raku p³askonab³onkowym krtani. Badania

Transkrypt

1 PRACE ORYGINALNE Magdalena BODNAR 1 ukasz SZYLBERG 1 Wojciech KA MIERCZAK 2 Andrzej MARSZA EK 1,3 Ocena ekspresji tkankowych inhibitorów metaloproteinaz (TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3) jako czynników prognostycznych w raku p³askonab³onkowym krtani Evaluation of expression of tissue inhibitors of etalloproteinases (TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3) as a prognostic markers in laryngeal squamous cell carcinoma 1 Katedra i Zak³ad Patomorfologii Klinicznej, Uniwersytet Miko³aja Kopernika, Toruñ, Collegium Medicum, Bydgoszcz Kierownik: Dr hab. Andrzej Marsza³ek prof. UMK 2 Katedra i Klinika Otolaryngologii, Uniwersytet Miko³aja Kopernika, Toruñ, Collegium Medicum, Bydgoszcz Kierownik: Prof. dr hab. Henryk KaŸmierczak 3 Katedra i Zak³ad Patomorfologii Klinicznej, Uniwersytet Medyczny im. Karola Marcinkowskiego, Poznañ Kierownik: Prof. dr hab. Przemys³aw Majewski Dodatkowe s³owa kluczowe: rak p³askonab³onkowy krtani tkankowe inhibitory metaloproteinaz immunohistochemia Additional key words: laryngeal squamous cell carcinoma tissue inhibitors of matrix metalloproteinases immunohistochemistry Adres do korespondencji: Dr hab. Andrzej Marsza³ek, prof. UMK Katedra i Zak³ad Patomorfologii Klinicznej Uniwersytet Miko³aja Kopernika w Toruniu Collegium Medicum im. L. Rydygiera w Bydgoszczy ul. M. Sk³odowskiej-Cuire Bydgoszcz Tel.: ; Faks: amars@cm.umk.pl Raki krtani wci¹ stanowi¹ powa - ny problem terapeutyczny, wynikaj¹cy g³ównie z póÿnego rozpoznania nowotworu. Utrzymanie równowagi miêdzy aktywnoœci¹ enzymów proteolitycznych i ich inhibitorów odgrywa istotn¹ rolê w utrzymaniu prawid³owej struktury tkanek oraz zapobiega degradacji sk³adników macierzy zewn¹trzkomórkowej. Nadmierna ekspresja enzymów proteolitycznych oraz brak aktywnoœci odpowiednich inhibitorów prowadzi do destabilizacji wspomnianej powy ej równowagi, co w konsekwencji u³atwia migracjê komórek nowotworowych. Celem niniejszej pracy by³a ocena lokalizacji i poziomu ekspresji (TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3) w raku p³askonab³onkowym krtani. Badania immunohistochemiczne przeprowadzono na 78 reprezentatywnych wycinkach tkankowych obejmuj¹cych 60 wycinków z rakiem p³askonab³onkowym krtani oraz 18 wycinków prawid³owej b³ony œluzowej. Stwierdzono ekspresjê oznaczanych czynników zarówno w komórkach nowotworowych, jak i podœcielisku nowotworu. Stwierdzono cytoplazmatyczn¹ ekspresjê oznaczanych bia³ek, odpowiednio w 91% (71/78) dla TIMP-1, 22% (17/ 78) TIMP-2, 100% (78/78) TIMP-3 przypadków raka p³askonab³onkowego krtani. Stwierdzono ró nicê istotn¹ statystycznie pomiêdzy ekspresj¹ TIMP- 1, TIMP-2 oraz TIMP-3 pomiêdzy ekspresj¹ tych parametrów w komórkach nowotworu a podœcieliskiem (p<0,05). Uwzglêdniaj¹c stopieñ zajêcia wêz³ów ch³onnych (N0 vs. N+) wykazano ró - nice istotne statystycznie w poziomach ekspresji TIMP-1 i TIMP-3 w zrêbie. Natomiast dla poziomów ekspresji TIMP-1, TIMP-2 TIMP-3 w nowotworze nie stwierdzono ró nic istotnych statystycznie pomiêdzy pacjentami N0 vs. N+. Ocena wzajemnych interakcji pomiêdzy wyszczególnionymi parame- Laryngeal cancer is still a therapeutic problem mainly become of late diagnosis. Balance between the activity of proteolytic enzymes and their inhibitors plays an important role in maintaining normal tissues structure and prevents the degradation of extracellular matrix components. Proteolytic enzymes overexpression and/or lack of activity of their inhibitors lead to destabilization of tissue structure, which in turn facilitates the migration of cancer cells. The aim of this study was to assess the localization and level of expression of tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMP-1, TIMP- 2, TIMP-3) in lanyngeal squamous cell carcinoma. The immunohistochemical study was performed on 78 representative tissue samples including: 60 sections of squamous cell carcinoma of the larynx and 18 sections of normal mucosa. Expression of determined parameters was found in both tumor cells and tumor stroma. We have found cytoplasmic expression of studied proteins, respectively in 91% (71/78) for TIMP-1, 22% (17/78) for TIMP-2, 100% (78/78) for TIMP-3 cases of squamous cell carcinoma of the larynx. Statistically significant difference between the expression of TIMP-1, TIMP-2 and TIMP-3 was found between tumor cells and tumor stroma (p<0.05). Analyzing the lymph node involvement (N0 vs. N +) we found statistically significant difference (p<0.05) in the levels of expression of TIMP-1 and TIMP-3 between those groups in the primary tumor stroma. However, for expression levels of TIMP-1, TIMP-2 TIMP-3 in the tumor cells there was no statistically significant differences between patients N0 vs. N +. Assessment of interactions between parameters involved in the process of tumor invasion may contribute to the development of therapies based on the inhibition of invasion. Understanding the mechanisms 678 Przegl¹d Lekarski 2011 / 68 / 10 M. Bodnar i wsp.

