Scientific Review in Pharmacy

Transkrypt

1 copyright 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN Farmaceutyczny Cena 24,50 zł PISMO POD PATRONATEM Przegląd WYDZIAŁU FARMACEUTYCZNEGO ŚLĄSKIEGO UNIWERSYTETU Naukowy MEDYCZNEGO W KATOWICACH IC Value - Current 3.66 MNiSW 4 ROK VI (X) Nr 6/2009 (53) Miesięcznik Scientific Review in Pharmacy Białka żółtka jaja kurzego, właściwości i zastosowanie Dynamika zmian aktywności izoenzymów dysmutazy ponadtlenkowej fibroblastów Efekty obecności kwercetyny w hodowlach fibroblastów narażonych na działanie etanolu Zagrożenia biologiczne w miejscu pracy. Lipopolisacharydy ważnym czynnikiem narażenia zawodowego Znaczenie wybranych cytokin w diagnostyce polipów nosa0 Zastosowanie spektroskopii EPR do badania melanin oraz kompleksów melanin z jonami metali i substancjami leczniczymi ISSN Znajomość roślin trujących na przestrzeni wieków 1

2

3 Farmaceutyczny PISMO POD PATRONATEM WYDZIAŁU FARMACEUTYCZNEGO ŚLĄSKIEGO UNIWERSYTETU MEDYCZNEGO W KATOWICACH Miesięcznik Przegląd Naukowy Scientific Review in Pharmacy Index Copernicus 3,66 MNiSW 4 Redaktor Naczelny / Editor-in-Chief: Prof. dr hab. Krystyna Olczyk Adres redakcji / Editorial Adress: ul. Jedności 8, Sosnowiec, Polska / Poland Tel Fax. 032/ Mail: fpn@kwiecinski.pl Konsultacyjna Rada Naukowa / Scientific Board Przewodniczący / Head: Prof. dr hab. Krystyna Olczyk - Sosnowiec Członkowie / Members: Prof. dr hab. Edward Bańkowski - Białystok Prof. dr Karmela Barišić - Zagreb, Chorwacja Prof. dr hab. Jerzy Brandys - Kraków Prof. dr Vitalis Briedis - Kaunas, Litwa Prof. dr hab. Elżbieta Brzezińska - Łódź Prof. dr Benito Del Castillo Garcia - Madrid, Hiszpania Prof. dr. Lionel Buéno - Toulouse, Francja Prof. dr hab. Kazimierz Głowniak - Lublin Prof. dr hab. Edmund Grześkowiak - Poznań Prof. dr Filiz Hincal - Ankara, Turcja Prof. dr. Michael Horowitz - Adelaide, Australia Prof. dr med. Kinga Howorka - AKH, UW, Wien, Austria Sekretarz Naukowy / Scientific Board Secretary: Dr n. med. Robert D. Wojtyczka Prof. dr hab. Renata Jachowicz - Kraków Prof. dr hab. Ewa Jagiełło-Wójtowicz - Lublin Prof. dr hab. Krzysztof Jonderko - Sosnowiec Prof. dr hab. Marcin Kamiński - Katowice Prof. dr Vesna Kuntić - Belgrade, Serbia Prof. dr hab. Jan Pachecka - Warszawa Prof. dr hab. Jerzy Pałka - Białystok Prof. dr hab. Janusz Pluta - Wrocław Prof. dr hab. Janusz Solski - Lublin Prof. dr Hiroshi Suzuki - Tokyo, Japonia Prof. dr hab. Yanusz Wegrowski - Reims, Francja Prof. dr hab. Marek Wesołowski - Gdańsk Prof. dr Mira Zečević - Belgrade, Serbia Członkowie Kolegium Redakcyjnego / Members of Editorial Board: Dr n. farm. Paweł Olczyk Dr n. biol. Małgorzata Kępa Mgr Anna Szeremeta Mgr Agnieszka Jura Półtorak Dr n. hum. Anna Kierczak Wydawca / Publisher: Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego Adres Wydawcy / Publisher Adress: Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ul. Wiśniowa 25/2, Bielsko-Biała, Polska / Poland tel. (0-33) fax (0-33) Prezes / President: dr n. med. Adam Kwieciński (Ph.D. M.D.) Marketing Manager: Opracowanie graficzne / Graphics: Skład / Technical Editor: Agnieszka Romańska Robert Cyganik Jerzy Partyka agnieszka.romanska@kwiecinski.pl Nakład: do egz. / Print run: up to 7000 copies Farmaceutyczny Przegląd Naukowy jest współfinansowany przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego. Scientific Review in Pharmacy is financially supported by Ministry of Science and Higher Education. Wszystkie materiały opublikowane w piśmie objęte są ochroną Prawa autorskiego. Projekty chronione są Ustawą o Prawie autorskim i pokrewnych prawach z 1994 r. (Dz. U. Nr 24, poz. 83). Redakcja zastrzega sobie prawo dostosowania nadesłanych materiałów do potrzeb pisma. Przedruki możliwe jedynie za zgodą wydawcy. Za treść materiałów reklamowych oraz listów od czytelników redakcja nie odpowiada. All published papers in Scientific Review in Pharmacy are protected by copyright laws (according to Law Gazette NO 24, item. 83). Board of Editors reserves the rights to harmonize the papers obtained to journal rules and requirements. Reprints are allowed only after Publisher agreement. Board of Editors are not responsible for advertisements and reader letters.

4 Zdj. Zygmunt Wieczorek Szanowni Państwo, Koleżanki i Koledzy, Drodzy Czytelnicy Przed nami kolejny numer Farmaceutycznego Przeglądu Naukowego. Serdecznie zapraszam do lektury zamieszczonych w nim artykułów. W numerze także zapowiedź Międzynarodowej Konferencji pod nazwą 7 th World Meeting on Pharmaceutics, Biopharmaceutics and Pharmaceutical Technology, która odbędzie się w 2010 roku, na Malcie, w miejscowości Valetta. Miło mi Państwa poinformować, iż Członkiem Międzynarodowego Komitetu Doradczego tej Konferencji jest Pani prof. dr hab. Renata Jachowicz. Pani Profesor przygotowała informację na temat wspomnianej Konferencji, którą z przyjemnością zamieszczamy. Warto wspomnieć, iż Malta przepiękna, o bajecznej architekturze i przyrodzie wyspa, gościła nie tak dawno farmaceutów, bowiem w 2005 r., kiedy na Uniwersytecie Maltańskim, właśnie w Valetcie stolicy Republiki Maltańskiej, odbywała się doroczna Konferencja Europejskiego Stowarzyszenia Wydziałów Farmaceutycznych (EAFP), pod nazwą Partnerships in education: Science and practice, a gdzie prezentowali, już tradycyjnie, swoje dokonania profesorowie z kilku polskich Wydziałów Farmaceutycznych. Szanowni Państwo. Obok starań o merytoryczną stronę naszego czasopisma, która stanowi gwarancję jego pozycji na rynku wydawniczym, nie ustajemy w staraniach nad ulepszaniem także i formalnej strony FPN. I tak, wprowadziliśmy w Regulaminie publikowania prac kolejny zapis, by w artykule przedkładanym Redakcji zamieszczać informację o źródle finansowania pracy (Grant ministerialny, Uczelniana praca statutowa lub własna, inne źródło finansowania). Dążeniem Kolegium Redakcyjnego jest ponadto zamieszczanie w publikowanym artykule informacji o dacie nadejścia pracy do Redakcji, jak i dacie zaakceptowania jej do druku. Jednak, warunkiem zamieszczenia tych ostatnich danych jest regularne ukazywanie się miesięcznika, z czym na razie mamy drobny problem. Wszelkie trudności staramy się systematycznie rozwiązywać, jakkolwiek podnoszona nieustannie przez nas samych poprzeczka sprawia kłopoty przede wszystkim właśnie nam kolegialno - redakcyjnym pomysłodawcom. Jednak, tak bardzo cieszy coraz lepsza jakość naszego Farmaceutycznego Przeglądu Naukowego, że i z dążenia do doskonałości nie zrezygnujemy. Niezwykła jest przy tym pasja i zaangażowanie Członków naszego Kolegium Redakcyjnego, bowiem to na Nich spada obowiązek codziennej pracy, uzgodnień z Autorami, Recenzentami i Wydawcą. Szanowni Państwo. Staramy się nie dopuszczać do zaległości w prowadzeniu artykułu od momentu kiedy dotrze do Redakcji aż do chwili jego opublikowania. Szanujące się czasopismo nie przetrzymuje bowiem artykułów, poddaje je niezwłocznie recenzji, po czym publikuje. Szczęśliwie, nasi Recenzenci wybitni Eksperci w swoich dziedzinach, oceniają prace jak Państwo wiedzą w tempie ekspresowym. Niebawem koniec roku i kolejna ocena czasopism. Miejmy nadzieję, iż będzie ona dla nas wszystkich korzystna, a to zależeć będzie w ogromnej mierze od Państwa. Zapraszam raz jeszcze serdecznie na łamy Farmaceutycznego Przeglądu Naukowego, by dzielili się Państwo z nami wszystkimi swoimi naukowymi dokonaniami. A tymczasem, jeszcze wypoczywajmy, bowiem nowy Rok Akademicki, a wraz z nim kolejne nasze dydaktyczne, naukowe i organizacyjne obowiązki już niebawem. Z życzeniami udanego wypoczynku, Redaktor Naczelny Prof. dr hab. Krystyna Olczyk

