Niedobór antytrombiny problemy diagnostyki laboratoryjnej

Transkrypt

1 diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics 2013 Volume 49 Number Praca poglądowa Review Article Niedobór antytrombiny problemy diagnostyki laboratoryjnej Antithrombin deficiency diagnostic difficulties 1 Magdalena Szymańska, 1,2 Ewa Wypasek, 1,2 Anetta Undas 1 Ośrodek Nowoczesnej Diagnostyki Laboratoryjnej, Pracownia Biologii Molekularnej, Krakowski Szpital Specjalistyczny im. Jana Pawła II, Kraków, 2 Instytut Kardiologii Collegium Medicum Uniwersytetu Jagiellońskiego, Kraków Streszczenie Antytrombina jest najważniejszym endogennym inhibitorem procesu krzepnięcia. Niedobór antytrombiny może mieć charakter nabyty lub wrodzony. Wrodzony niedobór występujący w populacji ogólnej z częstością ok. 0,02-0,17% jest schorzeniem dziedziczonym w sposób autosomalny dominujący i związany jest z wysokim ryzykiem wystąpienia żylnej choroby zakrzepowozatorowej. Wyróżniamy 2 typy wrodzonego niedoboru antytrombiny: typ I określany jako niedobór ilościowy i typ II niedobór jakościowy. Typ I niedoboru polega na zmniejszeniu syntezy nieprawidłowego białka, co prowadzi do spadku aktywności i stężenia antytrombiny w osoczu (zazwyczaj poniżej 75%). Typ II niedoboru polega na spadku aktywności antytrombiny przy normalnym stężeniu antygenu, sytuacja ta jest spowodowana obecnością w krążeniu dysfunkcjonalnego białka. W diagnostyce laboratoryjnej w celu wykrycia niedoboru antytrombiny jako pierwszy stosuje się test aktywności. Test ten stosowany jest jako test przesiewowy, ponieważ aktywność antytrombiny obniżona jest w obu typach niedoboru. Aby potwierdzić istnienie niedoboru i określić jego typ należy wykluczyć wszystkie nabyte przyczyny i ocenić stężenie antygenu antytrombiny w osoczu pacjenta z zastosowaniem odpowiedniej metody immunologicznej, gdy wynik testu funkcjonalnego jest obniżony. Molekularna analiza genu antytrombiny obejmuje bezpośrednie sekwencjonowanie uzupełniane metodą MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification). Po przeprowadzonej analizie molekularnej, która nie wykazała obecności mutacji zastosowanie dodatkowych technik elektroforetycznych daje możliwość rozpoznania nowej postaci niedoboru antytrombiny związanej z nieprawidłową glikozylacją cząsteczki antytrombiny. Diagnostyka laboratoryjna pacjentów z idiopatyczną żylną chorobą zakrzepowo-zatorową zwłaszcza przy dodatnim wywiadzie rodzinnym powinna obejmować test aktywności antytrombiny i w przypadku obniżonego wyniku kolejne testy potwierdzające i określające typ niedoboru, ponieważ przewlekła antykoagulacja jest wskazana w takiej trombofilii po pierwszym epizodzie żylnej choroby zakrzepowo-zatorowej. Summary Antithrombin is the main endogenous anticoagulant of blood coagulation. Antithrombin deficiency could be acquired or congenital. Inherited antithrombin deficiency with the prevalence of % in the general population is an autosomal dominant disorder associated with a high risk of venous thromboembolism (VTE). There are two types of antithrombin deficiency - type I - quantitative deficiency and type II qualitative deficiency. Type I of the deficiency results from decreased synthesis of abnormal protein leading to reduced activity and antigen level (usually below 75% of the reference values). Type II antithrombin deficiency results from reduction in antithrombin activity and normal antigen levels due to the presence of a circulating dysfunctional antithrombin variant. In the laboratory evaluation to diagnose antithrombin deficiency the recommended first test is the measurement of antithrombin activity. This is a screening test since antithrombin activity is reduced in both types of antithrombin deficiency. To confirm the deficiency and characterize its type all acquired causes should be excluded and antithrombin antigen levels in plasma should be determined using an appropriate immunological assay, if a functional test yields a lower value. Molecular analysis of the antithrombin gene involves direct gene sequencing with in some cases multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA).If the molecular analysis fails to detect a mutation, the use of additional electrophoretic analysis makes it possible to identify a new type of antithrombin deficiency resulting from abnormal glycosylation of the antithrombin molecule. Diagnostic evaluation of patients with idiopathic VTE, particularly those with a positive family history, should include antithrombin activity testing and if reduced further confirmation tests and those identifying the precise type of antithrombin deficiency, since life-long anticoagulation is recommended in this thrombophilia after the first VTE episode. 145

