, Tozer RG, Singh G. ETS proteins and MMPs: partners in invasion and metastasis. urr Drug Targets 2002; 3: Roeb E, Schleinkofer K, Kernebeck T, Potsch S, Jansen B, Behrmann I, Matern S, Grotzinger J. The matrix metalloproteinase 9 (MMP-9) hemopexin domain is a novel gelatin binding domain and acts as an antagonist. J Biol hem 2002; 277: Bode W, Fernandez-atalan, Tschesche H, Grams F, Nagase H, Maskos K. Structural properties of matrix metalloproteinases. ell Mol Life Sci 1999; 55: Marc A, Lafleur m, Handsley M, Dylan R Edwards. Potential and established roles for the matrix metalloproteinases (MMPs) during angiogenesis. Expert Rev Mol Med 2003; 5: Palosaari H. Matrix metalloproteinases (MMPs) and their specific tissue inhibitors (TIMPs) in mature human odontoblasts and pulp tissue. The regulation of expressions of fibrillar collagens, MMPs and TIMPs by growth factors, transforming growth factorβ 1 (TGF-β 1) and bone morphogenetic protein-2 (BMP-2). University of Oulu, Oulu Finland Okamoto T, Akaike T, Nagano T, Miyajima S, Suga M, Ando M, Ichimori K, Maeda H. Activation of human neutrophil procollagenase by nitrogen dioxide and peroxynitrite: a novel mechanism for procollagenase activation involving nitric oxide. Arch Biochem Biophys 1997; 342: Knäuper V, Will H, López-Otin, Smith B, Atkinson SJ, Stanton H, Hembry RM, Murphy G. ellular mechanisms for human procollagenase-3 (MMP-13) activation. Evidence that MT1-MMP (MMP- 14) and gelatinase a (MMP-2) are able to generate active enzyme. J Biol hem 1996; 271: Shamamian P, Schwartz JD, Pocock BJ, Monea S, Whiting D, Marcus SG, Mignatti P. Activation of progelatinase A (MMP-2) by neutrophil elastase, cathepsin G, and proteinase-3: a role for inflammatory cells in tumor invasion and angiogenesis. J ell Physiol 2001; 189: Zucker S, Drews M, onner, et al. Tissue inhibitor of metalloproteinase-2 (TIMP-2) binds to the catalytic domain of the cell

9 Metaloproteinazy macierzy zewn¹trzkomórkowej charakterystyka biochemiczna i kliniczna wartoœæ oznaczania u chorych na raka piersi 335 surface receptor, membrane type 1-matrix metalloproteinase 1 (MT1-MMP). J Biol hem 1998; 273: Toth M, hvyrkova I, Bernardo MM, Hernandez-Barrantes S, Fridman R. Pro-MMP-9 activation by the MT1-MMP/MMP-2 axis and MMP-3: role of TIMP-2 and plasma membranes. Biochem Biophys Res ommun 2003; 308: Imren S, Kohn DB, Shimada H, Blavier L, Delerck YA. Overexpression of tissue inhibitor of metalloproteinases-2 retroviral- -mediated gene transfer in vivo inhibits tumor growth and invasion. ancer Res 1996; 56: urran S, Murray GI. Matrix metalloproteinases in tumour invasion and metastasis. J Pathol 1999; 189: Blavier L, Henriet P, Imren S, Declerck YA. Tissue inhibitors of matrix metalloproteinases in cancer. Ann N Y Acad Sci 1999; 878: Grignon DJ, Sakr W, Toth M, et al. High levels of tissue inhibitor of metalloproteinase-2 (TIMP-2) expression are associated with poor outcome in invasive bladder cancer. ancer Res 1996; 56: Mimori K, Mori M, Shiraishi T, et al. linical significance of tissue inhibitor of metalloproteinase expression in gastric carcinoma. Br J ancer 1997; 76: Nagase H, Itoh Y, Binner S. Interaction of alpha 2-macroglobulin with matrix metalloproteinases and its use for identification of their active forms. Ann N Y Acad Sci 1994; 732: Gendron R, Grenier D, Sorsa T, Mayrand D. Inhibition of activities