Key words: fibroblasts, cell culture, SOD isoenzymes, lipid peroxidation, MDA

Transkrypt

1 Streszczenie Silikon i jego różne formy znajduje szerokie zastosowanie w medycynie i kosmetologii. Służy on między innymi do wyrobu cewników, drenów, protez małych stawów, protez stosowanych do ubytków kostnych i chrzęstnych w obrębie twarzy, ekspanderów tkankowych, czy żeli pomocnych w leczeniu blizn przerostowych i bliznowców. Silikony mają niski współczynnik rozpuszczalności, co powoduje że są one praktycznie nierozpuszczalne w fazach wodnych lub organicznych. Działanie silikonu w organizmie nie powinno być związane ze stresem oksydacyjnym i peroksydacją lipidów. Nie wiadomo jednak, czy w badaniach na hodowlach komórkowych in vitro silikon może generować reaktywne związki tlenu (RZT). Celem pracy było określenie czy wprowadzenie do hodowli linii MRC5 silikonu wpływa na dynamikę zmian aktywności wybranych izoenzymów układu stresu oksydacyjnego oraz peroksydację lipidów w komórkach linii MRC 5. Badania przeprowadzono stosując jedną dawkę silikonu w trzech przedziałach czasowych na hodowli komórek fibroblastów linii MRC5. Hodowlę prowadzono w standartowych warunkach temperatury i atmosfery wzbogaconej w dwutlenek węgla. W mediach komórkowych oznaczano aktywności dysmutazy ponadtlenkowej (SOD) i jej izoenzymów (MnSOD i Cu/ZnSOD) oraz stężenie dialdehydu malonowego, jako markera peroksydacji lipidów. Uzyskane wyniki sugerują wpływ silikonu na układ pro/ antyoksydacyjny, poprzez spadek stężenia MDA i wzrost aktywności izoenzymów SOD. Slowa kluczowe: fibroblasty, hodowla komórkowa, izoenzymy SOD, peroksydacja lipidów, MDA Summary Silicone and its different forms are widely used in medicine and cosmetology. It is used, among others, for production of catheters, drains, prostheses of small joints, prostheses used in bone and chondral fillings within the face, tissue expanders, or gels useful in treatment of hypertrophied scars and keloids. Silicones possess a low coefficient of solubility, which makes them practically insoluble in water or organic phases. The silicone action in an organism should not be correlated with oxidative stress and lipid peroxidation. However, it is unknown, if silicon can generate the radical oxygen species (ROS) in cell cultures in vitro. The aim of this work was to study if introduction of silicone to MRC5 cell culture can influence dynamics of selected isoenzymes of the oxidative stress system and lipid peroxidation in MRC 5 cell line. The study was performed using one dose of silicone in three time intervals in the fibroblast cell line MRC5. The culture was carried out in the standard temperature conditions and in the atmosphere saturated with carbon dioxide. Activities of superoxide dismutase (SOD) and its isoenzymes (MnSOD and Cu/ZnSOD) were titrated in cell media as well as concentration of malonate aldehyde, as a marker of lipid peroxidation was measured. The results suggest an inhibitory effect of silicone upon pro/antioxidative system by decreasing MDA concentration and by increasing SOD isoenzymes activities. Key words: fibroblasts, cell culture, SOD isoenzymes, lipid peroxidation, MDA