2 Niedobór antytrombiny problemy diagnostyki laboratoryjnej Słowa kluczowe: mutacje SERPINC1, niedobór antytrombiny, żylna choroba zakrzepowo-zatorowa Key words: antithrombin deficiency, SERPINC1 mutation, venous thromboembolism Antytrombina: synteza, budowa i czynność Antytrombina (AT), jednołańcuchowa glikoproteina o masie 58 kda, jest najważniejszym endogennym inhibitorem procesu krzepnięcia. Należy do nadrodziny białek określanych jako inhibitory proteaz serynowych. Syntetyzowana jest głównie w wątrobie, ale również w komórkach endotelialnych, megakariocytach i płytkach krwi. W warunkach fizjologicznych AT występuje w osoczu w stężeniu mg/l. Antykoagulacyjna aktywność antytrombiny polega na inaktywacji trombiny i aktywnego czynnika X, w mniejszym stopniu także czynnika IXa, XIa i XIIa, a ponadto AT spełnia również funkcje inhibitora czynnika VIIa związanego z czynnikiem tkankowym [1]. Poza działaniem antykoagulacyjnym AT wykazuje również działanie przeciwzapalne [2]. Poprzez hamowanie trombiny i cz. Xa AT redukuje zależne od tych czynników uwalnianie cytokin prozapalnych (IL-6, IL- 8). Ponadto przez wiązanie z siarczanem heparanu na komórkach śródbłonka naczyń, AT stymuluje uwalnianie przez te komórki prostacykliny, przez co pośrednio odgrywa rolę w hamowaniu agregacji płytek i ich aktywacji. Dodatkowo niezwiązana z heparyną AT ma zdolność hamowania aktywności elastazy, endopeptydazy uwalnianej w reakcji zapalnej, odpowiedzialnej za uszkodzenie ścian naczyń krwionośnych [1]. Gen antytrombiny (SERPINC1) zlokalizowany jest na długim ramieniu chromosomu 1 (q23-25) i składa się z 7 egzonów i 6 intronów [1]. Opisano ponad 200 defektów molekularnych genu AT warunkujących niedobór tego białka antykoagulacyjnego [3]. Dojrzałe białko AT składa się z 432 aminokwasów, 6 z nich to cysteiny formujące 3 mostki dwusiarczkowe. AT syntetyzowana jest z 32-aminokwasowym peptydem sygnałowym kierującym białko AT na szlak sekrecyjny. AT posiada dwie funkcjonalne domeny: centrum reaktywne i domenę odpowiedzialną za wiązanie glikozaminoglikanów. Argininowe centrum reaktywne zlokalizowane jest na C-końcu białka AT i działa jak pseudo-substrat dla centrum reaktywnego proteaz serynowych, tworząc nieodwracalny kompleks (T-AT), szybko usuwany z krążenia przez układ siateczkowo-śródbłonkowy [4]. Domena odpowiedzialna za wiązanie glikozaminoglikanów zlokalizowana jest w N-terminalnej części białka AT. W warunkach fizjologicznych antytrombina wykazuje niską aktywność antykoagulacyjną. Podawana egzogennie heparyna oraz naturalne glikozaminoglikany występujące na powierzchni śródbłonka naczyń zwiększają aktywność inhibitorową AT około 1000 razy. Heparyna wiążąc się z AT powoduje zmiany konformacyjne w cząsteczce AT polegające na odsłonięciu argininowego centrum aktywnego, co umożliwia interakcję z centrum aktywnym proteaz serynowych. Hamowanie trombiny przez AT wymaga utworzenia kompleksu pomiędzy AT, trombiną i heparyną dłuższą niż 18 jednostek cukrowych (w tym zawierających specyficzną sekwencję pentasacharydową), podczas gdy hamowanie cz.xa przez AT jest nasilane tylko przez związanie sekwencji pentasacharydowej heparyny z AT [5]. Glikozylacja jest jedyną potranslacyjną modyfikacją cząsteczki AT, która polega na przyłączaniu wiązaniem glikozydowym bocznych łańcuchów cukrowych do reszt kwasu asparaginowego w następujących pozycjach: Asn95, Asn135, Asn155 i Asn192. Taka glikozylowana AT stanowi 90% krążącej AT i określana jest jako α-at. Pozostałe 10% krążącej AT nie podlega glikozylacji w pozycji Asn135. Jest to β-at, która wykazuje większe powinowactwo do heparyny, jednak jej fizjologiczna rola pozostaje niejasna [6]. Niedobory antytrombiny Klasyfikacja niedoboru AT Niedobór AT może mieć charakter nabyty lub wrodzony. Nabyty niedobór AT (tabela nr I) towarzyszy wielu stanom klinicznym i może być wynikiem zaburzonej syntezy (w przebiegu chorób wątroby), a także nadmiernej utraty białka AT (w zespole nerczycowym). Obniżenie aktywności AT może być również efektem zużycia tego białka antykoagulacyjnego w czasie ostrej fazy incydentu zakrzepowego i w zespole rozsianego wykrzepiania wewnątrznaczyniowego (DIC). Warto zaznaczyć, że stężenie AT w osoczu noworodków jest fizjologicznie mniejsze niż u dorosłych [1, 7]. Na podstawie wyników badań laboratoryjnych, określających zarówno aktywność jak i stężenie antygenu AT, wyróżniamy 2 typy wrodzonego niedoboru AT: typ I określany jako nie- Tabela I. Nabyte przyczyny niedoboru AT [1,7]. Kategoria Przyczyny niedoboru Choroby wątroby Obniżona synteza AT U wcześniaków i noworodków Niedożywienie Zespół nerczycowy Nadmierna utrata AT Dializoterapia Enteropatia z utratą białka Sepsa z DIC Ostra faza epizodu zakrzepowego Urazy wielonarządowe Rozległe oparzenia Choroba zarostowa żył wątrobowych Zwiększone zużycie/ Zakrzepowa mikroangiopatia inaktywacja AT Operacja z zastosowaniem krążenia pozaustrojowego Choroby nowotworowe Zastosowanie pozaustrojowego natlenowania krwi Czynniki farmakologiczne indukujące Terapia heparyną Terapia L-asparaginazą spadek AT Długotrwała terapia estrogenami 146