2 trami, w procesie inwazji nowotworowej, mo e przyczyniæ siê do rozwoju terapii opartej na dzia³aniu przeciwinwazyjnym, a poznanie mechanizmów interakcji dzia³ania okreœlonych metaloproteinaz oraz ich inhibitorów mo e mieæ istotny wp³yw na strategie terapeutyczne. of interaction between several metalloproteinases and their inhibitors may have a significant impact on therapeutic strategies in the future. Tabela I Skala oceny reakcji immunohistochemicznej wg Remmele-Stegner w modyfikacji w³asnej. The immunohistochemical reaction scale of Remmel-Stegner with own modification. Skala IRS [SI] x [PP] Intensywnoœæ ekspresji [SI] 0 brak ekspresji 1 s³aba ekspresja 2 umiarkowana ekspresja 3 silna ekspresja Wstêp Rak krtani wci¹ pozostaje istotnym problemem diagnostycznym jak i terapeutycznym. W obszarze krtani, najczêœciej wystêpuj¹cym nowotworem jest rak p³askonab³onkowy, stanowi¹cy ok. 90% rozpoznawanych nowotworów z³oœliwych w tej lokalizacji. Etiologia tego nowotworu œciœle zwi¹zana jest z ekspozycj¹ na czynniki œrodowiskowe, wœród których podkreœla siê palenie tytoniu oraz nadu ywanie wysokoprocentowych alkoholi [2,32]. W Polsce w 2008 roku odnotowano 2075 nowych zachorowañ na raka krtani oraz 1423 zgony spowodowane tym typem nowotworu u mê czyzn. U kobiet dane te w 2008 roku przedstawia³y siê nastêpuj¹co: 308 nowych zachorowañ i 182 zgony spowodowane rakiem krtani [Krajowy Rejestr Nowotworów]. Przerzuty powstaj¹ce w wyniku procesu transformacji nowotworowej stanowi¹ jedn¹ z g³ównych przyczyn zgonów. W procesie tworzenia przerzutów istotn¹ rolê odgrywa zdolnoœæ komórek do migracji, która uwarunkowana jest degradacj¹ sk³adników macierzy zewn¹trzkomórkowej determinowana obecnoœci¹ ró nych enzymów nale- ¹cych do rodziny endopeptydaz (tzw. metaloproteinaz, MMP). W szczególnoœci podkreœla siê rolê MMP-2 oraz MMP-9. Udowodniono lokalizacjê tych enzymów nie tylko na powierzchni komórek nowotworowych, ale tak e zdolnoœæ ich wydzielania przez komórki podœcieliska nowotworu [13,19]. W licznych badaniach wskazano na interakcje zachodz¹ce pomiêdzy komórkami nowotworowymi a otaczaj¹cym je mikroœrodowiskiem, tzw. tumor host-reactions (interakcja guz-gospodarz), podkreœlaj¹c, e nie tylko sam nowotwór powoduje przekszta³cenie mikroœrodowiska, ale tak e reaguje na czynniki pochodz¹ce z podœcieliska [13]. Mikroœrodowisko bierze udzia³ w promocji mutagenezy komórek nowotworowych oraz wp³ywa na modyfikacje komórek wchodz¹cych w sk³ad podœcieliska guza [10,31]. Podkreœlaj¹c udzia³ komórek mikroœrodowiska guza, zaproponowano model mikroœrodowiskowej inwazji nowotworu (tumor microenviroment invasion model), wed³ug której na ka dym etapie tworzenia przerzutów nastêpuje aktywacja okreœlonych genów wspomagaj¹cych ten proces [11,12,31]. Aktywacja MMP mo e odbywaæ siê na dwóch poziomach: zewn¹trz i wewn¹trzkomórkowo. Wiêkszoœæ enzymów proteolitycznych aktywowana jest zewn¹trzkomórkowo. Metaloproteinazy wytwarzane i wydzielane s¹ w postaci nieaktywnych proenzymów, a aktywacja MMP zachodzi poprzez usuniêcie prodomeny, co prowadzi do ods³oniêcia aktywnego miejsca enzymu. Zmiany te zachodz¹ pod wp³ywem specyficznych aktywatorów oraz inhibitorów dzia³aj¹cych na poziomie: ekspresji genów, aktywacji pro-mmp, a tak e poprzez udzia³ specyficznych i niespecyficznych inhibitorów zaktywowanych metaloproteinaz [7,28]. W warunkach fizjologicznych aktywnoœæ i iloœæ MMPs regulowana jest poprzez endogenne inhibitory metaloproteinaz, czyli tzw. tkankowe inhibitory metaloproteinaz (ang. tissue inhibitors of matrix metalloproteinases, TIMPs). Dotychczas znane s¹ cztery typy inhibitorów tkankowych, odpowiednio: TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3, TIMP-4. ¹cz¹ siê one z fragmentem C-koñcowym cz¹steczki MMP wi¹zaniami niekowalencyjnymi. Powinowactwo poszczególnych inhibitorów do odpowiednich enzymów jest zró nicowane. Udowodniono, e TIMP-1 wykazuje zwiêkszone powinowactwo do MMP-9, w porównaniu z powinowactwem do MMP-2. Natomiast TIMP-2 wykazuje znacznie wiêksze zdolnoœci zahamowania aktywnoœci MMP-2, w porównaniu do efektu w przypadku pozosta³ych enzymów wchodz¹cych w sk³ad tej rodziny [16]. Udowodniono, e TIMPs pe³ni¹ tak e funkcje ligandów dla receptorów czynników wzrostu oraz cytokin. Wywieraj¹ tak e wp³yw na regulacjê aktywnoœci komórek nowotworowych, niezale nie od aktywnoœci MMPs [4]. Ponadto tkankowe inhibitory metaloproteinaz