of matrix metalloproteinases 2, 8 and 9 by chlorhexidine. lin Diagn Lab Immunol 1999; 6: Skotnicki JS, Zask A, Nelson F, Albright JD, Levin JI. Design and synthetic considerations of matrix metalloproteinase inhibitors. Ann N Y Acad Sci 1999; 878: Wojtowicz-Praga S, Torri J, Johnson M, et al. Phase I trial of Marimastat, a novel matrix metalloproteinase inhibitor, administered orally to patients with advanced lung cancer. J lin Oncol 1998; 16: Selzer MG, Zhu B, Block NL, Lokeshwar BL. MT-3, a chemically modified tetracycline, inhibits bony metastases and delays the development of paraplegia in a rat model of prostate cancer. Ann N Y Acad Sci 1999; 878: Shalinsky DR, Brekken J, Zou H, et al. Broad antitumor and antiangiogenic activities of AG3340, a potent and selective MMP inhibitor undergoing advanced oncology clinical trials. Acad N Y Sci 1999; 878: Naglich JG, Jure-Kunkel M, Gupta E, et al. Inhibition of angiogenesis and metastasis in two murine models by the matrix metalloproteinase inhibitor, BMS ancer Res 2001; 61: Gingras D, Boivin D, Deckers, Gendron S, Barthomeuf, Beliveau R. Neovastat a novel antiangiogenic drug for cancer therapy. Anticancer Drugs 2003; 14: Hicklin DJ, Ellis LM. Role of the vascular endothelial growth factor pathway in tumor growth and angiogenesis. J lin Oncol 2005; 23: Djonov V, resto N, Aebersold DM, et al. Tumor cell specific expression of MMP-2 correlates with tumor vascularisation in breast cancer. Int J Oncol 2002; 21: Emara M, WoŸniak M. Role of metalloproteinases in cancer cell invassivenss. Diag Lab 1999; 35: Parsons SL, Watson SA, Brown PD, ollins HM, Steele RJ. Matrix metalloproteinases. Br J Surg 1997; 84: Zucker S, Lysik RM, Zarrabi MH, Moll U. M (r) 92,000 type IV collagenase is increased in plasma of patients with colon cancer and breast cancer. ancer Res 1993; 53: Zucker S, Lysik RM, DiMassimo BI, Zarrabi HM, Moll UM, Grimson R, Tickle SP, Docherty AJ. Plasma assay of gelatinase B: tissue inhibitor of metalloproteinase complexes in cancer. ancer 1995; 76: Garbisa S, Scagliotti G, Masiero L, et al. orrelation of serum metalloproteinase levels with lung cancer metastasis and response to therapy. ancer Res 1992; 52: Sheen-hen SM, hen HS, Eng HL, Sheen, hen WJ. Serum levels of matrix metalloproteinase 2 in patients with breast cancer. ancer Lett 2001; 173: Talvensaari-Mattila A, Turpeenniemi-Hujanen T. Preoperative serum MMP-9 immunoreactive protein is a prognostic indicator for relapse-free survival in breast carcinoma. ancer Lett 2005; 217: Leppa S, Saarto T, Vehmanen L, Blomqvist, Elomaa I. A high serum matrix metalloproteinase-2 level is associated with an adverse prognosis in node-positive breast carcinoma. lin ancer Res 2004; 10: Kleiner DE, Stetler-Stevenson WG. Quantitative zymography: detection of picogram quantities of gelatinases. Anal Biochem 1994; 218: Leber TM, Balkwill FR. Zymography: a single-step staining method for quantitation of proteolytic activity on substrate gels. Anal Biochem 1997; 249: Davies B, Miles DW, Happerfield L, Naylor MS, Bobrow LG, Rubens RD, Balkwill FR. Activity of type IV collagenases in benign and malignant breast disease. Br J ancer 1993; 67: Farias E, Ranuncolo S, resta, et al. Plasma metalloproteinase activity is enhanced in the euglobulin fraction of breast and lung cancer patients. Int J ancer 2000; 89: Galis ZS, Sukhova GK, Libby