3 dobór ilościowy i typ II niedobór jakościowy. Typ I niedoboru polega na zmniejszeniu syntezy nieprawidłowego białka, co prowadzi do spadku aktywności i stężenia AT w osoczu. Typ II niedoboru polega na spadku aktywności AT przy normalnym stężeniu białka AT, sytuacja ta jest spowodowana obecnością w krążeniu dysfunkcjonalnego białka. W obrębie jakościowego defektu wyróżniono 3 podtypy. Podtyp II-RS (reactive site) jest wynikiem mutacji w obrębie centrum reaktywnego AT i wiąże się z dużym ryzykiem wystąpienia zakrzepicy. Kolejny podtyp II-HBS (heparyn binding site) obejmuje mutacje w obrębie domeny wiążącej heparynę, a ryzyko wystąpienia epizodów zakrzepowych jest najniższe. Podtyp II-PE (pleiotropic effect) obejmuje plejotropową grupę mutacji przy C-końcu w białku AT, które są przyczyną upośledzenia jej funkcji, ale również powodują obniżenie stężenia antygenu AT w osoczu poprzez wpływ na strukturalną integralność i stabilność białka AT [8]. Wrodzony niedobór AT jest schorzeniem dziedziczonym w sposób autosomalny dominujący. Większość chorych to heterozygoty. Homozygoty występują bardzo rzadko. Opisano homozygoty z mutacją w obrębie domeny wiążącej heparynę (podtyp II-HBS niedoboru AT), u których zakrzepica żylna lub tętnicza może pojawić się już w okresie noworodkowym [4, 9]. Epidemiologia i objawy kliniczne Niedobór AT został opisany najwcześniej ze wszystkich niedoborów białek antykoagulacyjnych już w 1965 roku [10] i związany jest z najwyższym ryzykiem rozwoju żylnej choroby zakrzepowo-zatorowej (ŻChZZ) w porównaniu z pozostałymi inhibitorami sięgającym 50%, a ryzyko to wzrasta wraz z wiekiem [11]. Z badań epidemiologicznych wynika, że wrodzony niedobór AT jest rzadkim defektem genetycznym i występuje w populacji ogólnej z częstością ok. 0,02-0,17% [12]. Wrodzony niedobór AT jest genetycznie uwarunkowanym stanem nadkrzepliwości (trombofilią) predysponującym do wystąpienia ŻChZZ, definiowanej jako zakrzepica żył głębokich (ZŻG) i/lub zatorowość płucna (ZP). Wśród pacjentów z potwierdzoną klinicznie ŻChZZ niedobór AT stwierdza się u ok. 0,5-4,9% osób [13]. Typ II niedoboru AT występuje częściej w populacji ogólnej, ale typ I niedoboru AT wykryto u ok. 80% pacjentów z ŻChZZ [1]. ZŻG w niedoborze AT najczęściej dotyczy kończyn dolnych, poza tym może wystąpić w nietypowej lokalizacji np. w zatokach żylnych mózgu, żyłach nerkowych, krezkowych i żyłach głębokich kończyn górnych [1, 11]. Opisywano również pacjentów z niedoborem AT, u których występowało nawracające zapalenie żył powierzchownych kończyn dolnych [14]. Niedobór AT może odgrywać również rolę w patogenezie zakrzepicy tętniczej najczęściej w postaci udarów niedokrwiennych mózgu [15] i rzadko zawału serca [16]. Wystąpienie ŻChZZ u pacjentów z niedoborem AT może być samoistne lub wywołane współwystępowaniem przejściowych czynników ryzyka zakrzepowego, takich jak zabieg operacyjny (zwłaszcza ortopedyczny), długotrwałe unieruchomienie, ciąża, czy doustne środki antykoncepcyjne lub hormonalna terapia zastępcza [1]. Charakterystyczne dla dziedzicznego niedoboru AT jest wystąpienie pierwszego incydentu ŻChZZ przed 40 rokiem życia, pomimo braku czynników ryzyka. Kliniczne objawy zakrzepicy mają najczęściej tendencję do nawracania i rodzinny charakter występowania [17]. Profilaktyka i leczenie Bezobjawowe osoby z niedoborem AT powinny otrzymywać profilaktykę przeciwzakrzepową w stanach zwiększonego ryzyka zakrzepowego np. po urazie nawet w młodym wieku, zwłaszcza gdy wywiad rodzinny w kierunku ŻChZZ jest dodatni. Taka strategia dotyczy też kobiet w ciąży [18]. Leczenie pacjentów z wrodzonym niedoborem AT po pierwszym epizodzie ŻChZZ jest w większości przypadków takie jak u innych chorych, jednak taka trombofilia jest wskazaniem do przewlekłej antykoagulacji, stąd szczególne znaczenie szybkiego i pewnego rozpoznania wrodzonego niedoboru AT. Pacjenci z niedoborem AT mogą wykazywać oporność na leczenie heparyną niefrakcjonowaną i drobnocząsteczkową i wymagać ich większych dawek, aby osiągnąć efekt terapeutyczny. W przypadku konieczności przeprowadzenia zabiegu operacyjnego u chorych z dużym niedoborem AT zaleca się podanie koncentratu AT zarówno przed zabiegiem, jak i w ciągu pierwszych dni pooperacyjnych [1, 19]. Diagnostyka laboratoryjna niedoboru AT Wskazaniami do przeprowadzenia badań w kierunku niedoboru AT są: ŻChZZ w wieku poniżej lat bez wystąpienia przejściowych czynników ryzyka, nawracające incydenty ŻChZZ, zakrzepica żylna o nietypowej lokalizacji, dodatni Rycina 1. Algorytm postępowania diagnostycznego we wrodzonym niedoborze AT. Modyfikacja na podstawie Khor B i wsp. [20]. 147