zaanga owane s¹ w degradacjê macierzy zewn¹trzkomórkowej poprzez zdolnoœæ do eliminacji MMPs, jak równie zdolnoœæ do hamowania aktywacji tych enzymów. Tworz¹ wi¹zania zarówno z formami aktywnymi jak i latentnymi MMPs, powoduj¹c zablokowanie mo liwoœci od³¹czenia koñca N okreœlonych metaloproteinaz, co uniemo liwia ich aktywacjê [4,16]. G³ówn¹ funkcj¹ TIMPs, oprócz zdolnoœci do hamowania aktywnoœci MMPs, jest zdolnoœæ do stymulowania rozwoju nowotworów. Stwierdzono, e TIMPs bior¹ udzia³ zarówno w procesach degradacji jak i syntezy macierzy pozakomórkowej reguluj¹c oba te procesy. W wyniku nadmiernego wydzielania MMPs, m.in. przez komórki nowotworowe, dochodzi do zwiêkszonego wydzielania TIMP. Ponadto w przebiegu procesu nowotworowego, wzrost syntezy MMPs, zarówno w komórkach guza, jak i podœcielisku nowotworu, zwi¹zany jest ze zwiêkszon¹ syntez¹ inhibitorów metaloproteinaz. Nadmierna synteza MMPs, w porównaniu do syntezy inhibitorów tkankowych, powoduje nasilenie procesów degradacyjnych, co z kolei mo e powodowaæ zwiêkszon¹ migracjê komórek guza [7,13,15]. Celem niniejszej pracy by³a ocena lokalizacji i poziomu ekspresji tkankowych inhibitorów metaloproteinaz (TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3) jako czynników zwi¹zanych z aktywacj¹ enzymów proteolitycznych nale ¹cych do elatynaz. Ponadto podjêto próbê opisania przebudowy podœcieliska nowotworu w trakcie jego powstawania i rozwoju, na przyk³adzie raka p³askonab³onkowego krtani poprzez ocenê lokalizacji i poziomu ekspresji tych parametrów w obszarze prawid³owej b³ony œluzowej i raku p³askonab³onkowym krtani. Materia³ i metody Grupa badana: Badania wykonano na materiale pochodz¹cym od 31 mê czyzn oraz 6 kobiet, którym wykonano laryngektomiê w Katedrze i Klinice Otolaryngologii i Onkologii Laryngologicznej CM UMK, Szpitala Klinicznego nr 1 im. dr. A. Jurasza w Bydgoszczy. Wiek pacjentów waha³ siê od 44 do 77 lat, tj. u mê czyzn od 44 do 77 lat (œrednia wieku: 57 lat), a u kobiet od 50 do 69 lat (œrednia wieku: 60 lat). Na badania otrzymano zgodê lokalnej Komisji Bioetycznej. W zgromadzonym materiale rozpoznano raka p³askonab³onkowego krtani, co zosta³o zweryfikowane poprzez dwukrotn¹ ocenê materia³u tkankowego przeprowadzon¹ przez dwóch lekarzy patologów. Ustalono stopnieñ z³oœliwoœci histologicznej. Stopieñ G3 zdiagnozowano u 2 pacjentów, G2 u 32, a G1 u 3 pacjentów. Dokonano oceny klinicznego stopnia zaawansowania procesu nowotworowego zgodnie z klasyfikacj¹ TNM (wg IUAC). Dwóch pacjentów zakwalifikowano do stadium T2, 24 pacjentów do T3, a 11 pacjentów do T4. U dwudziestu pacjentów nie stwierdzono przerzutów do wêz³ów ch³onnych. Przerzuty do okolicznych wêz³ów ch³onnych zdiagnozowano u 17 chorych (jedenastu chorych z N1, trzech w N2, trzech w N3). W analizowanej grupie nie stwierdzono przerzutów odleg³ych. Wszyscy pacjenci z grupy badanej palili papierosy. Dwudziestu oœmiu pali³o do 20 papierosów dziennie, a dziewiêciu ponad 20 papierosów dziennie. Ponadto 29 chorych nadu ywa³o alkoholi wysokoprocentowych. Materia³ tkankowy podzielono na nastêpuj¹ce grupy badawcze: 1. grupê badan¹ stanowi³y wycinki tkankowe z rakiem p³askonab³onkowym: 60 wycinków tkankowych. 2. grupê kontroln¹ stanowi³ obszar prawid³owej b³ony œluzowej: 18 wycinków tkankowych. Komórki/obszar o pozytywnej ekspresji [PP] 0 = brak komórek 1 = < 5% komórek 2 = 6-20% komórek 3 = 21-50% komórek 4 = 51-80% komórek 5 = > 81% komórek Przegl¹d Lekarski 2011 / 68 /

3 Badanie immunohistochemiczne Przeprowadzono badania immunohistochemiczne postêpuj¹c wg standardowej procedury opisanej we wczeœniejszych publikacjach [1]. Wykorzystano pierwszorzêdowe przeciwcia³a skierowane przeciwko TIMP-1; Dako, Denmark, klon VT7, 1:50; TIMP-2, Abcam, klon 3A4, 1:50; TIMP-3, Abcam, klon Loop1, 1:500. Ocenê poziomu ekspresji wykonano stosuj¹c zasady oceny morfometrycznej. Do oceny poziomu ekspresji oznaczanych czynników zastosowano zmodyfikowan¹ skalê (0-15) wg Remmele-Stegner [21] (tabela I). Zbadano zgodnoœæ poszczególnych zmiennych z rozk³adem normalnym wykorzystuj¹c test Ko³mogorowa- Smirnowa z poprawk¹ istotnoœci Lillieforsa oraz testem Shapiro-Wilka. Jednorodnoœæ wariancji oceniono za pomoc¹ testu Levene'a. Rozk³ad uzyskanych wyników odbiega³ od rozk³adu normalnego, dlatego analizê statystyczn¹ przeprowadzono za pomoc¹ testów nieparametrycznych. Do oceny ró nic istotnych statystycznie, miêdzy