2 Silikon i jego różne formy znajduje szerokie zastosowanie w medycynie i kosmetologii. Służy on między innymi do wyrobu cewników, drenów, protez małych stawów, protez stosowanych do ubytków kostnych i chrzęstnych w obrębie twarzy, ekspanderów tkankowych, czy żeli pomocnych w leczeniu blizn przerostowych i bliznowców. Silikony mają niski współczynnik rozpuszczalności, co powoduje że są one praktycznie nierozpuszczalne w fazach wodnych lub organicznych [1] Oleje silikonowe czyli polidimetylosiloksany (PMDS) to podstawowa grupa, która posłużyła za punkt wyjścia do modyfikacji. Silikony medyczne to rodzina związków krzemoorganicznych zbudowanych z różnej długości łańcuchów dimetylsiloksanu. Jest to najlepiej przebadany materiał stosowany do produkcji różnego rodzaju implantów. Miejscowe opatrunki z żelu silikonowego są stosowane od 1982 roku. Dokładny mechanizm terapeutyczny oddziaływania żelu silikonowego nie jest znany. Znaczenie przypisuje się zjawisku okluzji, zmniejszającemu powierzchniową utratę wody i w ten sposób zwiększające uwodnienie tkanek. Działanie opatrunku silikonowego porównuje się do funkcji jaką w normalnych warunkach pełni warstwa rogowa naskórka. Przyjmuje się że ogranicza ono proces angiogenezy, zmniejsza ilość mediatorów zapalnych oraz syntezę kolagenu i GAG-ów przez fibroblasty. Ponieważ podobny efekt okluzji można osiągnąć poprzez stosowanie innych opatrunków, co jednak nie oddziałuje tak pozytywnie jak działanie silikonu, z pewnością istnieją jeszcze inne dodatkowe mechanizmy. Być może jednym z nich jest oddziaływanie negatywnych ładunków elektrycznych gromadzących się na powierzchni opatrunków silikonowych, a tworzących się na skutek wywieranego na niego tarcia [1,2]. Stosowanie opatrunków silikonowych winno zostać zarekomendowane zarówno w profilaktyce jak i zachowawczym leczeniu zarówno bliznowców jak i blizn przerostowych jako prosta, bezpieczna i efektywna metoda. W przypadku już istniejących blizn przerostowych i bliznowców winno być terapią pierwszego rzutu. Działanie silikonu w organizmie nie powinno być związane ze stresem oksydacyjnym i peroksydacją lipidów. Nie wiadomo jednak, czy w badaniach na hodowlach komórkowych in vitro silikon może generować reaktywne związki tlenu (RZT) takie jak nadtlenek wodoru, tlen atomowy, anionorodnik ponadtlenkowy i rodnik hydroksylowy. Teoria uwolnienia patologicznych procesów na poziomie komórki z pobudzeniem nadmiernego wydzielania cytokin zapalnych i niszczącego działania wolnych rodników tlenowych jest jedynie potwierdzeniem uogólnionego i miejscowego procesu zapalnego. Występują one w różnorakich urazach. W tworzeniu się bliznowców i blizn przerostowych żadna z teorii osobno nie jest wystarczająca do wyjaśnienia patomechanizmu ich powstawania. Połączenie ich razem też jeszcze nie wyjaśnia wszystkich zjawisk. [1,2]. Organizmy żywe posiadają mechanizmy antyoksydacyjne, które w warunkach fizjologicznych osłaniają przemiany ustrojowe przed działaniem wolnych rodników. Należą do nich układy enzymatyczne, oraz nieswoiste antyoksydanty (witamina A, E, C, selen, nienasycone kwasy tłuszczowe, acetylocysteina, glutation i inne). Do enzymów antyoksydacyjnych zaliczamy: dysmutazę ponadtlenkową (SOD) i jej izoenzymy (MnSOD i Cu/ZnSOD), katalazę (CAT) oraz enzymy związane z przemianami glutationu: peroksydazę glutationową (GSH-Pox), transferazę glutationową (GST). Wskaźnikiem peroksydacji lipidów jest stężenie dialdehydu malonowego (MDA) [3,4,5]. Ze względu na nie w pełni poznany wpływ silikonu na procesy zachodzące podczas tworzenia blizn, istotne jest poszukiwanie molekularnych zmian indukowanych silikonem, mających wpływ na proces tworzenia blizn. Celem pracy było określenie czy wprowadzenie do hodowli fibroblastów linii MRC5 silikonu w zastosowanej dawce i przedziałach czasowych wpływa na dynamikę zmian aktywności izoenzymów dysmutazy ponadtlenkowej: MnSOD i Cu/ZnSOD, jako enzymów układu stresu oksydacyjnego oraz peroksydację lipidów, na podstawie zmian stężenia MDA w medium hodowlanym komórkach linii MRC 5. Badania przeprowadzono stosując jedną dawkę