4 Niedobór antytrombiny problemy diagnostyki laboratoryjnej wywiad rodzinny w kierunku ŻChZZ. Jak pokazano na rycinie 1 w diagnostyce laboratoryjnej w celu wykrycia niedoboru AT jako pierwszy stosuje się test aktywności AT metodą chromogenną. Test ten stosowany jest jako test przesiewowy, ponieważ aktywność AT obniżona jest w obu typach niedoboru [19]. Oznaczanie aktywności AT metodą chromogenną opiera się na pomiarze stopnia hamowania trombiny lub czynnika Xa (cz.xa) przez AT pochodzącą z próbki pacjenta po dodaniu heparyny. Następnie w metodzie tej wykorzystywany jest tzw. substrat chromogenny, który zawiera specyficzny peptyd połączony z barwnym związkiem, zazwyczaj jest to p-nitroanilina (p-na). Aktywne proteazy (które nie zostały zahamowane przez AT), katalizują hydrolizę wiązania peptyd p-na i uwalniają p-na, której ilość jest mierzona spektrofotometrycznie. Aktywność AT w badanej próbce jest odwrotnie proporcjonalna do intensywności zabarwienia [21]. W rutynowej diagnostyce stosowany jest częściej test z użyciem cz.xa, zamiast trombiny. Ze względu na kofaktor II heparyny, będący naturalnym inhibitorem tylko trombiny, a nie cz.xa, w teście aktywności z użyciem trombiny wyniki mogą być zawyżone. Interferencja kofaktora II heparyny w tym teście ma szczególne znaczenie u pacjentów poddanych terapii heparyną, również w przypadku leczenia hirudyną i innymi bezpośrednimi inhibitorami trombiny [22]. Istnieją jednak dane świadczące o tym, że test funkcjonalny oparty o hamowanie cz.xa jest mniej wrażliwy jeżeli chodzi o wykrycie niektórych podtypów w typie II niedoboru AT [23, 24]. Opisywane są również takie warianty AT, które mogą być wykryte jedynie przez zastosowanie więcej niż jednego testu lub przez odpowiednie modyfikacje (skrócenie czasu preinkubacji) metody pomiarowej z użyciem trombiny [25]. W testach określających aktywność AT używana jest heparyna, dlatego też wynik zależy zarówno od zdolności AT do wiązania heparyny jak i możliwości inhibicyjnych AT. Jak w każdym typie niedoboru AT, aktywność jest obniżona również w podtypie II-HBS charakteryzującym się nieprawidłowym wiązaniem heparyny. Ten podtyp może być zidentyfikowany jedynie w teście określającym aktywność AT niezależnie od zdolności wiązania heparyny z zastosowaniem cz.xa, przy całkowitym braku lub bardzo niskim stężeniu heparyny i przedłużonym czasem inkubacji (tzw. test progresywny) [26]. Większość laboratoriów wyraża aktywność AT w procentach, przedział referencyjny zazwyczaj wynosi ok %, gdzie 100% odpowiada aktywności 1 jednostki AT w 1 ml osocza referencyjnego [19]. Większość heterozygotycznych pacjentów z wrodzonym niedoborem AT ma aktywność AT w przedziale 40-60% [1]. Rekomendowane jest przeprowadzenie testu potwierdzającego na nowej próbce w przypadku uzyskania nieprawidłowej wartości w teście aktywności AT jak również gdy wynik jest na granicy normy (przedział 70-80%). Badania grupy Oldeburg pokazują, że genetycznie uwarunkowany niedobór AT udaje się potwierdzić u większości chorych z aktywnością AT <75% [27]. Aby potwierdzić istnienie niedoboru i określić jego typ w przypadku gdy wynik testu funkcjonalnego jest obniżony, należy ocenić stężenie antygenu AT w osoczu pacjenta z zastosowaniem odpowiedniej metody immunologicznej [19]. Strategia diagnostyczna wrodzonego niedoboru AT powinna uwzględnić wywiad rodzinny, a zwłaszcza nawracające epizody ŻChZZ i wykluczyć wszystkie przyczyny nabytego niedoboru (tabela nr I). W interpretacji wyników należy uwzględnić również wpływ leków na AT. Spadek stężenia AT w osoczu może pojawić się w związku z przeciwnowotworową terapią L-asparaginazą. Leczenie przeciwzakrzepowe heparyną powoduje obniżenie stężenia AT nawet do 30% poprzez nasilenie formowania nieodwracalnych kompleksów T-AT w osoczu i inaktywacji AT, dlatego zalecane jest przeprowadzenie badań po około 5 dniach od zakończenia terapii. Nie należy również oznaczać aktywności AT w świeżej zakrzepicy. Najlepiej jest wykonać oznaczenie po 3-6 miesiącach po wystąpieniu epizodu ŻChZZ [19]. Przykładowo w tabeli nr II porównano wyniki aktywności AT przeprowadzone z zastosowaniem dwóch metod. Oznaczając aktywność AT testem opartym na hamowaniu bydlęcego cz. Xa przy użyciu zestawu HemosIL Liquid Antithrombin (za pomocą analizatora ACL TOP) otrzymano wyniki niewiele poniżej dolnej granicy normy, poza wyraźnym spadkiem w przypadku pacjenta nr 4. U pacjentów, u których aktywność AT jest umiarkowanie obniżona (wynik w przedziale 70-80%) nie należy stawiać diagnozy dopóki nabyte przyczyny obniżenia aktywności AT nie zostaną wykluczone i wynik nie zostanie potwierdzony kolejnym testem przeprowadzonym najlepiej w innym laboratorium. Z zastosowaniem metody pomiaru aktywności AT opartej na hamowaniu bydlęcej trombiny z zestawu Berichrom Antithrombin III (przy użyciu analizatora Siemens) otrzymano wyższe wartości w porównaniu z wynikami z poprzedniego testu. W tym teście w celu zredukowania niespecyficznego hamowania przez inne naturalne proteazy, wykorzystano fakt, że trombina bydlęca nie wchodzi w interakcję z kofaktorem II heparyny [19]. W przypadku granicznych wyników otrzymanych pierwszą metodą w teście z bydlęcą trombiną uzyskane wyniki mieściły się w zakresach wartości referencyjnych. U pacjenta Tabela II. Porównanie wyników badań aktywności AT z zastosowaniem dwóch testów. Pacjent Inkubacja z bydlęcym cz.xa Przedział referencyjny % Aktywność antytrombiny Inkubacja z bydlęcym cz.iia Przedział referencyjny % 1 72% 87% 2 80% 79% 3 61% 81,8% 4 42% 62,8% 5 71% 80,1% 6 80% 84,2% 7 79% 83,4% 148