P. Microscopic localization of active proteases by in situ zymography: detection of matrix metalloproteinase activity in vascular tissue. FASEB J 1995; 9: Zucker S, Lysik RM, Zarrabi HM, Moll U, Tickle SP, Stetler-Stevenson W, Baker TS, Docherty AJ. Plasma assay of matrix metalloproteinases (MMPs) and MMP-inhibitor complexes in cancer. Potential use in predicting metastasis and monitoring treatment. Ann N Y Acad Sci 1994; 732: La Rocca G, Pucci-Minafra I, Marrazzo A, Taormina P, Minafra S. Zymographic detection and clinical correlations of MMP-2 and MMP-9 in breast cancer sera. Br J ancer 2004; 90: Ranuncolo SM, Armanasco E, resta, Bal De Kier Joffe E, Puricelli L. Plasma MMP-9 (92 kda-mmp) activity is useful in the follow-up and in the assessment of prognosis in breast cancer patients. Int J ancer 2003; 106: Kopczyñski Z, Œliwowska I, Grodecka-Gazdecka S. Oznaczanie aktywnoœci elatynazy A (MMP-2) i elatynazy B (MMP-9) w surowicy kobiet chorych na raka gruczo³u piersiowego. Diag Lab 2001; 37 supl. 2: Œliwowska I. Ocena przydatnoœci oznaczania markerów nowotworowych TPA, TPS, A 15-3 oraz elatynazy A (MMP-2) i elatynazy B (MMP-9) w diagnostyce laboratoryjnej raka sutka. Rozprawa doktorska, Akademii Medycznej im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu, Kopczyñski Z, Œliwowska I, Grodecka-Gazdecka S. Przydatnoœæ testów do oznaczania stê enia tkankowego polipeptydowego antygenu (TPA), swoistego tkankowego polipeptydowego antygenu (TPS), antygenu 15-3 (A 15-3) i oznaczania aktywnoœci elatynazy A (pro-mmp-2, 72 kda) i elatynazy B (pro-mmp-9, 92 kda) w ró nicowaniu pierwotnego raka piersi od zmian ³agodnych. Diag Lab 2004; 40: 379. Adres do korespondencji dr n. biol. Izabela Œliwowska Zak³ad Diagnostyki Laboratoryjnej Katedra Onkologii Akademia Medyczna im. Karola Marcinkowskiego ul. ¹kowa 1/ Poznañ tel diagnostyka@oncology.am.poznan.pl

10 Wspó³czesna Onkologia (2005) vol. 9; 8 ( ) Pozytonowa tomografia emisyjna (PET) z u yciem F-18-fluorodeoksyglukozy (FDG) znajduje coraz szersze zastosowanie w rozpoznawaniu i leczeniu nowotworów. Po³¹czenie badania FDG-PET z tomografi¹ komputerow¹ (T) zwiêksza mo liwoœci diagnostyczne. elem pracy by³a wstêpna, retrospektywna ocena wartoœci klinicznej badania PET/T w ustaleniu stopnia zaawansowania raka prze³yku. U 12 mê czyzn w wieku od 36 do 78 lat (œrednio 59,1) z rozpoznanym rakiem prze³yku wykonano badanie FDG-PET/T ca³ego cia³a. Ogniska wzmo onej utylizacji glukozy (wychwytu FDG) w prze³yku stwierdzono u wszystkich chorych. Ogniska zwiêkszonego wychwytu FDG poza prze³ykiem stwierdzono u 6 chorych, w tym u 2 chorych w p³ucach, a u 5 chorych w wêz³ach ch³onnych œródpiersia, okolicy nadobojczykowej, szyi, nadbrzuszu i przestrzeni nadobojczykowej. U 3 chorych, u których przeprowadzono potencjalnie lecznicze zabiegi resekcyjne w 2 przypadkach ocena stopnia zaawansowania nowotworu w badaniu PET/T by³a zgodna z ocen¹ œródoperacyjn¹ i histopatologiczn¹ materia³u pooperacyjnego, a w 1 przypadku fa³szywie ujemna w rozpoznaniu przerzutów do regionalnych wêz³ów ch³onnych. W 4 przypadkach badanie PET/T niewystarczaj¹co dok³adnie okreœli³o g³êbokoœæ naciekania œciany prze³yku i/lub obecnoœæ przerzutów do regionalnych wêz³ów ch³onnych. U 5 chorych na podstawie badania PET/T stwierdzono IV stopieñ zaawansowania klinicznego raka prze³yku. U 3 chorych wynik badania PET/T spowodowa³ zmianê