silikonu w trzech przedziałach czasowych. W eksperymencie wykorzystano hodowlę komórek fibroblastów in vitro w postaci kolonii. Linia hodowlana fibroblastów MRC5 pochodziła z banku komórek w Instytucie Onkologii w Gliwicach. W układzie kolonii, komórki pozostają w stałym kontakcie ze sobą i z podłożem. Płaski charakter kolonii umożliwia łatwy dostęp płynu odżywczego do komórek, co w efekcie daje możliwość długotrwałego prowadzenia hodowli bez potrzeby wykonywania kolejnych pasaży. Jest to niezwykle istotne dla prowadzenia badań np. w określeniu dynamiki wzrostu komórek. Hodowlę prowadzono w standartowych warunkach temperatury i atmosfery wzbogaconej w dwutlenek węgla. Jako podłoże hodowlane stosowano roztwór Dulbeco s z L-glutaminą, wzbogacone wołową surowicą płodową. Hodowlę prowadzono w butelkach hodowlanych firmy Sarsedt o powierzchni 75cm² [6]. Badane kolonie podzielono na następujące grupy eksperymentalne: 1. kontrole: K24, K72, K5d - dla każdej grupy czasowej była grupa kontrolna (dla 24 h, 72 h, 5 dni); medium bez zawartości silikonu 2. grupa badana 1 (B24) - komórki poddane działaniu silikonu 24 godz. 3. grupa badana 2 (B72) - komórki poddane działaniu silikonu 72 godz. 4. grupa badana 3 (B5d) - komórki poddane działaniu silikonu 5 dni. Na podstawie piśmiennictwa i badań pilotażowych w eksperymencie zastosowano dawkę silikonu 2,2 mg/ml medium hodowlanego. W mediach badanych kolonii oznaczano: 1. aktywność dysmutazy ponadtlenkowej (SOD) [EC ] 2. aktywność izoenzymów SOD:

3 a) mitochondrialnego (MnSOD) b) cytoplazmatycznego (Cu/ZnSOD) wg. metody Oyanagui [7], wykorzystując ich różną podatność na inhibicję cyjankiem potasu. Aktywność enzymów wyrażono w NU/ml medium (NU- Jednostka Nitrowa, jest to taka ilość enzymu, która rozkłada w jednostce czasu 50% ilości powstającego rodnika ponadtlenkowego). 3. stężenie dialdehydu malonowego (MDA), jako markera peroksydacji lipidów, wykorzystując jego reakcje z kwasem tiobarbiturowym wg. metody Ohkawy [8]. Stężenie MDA odczytano z krzywej standardowej (1,1,3,3-tetraetoksypropan) i wyrażono w μmolach MDA/ml medium hodowlanego. Analizę statystyczną przeprowadzono w oparciu o program StatSoft, Inc. (2001). STATISTICA (data analysis software system), version 6. Oceniono normalność rozkładu uzyskanych wyników we wszystkich badanych grupach (grupy kontrolne; grupy badane traktowane silikonem) stosując test Shapiro-Wilka. Ponieważ niektóre analizowane parametry nie miały rozkładów normalnych, dla oceny różnic pomiędzy poszczególnymi grupami zastosowano test nieparametryczny U Mann-Whitney a, natomiast dla pozostałych do oceny różnicy pomiędzy badanymi grupami wykorzystano test t- Studenta, przyjmując poziom istotności p<0.05. Porównano aktywność SOD [NU/ml] w medium komórkowym hodowli linii MRC5 poddanych działaniu silikonu i komórek tej samej linii nie poddanych działaniu silikonu, po upływie 24h, 72h i 5 dni. Po 24h zaobserwowano znamienny statystycznie wzrost aktywności SOD w grupie badanej w stosunku do grupy kontrolnej. Po 72h i 5 dniach eksperymentu aktywność enzymu w grupach badanych spadla istotnie statystycznie w stosunku do grup kontrolnych. Stwierdzono najniższą aktywność SOD zarówno w przypadku grup kontrolnych, jak i grup badanych po upływie 5 dni eksperymentu (Ryc.1). Ryc. 2. Aktywność MnSOD [NU/ml] w mediach komórkowych linii MRC5 poddanych działaniu silikonu przez 24h, 72h i 5 dni eksperymentu Aktywności Cu/ZnSOD [NU/ml] w mediach komórkowych linii MRC5 poddanych działaniu silikonu i w grupach kontrolnych, nie poddanych działaniu silikonu przez 24h, 72h i 5 dni była istotnie statystycznie wyższa w grupach badanych