5 z aktywnością osoczową AT 42% znaczne obniżenie potwierdzono również w drugim teście. Różnice w wynikach uzyskanych tymi dwoma metodami mogą wynikać również z różnic w czasie inkubacji, czy też stężenia heparyny co może mieć istotny wpływ na wynik. Do ilościowego oznaczenia stężenia AT w osoczu obecnie najczęściej stosuje się nefelometryczny pomiar, który polega na rejestracji zmian zmętnienia roztworu podczas reakcji AT z komplementarnym przeciwciałem. Zwiększenie czułości testu osiąga się dzięki użyciu określonego nośnika - kuleczek lateksu, do których mogą być umocowane antygeny lub przeciwciała. Czułość tej techniki z cząsteczkami lateksu jest porównywalna z czułością metod z użyciem znaczników (enzymów, pierwiastków promieniotwórczych). Test immunoenzymatyczny ELISA pozwala na określenie stężenia antygenu AT z użyciem specyficznych przeciwciał sprzężonych z enzymem, po dodaniu odpowiedniego chromogennego substratu, enzym katalizuje reakcję, której barwny produkt można oznaczyć spektrofotometrycznie. Stężenie AT w badanym osoczu odczytuje się z krzywej wzorcowej sporządzonej dla znanych stężeń antygenu. W celu ilościowego określenia antygenu AT stosowana jest również immunodyfuzja radialna i immunoelektroforeza wg Laurella. Pierwsza metoda opiera się na pomiarze pierścienia precypitacyjnego powstałego w agarozie w wyniku interakcji między antygenem i specyficznym przeciwciałem znajdującym się w żelu. Połączeniem dwóch technik: immunodyfuzji radialnej i elektroforezy jest immunoelektroforeza wg Laurella. Jest to metoda ilościowa, w której antygen przemieszcza się w żelu umieszczonym w polu elektrycznym, zawierającym unieruchomione przeciwciała stężenie antygenu określa się na podstawie wysokości szczytów precypitacyjnych powstałych wtedy, gdy antygen zostanie w całości związany przez przeciwciała. Podsumowując należy stwierdzić, że wybór odpowiedniej techniki pomiarowej charakteryzującej się wysoką czułością i specyficznością ma kluczowe znaczenie w rozpoznaniu niedoboru AT. Diagnostyka molekularna Identyfikacja mutacji genu AT z zastosowaniem metod biologii molekularnej pozwala na potwierdzenie klinicznie rozpoznanego wrodzonego niedoboru AT, może być również pomocna w określeniu typu niedoboru i oszacowaniu ryzyka rozwoju ŻChZZ w przebiegu niedoboru AT. Analiza genetyczna nie jest stosowana w diagnostyce rutynowej. Materiałem do badań jest DNA izolowane z krwi obwodowej, dlatego krew można pobierać nawet w ostrej fazie choroby i podczas leczenia przeciwzakrzepowego. Możliwość identyfikacji zmian na poziomie DNA przynosi bezpośrednie sekwencjonowanie czyli ustalenie kolejności nukleotydów w analizowanym genie AT, zwykle metodą Sangera, polegającą na hamowaniu wydłużania nowych łańcuchów syntetyzowanych na matrycy sekwencjonowanego DNA przez dideoksyrybonukleotydy. Cykliczne sekwencjonowanie DNA pozwala bezpośrednio analizować produkt reakcji PCR. W metodzie tej końcowy proces rozdziału elektroforetycznego i detekcja uzyskanego obrazu przeprowadzane są automatycznie, a wyniki opracowywane są komputerowo [28]. Sekwencjonowane jest podstawową techniką molekularną stosowaną do identyfikacji substytucji oraz małych (kilka par zasad) delecji i insercji. Aby określić charakter zmiany przeprowadza się analizę wpływu mutacji na właściwości biologiczne białka z użyciem odpowiednich programów komputerowych oraz porównawczą analizę międzygatunkową, która umożliwia określenie stopnia ewolucyjnego konserwowania zmutowanego podstawnika [29]. Uzupełnieniem sekwencjonowania genu AT jest często analiza MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) w celu wykrycia dużych delecji obejmujących jeden lub kilka egzonów lub nawet cały gen, co w klasycznym sekwencjonowaniu nie jest możliwe. Metoda MLPA łączy w sobie takie techniki molekularne jak ligacja i PCR. W MLPA używane są specyficzne sondy hybrydyzujące do komplementarnych badanych odcinków DNA. Sondy te są konstruowane z dwóch fragmentów, które po hybrydyzacji do badanego obszaru ulegają ligacji i służą następnie jako jedna matryca dla polimerazy DNA. Po przeprowadzeniu PCR z użyciem znakowanych starterów następuje ocena ilości produktu zależna bezpośrednio od ilości matrycy, co widoczne jest jako zmiana intensywności fluorescencji podczas rozdziału w elektroforezie kapilarnej w stosunku do prób kontrolnych [30]. Niedawno odkryta nowa postać niedoboru AT wiąże się z nieprawidłową glikozylacją cząsteczki AT. Mutacja zmiany sensu w genie AT, której efektem jest zamiana kwasu asparaginowego na treoninę w pozycji 135 łańcucha peptydowego AT, zaburza proporcję pomiędzy dwoma izoformami AT występującymi w osoczu. Stężenie frakcji β-at wzrasta do ok. 30%, maskując w badaniach laboratoryjnych (wyniki na granicy normy) niedobór jakościowy i ilościowy AT [31]. Mutacje będące przyczyną niewłaściwego procesu glikozylacji AT mogą dotyczyć cząsteczki AT lub enzymów biorących udział w syntezie N-glikanów [32]. Dodatkowa analiza glikozylacji AT z zastosowaniem elektroforezy jest wskazana w przypadku gdy u pacjenta utrzymuje się obniżony poziom aktywności AT, a bezpośrednie sekwencjonowanie jak i analiza MLPA nie wykazały obecności mutacji w genie SER- PINC1. Najczęściej stosowana jest technika ogniskowania izoelektrycznego, która polega na rozdziale elektroforetycznym białek w żelach poliakrylamidowych mających odpowiedni gradient ph. Różnice w ruchliwości elektroforetycznej wynikają z odmiennego punktu izoelektrycznego (pi) nieprawidłowej izoformy AT o rożnym stopniu glikozylacji w efekcie czego występuje więcej niż jeden prążek AT. Przedstawione dane wskazują, że zastosowanie dodatkowych technik diagnostycznych po przeprowadzonej analizie molekularnej daje możliwość zwiększenia liczby rozpoznawanych przyczyn niedoboru AT. Molekularne podłoże dziedzicznego niedoboru AT Mutacje powodujące niedobór AT stanowią heterogenną 149