stopnia zaawansowania raka prze³yku (upstaging). Badanie PET/T ma du ¹ wartoœæ w ocenie stopnia zaawansowania klinicznego raka prze³yku. Zastosowanie badania PET/T poprawia skutecznoœæ rozpoznania przerzutów do odleg³ych wêz³ów ch³onnych i narz¹dów wewnêtrznych, a u czêœci chorych zmienia stopieñ klinicznego zaawansowania nowotworu oraz decyzje terapeutyczne. W ocenie g³êbokoœci naciekania œciany prze³yku i wêz³ów ch³onnych œródpiersia prawdopodobnie metoda ma mniejsz¹ wartoœæ kliniczn¹. U chorych kwalifikowanych do leczenia operacyjnego ocena stopnia klinicznego zaawansowania raka prze³yku za pomoc¹ PET/T mo e przynieœæ wymierne korzyœci. S³owa kluczowe: rak prze³yku, pozytonowa tomografia emisyjna, tomografia komputerowa, po³¹czenie obrazów. Po³¹czenie pozytonowej tomografii emisyjnej z tomografi¹ komputerow¹ (PET/T) w ocenie stopnia zaawansowania raku prze³yku analiza 12 przypadków ombined positron emission tomography and computed tomography (PET/T) imaging in staging esophageal cancer analysis of 12 cases Zbigniew Kula 1, Tomasz Pietrzak 2, Katarzyna Kobus-B³achnio 2, Zdzis³aw Zuchora 2 1Poradnia Gastroenterologiczna z Pracowni¹ Endoskopow¹, entrum Onkologii im. prof. F. ukaszczyka w Bydgoszczy 2Zak³ad Medycyny Nuklearnej, entrum Onkologii im. prof. F. ukaszczyka w Bydgoszczy Wstêp Rak prze³yku jest jednym z najgorzej rokuj¹cych nowotworów z³oœliwych. Na œwiecie zajmuje 8. miejsce wg czêstoœci wystêpowania. W 2002 r. rozpoznano 462 tys. nowych przypadków (4,2 proc. wszystkich raków) i stwierdzono 386 tys. zgonów (5,7 proc.) [1]. W Polsce w 2002 r. rozpoznano przypadków raka prze³yku u mê czyzn (1,8 proc.) i 234 przypadków u kobiet (0,4 proc.). Wœród przyczyn zgonów z powodu nowotworów z³oœliwych w Polsce rak prze³yku zajmuje u mê czyzn 10. miejsce (2,5 proc.), a u kobiet 27. (0,7 proc.) [2]. PóŸne wystêpowanie objawów chorobowych raka prze³yku jest g³ówn¹ przyczyn¹ opóÿnienia zg³aszania siê chorych do lekarza, w okresie, gdy choroba jest zaawansowana i niemo liwe jest leczenie z zamiarem radykalnym. Przyjmuje siê, e ok. 90 proc. chorych poddanych leczeniu operacyjnemu ma zajête przez nowotwór wêz³y ch³onne, a odsetek 5-letnich prze yæ wynosi zaledwie 16 proc. w Stanach Zjednoczonych i 10 proc. w Europie [3, 4]. U chorych z rozpoznanym rakiem prze³yku dalsze postêpowanie lecznicze zale y od prawid³owej oceny stopnia zaawansowania nowotworu. Wprowadzenie diagnostyki opartej na tomografii komputerowej (T computed tomography), rezonansie magnetycznym (MRI magnetic resonance imaging), ultrasonografii endoskopowej z biopsj¹ aspiracyjn¹ cienkoig³ow¹ (EUS/FNA endoscopic ultrasound with fine needle aspiration) oraz pozytonowej tomografii emisyjnej (PET positron emission tomography) w wiêkszoœci przypadkach umo liwia trafne rozpoznanie stopnia zaawansowania choroby nowotworowej. Badania te charakteryzuj¹ siê jednak okreœlon¹ czu³oœci¹, specyficznoœci¹ i trafnoœci¹ diagnostyczn¹, st¹d wykonywanie tych badañ jednoczasowe, a tak e próby wprowadzania nowych metod oceny stopnia zaawansowania raka prze³yku. Poszerzenie diagnostyki raka prze³yku o po³¹czenie PET z tomografi¹ komputerow¹ (PET/T) w du ym stopniu mo e przyczyniæ siê do poprawy dok³adnoœci oceny stopnia zaawansowania raka prze³yku i wyboru optymalnego sposobu leczenia. elem pracy jest próba oceny przydatnoœci badania PET/T w ustaleniu stopnia zaawansowania raka prze³yku.