aniżeli w grupach kontrolnych. Najwyższą aktywność Cu/ZnSOD stwierdzono w grupie badanej po 24 h eksperymentu, a najniższą w grupie kontrolnej oraz grupie badanej po 5 dniach eksperymentu (Ryc.3). Ryc. 3. Aktywność Cu/ZnSOD [NU/ml] w mediach komórkowych linii MRC5 poddanych działaniu silikonu przez 24h, 72h i 5 dni eksperymentu Stężenie MDA w medium komórkowym grup badanych linii MRC5 pod wpływem silikonu po upływie 24h, 72h i 5 dni było istotnie statystycznie niższe aniżeli w grupach kontrolnych. Stwierdzono najniższą wartość oznaczanego parametru po upływie 5 dni a najwyższą po 24h ekspozycji na silikon (Ryc.4). Stwierdzono istotną statystycznie różnicę pomiędzy stężeniem dialdehydu malonowego po 24h i po 5 dniach eksperymentu (p=0.043; test t-studenta dla prób zależnych). Ryc. 1. Aktywności SOD [NU/ml] w mediach komórkowych linii MRC5 poddanych działaniu silikonu przez 24h, 72h i 5 dni eksperymentu (p<0,05 vs.k) Porównano aktywności MnSOD [NU/ml] w grupach badanych MRC5 poddanych działaniu silikonu i grupach kontrolnych, nie poddanych działaniu silikonu przez 24h, 72h i 5 dni. Zaobserwowano istotny statystycznie spadek aktywności oznaczanego enzymu w grupach badanych w stosunku do grup kontrolnych. Stwierdzono najniższą aktywność MnSOD zarówno w przypadku grup kontrolnych, jak i badanych po upływie 72h eksperymentu. (Ryc.2). Ryc. 4. Stężenie MDA [μmol/l] w mediach komórkowych linii MRC5 poddanych działaniu silikonu przez 24h, 72h i 5 dni eksperymentu Hodowle komórkowe i tkankowe in vitro są bardzo dogodną i rozpowszechnioną formą prowadzenia badań naukowych. Dzięki nim można dokonać oceny aktywności

4 i stężenia produktów przemian biochemicznych wybranych szlaków metabolicznych [9]. Nowatorskim przedsięwzięciem naukowym opracowanym przez dr Kummerhmera w Instytucie Badań nad Promieniotwórczością w Monachium, a zmodyfikowanym w Zakładzie Biochemii Ogólnej SUM, było prowadzenie hodowli in vitro komórek raka płaskonabłonkowego linii AT549 w postaci megakolonii [10,11]. Na podstawie przeprowadzonych badań magakolonii linii raka płaskonabłonkowego stwierdzono, że jednym z najistotniejszych antyoksydantów jest melatonina [19], zaś wolnozmienne pole elektromagnetyczne również może spełniać rolę zmiatacza wolnych rodników w zależności od zastosowanego natężenia pola i przedziału czasowego ekspozycji. Podobne badania przeprowadzono na innych liniach komórkowych, np. na fibroblastach mysich 3T3L [20,21]. Hodowle komórkowe i tkankowe mogą być prowadzone na różnych liniach in vitro: nowotworowych, limfocytach, hepatocytach, itp. [12,13,14,15]. Szczególnie rozpowszechnione są prace dotyczące badań na fibroblastach, np. badania wpływu histaminy na fibroblasty, czy pochodnych kolagenu [16]. W dostępnym piśmiennictwie wiele prac poświęconych jest wpływowi silikonu na fibroblasty zarówno w układzie in vivo jak i in vitro. Doniesienia te, jednak dotyczą badań klinicznych, pooperacyjnych pacjentów (rola silikonu w przeszczepach, czy reakcji organizmu pacjentów) [17], natomiast nie ma prac zajmujących się problematyką przemian biochemicznych ukladów biologicznych in vitro pod wplywem oddziaływania silikonu. W badaniach in vitro natomiast, zajęto się przede wszystkim zmianami molekularnymi wpływającymi na zachowanie mobilności komórki [18]. Nie znaleziono jednak prac dotyczących dynamiki zmian aktywności enzymów antyoksydacyjnych, w tym izoenzymów SOD, oraz wskaźników peroksydacji lipidów (MDA) fibroblastów hodowanych in vitro, eksponowanych na działanie silikonu. Dlatego przeprowadzono badania dotyczące tego tematu. Stwierdzono, że silikon, preparat szeroko stosowany w medycynie, w