6 Niedobór antytrombiny problemy diagnostyki laboratoryjnej grupę. Najczęściej występują mutacje zmiany sensu polegające na zamianie pojedynczego nukleotydu w kodonie, czego konsekwencją jest zamiana aminokwasu w kodowanym białku. Tego typu mutacje w peptydzie sygnałowym AT mogą zahamować transport przez błony komórkowe i sekrecję zmutowanego wariantu AT do osocza. Efektem mutacji powodujących substytucje aminokwasów zaangażowanych w tworzenie struktur przestrzennych białka AT może być wewnątrzkomórkowa degradacja, czemu towarzyszy osoczowy niedobór AT. Mniej powszechne są mutacje nonsensowne gdzie przedwczesne wprowadzenie jednego z kodonów STOP wiąże się ze zmianą całej sekwencji białka poniżej mutacji i znacząco wpływa na jego funkcję. W niedoborze AT opisano również mutacje miejsc splicingowych w genie SERPINC1, które dotyczą specjalnych sekwencji w obrębie połączeń intron-egzon. Mutacje te mogą prowadzić do całkowitego braku prawidłowego składania mrna, czego wynikiem jest powstanie niestabilnego białka. Rzadko występują krótkie delecje i insercje powodujące przesunięcie ramki odczytu. Duże delecje stanowią jedynie niewielki odsetek wykrytych w genie AT mutacji [3]. Profil mutacji w genie AT odpowiedzialnych za niedobór AT określono w populacji niemieckiej. Mutacje zmiany sensu stanowiły ok. 71%, kolejno mutacje nonsensowne ok. 7% i mutacje miejsc splicingowych 8%. Krótkie delecje, insercje i duplikacje łącznie wystąpiły u ok. 9% pacjentów z niedoborem AT. Duże delecje obejmujące nawet całe egzony wykryto w 5% przypadków [27]. Należy zaznaczyć, że w typie I niedoboru mutacje genu AT powodują, że w osoczu brak jest zmutowanego białka, albo występują niewielkie jego ilości, co jest spowodowane obniżoną ekspresją (niestabilność transkryptu mrna) czy przyśpieszoną proteolizą źle sfałdowanych peptydów lub obu tych przyczyn jednocześnie [4]. Mutacje genu SERPINC1 odpowiedzialne za typ II niedoboru AT to w większości przypadków substytucje pojedynczego nukleotydu, a dokładniej mutacje zmiany sensu, powodujące zamianę aminokwasu w jednej z dwóch domen funkcjonalnych AT, w wyniku czego w osoczu obecna jest AT ale zwykle nie wykazuje właściwej aktywności [1]. Niedobory AT opisane u polskich chorych Dotychczas zidentyfikowano 14 różnych typów mutacji odpowiedzialnych za wrodzony niedobór AT u polskich pacjentów (tabela nr III), 7 z nich to nowe mutacje w genie SERPINC1 [33, 34, 35, 36, 37]. W krakowskim ośrodku opublikowano pierwszy opis molekularnego podłoża niedoboru AT w Polsce nazwany AT Kraków [33]. U 30 letniej ciężarnej kobiety bez wywiadu zakrzepowego na podstawie obniżonej aktywności AT (56,3%; N:70-120%) i stężenia antygenu AT (0,164 g/l; N: 0,19-0,31g/L) rozpoznano niedobór AT typu I. W wywiadzie rodzinnym stwierdzono ŻChZZ i zawał serca w młodym wieku. Do końca ciąży pacjentka otrzymywała heparynę drobnocząsteczkową. U noworodka płci żeńskiej w 3 dobie życia zdiagnozowano zakrzep w tętnicy biodrowej przy aktywności AT ok. 38,2% (N:70-120%) i antygenie AT 0,104 g/l (N: 0,19-0,31g/L). Analiza genetyczna genu AT wykazała delecję nukleotydu A w kodonie 438, powodującą przesunięcie ramki odczytu i przedwczesne wprowadzenie kodonu STOP w pozycji 444. Mutację AT Kraków potwiedzono u matki i u dziecka. Kolejny opis (AT Kraków II) z genetyczną charakterystyką niedoboru AT dotyczył mężczyzny w wieku 26 lat, u którego pomimo stosowania profilaktyki przeciwzakrzepowej heparyną drobnocząsteczkową po urazie ortopedycznym wystąpiły objawy ŻChZZ. Pacjent nie miał obciążeń w wywiadzie rodzinnym. Wyniki badań laboratoryjnych wskazywały na typ I niedoboru AT na podstawie małej aktywności AT ok. 47% (N: %) i stężenia antygenu AT 0,15 g/l (N: 0,19-0,31g/L). Sekwencjonowanie genu AT wykazało obecność nowej mutacji, substytucję G>A w pozycji c.624, która dotyczy miejsca splicingowego i tłumaczy ilościowy i jakościowy nideobór AT u pacjenta [35]. Opisywaną już w literaturze mutację w genie AT (9788 G>A) zidentyfikowano również u 43-letniego pacjenta, ale jak dotąd nie łączono tej mutacji z zakrzepicą tętniczą [36]. Pierwsza manifestacja kliniczna niedoboru AT w postaci ZŻG kończyny dolnej miała miejsce w wieku 39 lat, gdzie czynnikiem wywołującym był lot samolotem trwający 9 godzin. Kolejny incydent idiopatycznej ŻChZZ wystąpił 2 lata