5 Farmaceutyczny PISMO POD PATRONATEM WYDZIAŁU FARMACEUTYCZNEGO ŚLĄSKIEGO UNIWERSYTETU MEDYCZNEGO W KATOWICACH Miesięcznik Przegląd Naukowy Scientific Review in Pharmacy Nr 6 / 2009 Index Copernicus 3,66 MNiSW 4 Spis treści Białka żółtka jaja kurzego, właściwości i zastosowanie0 19 Dynamika zmian aktywności izoenzymów dysmutazy ponadtlenkowej fibroblastów eksponowanych na działanie silikonu in vitro0 23 Kinetics of superoxide dismutaze isoenzymes in fibroblasts exposed to silicone in vitro0 Efekty obecności kwercetyny w hodowlach fibroblastów narażonych na działanie etanolu0 28 The effects of quercetin on fibroblasts cultured in presence of ethanol Zagrożenia biologiczne w miejscu pracy. Lipopolisacharydy ważnym czynnikiem narażenia zawodowego 31 Biological hazards in the workplace. Lipopolysaccharides a significant factor for occupational exposure0 Znaczenie wybranych cytokin w diagnostyce polipów nosa0 38 The role of cytokines in nasal polyposis Zastosowanie spektroskopii EPR do badania melanin oraz kompleksów melanin z jonami metali i substancjami leczniczymi 42 Application of EPR spectroscopy to examination of melanin, 0 melanin complexes with metal ions and drugs0 Znajomość roślin trujących na przestrzeni wieków 47 Characterization of poisonous plants over the ages

6 komunikat Szanowni Państwo, Pragnę poinformować, że w dniach od 8 do 11 marca 2010 r. w Valletta odbędzie się Międzynarodowa Konferencja: 7 th World Meeting on Pharmaceutics, Biopharmaceutics and Pharmaceutical Technology. Z prawdziwą przyjemnością informuję, że podobnie jak w ubiegłym roku, Polskie Towarzystwo Farmaceutyczne zostało zaproszone przez przewodniczącego Niemieckiego Towarzystwa Naukowego International Association for Pharmaceutical Technology, prof. dr hab. Petera Kleinebudde, do współpracy w organizacji konferencji. Jesteśmy w gronie 19 współpracujących Towarzystw Naukowych. Proponowana, bardzo szeroka tematyka dotycząca zagadnień związanych z różnymi formami leku, z uwzględnieniem m.in. aspektów biofarmaceutycznych, a także zagadnień prawnych stwarza, co niezwykle cenne, płaszczyznę do wymiany doświadczeń w gronie pracowników nauki i przedstawicieli przemysłu farmaceutycznego oraz prezentacji własnych osiągnięć. Bardzo serdecznie zapraszam Państwa do wzięcia udziału w konferencji. Szeroka problematyka daje możliwości uczestnictwa przedstawicieli różnych dyscyplin nauk farmaceutycznych. Wszelkie informacje można znaleźć na stronie Raz jeszcze bardzo serdecznie zapraszam. Z poważaniem Prof. dr hab. Renata Jachowicz Kraków,

7 Farm Przegl Nauk, 2009,6, 7-10 copyright 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19 Farm Przegl Nauk, 2009,6, copyright 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN Białka żółtka jaja kurzego, właściwości i zastosowanie* Barbara Dolińska 1, Dominika Woźniak 2, Florian Ryszka 1 Farmaceutyczny Zakład Naukowo-Produkcyjny Biochefa, Sosnowiec 2 Apteka 2000, Dąbrowa Górnicza Streszczenie Opisano właściwości i możliwości zastosowania w medycynie i farmacji białek żółtka jaja kurzego: foswityny i liwetyny. Dzięki unikalnym właściwościom foswityny może ona znaleźć zastosowanie jako emulgator, substancja przeciwdrobnoustrojowa, a produkty jej hydrolizy jako nośniki wapnia w leczeniu osteoporozy. Również jej właściwości antyoksydacyjne stwarzają perspektywy jej zastosowania. Frakcja γ liwetyny (Ig Y) wyodrębniona z żółtka jaja kurzego może zostać wykorzystana w terapii wielu schorzeń oraz w immunochromatografii do izolacji substancji bioaktywnych. Abstract The properties of hen s egg yolk proteins: phosvitin and livetin have been described in context of their applications in human medicine and pharmaceutical industry. Owing to the unique properties of phosvitin, this protein can be used as emulsifier and antimicrobial substance. The products of its hydrolysis can be used as carriers of calcium in the treatment of osteoporosis. Its antioxidant properties show that they can as well be used for pharmaceutical applications. Key words: egg yolk, proteins, properties, use Słowa kluczowe: żółtko jaja, białka, właściwości, zastosowanie Wstęp Jajo kurze jest bardzo cennym źródłem pełnowartościowego białka, składników odżywczych i mineralnych łącznie z pierwiastkami śladowymi [1,2]. Najważniejszą częścią jaja jest żółtko, które stanowi ~ 30% jego masy. Skład chemiczny żółtka zestawiono w tabeli I [2]. Żółtko w 50% swej masy składa się z wody i z 50% suchej substancji. Do substancji białkowych żółtka należy: foswityna (fosfowityna), liwetyna i lipoproteidy [1,2]. Frakcjonując żółtka jaj kurzych zmodyfikowaną metodą Lasso i Nakai można otrzymać w sposób prosty, z dużą wydajnością surowe frakcje tych substancji białkowych [3]. W żółtku można wyróżnić 70% α- i β-lipowitelin, które stanowią frakcję HDL o wysokiej gęstości. 12% stanowi frakcja LDL o niskiej gęstości i 16% foswityna. Lipowiteliny zawierają ~ 17-22% lipidów, a wśród nich ~ 40% triacylogliceroli i 60% fosfolipidów, głównie fosfatydylocholinę (lecytynę) i fosfatydyloetanoloaminę (kefalinę) oraz sfingomelinę i lysylofosfolipidy [2,4,5]. Foswityna (fosfowityna) jest główną fosfoglikoproteiną, która stanowi 7% suchej masy żółtka. Powstaje z dużej cząsteczki prekursorowej witellogeniny [6,7]. Występuje ona w naturalnym kompleksie z innym białkiem zwanym Składnik Żółtko Woda 50,0 Substancja sucha: 50,0 Białka: Lipidy: Liwetyna Foswityna Lipoproteidy Trójglicerydy Fosfolipidy 16,0 2,5 3,5 10,0 32,0 21,0 10,0 3. Sterole 1,0 Cukry 1,0 Sole mineralne 1,0 Tabela 1. Skład chemiczny żółtka [w %] lipowiteliną. Stosunek molowy foswityny do lipowiteliny wynosi 2:1, co odpowiada stosunkowi wagowemu 0,23:1. Rozdzielenie tego kompleksu następowało przy użyciu * Praca naukowa finansowana ze środków na realizację projektu rozwojowego Chemiczna ekstrakcja frakcji proteinowofosfolipidowych żółtka jaja, ich enzymatyczna modyfikacja ukierunkowana na wykorzystanie biomedyczne oraz produkcję suplementów diety (nr R ) w latach:

20 Farm Przegl Nauk, 2009,6 roztworów siarczanu magnezu lub rozpuszczalników organicznych [2]. Charakterystyczną cechą tego białka jest duża zawartość seryny - 54% oraz brak metioniny, tryptofanu czy tyrozyny [2,8]. Jest kwaśnym białkiem bogatym w fosfor [2]. Fosfor w foswitynie związany jest głównie przez serynę. Dwie foswityny zawierają 3% α- i 10% β-fosforu, który stanowi około 80% całego fosforu żółtka [12]. Fosfor jest obecny jako kwas fosforowy powiązany z resztami serylowymi, około 96% reszt serylowych jest ufosforylowanych [13]. Wysoka zawartość fosforu w foswitynie decyduje o dużym powinowactwie do jonów metali, szczególnie żelaza. 95% żelaza z żółtka jest związane przez foswitynę. W roztworach o małej sile jonowej i niskim ph tworzy kompleksy z jonami metali: Ca 2+, Mg 2+, Mn 2+, Co 2+, Fe 2+, Fe 3+. Z tego też powodu foswitynę uważa się za nośnik Ca 2+ i Fe 2+. Wiąże prawie całe żelazo zawarte w żółtku, nawet po jego ogrzewaniu. Kompleksy żelazowe są silne i stabilne, a żelazawe są słabe i z łatwością dysocjują [9]. Foswityna to mieszanka dwóch złożonych polipeptydów: α-foswityny o masie cząsteczkowej 160 kda i β-foswityny o masie 190 kda [10]. α-foswityna zawiera trzy lub cztery podjednostki o masie cząsteczkowej od 35 do 40 kda, a β-foswityna - cztery lub pięć podjednostek o masie cząsteczkowej 45 kda. W α-foswitynie jest około 6% węglowodanów, w tym: 2,5% heksozy, 1% heksozaminy i 2% kwasu sialowego. W β-foswitynie jest tylko 2% węglowodanów, głównie heksoza [11]. W neutralnym ph foswityna istnieje w przypadkowej, spiralnej konformacji. β-konformacja przeważa w środowisku kwaśnym [14]. Zawarta w granulach żółtka foswityna to białko o właściwościach antyoksydacyjnych. Właściwości te są bardzo pożądane gdyż, procesy oksydacyjne w produktach spożywczych wykazują negatywne skutki zdrowotne prowadzące nawet do chorób nowotworowych. Foswityna nie wychwytuje wolnych rodników, tylko wiąże metale: żelazo, miedź, które z kolei katalizują procesy oksydacyjne. Jest białkiem stosunkowo mało znanym, ale interesującym gdyż, rozpuszcza się zarówno w wodzie, jak i w tłuszczu. Ze względu na właściwości antyoksydacyjne foswityny zastosowano ją jako naturalny antyutleniacz do hamowania procesów oksydacji w margarynach. Jest alternatywą dla antyoksykantów chemicznych, które mogą wykazywać właściwości toksyczne [15,16]. Wykazano także, że foswityna skutecznie hamuje utlenianie fosfolipidów katalizowane przez Fe 2+ i Cu 2+ Nie działa jednak jako antyoksydant w przypadku heminy. Białko to. ma też wpływ na hamowanie procesu oksydacji w emulsji lipidowej z dodatkiem kationów miedzi, ale jedynie w stężeniu poniżej 5 μm Cu 2+ [16,17]. Wykazano także ochronne właściwości foswityny przed światłem UV, które indukuje dodatkowo peroksydację lipidów w obecności jonów żelaza [18]. Oksydacja kwasu linolowego katalizowana przez Fe 2+ jest silnie hamowana przez foswitynę. Także degradacja DNA katalizowana przez Fe 2+ w obecności H 2 O 2 jest hamowana przez foswitynę [19]. Jest skutecznym antyoksydantem w przedziale wartości ph od 5,6 do 7,8. Obniżenie wartości ph do 3,8 powoduje zmniejszenie tych właściwości foswityny. Potwierdzono także jej właściwości emulgujące i zdolności stabilizowania emulsji w stężeniu 0,5% [20,21]. Właściwości te były 2-3 krotnie wyższe niż innych białek np. albuminy wołowej, stosowanych w żywności. Stwierdzono, że N i C terminalne fragmenty peptydu i reszty fosforanowe są kluczowe dla jej właściwości emulgujących [1]. Badano wpływ obecności reszt fosforanowych w foswitynie na jej emulgujące właściwości. Stwierdzono, że aktywność emulgująca i stabilizująca emulsję foswityny bardzo się zmniejsza przy częściowym usunięciu fosforanu przez fosfatazę, a także przy całkowitym usunięciu fosforanu w zasadowych warunkach. Również jeśli do roztworu foswityny dodać jony wapnia, to znacznie pogarszają się jej właściwości emulgujące. Optymalne właściwości foswityny w układach dyspersyjnych są widoczne przy jej 0,5% dodatku [2,22,23]. Foswityna wykazuje właściwości emulgujące, ale ich mechanizm nie jest jasny do końca i pozostaje przedmiotem dalszych badań [2,17,24-28]. Foswityna jest stabilna podczas pasteryzacji w temp. 61 o C przez 3,5 minuty, ale ulega denaturacji podczas gotowania i sterylizacji [2]. Badania nad foswityną w stężeniu 0,l mg/ml wykazały także niezwykły jej antybakteryjny efekt przeciw E. coli pod wpływem stresu termicznego w temperaturze 50 o C [29]. Stwierdzono także, że foswityna wydłuża całkowity czas krzepnięcia krwi w krwi kurczaków in vitro [30]. Badania na zwierzętach wykazały, że dieta wzbogacona o foswitynę znakomicie zwiększa wbudowywanie wapnia do kości [1,31]. W plazmie znajdują się także frakcje rozpuszczalne w wodzie określane jako liwetyna Liwetyna stanowi ok. 10% całej masy żółtka [2,3]. Liwetynę rozdzielono na 3 frakcje α, β i γ. Liwetyny α i β zawierają po 14,3% azotu, a ta ostatnia zawiera też 7% glukozy. γ-liwetyna zawiera 15,6% azotu, 2,6% glukozy i 1,8% glukozaminy [2]. Wykazano, że stosunek frakcji α, β i γ wynosi odpowiednio 2:5:3. α-liwetyna albumina jest alergenem obecnym w żółtku jaja oraz w surowicy krwi kurcząt (albumina surowicy). Została ona zidentyfikowana jako czynnik często alergizujący osoby dorosłe. Może być przyczyną występowania objawów ze strony dróg oddechowych oraz przewodu pokarmowego. Opisano przypadki astmy oskrzelowej i alergicznego zapalenia pęcherzyków płucnych u pracowników serowarni [1]. Alergen ten jest również odpowiedzialny za występowanie alergii krzyżowej związanej z uczuleniem na alergeny ptasie i jaja (ang. bird-egg syndrom) [32]. Z tego też względu należałoby liwetynę oddzielić lub zdenaturować. α-2-glikoproteina jest głównym składnikiem β-liwetyny. Prowadzono badania nad trzema różnymi fenotypami β-liwetyny. Fenotypy te są kontrolowane przez dwa autosomalne allele w pojedynczym locus. Z frakcji liwetynowej wyodrębniono transferynę, białko o różowym zabarwieniu, które wiąże żelazo znajdowane w surowicy krwi ptaków, analogiczne do konalbuminy. Liwetyna jest białkiem bardzo złożonym i nie jest jeszcze w pełni poznana. Szczególnym zainteresowaniem przemysłu żywnościowego i farmaceutycznego cieszy się frakcja γ-liwetyny. Frakcja ta posiada aktywność immunologiczną identyczną jak immunoglobulina G (IgG). Od angielskiego określenia żółtka (yolk) nazwaną ją immunoglobuliną Y(Ig Y) [2]. Rozcieńczona plazma zawierająca frakcję liwetyn i LDL lipoprotein wykorzystywana jest do otrzymywania preparatu immunoglobuliny żółtka [1]. 20

21 copyright 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN Podstawową rolą immunoglobulin, przetransportowanych do żółtka z surowicy krwi, jest wywołanie biernej odporności u zarodka aż do momentu, gdy sam będzie w stanie wytwarzać w pełni funkcjonalne przeciwciała. Żółtko zawiera 8 20 mg/ml immunoglobulin Y, które powstają po 5 6 dniach od pojawienia się antygenu. IgY są ewolucyjnymi prekursorami IgG i IgE swoistych dla ssaków, stąd mają podobną do nich budowę. Charakteryzują się niską masą około 180 kda. Zawierają dwa ciężkie łańcuchy o masie cząsteczkowej kda i dwa lekkie o masie kda. Łańcuchy ciężkie mają jeden zmienny i cztery stałe obszary domen. Immunoglobuliny Y są stabilne w szerokim zakresie ph 4 9 i dobrze znoszą wysoką temperaturę. IgY wyodrębniona z żółtka jest stosowana jako dodatek do żywności zapobiegający biegunkom i gorączce podróżniczej wywoływanych przez rotawirusy, albo stosowanego profilaktycznie w żywności dla dzieci [1,2,33]. Podsumowanie Szybki rozwój nauk biochemicznych doprowadził do poznania poszczególnych składników żółtka jaja kurzego. Opublikowane w ostatnich latach wyniki badań w renomowanej literaturze, w tym medycznej dowodzą możliwości wykorzystania tych składników w przemyśle farmaceutycznym. Szerokie możliwości otwierają się przed foswityną. Pełni ona funkcję emulgatora o działaniu przeciwutleniającym. Udowodniono jej właściwości emulgujące i zdolność do stabilizowania emulsji. Daje to ogromne szanse do wykorzystania foswityny jako związku umożliwiającego powstanie emulsji oraz zapewnienie jej trwałości. Foswityna może być także składnikiem liposomów a fosfopeptydy otrzymywane z foswityny mogą zwiększać przyswajalność wapnia w przewodzie pokarmowym człowieka. Stąd foswityna jako źródło fosfopeptydów może mieć zastosowanie w leczeniu osteoporozy. Być może dzięki właściwościom przeciwbakteryjnym foswityna będzie kojarzona z syntetycznymi lekami w celu zwiększenia skuteczności terapii. Frakcja γ liwetyny (Ig Y) wyodrębniona z żółtka jaja kurzego może zostać wykorzystana w terapii wielu schorzeń oraz w immunochromatografii do izolacji substancji bioaktywnych. Piśmiennictwo 1. Gołąb K, Warwas M. Białka jaja kurzego właściwości biochemiczne i zastosowania. Adv Clin Exp Med 2005; 5: Trziszka T. Jajczarstwo. Wydawnictwo Akademii Rolniczej we Wrocławiu. Wrocław Ryszka F, Dolińska B, Leszczyńska L, Trziszka T. Rozdział białek żółtka jaja kurzego. Farm. Przegląd Naukowy 2009 (przyjęte do druku). 4. Ipatova O M, Prozorovskaia N N, Torkhovskaia T I, Baranova VS. Biological effects of the soybean phospholipids. Biomed Khim 2004; 50: Kawaguchi E, Shimokawa K, Ishii F. Physicochemical properties of structured phosphatidylcholine in drug carrier lipid emulsions for drug delivery systems. Colloids Surf B Biointerfaces 2008; 62: Finn R N. Vertebrate yolk complexes and the functional implications of phosvitins and other subdomains in vitellogenins. Biol Reprod 2007; 76: Goulas A, Triplett E L, Taborsky G. Oligophosphopeptides of varied structural complexity derived from the egg phosphoprotein, phosvitin. J Protein Chem 1996; 15: Renugopalakrishnan V, Horowitz P M, Glimcher M J. Structural studies of phosvitin in solution and in the solid state. J Biol Chem 1985; 260: Taborsky G. Iron binding by phosvitin and its conformational consequences. J Biol Chem 1980; 255: Ito Y, Fujii T. Chemical composition of the egg-yolk lipoproteins. J Biochem 1962; 52: Itoh T, Abe Y, Adachi S. Comparative studies on the α and β-phosvitin from hen s egg yolk. J Food Sci 1983; 48: Joubert F J, Cook W H Preparation and characterization of phosvitin from hen egg yolk. Can J Biochem Physiol 1958; 36: Byrne B M, van het Schip A D, van de Klundert J A. Amino acid sequence of phosvitin derived from the nucleotide sequence of part of the chicken vitellogenin gene. Biochemistry 1984; 23: Damodaran S, Xu S. The role of electrostatic forces in anomalous adsorption behavior of phosvitin at the air/water interface. J Colloid Interface Sci 1996; 178: Ishikawa S, Yano Y, Arihara K, Itoh M. Egg yolk phosvitin inhibits hydroxyl radical formation from the fenton reaction. Biosci Biotechnol Biochem 2004; 68: Lu C L, Baker R C. Characteristics of egg yolk phosvitin as an antioxidant for inhibiting metal- catalyzed phospholipid oxidations. Poult Sci 1986; 65: Lu C L, Baker R C. Effect of ph and food ingredients on the stability of egg yolk phospholipids and the metal-chelator antioxidant activity of phosvitin. J Food Sci 1987; 52: Ishikawa S, Ohtsuki S, Tomita K. Protective effect of egg yolk phosvitin against ultraviolet- light-induced lipid peroxidation in the presence of iron ions. Biol Trace Elem Res 2005; 105: Maheswari S U, Ramadoss C S, Krishnaswamy P R. Inhibition of Fe(II) catalyzed linoleic acid oxidation and DNA damage by phosvitin. Mol Cell Biochem 1997; 177: Nakamura S, Ogawa M, Nakai S. Antioxidant Activity of a Maillard-Type Phosvitin Galactomannan Conjugate with Emulsifying Properties and Heat Stability. J Agric Food Chem 1998; 46: Kahn M A, Babiker E E, Azakami H. Molecular mechanism of the excellent emulsifying properties of phosvitin-galactomannan conjugate. J Agric Food Chem 1999; 47: Kato A, Miyazaki S, Kawamoto A. Effects of Phosphate Residues on the Excellent Emulsifying Properties of Phosphoglycoprotein Phosvitin. Agricultural and Biological Chemistry 1987; 51:

22 Farm Przegl Nauk, 2009,6 23. Chung S L, Ferrier L K. Conditions affecting emulsifying properties of egg yolk phosvitin. J Food Sci 1991; 56: Anton M, Le Denmat M, Gandemer G. Thermostability of Hen Egg Yolk Granules: Contribution of Native Structure of Granules. Journal of Food Sci 2000; 65: Belhomme C, David-Briand E, Guérin-Dubiard C. Phosvitin-calcium aggregation and organization at the air-water interface. Colloids Surf B Biointerfaces 2008; 63: Rotimi E, Aluko E, Yoshinori M. Competitive Adsorption of Hen s Egg Yolk Granule Lipoproteins and Phosvitin in Oil-in-Water Emulsions J Agric Food Chem 1997; 45: Nilsson L, Osmark P, Fernandez C. Competitive Adsorption of Proteins from Total Hen Egg Yolk during Emulsification. J Agric Food Chem 2007; 55: Castellani O, Belhomme C, David-Briand E. The role of metal ions in emulsion characteristics and flocculation behaviour of phosvitin-stabilised emulsions. Food Hydrocolloids 2008; 22: Sattar Khan M A, Nakamura S, Ogawa M. Bactericidal action of egg yolk phosvitin against Escherichia coliunder thermal stress. J Agric Food Chem 2000; 48: Sato K, Homma K, Gotoh J. Anticlotting activity of phosvitin on chicken blood in vitro. Am J Physiol 1962; 203: Choi I, Jung Ch, Choi H. Effectiveness of phosvitin peptides on enhancing bioavailability of calcium and its accumulation in bones. Food Chemistry 2005; 93: Quirce S, Maranon F, Umpierrez A. Chicken serum albumin (Gal d5) is a partially heat-labile inhalant and food allergen implicated in the bird-egg syndrome. Allergy 2001; 56: Tini M, Jewell U R, Camenisch G. Generation and application of chicken egg yolk antibodies. Comp Bioch Phys Part A 2001; 131: Adres do korespondencji: Dr hab. n. farm. Barbara Dolińska Farmaceutyczny Zakład Naukowo-Produkcyjny Biochefa, Sosnowiec, Kasztanowa 3 Tel.: 0-32/ b.dolinska@biochefa.pl 22

23 Farm Przegl Nauk, 2009,6, copyright 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN Dynamika zmian aktywności izoenzymów dysmutazy ponadtlenkowej fibroblastów eksponowanych na działanie silikonu in vitro Kinetics of superoxide dismutaze isoenzymes in fibroblasts exposed to silicone in vitro Renata Polaniak 1, Ewa Birkner 1, Natalia Matysiak 2, Marcin Sierociński 1, Agata Filipowska-Grońska 1, Elżbieta Ratajczak-Kubiak 1 1 Zakład Biochemii Ogólnej Katedry Biochemii w Zabrzu, Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach; 2 Katedra i Zakład Histologii w Zabrzu, Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach Streszczenie Silikon i jego różne formy znajduje szerokie zastosowanie w medycynie i kosmetologii. Służy on między innymi do wyrobu cewników, drenów, protez małych stawów, protez stosowanych do ubytków kostnych i chrzęstnych w obrębie twarzy, ekspanderów tkankowych, czy żeli pomocnych w leczeniu blizn przerostowych i bliznowców. Silikony mają niski współczynnik rozpuszczalności, co powoduje że są one praktycznie nierozpuszczalne w fazach wodnych lub organicznych. Działanie silikonu w organizmie nie powinno być związane ze stresem oksydacyjnym i peroksydacją lipidów. Nie wiadomo jednak, czy w badaniach na hodowlach komórkowych in vitro silikon może generować reaktywne związki tlenu (RZT). Celem pracy było określenie czy wprowadzenie do hodowli linii MRC5 silikonu wpływa na dynamikę zmian aktywności wybranych izoenzymów układu stresu oksydacyjnego oraz peroksydację lipidów w komórkach linii MRC 5. Badania przeprowadzono stosując jedną dawkę silikonu w trzech przedziałach czasowych na hodowli komórek fibroblastów linii MRC5. Hodowlę prowadzono w standartowych warunkach temperatury i atmosfery wzbogaconej w dwutlenek węgla. W mediach komórkowych oznaczano aktywności dysmutazy ponadtlenkowej (SOD) i jej izoenzymów (MnSOD i Cu/ZnSOD) oraz stężenie dialdehydu malonowego, jako markera peroksydacji lipidów. Uzyskane wyniki sugerują wpływ silikonu na układ pro/ antyoksydacyjny, poprzez spadek stężenia MDA i wzrost aktywności izoenzymów SOD. Slowa kluczowe: fibroblasty, hodowla komórkowa, izoenzymy SOD, peroksydacja lipidów, MDA Summary Silicone and its different forms are widely used in medicine and cosmetology. It is used, among others, for production of catheters, drains, prostheses of small joints, prostheses used in bone and chondral fillings within the face, tissue expanders, or gels useful in treatment of hypertrophied scars and keloids. Silicones possess a low coefficient of solubility, which makes them practically insoluble in water or organic phases. The silicone action in an organism should not be correlated with oxidative stress and lipid peroxidation. However, it is unknown, if silicon can generate the radical oxygen species (ROS) in cell cultures in vitro. The aim of this work was to study if introduction of silicone to MRC5 cell culture can influence dynamics of selected isoenzymes of the oxidative stress system and lipid peroxidation in MRC 5 cell line. The study was performed using one dose of silicone in three time intervals in the fibroblast cell line MRC5. The culture was carried out in the standard temperature conditions and in the atmosphere saturated with carbon dioxide. Activities of superoxide dismutase (SOD) and its isoenzymes (MnSOD and Cu/ZnSOD) were titrated in cell media as well as concentration of malonate aldehyde, as a marker of lipid peroxidation was measured. The results suggest an inhibitory effect of silicone upon pro/antioxidative system by decreasing MDA concentration and by increasing SOD isoenzymes activities. Key words: fibroblasts, cell culture, SOD isoenzymes, lipid peroxidation, MDA 23

24 Farm Przegl Nauk, 2009,6 Wstęp Silikon i jego różne formy znajduje szerokie zastosowanie w medycynie i kosmetologii. Służy on między innymi do wyrobu cewników, drenów, protez małych stawów, protez stosowanych do ubytków kostnych i chrzęstnych w obrębie twarzy, ekspanderów tkankowych, czy żeli pomocnych w leczeniu blizn przerostowych i bliznowców. Silikony mają niski współczynnik rozpuszczalności, co powoduje że są one praktycznie nierozpuszczalne w fazach wodnych lub organicznych [1] Oleje silikonowe czyli polidimetylosiloksany (PMDS) to podstawowa grupa, która posłużyła za punkt wyjścia do modyfikacji. Silikony medyczne to rodzina związków krzemoorganicznych zbudowanych z różnej długości łańcuchów dimetylsiloksanu. Jest to najlepiej przebadany materiał stosowany do produkcji różnego rodzaju implantów. Miejscowe opatrunki z żelu silikonowego są stosowane od 1982 roku. Dokładny mechanizm terapeutyczny oddziaływania żelu silikonowego nie jest znany. Znaczenie przypisuje się zjawisku okluzji, zmniejszającemu powierzchniową utratę wody i w ten sposób zwiększające uwodnienie tkanek. Działanie opatrunku silikonowego porównuje się do funkcji jaką w normalnych warunkach pełni warstwa rogowa naskórka. Przyjmuje się że ogranicza ono proces angiogenezy, zmniejsza ilość mediatorów zapalnych oraz syntezę kolagenu i GAG-ów przez fibroblasty. Ponieważ podobny efekt okluzji można osiągnąć poprzez stosowanie innych opatrunków, co jednak nie oddziałuje tak pozytywnie jak działanie silikonu, z pewnością istnieją jeszcze inne dodatkowe mechanizmy. Być może jednym z nich jest oddziaływanie negatywnych ładunków elektrycznych gromadzących się na powierzchni opatrunków silikonowych, a tworzących się na skutek wywieranego na niego tarcia [1,2]. Stosowanie opatrunków silikonowych winno zostać zarekomendowane zarówno w profilaktyce jak i zachowawczym leczeniu zarówno bliznowców jak i blizn przerostowych jako prosta, bezpieczna i efektywna metoda. W przypadku już istniejących blizn przerostowych i bliznowców winno być terapią pierwszego rzutu. Działanie silikonu w organizmie nie powinno być związane ze stresem oksydacyjnym i peroksydacją lipidów. Nie wiadomo jednak, czy w badaniach na hodowlach komórkowych in vitro silikon może generować reaktywne związki tlenu (RZT) takie jak nadtlenek wodoru, tlen atomowy, anionorodnik ponadtlenkowy i rodnik hydroksylowy. Teoria uwolnienia patologicznych procesów na poziomie komórki z pobudzeniem nadmiernego wydzielania cytokin zapalnych i niszczącego działania wolnych rodników tlenowych jest jedynie potwierdzeniem uogólnionego i miejscowego procesu zapalnego. Występują one w różnorakich urazach. W tworzeniu się bliznowców i blizn przerostowych żadna z teorii osobno nie jest wystarczająca do wyjaśnienia patomechanizmu ich powstawania. Połączenie ich razem też jeszcze nie wyjaśnia wszystkich zjawisk. [1,2]. Organizmy żywe posiadają mechanizmy antyoksydacyjne, które w warunkach fizjologicznych osłaniają przemiany ustrojowe przed działaniem wolnych rodników. Należą do nich układy enzymatyczne, oraz nieswoiste antyoksydanty (witamina A, E, C, selen, nienasycone kwasy tłuszczowe, acetylocysteina, glutation i inne). Do enzymów antyoksydacyjnych zaliczamy: dysmutazę ponadtlenkową (SOD) i jej izoenzymy (MnSOD i Cu/ZnSOD), katalazę (CAT) oraz enzymy związane z przemianami glutationu: peroksydazę glutationową (GSH-Pox), transferazę glutationową (GST). Wskaźnikiem peroksydacji lipidów jest stężenie dialdehydu malonowego (MDA) [3,4,5]. Ze względu na nie w pełni poznany wpływ silikonu na procesy zachodzące podczas tworzenia blizn, istotne jest poszukiwanie molekularnych zmian indukowanych silikonem, mających wpływ na proces tworzenia blizn. Celem pracy było określenie czy wprowadzenie do hodowli fibroblastów linii MRC5 silikonu w zastosowanej dawce i przedziałach czasowych wpływa na dynamikę zmian aktywności izoenzymów dysmutazy ponadtlenkowej: MnSOD i Cu/ZnSOD, jako enzymów układu stresu oksydacyjnego oraz peroksydację lipidów, na podstawie zmian stężenia MDA w medium hodowlanym komórkach linii MRC 5. Materiał i metody Badania przeprowadzono stosując jedną dawkę silikonu w trzech przedziałach czasowych. W eksperymencie wykorzystano hodowlę komórek fibroblastów in vitro w postaci kolonii. Linia hodowlana fibroblastów MRC5 pochodziła z banku komórek w Instytucie Onkologii w Gliwicach. W układzie kolonii, komórki pozostają w stałym kontakcie ze sobą i z podłożem. Płaski charakter kolonii umożliwia łatwy dostęp płynu odżywczego do komórek, co w efekcie daje możliwość długotrwałego prowadzenia hodowli bez potrzeby wykonywania kolejnych pasaży. Jest to niezwykle istotne dla prowadzenia badań np. w określeniu dynamiki wzrostu komórek. Hodowlę prowadzono w standartowych warunkach temperatury i atmosfery wzbogaconej w dwutlenek węgla. Jako podłoże hodowlane stosowano roztwór Dulbeco s z L-glutaminą, wzbogacone wołową surowicą płodową. Hodowlę prowadzono w butelkach hodowlanych firmy Sarsedt o powierzchni 75cm² [6]. Badane kolonie podzielono na następujące grupy eksperymentalne: 1. kontrole: K24, K72, K5d - dla każdej grupy czasowej była grupa kontrolna (dla 24 h, 72 h, 5 dni); medium bez zawartości silikonu 2. grupa badana 1 (B24) - komórki poddane działaniu silikonu 24 godz. 3. grupa badana 2 (B72) - komórki poddane działaniu silikonu 72 godz. 4. grupa badana 3 (B5d) - komórki poddane działaniu silikonu 5 dni. Na podstawie piśmiennictwa i badań pilotażowych w eksperymencie zastosowano dawkę silikonu 2,2 mg/ml medium hodowlanego. W mediach badanych kolonii oznaczano: 1. aktywność dysmutazy ponadtlenkowej (SOD) [EC ] 2. aktywność izoenzymów SOD: 24

25 copyright 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN a) mitochondrialnego (MnSOD) b) cytoplazmatycznego (Cu/ZnSOD) wg. metody Oyanagui [7], wykorzystując ich różną podatność na inhibicję cyjankiem potasu. Aktywność enzymów wyrażono w NU/ml medium (NU- Jednostka Nitrowa, jest to taka ilość enzymu, która rozkłada w jednostce czasu 50% ilości powstającego rodnika ponadtlenkowego). 3. stężenie dialdehydu malonowego (MDA), jako markera peroksydacji lipidów, wykorzystując jego reakcje z kwasem tiobarbiturowym wg. metody Ohkawy [8]. Stężenie MDA odczytano z krzywej standardowej (1,1,3,3-tetraetoksypropan) i wyrażono w µmolach MDA/ml medium hodowlanego. Wyniki Analizę statystyczną przeprowadzono w oparciu o program StatSoft, Inc. (2001). STATISTICA (data analysis software system), version 6. Oceniono normalność rozkładu uzyskanych wyników we wszystkich badanych grupach (grupy kontrolne; grupy badane traktowane silikonem) stosując test Shapiro-Wilka. Ponieważ niektóre analizowane parametry nie miały rozkładów normalnych, dla oceny różnic pomiędzy poszczególnymi grupami zastosowano test nieparametryczny U Mann-Whitney a, natomiast dla pozostałych do oceny różnicy pomiędzy badanymi grupami wykorzystano test t- Studenta, przyjmując poziom istotności p<0.05. Porównano aktywność SOD [NU/ml] w medium komórkowym hodowli linii MRC5 poddanych działaniu silikonu i komórek tej samej linii nie poddanych działaniu silikonu, po upływie 24h, 72h i 5 dni. Po 24h zaobserwowano znamienny statystycznie wzrost aktywności SOD w grupie badanej w stosunku do grupy kontrolnej. Po 72h i 5 dniach eksperymentu aktywność enzymu w grupach badanych spadla istotnie statystycznie w stosunku do grup kontrolnych. Stwierdzono najniższą aktywność SOD zarówno w przypadku grup kontrolnych, jak i grup badanych po upływie 5 dni eksperymentu (Ryc.1). Ryc. 2. Aktywność MnSOD [NU/ml] w mediach komórkowych linii MRC5 poddanych działaniu silikonu przez 24h, 72h i 5 dni eksperymentu (p<0,05 vs. K) Aktywności Cu/ZnSOD [NU/ml] w mediach komórkowych linii MRC5 poddanych działaniu silikonu i w grupach kontrolnych, nie poddanych działaniu silikonu przez 24h, 72h i 5 dni była istotnie statystycznie wyższa w grupach badanych aniżeli w grupach kontrolnych. Najwyższą aktywność Cu/ZnSOD stwierdzono w grupie badanej po 24 h eksperymentu, a najniższą w grupie kontrolnej oraz grupie badanej po 5 dniach eksperymentu (Ryc.3). Ryc. 3. Aktywność Cu/ZnSOD [NU/ml] w mediach komórkowych linii MRC5 poddanych działaniu silikonu przez 24h, 72h i 5 dni eksperymentu (p<0,05 vs. K) Stężenie MDA w medium komórkowym grup badanych linii MRC5 pod wpływem silikonu po upływie 24h, 72h i 5 dni było istotnie statystycznie niższe aniżeli w grupach kontrolnych. Stwierdzono najniższą wartość oznaczanego parametru po upływie 5 dni a najwyższą po 24h ekspozycji na silikon (Ryc.4). Stwierdzono istotną statystycznie różnicę pomiędzy stężeniem dialdehydu malonowego po 24h i po 5 dniach eksperymentu (p=0.043; test t-studenta dla prób zależnych). Ryc. 1. Aktywności SOD [NU/ml] w mediach komórkowych linii MRC5 poddanych działaniu silikonu przez 24h, 72h i 5 dni eksperymentu (p<0,05 vs.k) Porównano aktywności MnSOD [NU/ml] w grupach badanych MRC5 poddanych działaniu silikonu i grupach kontrolnych, nie poddanych działaniu silikonu przez 24h, 72h i 5 dni. Zaobserwowano istotny statystycznie spadek aktywności oznaczanego enzymu w grupach badanych w stosunku do grup kontrolnych. Stwierdzono najniższą aktywność MnSOD zarówno w przypadku grup kontrolnych, jak i badanych po upływie 72h eksperymentu. (Ryc.2). Ryc. 4. Stężenie MDA [µmol/l] w mediach komórkowych linii MRC5 poddanych działaniu silikonu przez 24h, 72h i 5 dni eksperymentu (p<0,05 vs. K) Dyskusja Hodowle komórkowe i tkankowe in vitro są bardzo dogodną i rozpowszechnioną formą prowadzenia badań naukowych. Dzięki nim można dokonać oceny aktywności 25

26 Farm Przegl Nauk, 2009,6 i stężenia produktów przemian biochemicznych wybranych szlaków metabolicznych [9]. Nowatorskim przedsięwzięciem naukowym opracowanym przez dr Kummerhmera w Instytucie Badań nad Promieniotwórczością w Monachium, a zmodyfikowanym w Zakładzie Biochemii Ogólnej SUM, było prowadzenie hodowli in vitro komórek raka płaskonabłonkowego linii AT549 w postaci megakolonii [10,11]. Na podstawie przeprowadzonych badań magakolonii linii raka płaskonabłonkowego stwierdzono, że jednym z najistotniejszych antyoksydantów jest melatonina [19], zaś wolnozmienne pole elektromagnetyczne również może spełniać rolę zmiatacza wolnych rodników w zależności od zastosowanego natężenia pola i przedziału czasowego ekspozycji. Podobne badania przeprowadzono na innych liniach komórkowych, np. na fibroblastach mysich 3T3L [20,21]. Hodowle komórkowe i tkankowe mogą być prowadzone na różnych liniach in vitro: nowotworowych, limfocytach, hepatocytach, itp. [12,13,14,15]. Szczególnie rozpowszechnione są prace dotyczące badań na fibroblastach, np. badania wpływu histaminy na fibroblasty, czy pochodnych kolagenu [16]. W dostępnym piśmiennictwie wiele prac poświęconych jest wpływowi silikonu na fibroblasty zarówno w układzie in vivo jak i in vitro. Doniesienia te, jednak dotyczą badań klinicznych, pooperacyjnych pacjentów (rola silikonu w przeszczepach, czy reakcji organizmu pacjentów) [17], natomiast nie ma prac zajmujących się problematyką przemian biochemicznych ukladów biologicznych in vitro pod wplywem oddziaływania silikonu. W badaniach in vitro natomiast, zajęto się przede wszystkim zmianami molekularnymi wpływającymi na zachowanie mobilności komórki [18]. Nie znaleziono jednak prac dotyczących dynamiki zmian aktywności enzymów antyoksydacyjnych, w tym izoenzymów SOD, oraz wskaźników peroksydacji lipidów (MDA) fibroblastów hodowanych in vitro, eksponowanych na działanie silikonu. Dlatego przeprowadzono badania dotyczące tego tematu. Stwierdzono, że silikon, preparat szeroko stosowany w medycynie, w zastosowanej dawce i przedziałach czasowych, powoduje zaburzenia w procesach oksydoredukcyjnych badanej linii fibroblastów MCR5, hodowanej in vitro. W świetle opublikowanych danych literaturowych istnieją sprzeczne doniesienia dotyczące udziału wolnych rodników w patomechanizmie toksycznego działania silikonu. Mechanizmy antyoksydacyjne, które posiadają organizmy żywe, w tym także hodowle komórkowe prowadzone in vitro, osłaniają przemiany ustrojowe przed działaniem wolnych rodników. Należą do nich przede wszystkim układy enzymatyczne. Dysmutaza ponadtlenkowa i jej izoenzymy są właśnie przedstawicielami tej grupy enzymatycznej. SOD jest enzymem występującym we wszystkich organizmach żywych, przede wszystkim w jądrze komórkowym i lizosomach. Kompleksowe związanie z wchodzących w skład enzymów jonów metali prowadzi do jego dezaktywacji [19]. Natomiast MDA, jako wskaźnik peroksydacji lipidów, pozwala określić nasilenie procesów peroksydacyjnych zachodzących w organizmie żywym [20]. W przeprowadzonych badaniach nasilenie peroksydacji lipidów dotyczyło procesów wolnorodnikowych zachodzących w medium hodowlanym komórek fibroblastów linii MRC5. Podsumowując, należy zwrócić uwagę, jak istotnym zagadnieniem wydaje się być oddziaływanie silikonu na przemiany metaboliczne komórek fibroblastów in vitro, w tym aktywności enzymów układu stresu oksydacyjnego oraz markerów peroksydacji lipidów. W przeprowadzonym eksperymencie stwierdzono wyraźny wpływ silikonu na procesy przemian biochemicznych komórek linii MRC 5. Aczkolwiek biorąc pod uwagę mechanizmy życiowe omawianych układów biologicznych, problem ten nie uwzględnia wielu elementów i wymaga dalszych badań. Także z zakresu innych dziedzin, jak chociażby związku pomiędzy mechanizmem działania silikonu a ekspresją genów badanych komórek in vitro. Wnioski W warunkach przeprowadzonego eksperymentu, pod wpływem zastosowanej dawki silikonu i przedziałach czasowych stwierdzono, że dochodzi do zaburzeń układu pro/ antyoksydacyjnego komórek fibroblastów linii MRC5 hodowanych in vitro. Można jednak przyjąć, że silikon stosowany w dawkach leczniczych jest preparatem bezpiecznym. Aczkolwiek wyniki badań sugerują, że nadużywanie preparatów silikonowych może ujemnie wpływać na metabolizm komórkowy organizmu. Piśmiennictwo 1. Gajos A. Silikony, Farmakoterapia, 2008, mat.inern.: Mitchel P. Goldman R.E. Fitzpatrick RG. i wsp., Instrumentation for cosmetic surgery. Clinics in Dermatology, 1988, 6(3), Basaga H.S.: Biochemical aspects of free radicals. Biochem. Cell. Biol., 1990; 68: Hagar J.M., Hale S.L., Ilvento J.P., i wsp.: Lack of significant effects of superoxide dismutase and catalase on development of reperfussion arrytmias. Basic Res. Cardiol., 1991; 86: Senga S., Onituka A., Hirose H.: Protective effect of liposomal encapsulated superoxide dismutase on ischemically injured liver in the rat. Transplantation Proccedings, 1990; 22(4): Polaniak R., Birkner E., Beck B., i wsp: Ocena aktywności wybranych enzymów przemian metabolicznych w medium hodowlanym komórek AT478 in vitro pod wplywem cisplatyny i wolnozmiennego pola magnetycznego. Diagn.Lab., 2006, 42: Oyanagui Y.: Reevaulation of assay methods and estabilishment of kit for superoxide dismutase activity. Analyt. Biochem., 1984; 142: Ohkawa H., Ohishi N., Kunio Y.: Assay for peroxides in animal tissues by thiobarbiruric acid reaction. Annal. Biochem., 1979; 95: Przybyszewski W., Wideł M., Polaniak R. i wsp.: Contrasting effects of low vs high dose-rate radiation on lipid peroxidation, DNA damage, and antioxidant enzyme activities in tumor cells. Progress in Medical Research, 2005; 3:

27 copyright 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN Polaniak R., Birkner E., Kasperczyk S. i wsp.: Wplyw holoksanu na aktywność dehydrogenazy mleczanowej w medium megakolonii raka plaskonablonkowego in vitro. Farm.Przegl.Nauk., 2006, 1: Tarnawski R., Kummermehr J., Trott K.R.: The radiosensitivity of recurrent clones of a irradiated murine squamous cell carcinoma in the in vitro megacolony system. Radiotherapy & Oncology, 1998, 46: Partchment R.E., Gordon M., Grieshaber C.K. i wsp.: Predicting hematological toxicity (myelosuppression) of cytotoxic drug therapy from in vitro test. Annales of Onkology, 1998; 9 (4): Tabata M.J., Matsumura T., Liu J.G. i wsp.: Expression of cytokeratin 14 in ameloblast-lineage cells of the developing tooth of rat, both in vivo and in vitro. Archivesof Oral Biology, 1998; 46 (2): Takeda T., Goto H., Arisawa T.: Effect of histamine on human fibroblast in vitro. Arzneimittel-Forschung, 1997, 47(10): Waked W, Grauer J.: Silicates and bone fusion. Orthopedics. 2008, 31(6): McCauley RL, Riley WB Jr, Juliano RA, i wsp.: In vitro alterations in human fibroblast behavior secondary to silicone to silicone polymers. J.Surg.Res., 1990, 49(1): Przybyszewski W., Wideł A., Szurko A., LubeckaB., Matulewicz Ł, Manikowski Z., Polaniak R. et al.: Multiple bystander effect of irradiated megakolonies of melanoma cells on non-irradiated neighbours. Conser Letters, 2004, 214 (1): Tetsuya O., Masayasu I., Yukio A. i wsp.: Chemical modification of superoxide dismutase Extension of plasma half life of the enzyme through its reversible binding to the circulating albumin. Int.J. Peptide and Protein Res., 2009, 32(2); Żwirska-Korczala K., Adamczyk-Sowa M., Polania R., et al.: Influence of extremely-low-frequency magnetic field on antioxidative melatonin properties in AT478 murine squamous cell carcinoma culture. Biol. Trace. Elem. Res. 2004, 102: Żwirska-Korczala M., JochemJ., Adamczyk-Sowa M., et al.:effect of extremely low frequency electromagnetic fields on cell proliferation, antioxidative enzymes activities and lipid peroxidation in 3T3-L1 preadipocytes - an in vitro study. J.Physiol.Pharm., 2005, 56: Torres-Duran PV., Ferreira-Hermosillo A., Juarez- Oropeza MA.: Effects of whole body exposure to extremely low frequency electromagnetic fields (ELF-EMF) on serum and liver lipid levels, in the rat. Lipids Health Dis., 2007, 16: Adres do korespondencji: Dr Renata Polaniak Zakład Biochemii Ogólnej SUM ul. Jardana 19; Zabrze Tel.: 32/ rpolaniak@sum.edu.pl 27

28 Farm Przegl Nauk, 2009,6, Efekty obecności kwercetyny w hodowlach fibroblastów narażonych na działanie etanolu The effects of quercetin on fibroblasts cultured in presence of ethanol Katarzyna Pawłowska-Góral, Małgorzata Góral, Ewa Kurzeja, Justyna Kania Katedra i Zakład Żywności i Żywienia, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach Streszczenie Flawonoidy obecne w żywności należą do tych składników nieodżywczych, które mogą działać profilaktycznie a nawet leczniczo w niektórych schorzeniach (szczególnie w tzw. schorzeniach cywilizacyjnych). Mechanizm tego działania wynika prawdopodobnie z właściwości antyoksydacyjnych flawonoidów. Celem pracy była ocena aktywności wybranych komórkowych enzymów antyoksydacyjnych w fibroblastach po ich inkubacji z etanolem jako, związkiem generującym wolne rodniki oraz kwercetyną. Badania przeprowadzono na hodowlach pierwotnych fibroblastów, inkubowanych w pożywce z dodatkiem kwercetyny o różnych stężeniach rozpuszczonej w etanolu. Hodowle likwidowano w 2, 4 i 6 dniu ich trwania i oceniano żywotność komórek, stężenie białka oraz aktywność enzymów antyoksydacyjnych tj. dysmutazy ponadtlenkowej (SOD), peroksydazy glutationowej (GPx) oraz reduktazy glutationowej (GR). Uzyskane wyniki wskazują, że obecność kwercetyny w hodowlach fibroblastów narażonych na działanie etanolu ingeruje zarówno w aktywność komórkowych enzymów antyoksydacyjnych jak i stężenie nieenzymatycznych drobnocząsteczkowych komórkowych antyoksydantów. Słowa kluczowe: kwercetyna, fibroblasty, enzymy antyoksydacyjne Abstract Flavonoids present in food are among those non-nutritive elements which can play a preventive or even a curative role on certain ailments (especially in so-called lifestyle diseases). The mechanism of their effectiveness probably results from the antioxidative properties of flavonoids. The aim of this work was to assess the activity of chosen antioxidative cell enzymes in fibroblasts after incubation with ethyl alcohol serving as the agent generating free radicals, and quercetin. The tests were carried out on cultures of primary fibroblasts, incubated on medium with the addition of various saturations of quercetin dissolved in ethanol alcohol. The cultures were liquidated in the 2 nd, 4 th and 6 th day of breeding and the vitality of cells, the saturation of proteins and the activity of antioxidative enzymes: superoxide dismutase (SOD), glutatione peroxidase (GPx), as well as glutatione reductase (GR) were assessed. The obtained results indicate that the presence of quercetin in cultures exposed to the activity of ethanol alcohol interferes with both the activity of antioxidative cell enzymes and the saturation of non enzymatic low-molecular-weight cell antioxidants. Key words: quercetin, fibroblasts, antioxidative enzymes Kwercetyna jest jednym z najczęściej badanych flawonoli należących do grupy flawonoidów. W naturalnych warunkach kwercetyna występuje głównie w postaci glikozydów pełniąc rolę aglikonu. Kwercetyna występuje w szeregu produktów spożywczych pochodzenia roślinnego. Występuje również w postaci rutyny (glikozydu) będącej składnikiem leków. Dane piśmiennictwa naukowego dotyczące kwercetyny są rozbieżne. Większość przeprowadzonych badań wskazuje na jej właściwości prozdrowotne, w tym antyoksydacyjne [1], przeciwmiażdżycowe [2] oraz przeciwzapalne [3]. Jednakże wyniki innych badań wskazują na jej działanie mutagenne i apoptyczne [4] wynikające być może z działania prooksydacyjnego [5]. Niewykluczone, że z tego powodu, kwercetyna do tej pory nie została dopuszczona jako barwnik do barwienia żywności. Celem podjętych badań była ocena wpływu kwercetyny na metabolizm fibroblastów w aspekcie oceny stresu oksydacyjnego spowodowanego obecnością etanolu w pożywce komórek. Materiał i metody Badania przeprowadzono na hodowlach pierwotnych fibroblastów izolowanych ze skóry mysiej. Fibroblasty izolowano metodą trypsynowania tkanki [6] ze skóry pochodzącej z ogona i brzucha 60 dniowych myszy, szczepu Balb c, pochodzących z Centrum Medycyny Doświadczalnej Śląskiego Uniwersytetu Medycznego. Na przeprowadzenie badań uzyskano zgodę Komisji Bioetycznej. Fibroblasty hodowane były w kolbach do hodowli ko- 28