dwoma grupami (uwzglêdniaj¹c lokalizacjê tj. w komórkach prawid³owego nab³onka versus komórkach nowotworu oraz podœcielisku [zrêbie] w prawid³owej b³onie œluzowej oraz w utkaniu nowotworu), wykorzystano test nieparametryczny U Manna-Whitneya. Ocenê ekspresji oznaczanych parametrów wzglêdem lokalizacji i obecnoœci lub nie, przerzutów do wêz³ów ch³onnych (cecha N) wykonano za pomoc¹ testu Kruskala-Wallisa. W celu porównañ statystycznych analizowanych zmiennych w niniejszej pracy wykorzystano modu³ budowy i analizy drzew klasyfikacyjnych, z zastosowaniem testu zgodnoœci Chi kwadrat. Za ró nicê istotn¹ statystycznie przyjêto wartoœci p<0,05. Wyniki Stwierdzono spadek przeciêtnych wartoœci ekspresji dla TIMP-1 oraz TIMP-2 zarówno w zrêbie jak i nowotworze u pacjentów pal¹cych powy ej 20 papierosów dziennie w porównaniu z grupa osób pal¹cych do 20 papierosów dziennie. Natomiast przeciêtne wartoœci ekspresji TIMP-3 w obu grupach znajdowa³y siê na zbli onym poziomie. Najwy sze wartoœci ekspresji stwierdzono dla TIMP-3, natomiast najni sz¹ ekspresjê odnotowano dla TIMP-2 w obu analizowanych grupach. Jednak e ze wzglêdu na zbyt du ¹ ró nicê w liczebnoœci poszczególnych grup (uwzglêdniaj¹c liczbê wypalanych dziennie papierosów) nie przeprowadzono analizy statystycznej. W niniejszej pracy zwróciliœmy uwagê na ocenê ekspresji oznaczanych parametrów podczas procesu biologicznego, zw³aszcza interakcji pomiêdzy nowotworem a podœcieliskiem w raku krtani - nowotworze, którego patogeneza œciœle zwi¹zana jest z ekspozycj¹ na dym tytoniowy. Stwierdzono cytoplazmatyczn¹ ekspresjê oznaczanych parametrów (TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3) w prawid³owym nab³onku oraz otaczaj¹cym je utkaniu ³¹cznotkankowym (ekspresja obecna w komórkach nacieku zapalnego). Stwierdzono cytoplazmatyczn¹ ekspresjê oznaczanych bia³ek, odpowiednio w 91% (71/78) dla TIMP-1, 22% (17/78) TIMP-2, 100% (78/78) TIMP-3 przypadków raka p³askonab³onkowego krtani. Zaobserwowano wy sz¹ ekspresjê oznaczanych inhibitorów tkankowych w utkaniu nowotworu, w porównaniu z podœcieliskiem. Najwy sz¹ ekspresjê zarówno w nowotworze jak i zrêbie stwierdzono dla TIMP-3 (odpowiednio: 8 i 6). Natomiast najni sz¹ ekspresjê stwierdzono w badaniu TIMP-2, w komórkach nowotworu 0,5 i 0 w zrêbie nowotworu (tabela II). Tabela II Porównanie poziomów ekspresji badanych antygenów pomiêdzy grup¹ kontroln¹ a badan¹ w nab³onku, nowotworze i zrêbie. Comparison of the expression levels of studied antigens between the control group and epithelium, tumor cells and tumor stroma. Oznaczany parametr TIMP-1 TIMP-2 TIMP-3 * ró nica istotna statystycznie Lokalizacja Grupa kontrolna Mediana Lokalizacja Grupa badana Mediana Istotnoœæ statystyczna P nab³onek 10 nowotwór 4 0,000 * zr¹b 4 zr¹ b 4 0,795 nab³onek 5 nowotwór 0, 5 0,000 * zr¹b 0 zr¹ b 0 0,000 * nab³onek 12 nowotwór 8 0,000 * zr¹b 9 zr¹ b 6 0,000 * Tabela III Wyniki analiz statystycznych ekspresji oznaczanych parametrów z uwzglêdnieniem obecnoœci lub braku przerzutów do wêz³ów ch³onnych za pomoc¹ testu Kruskala-Wallisa. The results of statistical analysis of expression of determined parameters including lymph node involvement using Kruskal-Wallis test. NOWOTWÓR N0 N1 N2 N3 Istotnoœæ statystyczna: N0 vs. N+3 ZR B N0 N1 N2 N3 Istotnoœæ statystyczna: N0 vs. N+3 TIMP ns 6 4 1, 5 1 p<0,05 TIMP-2 1 0, ns ns TIMP ns p<0,05 Rycina 1 Ekspresja w poszczególnych stopniach zajêcia wêz³ów ch³onnych w nowotworze. Expression of tissue inhibitors of matrix metalloproteinases in various degrees of lymph nodes involvement in the tumor cells. Porównuj¹c poziom ekspresji oznaczanych antygenów w komórkach nab³onka grupy kontrolnej i badanej, w analizie statystycznej stwierdzono istotne statystycznie ró nice dla oznaczanych parametrów: TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3. Oceniaj¹c poziom ekspresji badanych antygenów w zrêbie stwierdzono ró nice istotne statystycznie pomiêdzy ekspresj¹ TIMP-2 i TIMP-3 pomiêdzy grup¹ kontroln¹ a grup¹ badan¹. Nie stwierdzono ró nic istotnych statystycznie w przypadku porównania poziomów ekspresji TIMP-1 w zrêbie oraz kontroli grupy badanej. Ponadto wykorzystuj¹c test nieparametryczny U Manna-Whitneya stwierdzono ró nicê istotn¹ statystycznie pomiêdzy ekspresj¹ TIMP- 1, TIMP-2 oraz TIMP-3 w komórkach nowotworu a podœcieliskiem (p<0,05). 680 Przegl¹d Lekarski 2011 / 68 / 10 M. Bodnar i wsp.

4 Rycina 2 Ekspresja w poszczególnych stopniach zajêcia wêz³ów ch³onnych w zrêbie. Expression of tissue inhibitors of matrix metalloproteinases in various degrees of lymph nodes involvement in tumor stroma. Uwzglêdniaj¹c stopieñ zajêcia wêz³ów ch³onnych, pacjentów podzielono na nastêpuj¹ce grupy: bez przerzutów do wêz³ów ch³onnych (N0), z przerzutami do wêz³ów ch³onnych (odpowiednio: N1, N2, N3) i przeprowadzono analizê ró nic ekspresji badanych parametrów. Wykazano ró nice istotne statystycznie (test Kruskala-Wallisa) w poziomach ekspresji TIMP-1 i TIMP-3 w zrêbie zmiany pierwotnej porównuj¹c materia³ od pacjentów z przerzutami lub bez przerzutów do wêz³ów ch³onnych. Natomiast dla poziomów ekspresji TIMP-1, TIMP-2 TIMP- 3 w nowotworze nie stwierdzono ró nic istotnych statystycznie pomiêdzy pacjentami z N+ (³¹cznie N1-N3) lub bez przerzutów do wêz³ów ch³onnych W wyniku analizy ekspresji oznaczanych parametrów uwzglêdniaj¹cej stopieñ zajêcia wêz³ów ch³onnych zaobserwowano w obrêbie pierwotnego nowotworu spadek ekspresji TIMP-1 oraz TIMP-2 wraz ze wzrostem stopnia zajêcia wêz³ów ch³onnych. Wartoœci TIMP-1 w nowotworze dla poszczególnych grup wynosi³y odpowiednio N0-6, N1-4 i N3-1. Dla TIMP-2 w nowotworze wynosi³y: N0-1,0, N1-0,5 oraz N2-0. Natomiast w przypadku ekspresji TIMP- 3 stwierdzono wzrost wartoœci ekspresji oznaczanego parametru, porównuj¹c pacjentów bez przerzutów do wêz³ów ch³onnych N0-8 i pacjentów w stopniu N3-10 (rycina 1). Ponadto w zrêbie nowotworu zaobserwowano spadek ekspresji TIMP-1 u pacjentów, u których stwierdzono przerzuty do wêz³ów ch³onnych (N1-4, N2-1,5, N3-1) w porównaniu z ekspresj¹ oznaczanego enzymu w stadium N0-6. Podobn¹ tendencjê stwierdzono analizuj¹c poziom ekspresji TIMP-3. U pacjentów, u których nie stwierdzono przerzutów do wêz³ów ch³onnych, przeciêtne wartoœci ekspresji TIMP-3 by³y wy sze (N0-6) w porównaniu z ekspresj¹ tego antygenu u pacjentów z przerzutami do wêz³ów ch³onnych (N2-4, N3-4) (rycina 2). Dyskusja Transformacja nowotworowa jest procesem z³o onym i wieloetapowym. Z biologicznego punktu widzenia naturalna historia nowotworu rozpoczyna siê pojawieniem pierwotnego ogniska guza. Nastêpnie obserwujemy miejscowy wzrost guza. Natomiast kluczowym etapem w procesie dalszego rozwoju jest uwolnienie komórek nowotworowych z pierwotnego utkania guza. Rozwój tego stadium uzale niony jest od nabycia przez komórki nowotworowe tzw. fenotypu inwazyjnego. Zjawisko to w konsekwencji determinuje zdolnoœæ komórek nowotworowych do naciekania otaczaj¹cych tkanek i ostatecznie daje mo liwoœæ tworzenia przerzutów. Inwazja komórek nowotworowych do podœcieliska staje siê mo liwa dziêki zdolnoœci do degradacji b³on podstawnych, które stanowi¹ podstawow¹ barierê chroni¹c¹ przed ekspansj¹ komórek guza. Powstawanie przerzutów odleg³ych w ró nych narz¹dach jest wynikiem zró nicowanych interakcji pomiêdzy komórkami nowotworowymi a nowym mikroœrodowiskiem [9]. Proces inwazji nowotworowej zwi¹zany jest g³ównie z degradacj¹ macierzy zewn¹trzkomórkowej (ECM) otaczaj¹cej nowotwór [13]. Doniesienia licznych autorów wskazuj¹ na ekspresjê MMPs w ró nych typach nowotworów z³oœliwych, w tym tak e w rakach p³askonab³onkowych obszaru g³owy i szyi [5]. W niniejszej pracy dokonano szczegó³owej oceny ekspresji poszczególnych parametrów zarówno w komórkach raka p³askonab³onkowego krtani, jak i w podœcielisku nowotworu. Zrozumienie oraz poznanie wielostronnych interakcji zachodz¹cych pomiêdzy utkaniem guza a jego podœcieliskiem oraz wskazanie dominuj¹cych zale noœci pomiêdzy guzem a podœcieliskiem umo liwi³oby lepsze poznanie biologii nowotworu. Do jednych z g³ównych enzymów proteolitycznych zaanga owanych w proces degradacji podœcieliska nowotworu, a przede wszystkim proteolizy sk³adników b³on podstawnych (kolagenu typu IV), nale ¹ metaloproteinazy zaliczane do grupy elatynaz: elatynaza-a (MMP-2) oraz elatynaza-b (MMP-9) [15]. Wydzielane s¹ w postaci nieaktywnych form, tzw. zymogenów, a ich aktywacja regulowana jest na kilku poziomach, tj. zarówno na poziomie transkrypcji, jak i na poziomie posttranslacyjnym. Na poziomie posttranslacyjnym aktywnoœæ wyszczególnionych enzymów proteolitycznych kontrolowana jest w macierzy zewn¹trzkomórkowej, poprzez koordynowanie aktywacji i wydzielania proenzymów oraz interakcji aktywnych form enzymów proteolitycznych z ich inhibitorami [8,15]. Do najwa niejszych nale ¹ TIMP-1 oraz TIMP-2. ¹cz¹ siê one w stosunku stechiometrycznym (1:1). Ponadto elatynazy (zarówno MMP-2, jak i MMP-9) s¹ jedynymi enzymami proteolitycznymi wœród wszystkich MMPs, które wykazuj¹ zdolnoœæ do interakcji z odpowiednimi dla nich inhibitorami zarówno w formie aktywnej, jak i w postaci zymogenów [5,15]. W warunkach fizjologicznych aktywnoœæ i iloœæ MMPs regulowana jest poprzez endogenne inhibitory metaloproteinaz (TIMP). Dotychczas znane s¹ cztery TIMP, odpowiednio: TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3, TIMP-4. Tkankowe inhibitory metaloproteinaz tak e s¹ zaanga owane w degradacjê macierzy zewn¹trzkomórkowej poprzez zdolnoœæ do eliminacji MMPs oraz zdolnoœæ do hamowania aktywacji tych enzymów. Tworz¹ wi¹zania zarówno z formami aktywnymi jak i latentnymi MMPs powoduj¹c zablokowanie mo liwoœci od³¹czenia koñca N-terminalnego okreœlonych metaloproteinaz, co uniemo liwia ich aktywacjê. Biologiczna funkcja jest ró norodna. Z jednej strony odpowiedzialne s¹ za zahamowanie syntezy oraz aktywnoœci enzymów proteolitycznych, natomiast z drugiej strony wykazuj¹ w³aœciwoœci antyapoptotyczne oraz proproliferacyjne [30]. G³ówn¹ funkcj¹ TIMPs, oprócz zdolnoœci do hamowania aktywnoœci MMPs, jest tak e zdolnoœæ do stymulowania wzrostu nowotworów. Stwierdzono, e TIMPs bior¹ udzia³ zarówno w procesach degradacji, jak i syntezy macierzy pozakomórkowej reguluj¹c oba te procesy.w wyniku nadmiernego wydzielania MMPs, m.in. przez komórki nowotworowe, dochodzi do zwiêkszonego wydzielania TIMP. Ponadto w przebiegu procesu nowotworowego wzrost syntezy MMPs, zarówno w komórkach guza jak i podœcielisku nowotworu, zwi¹zany jest ze zwiêkszon¹ syntez¹ inhibitorów metaloproteinaz. Nadmierna synteza MMPs, w porównaniu do syntezy inhibitorów tkankowych, powoduje nasilenie procesów degradacyjnych, co z kolei powoduje zwiêkszon¹ migracjê komórek guza [30]. Wed³ug niektórych autorów TIMP-1 wydzielany jest g³ównie przez komórki zrêbu, natomiast TIMP-2 zarówno przez podœcielisko jak i komórki nowotworowe [17,27,29]. Ponadto w badaniach innych autorów, opie- Przegl¹d Lekarski 2011 / 68 /

5 raj¹c siê na badaniach immunohistochemicznych, wykazano, e ekspresja tych parametrów by³a wy sza w porównaniu z ekspresj¹ elatynaz, co mo e sugerowaæ ich aktywnoœæ hamujac¹ w stosunku do enzymów proteolitycznych [5]. W niniejszej pracy wykazano niewielkie ró nice w ekspresji MMP-2 i MMP-9 a odpowiadaj¹cym im inhibitorom w utkaniu guza (dane niepublikowane). Zaobserwowano natomiast znacznie wy sze wartoœci ekspresji MMP-2 w zrêbie nowotworu w porównaniu z ekspresj¹ TIMP-2 w tej samej lokalizacji. Ponadto wykazano zale noœæ pomiêdzy ekspresj¹ MMP-9 a TIMP-1 (dane niepublikowane). Ocena lokalizacji tkankowych inhibitorów metaloproteinaz pozostaje wci¹ nierozstrzygniêta. Istniej¹ doniesienia stwierdzaj¹ce, e ekspresja TIMP-1, TIMP-2 zachodzi wy³¹cznie na powierzchni komórek nowotworowych [18]. Natomiast wyniki badañ Sutinena i wsp. [27] oraz innych autorów [29] wskazuj¹ na ekspresjê TIMP-2 w zlokalizowanych bezpoœrednio przy utkaniu guza komórkach zrêbu. W wyniku badañ przedstawionych w niniejszej pracy wykazano ekspresjê oznaczanych parametrów zarówno w komórkach nowotworowych jak i w podœcielisku nowotworu. Warto podkreœliæ, i zaobserwowano wy sz¹ ekspresjê oznaczanych inhibitorów tkankowych w utkaniu nowotworu w porównaniu z otaczaj¹cym do podœcieliskiem. W niniejszej pracy wykazano ekspresjê TIMP-1 w 91% przypadków SCC i TIMP-2 w 22% przypadkach SCC, natomiast TIMP-3 w 100% badanych prób. Ponadto dla TIMP-3 odnotowano najwy sz¹ ekspresjê zarówno w nowotworze jak i zrêbie. Natomiast najni sze poziomy ekspresji stwierdzono w przypadku TIMP-2. Analizuj¹c ekspresjê badanych czynników w podœcielisku, zaobserwowano zmniejszon¹ ekspresjê bezpoœrednio przy froncie naciekania nowotworu (w fibroblastach), natomiast siln¹ ekspresjê stwierdzono w nacieku zapalnym. Ponadto nie zaobserwowano ekspresji inhibitorów w podœcielisku znajduj¹cym siê wewn¹trz utkania nowotworu. W œwietle dostêpnych danych literaturowych jest to nowe stwierdzenie, które mo e czêœciowo t³umaczyæ zjawisko promocji nowotworu przez naciek zapalny. Dotychczas naciek zapalny by³ traktowany jako silne Ÿród³o czynników wzrostowych wzmagaj¹cych proliferacjê komórek nowotworu. W œwietle wyników niniejszej pracy naciek zapalny wokó³ nowotworu, poprzez wydzielanie inhibitorów enzymów degraduj¹cych podœcielisko, jest tak e czynnikiem hamuj¹cym powstanie przerzutów. W aspekcie obrony organizmu przed nowotworem (tumor-host interaction) w wiêkszoœci dostêpnego piœmiennictwa naciek zapalny jest opisywany jako wyk³adnik immunologicznego zwalczania komórek nowotworowych. Wyniki niniejszych badañ wskazuj¹ na mo liwoœæ istnienia tak e innych mechanizmów obronnych przed progresj¹ nowotworow¹. Christopoulos i wsp. [5] wykazali prawie dwukrotnie wy sz¹ ekspresjê oznaczanych parametrów (TIMP) w tkance nowotworowej ni w materiale kontrolnym. Zjawisko to wskazuje na pewn¹ zale noœæ sugeruj¹c¹, i wy sze stê- enia tkankowych inhibitorów w utkaniu guza maj¹ za zadanie przygotowaæ tkankê do inwazji nowotworowej. Autorzy wskazuj¹ na zdolnoœæ syntezy TIMP-2 nie tylko przez komórki podœcieliska, ale tak e przez komórki nowotworowe, zw³aszcza w póÿnych etapach rozwoju nowotworu [5]. Cytoplazmatyczn¹ ekspresjê tkankowego inhibitora-1 stwierdzono w wielu typach nowotworów m.in. w raku piersi [33], p³uc [34], o³¹dka [25], a tak e w raku p³askonab³onkowym krtani [8]. Badania Görötha i wsp. [8] wskazuj¹ na supresorowe w³aœciwoœci (TIMP-1, TIMP-2) w stosunku do inwazji oraz wzrostu nowotworu. Badania autorów wykaza³y tak e, e zwiêkszenie ekspresji na poziomie transkrypcyjnym inhibitorów TIMP-1 i TIMP-2 w konsekwencji prowadzi do zmniejszenia aktywnoœci enzymatycznej MMPs, podlegaj¹cych regulacji okreœlonym inhibitorom. Ponadto badania Sato i wsp. [22-24] wykaza³y, e w wyniku aktywacji MMPs, dochodzi jednoczeœnie do syntezy przez komórki zrêbu. Immunohistochemiczna analiza ekspresji TIMP-3, przeprowadzona przez Miyazaki i wsp. wykaza³a ekspresjê oznaczanego parametru w utkaniu nowotworu, zaznaczaj¹c jej brak przy froncie naciekania guza. Ci sami autorzy stwierdzili obni on¹ ekspresjê w centralnej czêœci, wskazuj¹c na wzrost ekspresji TIMP-3 w zewnêtrznej czêœci utkania nowotworu [14]. Znamienn¹ korelacjê spadku ekspresji TIMP-3 z nasileniem stopnia inwazji oraz obecnoœci¹ przerzutów do wêz³ów ch³onnych, potwierdzaj¹ nasze obserwacje. Analiza ekspresji TIMP-3 wykaza³a spadek œrednich wartoœci TIMP-3 w podœcielisku oraz w komórkach nowotworowych w stadium N2 w stosunku do N0. Natomiast w N3 odnotowano wzrost ekspresji tego inhibitora. Ponadto liczni autorzy podkreœlili znaczenie prognostyczne TIMP-3, wskazuj¹c, i pacjenci, u których obserwowano spadek ekspresji tkankowego inhibitora-3 charakteryzowali siê krótszym czasem prze ycia, w porównaniu z pacjentami z wy sz¹ ekspresj¹ TIMP-3. Badania te sugeruj¹ znaczenie TIMP-3 jako czynnika wykazuj¹cego w³aœciwoœci supresorowe w stosunku do wzrostu nowotworów oraz procesu angiogenezy [20,26]. Na podstawie przedstawionej powy ej dyskusji mo na wysun¹æ hipotezê, e w ró - nych typach raków p³askonab³onkowych obszaru g³owy i szyi, istniej¹ zró nicowane mechanizmy zwi¹zane z procesem transformacji nowotworowej uzale nione od MMPs i ich inhibitorów. Utrzymanie równowagi miêdzy aktywnoœci¹ enzymów proteolitycznych i ich inhibitorów odgrywa istotn¹ rolê w utrzymaniu prawid³owej struktury tkanek oraz zapobiega degradacji sk³adników macierzy zewn¹trzkomórkowej. Nadmierna ekspresja enzymów proteolitycznych oraz brak aktywnoœci odpowiednich inhibitorów prowadzi do destabilizacji równowagi pomiêdzy okreœlonymi bia³kami, co w konsekwencji u³atwia migracjê komórek nowotworowych. Natomiast nadekspresja w stosunku do enzymów proteolitycznych prowadzi do zahamowania migracji komórek oraz tworzenia przerzutów odleg³ych [15]. Rozwój wiedzy dotycz¹cej roli metaloproteinaz oraz ich inhibitorów, podkreœla znaczenie szlaków aktywacji MMP- 2 i MMP-9 [3,6,28]. Ponadto ocena wzajemnych interakcji pomiêdzy wyszczególnionymi parametrami, w procesie inwazji nowotworowej, mo e przyczyniæ siê do rozwoju terapii opartej na dzia³aniu przeciwinwazyjnym, a poznanie mechanizmów interakcji dzia³ania okreœlonych metaloproteinaz oraz ich inhibitorów mo e mieæ istotny wp³yw na strategie terapeutyczne. Piœmiennictwo 1. Bodnar M, Rekwirowicz H, Burduk P. i wsp.: Impact of tobacco smoking on biologic background of laryngeal squamous cell carcinoma. Przegl. Lek. 2009, 66, Bieñ S., Kamiñski B., y³ka S. i wsp.: Ewolucja obrazu epidemiologicznego i klinicznego raka krtani i krtaniowej czêœci gard³a w Polsce w latach Otolaryngol. Pol. 2005, 59, Birkedal-Hansen B., Pavelic Z.P., Gluckman J.L. et al.: MMP and TIMP gene expression in head and neck squamous cell carcinomas and adjacent tissues. Oral Dis. 2000, 6, Blavier L., Henriet P., Imren S. et al.: Tissue inhibitors of matrix metalloproteinases in cancer. Ann. N Y Acad. Sci. 1999, 878, Christopoulos T.A., Papageorgakopoulou N., Ravazoula P. et al.: Expression of metalloproteinases and their tissue inhibitors in squamous cell laryngeal carcinoma. Oncol. Rep. 2007, 18, Clark I.M., Swingler T.E., Young D.A.: Acetylation in the regulation of metalloproteinase and tissue inhibitor of metalloproteinases gene expression. Front Biosci. 2007, 12, Egeblad M., Werb Z.: New functions for the matrix metalloproteinases in cancer progression. Nat. Rev. Cancer. 2002, 2, Göröth T., Beier U.H., Bäumken J. et al.: Metalloproteinases and their inhibitors: influence on tumor invasiveness and metastasis formation in head and neck squamous cell carcinomas. Head Neck. 2006, 28, Gupta G.P., Massagué J.: Cancer metastasis: building a framework. Cell. 2006, 127, Hunter K.W.: Host genetics and tumor metastasis. Br. J. Cancer 2004, 90, Jodele S., Blavier L., Yoon J.M. et al.: Modifying the soil to affect the seed: role of stromal-derived matrix metalloproteinases in cancer progression. Cancer Metastasis Rev. 2006, 25, Kalluri R., Zeisberg M.: Fibroblasts in cancer. Nat. Rev. Cancer 2006, 6, McAllister S.S., Wienberg R.A.: Tumor-host interactions: a far-reaching relationship. J. Clin. Oncol. 2010, 28, Miyazaki T., Kato H., Nakajima M. et al.: An immunohistochemical study of TIMP-3 expression in oesophageal cell carcinoma. Br. J. Cancer. 2004, 91, Murphy G., Nagase H.: Progress in matrix metalloproteinase research. Mol. Aspects Med. 2008, 29, Nakopoulou L., Tsirmpa I., Alexandrou P. et al.: MMP-2 protein in invasive breast cancer and the impact of MMP-2/TIMP-2 phenotype on overall survival. Breast Cancer Res. Treat. 2003, 77, Oberg A., Höyhtyä M., Tavelin B. et al.: Limited value of preoperative serum analyses of matrix metalloproteinases (MMP-2, MMP-9) and tissue inhibitors of matrix metalloproteinases (TIMP-1, TIMP- 2) in colorectal cancer. Anticancer Res. 2000, 20, Ohashi K., Nemoto T., Nakamura K. et al.: Increased expression of matrix metalloproteinase-7, and -9 and membrane type matrix metalloproteinase in esophageal squamous cell carcinoma. Cancer. 2000, 88, Oppenheimer S.B.: Cellular basis of cancer metastasis: A review of fundamentals and new advances. Acta Histochem. 2006, 108, Qi J.H., Ebrahem Q., Moore N. et al.: A novel function for tissue inhibitor of metalloproteinases-3 (TIMP-3): inhibition of angiogenesis by blockage of 682 Przegl¹d Lekarski 2011 / 68 / 10 M. Bodnar i wsp.

6 VEGF binding to VEGF receptor-2. Nat. Med. 2003, 9, Remmele W., Stegner H.E.: Vorschlag zur einheitlichen Definition eines immunoreactiven Score (IRS) für den Immunohistochemischen Ostrogenrezeptor - Nachwies (ER-ICA) im Mammakarzinomgewebe. Pathologe. 1987, 8, Sato H., Kida Y., Mai M. et al.: Expression of genes encoding type IV collagen-degrading metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in various human tumor cells. Oncogene 1992, 7, Sato H., Takino T., Kinoshita T. et al.: Cell surface binding and activation of gelatynase A induced by expression of membranr-type-1- matrix metallo-proteinase (MT1-MMP). FEBS Lett. 1996, 385, Sato H., Takino T., Okada Y. et al.: A matrix metalloproteinase expressed on the surface of invasive tumor cells. Nature. 1994, 370, Shim K.N., Jung S.A., Joo Y.H. et al.: Clinical significance of tissue levels of matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in gastric cancer. J. Gastroenterol. 2007, 42, Spurbeck W.W., Ng C.Y., Strom T.S. et al.: Enforced expression of tissue inhibitor of matrix metallo-proteinase-3 affects functional capillary morphogenesis and inhibits tumor growth in a murine tumor model. Blood. 2002, 100, Sutinen M. Kainulainen T., Hurskainen T. et al.: Expression of matrix metalloproteinase (MMP-1 and -2) and their inhibitors (TIMP-1, -2, and -3) in oral lichen planus, dysplasia, squamous cell carcinoma and lymph node metastasis. Br. J. Cancer. 1998, 77, Vihinen P., Käkäri V.M.: Matrix metalloproteinases in cancer: prognostic markers and therapeutic targets. Int. J. Cancer 2002, 99, Visscher W., Höyhtyä M., Ottosen S.K. et al.: Enhanced expression of tissue inhibitor of metalo-proteinase-2 (TIMP-2) in the stroma of breast carcinoma correlates with tumor recurrence. Int. J. Cancer 1994, 59, Visse R., Nagase H.: Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases: structure, function, and biochemistry. Circ. Res. 2003, 92, Wang W., Goswami S., Sahai E. et al.: Tumor cells caught in the act of invading: their strategy for enhanced cell motility. Trends Cell Biol. 2005, 15, Wierzbicka M., Szyfter W., Bieñ S. i wsp.: Zalecenia diagnostyczno-terapeutyczne dla wybranych nowotworów g³owy i szyi. Rak krtani. Wspó³cz. Onkol. 2006, 5, Wu Z.S., Wu Q., Yang J.H. et al.: Prognostic significance of MMP-9 and TIMP-1 serum and tissue expression in breast cancer. Int. J. Cancer. 2008, 122, Ylisirnio S., Hoyhtya M., Turpeenniemi-Hujanen T.: Serum matrix metalloproteinase-2, -9 and tissue inhibitors of metalloproteinase-1, -2 in lung cancer- TIMP-1 as prognostic marker. Anticancer Res. 2000, 20, Przegl¹d Lekarski 2011 / 68 /