później, a dzień po tym incydencie miał miejsce udar niedokrwienny mózgu. Z powodu badania kolonoskopowego terapia aspiryną i warfaryną została przerwana, a dzień po kolonoskopii wystąpiły 2 przemijające ataki niedokrwienne mózgu z towarzyszącą afazją. W wywiadzie rodzinnym odnotowano śmierć ojca w wieku 51 lat z powodu udaru niedokrwiennego mózgu. W badaniach laboratoryjnych zaobserwowano obniżoną aktywność AT 58% (N: %) i spadek stężenia antygenu AT - 0,169 g/l (N: 0,19-0,31 g/l). Bezpośrednie sekwencjonowanie genu AT wykazało obecność w postaci heterozygotycznej mutacji miejsca splicingowego 9788G>A w intronie IV. U pacjentki z wariantem AT Rybnik w wieku 22 lat miał miejsce pierwszy incydent zakrzepowo-zatorowy po cięciu cesarskim, po którym prowadzono leczenie acenokumarolem przez 7 lat. W ciągu kolejnych lat wystąpiło kilka epizodów zapalenia żył powierzchniowych kończyn dolnych. Wywiad rodzinny był dodatni. Wyniki badań laboratoryjnych wskazywały na typ I niedoboru AT. Aktywność AT wynosiła 46% (N: %), a stężenie antygenu AT 0,15 g/l (N: 0,19-0,31 g/l). Zidentyfikowano nową mutację tj.- substytucję c.683g>t, co na poziomie białka powoduje zamianę glicyny na walinę w pozycji 228 łańcucha peptydowego AT [37]. Podsumowując, niedobór AT jest uważany za przyczynę nadkrzepliwości, która powinna być wykluczona u wszystkich chorych z ŻChZZ występującą w młodym wieku zwłaszcza przy dodatnim wywiadzie rodzinnym. Niedobór AT jest wskazaniem do przewlekłej antykoagulacji, zatem właściwa diagnostyka laboratoryjna tej trombofilii ma duże znaczenie 150

7 Tabela III. Genetyczne podłoże wrodzonego niedoboru AT u polskich pacjentów [33, 34, 35, 36, 37]. Pacjent Typ mutacji Wyniki badań laboratoryjnych Test aktywności AT Stężenie antygenu AT Kliniczna manifestacja/ wiek wystąpienia pierwszego epizodu zakrzepowego Typ niedoboru Referencje G>A Arg393His 62* 90 # ŻChZZ/27 lat 52* 57 # ŻChZZ/27 lat 60* 102 # ŻChZZ/31 lat II-RS T>C Phe402Leu G>C Ala404Pro Del.CTT ( ) 5355 A>G His120Arg 9819 C>T Arg359Stop C>A Pro407Thr 5381 C>T Arg129Stop 9805 T>C Arg393Cys 9805 T>C Ile354Thr Antytrombina Kraków Del.A w kodonie 438, przesunięcie ramki odczytu: Stop Kodon * 48 # Brak objawów 66* 58 # ŻChZZ/49 lat II-PE 34 62* 61 # ŻChZZ/41 lat II-PE 34 39* Brak wyniku ŻChZZ/31 lat 52* 55 # ŻChZZ/28 lat 42* 57 # ŻChZZ/33 lata 50* Brak wyniku ŻChZZ/26 lat 56* 54 # ŻChZZ/19 lat I 34 I 34 48* 52 # ŻChZZ/20 lat I 34 55* 64 # ŻChZZ/32 lata II-PE 34 44* 48 # ŻChZZ/48 lat I 34 49* 71 # ŻChZZ/28 lat II-RS 34 61* 72 # ŻChZZ/22 lata I 34 56,3%^ 0,16 g/l α brak objawów (epizody zakrzepowe u członków 30 lat rodziny z potwierdzoną mutacją AT Kraków: ŻChZZ, zawał serca) 38,2%^ 0,10 g/l α Zakrzepica tętnicza u noworodka I Antytrombina Kraków II c G>T mutacja miejsca splicingowego 9788 G>A mutacja miejsca splicingowego Antytrombina Rybnik Gly228Val c.683 G>T 53%^ 0,15 g/l α ŻChZZ/26 lat I 35 58%^ 0,17 g/l α udar niedokrwienny mózgu/41 lat, przemijające ataki ŻChZZ/39 lat niedokrwienne mózgu/43 lata 46%^ 0,15 g/l α zapalenie żył powierzchniowych ŻChZZ/22 lata, kończyn dolnych I 36 I 37 Objaśnienia: * przedział referencyjny j.m./dl; # przedział referencyjny j.m./dl; ^ przedział referencyjny %; α przedział referencyjny g/l; ŻChZZ żylna choroba zakrzepowo-zatorowa. ze względu na skuteczność profilaktyki i leczenia przeciwzakrzepowego. U każdego chorego z aktywnością AT<75% należy dążyć do szczegółowej diagnostyki w celu określenia typu niedoboru. Również bezobjawowe osoby z niedoborem AT powinny otrzymać profilaktykę w stanach zwiększonego ryzyka zakrzepowego np. po urazie. Niedobór AT jest przykładem schorzenia, którego rozpoznanie wymaga dobrej współpracy lekarza i diagnosty. Piśmiennictwo: 1. Patnaik M, Moll S. Inherited antithrombin deficiency: a review. Haemophilia. 2008; 14: Wiedermann CJ, Romisch J. The anti-inflammatory actions of antithrombin: a review. Acta Med Austriaca 2002; 29: Human Gene Mutation Database, , ac/gene.php?gene=serpinc1 4. Perry DJ, Carrell RW. Molecular genetics of human antithrombin deficiency. Hum Mutat 1996; 7: Olson ST, Richard B, Izaguirre G, et al. Molecular mechanisms 151

8 Niedobór antytrombiny problemy diagnostyki laboratoryjnej of anithrombin-heparin regulation of blood clotting proteinases. A Paradigm for understanding proteinase regulation by serpin family protein proteinase inhibitors. Biochimie. 2010; 92: McCoy AJ, Pei XY, Sinner R, et al. Stucture of beta-antithrombin and the effect of glycosylation on heparin affinity and activity. J Mol Biol 2003; 326: Maclean PS, Tait RC. Hereditary and acquired antithrombin deficiency: epidemiology, pathogenesis and treatment options. Drugs 2007; 67: Lane DA, Kunz G, Olds RJ, et al. Molecular genetics of antithrombin deficiency. Blood Rev. 1996; 10: Kuhle S, Lane DA, Jochmanns K, et al. Homozygous antithrombin deficiency type II (99 Leu to Phe mutation) and childhood thromboembolism. Thromb Haemost.2001; 86: Egeberg O. Inherited antithrombin deficiency causing thrombophilia. Thromb Diath Haemorrh. 