zastosowanej dawce i przedziałach czasowych, powoduje zaburzenia w procesach oksydoredukcyjnych badanej linii fibroblastów MCR5, hodowanej in vitro. W świetle opublikowanych danych literaturowych istnieją sprzeczne doniesienia dotyczące udziału wolnych rodników w patomechanizmie toksycznego działania silikonu. Mechanizmy antyoksydacyjne, które posiadają organizmy żywe, w tym także hodowle komórkowe prowadzone in vitro, osłaniają przemiany ustrojowe przed działaniem wolnych rodników. Należą do nich przede wszystkim układy enzymatyczne. Dysmutaza ponadtlenkowa i jej izoenzymy są właśnie przedstawicielami tej grupy enzymatycznej. SOD jest enzymem występującym we wszystkich organizmach żywych, przede wszystkim w jądrze komórkowym i lizosomach. Kompleksowe związanie z wchodzących w skład enzymów jonów metali prowadzi do jego dezaktywacji [19]. Natomiast MDA, jako wskaźnik peroksydacji lipidów, pozwala określić nasilenie procesów peroksydacyjnych zachodzących w organizmie żywym [20]. W przeprowadzonych badaniach nasilenie peroksydacji lipidów dotyczyło procesów wolnorodnikowych zachodzących w medium hodowlanym komórek fibroblastów linii MRC5. Podsumowując, należy zwrócić uwagę, jak istotnym zagadnieniem wydaje się być oddziaływanie silikonu na przemiany metaboliczne komórek fibroblastów in vitro, w tym aktywności enzymów układu stresu oksydacyjnego oraz markerów peroksydacji lipidów. W przeprowadzonym eksperymencie stwierdzono wyraźny wpływ silikonu na procesy przemian biochemicznych komórek linii MRC 5. Aczkolwiek biorąc pod uwagę mechanizmy życiowe omawianych układów biologicznych, problem ten nie uwzględnia wielu elementów i wymaga dalszych badań. Także z zakresu innych dziedzin, jak chociażby związku pomiędzy mechanizmem działania silikonu a ekspresją genów badanych komórek in vitro. W warunkach przeprowadzonego eksperymentu, pod wpływem zastosowanej dawki silikonu i przedziałach czasowych stwierdzono, że dochodzi do zaburzeń układu pro/ antyoksydacyjnego komórek fibroblastów linii MRC5 hodowanych in vitro. Można jednak przyjąć, że silikon stosowany w dawkach leczniczych jest preparatem bezpiecznym. Aczkolwiek wyniki badań sugerują, że nadużywanie preparatów silikonowych może ujemnie wpływać na metabolizm komórkowy organizmu. Piśmiennictwo 1. Gajos A. Silikony, Farmakoterapia, 2008, mat.inern.: Mitchel P. Goldman R.E. Fitzpatrick RG. i wsp., Instrumentation for cosmetic surgery. Clinics in Dermatology, 1988, 6(3), Basaga H.S.: Biochemical aspects of free radicals. Biochem. Cell. Biol., 1990; 68: Hagar J.M., Hale S.L., Ilvento J.P., i wsp.: Lack of significant effects of superoxide dismutase and catalase on development of reperfussion arrytmias. Basic Res. Cardiol., 1991; 86: Senga S., Onituka A., Hirose H.: Protective effect of liposomal encapsulated superoxide dismutase on ischemically injured liver in the rat. Transplantation Proccedings, 1990; 22(4): Polaniak R., Birkner E., Beck B., i wsp: Ocena aktywności wybranych enzymów przemian metabolicznych w medium hodowlanym komórek AT478 in vitro pod wplywem cisplatyny i wolnozmiennego pola magnetycznego. Diagn.Lab., 2006, 42: Oyanagui Y.: Reevaulation of assay methods and estabilishment of kit for superoxide dismutase activity. Analyt. Biochem., 1984; 142: Ohkawa H., Ohishi N., Kunio Y.: Assay for peroxides in animal tissues by thiobarbiruric acid reaction. Annal. Biochem., 1979; 95: Przybyszewski W., Wideł M., Polaniak R. i wsp.: Contrasting effects of low vs high dose-rate radiation on lipid peroxidation, DNA damage, and antioxidant enzyme activities in tumor cells. Progress in Medical Research, 2005; 3: 12.

5 10. Polaniak R., Birkner E., Kasperczyk S. i wsp.: Wplyw holoksanu na aktywność dehydrogenazy mleczanowej w medium megakolonii raka plaskonablonkowego in vitro. Farm.Przegl.Nauk., 2006, 1: Tarnawski R., Kummermehr J., Trott K.R.: The radiosensitivity of recurrent clones of a irradiated murine squamous cell carcinoma in the in vitro megacolony system. Radiotherapy & Oncology, 1998, 46: Partchment R.E., Gordon M., Grieshaber C.K. i wsp.: Predicting hematological toxicity (myelosuppression) of cytotoxic drug therapy from in vitro test. Annales of Onkology, 1998; 9 (4): Tabata M.J., Matsumura T., Liu J.G. i wsp.: Expression of cytokeratin 14 in ameloblast-lineage cells of the developing tooth of rat, both in vivo and in vitro. Archivesof Oral Biology, 1998; 46 (2): Takeda T., Goto H., Arisawa T.: Effect of histamine on human fibroblast in vitro. Arzneimittel-Forschung, 1997, 47(10): Waked W, Grauer J.: Silicates and bone fusion. Orthopedics. 2008, 31(6): McCauley RL, Riley WB Jr, Juliano RA, i wsp.: In vitro alterations in human fibroblast behavior secondary to silicone to silicone polymers. J.Surg.Res., 1990, 49(1): Przybyszewski W., Wideł A., Szurko A., LubeckaB., Matulewicz Ł, Manikowski Z., Polaniak R. et al.: Multiple bystander effect of irradiated megakolonies of melanoma cells on non-irradiated neighbours. Conser Letters, 2004, 214 (1): Tetsuya O., Masayasu I., Yukio A. i wsp.: Chemical modification of superoxide dismutase Extension of plasma half life of the enzyme through its reversible binding to the circulating albumin. Int.J. Peptide and Protein Res., 2009, 32(2); Żwirska-Korczala K., Adamczyk-Sowa M., Polania R., et al.: Influence of extremely-low-frequency magnetic field on antioxidative melatonin properties in AT478 murine squamous cell carcinoma culture. Biol. Trace. Elem. Res. 2004, 102: Żwirska-Korczala M., JochemJ., Adamczyk-Sowa M., et al.:effect of extremely low frequency electromagnetic fields on cell proliferation, antioxidative enzymes activities and lipid peroxidation in 3T3-L1 preadipocytes - an in vitro study. J.Physiol.Pharm., 2005, 56: Torres-Duran PV., Ferreira-Hermosillo A., Juarez- Oropeza MA.: Effects of whole body exposure to extremely low frequency electromagnetic fields (ELF-EMF) on serum and liver lipid levels, in the rat. Lipids Health Dis., 2007, 16: Adres do korespondencji: Dr Renata Polaniak Zakład Biochemii Ogólnej SUM ul. Jardana 19; Zabrze Tel.: 32/ rpolaniak@sum.edu.pl