1965; 13: Bucciarelli P, Rosendaal FR, Tripodi A, et al. Risk of venous thromboembolism and clinical manifestations in carriers of antithrombin, protein C, protein S deficiency, or activated protein C resistance: a multicenter collaborative family study. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 1999; 19: Tait RC, Walker ID, Perry DJ, et al. Prevalence of antithrombin deficiency in the healthy population. Br J Haemotol 1994; 87: Melissari E, Monte G, Lindo VS, et al. Congenital thrombophilia among patients with venous thromboembolism. Blood Coagul Fibrynolysis 1992; 3: Milio G, Siragusa S, Malato A, et al. Superficial venous thrombosis: role of inherited deficiency of natural anticoagulants in extension to deep veins. Int Angiol 2009; 28: Martinez HR, Rangel-Guerra RA, Marfil LJ. Ischemic stroke due to deficiency of coagulation inhibitors. Report of 10 young adults. Stroke.1993; 24: Roldán V, Ordoñez A, Marín F, et al. Antithrombin Cambridge II (A384S) supports a role for antithrombin deficiency in arterial thrombosis. Thromb Haemost. 2009; 101: De Stefano V, Simioni P, Rossi E, et al. The risk of recurrent venous thromboembolism in patients with inherited deficiency of natural anticoagulants antithrombin, protein C and protein S. Haematologica. 2006; 91: Zawilska K, i wsp. Polskie wytyczne profilaktyki i leczenia żylnej choroby zakrzepowo-zatorowej: aktualizacja PAMW 2012; 122 (Suppl 2). 19. Kottke-Marchant C, Duncan A. Antithrombin deficiency: Issues in laboratory diagnosis. Arch Pathol Lab Med 2002; 126: Khor B, Van Cott E. Laboratory tests for antithrombin deficiency. Am J Hematol 2010; 85: Raszeja-Szpecht A. Metody badań układu hemostazy. W: Jastrzębska M. Diagnostyka laboratoryjna w hemostazie. OIN- PHARMA, Warszawa, 2009: Bohner J, von Pape KW, Blaurock M. Thrombin-based antithrombin assay show overestimation of antithrombin III activity in patients on heparin therapy due to heparin cofactor II influence. Thromb Haemost 1994; 71: Ungerstedt JS, Schulman S, Egberg N, et al. Discrepancy between antithrombin activity methods revealed in Antithrombin Stockholm: do factor Xa-based methods overestimate antithrombin activity in some patient? Blood 2002; 99: Corral J, Hernandez-Espinosa D, Soria JM, et al. Antithrombin Cambridge II (A384S): an underestimated genetic risk factor for venous thrombosis. Blood 2007;109: Kristensen S, Brasmussen B, Pederden S, et al. Detecting antithrombin deficiency may be a difficult task-more than one test is necessary. J Thromb Haemost 2007; 5: Rossi E, Chiusolo P, Za T, et al. Report of a novel kindred with antithrombin heparin-binding site variant (47 Arg to His): demand for automated progressive antithrombin assay to detect molecular variants with low thombotic risk. Thromb Haemost 2007; 98: Caspers M, Pavlova A, Driesen J, et al. Deficiencies of antithrombin, protein C and protein S - practical experience in genetic analysis of a large patient cohort. Thromb Haemost 2012; 108: Picard V, Nowak-Göttl U, Biron-Andreani C, et al. Molecular bases of antithrombin deficiency: twenty-two novel mutations in the antithrombin gene. Hum Mutat 2006; 27: Ng PC, Henikoff S. SIFT: Predicting amino acid changes that affect protein function. Nucleic Acids Res 2003; 31: Łaczmańska I, Łaczmański Ł. Metoda MLPA oraz jej zastosowanie w diagnostyce chorób uwarunkowanych genetycznie. Post Biol Kom 2009 ;4: Bayston TA, Tripodi A, Mannucci PM, et al. Familial overexpression of beta antithrombin caused by an Asn135Thr substitution. Blood. 1999; 93: De la Morena-Barrio ME, Sevivas TS, Martinez-Martinez I, et al. Congenital disorder of glycosylation (PMM2-CDG) in a patient with antithrombin deficiency and severe thrombophilia. J Thromb Haemost 2012; 10: Celinska-Lowenhoff M, Iwaniec T, Alhenc-Gelas M, et al. Arterial and venous thrombosis and prothrombotic fibrin clot phenotype in a Polish family with type 1 antithrombin deficiency (antithrombin Krakow). Thromb Haemost 2011; 106: Odnoczko E, Vertun-Baranowska B, Buczma A, et al. Podłoże genetyczne wrodzonego niedoboru antytrombiny w 18 polskich rodzinach. Acta Haematol Pol 2011; 42: Celinska-Löwenhoff M, Iwaniec T, Alhenc-Gelas M, et al. Antithrombin Krakow II (c G > T): a novel mutation leading to type 1 antithrombin deficiency. Blood Coagul Fibrinolysis 2012; 23: Szymańska M, Alhenc-Gelas M, Undas A. Recurrent ischemic cerebrovascular events in a patient with type I antithrombin deficiency caused by 9788 G>A splice site mutation: a case report. Blood Coagul Fibrinolysis 2013; 24: Szymańska M, Alhenc-Gelas M, Undas A. Antithrombin Rybnik: a new point mutation (nt 683 G>T) associated with type I antithrombin deficiency in a patient with venous thromboembolism and recurrent superficial venous thrombosis. Blood Coagul Fibrinolysis 2013;24: Adres do korespondencji: dr n. med. Magdalena Szymańska Pracownia Biologii Molekularnej Krakowski Szpital Specjalistyczny im. Jana Pawła II Kraków, ul. Prądnicka 80 tel , faks m.szymanska@szpitaljp2.krakow.pl Zaakceptowano do publikacji: