PodłoŜe genetyczne wrodzonego niedoboru antytrombiny w 18 polskich rodzinach

Transkrypt

1 PRACA ORYGINALNA Original Article Acta Haematologica Polonica 2011, 42, Nr 3, str E. ODNOCZKO 1, B. VERTUN-BARANOWSKA 1, A. BUCZMA 1, E. STEFAŃSKA-WINDYGA 1, J. OLDENBURG 2, J. WINDYGA 1 PodłoŜe genetyczne wrodzonego niedoboru antytrombiny w 18 polskich rodzinach Genetic analysis of inherited antithrombin deficiency in 18 Polish families 1 Zakład Hemostazy i Chorób Metabolicznych, Instytut Hematologii i Transfuzjologii w Warszawie Kierownik: Prof. nad zw. dr hab. n. med. Jerzy Windyga 2 Instytut Hematologii Eksperymentalnej i Transfuzjologii w Bonn, Niemcy Kierownik: Prof. Johannes Oldenburg STRESZCZENIE W pracy przedstawiono wyniki badań nad wrodzonym niedoborem antytrombiny przeprowadzone w grupie 21 pacjentów reprezentujących 18 polskich rodzin. Analiza molekularna genu SERPINC1 potwierdziła wrodzony charakter niedoboru antytrombiny u 16 z 21 pacjentów. Na 10 wykrytych mutacji 4 nie były dotąd opisane. Wyniki obecnej pracy wskazują, Ŝe identyfikacja mutacji sprawczej moŝe być pomocna w przewidywaniu cięŝkości przebiegu klinicznego wrodzonego niedoboru AT. SŁOWA KLUCZOWE: Antytrombina Wrodzony niedobór antytrombiny SERPINC1 trombofilia śchzz. SUMMARY The paper presents results of the study on congenital antithrombin deficiency performed in a group of 21 patients from 18 Polish families. The molecular analysis of the SERPINC1 gene confirmed congenicity of antithrombin deficiency in 16 of the 21 patients. Up to date, 4 of the 10 detected mutations have not yet been described. The above results indicate that detection of causative mutation may prove helpful in prognosis of severe clinical course of AT defficiency. KEY WORDS: Antithrombin Inherited antithrombin deficiency SERPINC1 trombophilia VTE. WSTĘP Niedobory endogennych inhibitorów krzepnięcia oraz mutacja Leiden genu czynnika V i mutacja G20210A genu protrombiny są powszechnie uznane za przyczyny wrodzonej trombofilii, czyli dziedzicznie uwarunkowanej skłonności do Ŝylnej choroby zakrzepowo zatorowej (śchzz), definiowanej jako zakrzepica Ŝył głębokich (ZśG) i wikłający ją zator tętnicy płucnej (ZTP). Deficyt antytrombiny (antithrombin, AT), białka C (protein C, PC) i białka S (protein S, PS) moŝe mieć charakter wrodzony bądź nabyty (np. w przebiegu chorób wątroby). Niekiedy, na podstawie wyników oznaczeń aktywności i zawartości białka w osoczu, trudno jest określić charakter niedoboru. Jedynym sposobem ostatecznego potwierdzenia wrodzonego charakteru niedoboru endogennych inhibitorów krzepnięcia jest wykazanie obecności mutacji sprawczej. Identyfikacja mutacji pozwala dodatkowo określić typ niedoboru białka i stanowi punkt wyjścia do dalszych studiów nad przebiegiem klinicznym defektu. Antytrombina jest jednym z najwaŝniejszych naturalnych inhibitorów krzepnięcia, której główną rolą jest utrzymanie płynności krąŝącej krwi i zapobieganie nadmiernemu narastaniu czopu hemostatycznego. To krąŝąca w osoczu jednołańcuchowa glikoproteina o masie około 58 kd, zbudowana z 432

2 520 E. ODNOCZKO i wsp. aminokwasów i naleŝąca do rodziny serpin białek inaktywujących proteazy serynowe. Mechanizm działania AT polega na wiązaniu w stechiometryczny kompleks (1:1) i neutralizacji trombiny oraz czynników Xa, IXa, XIa i XIIa, a takŝe czynnika VIIa związanego z TF. Jej synteza odbywa się głównie w wątrobie pod kontrolą genu zlokalizowanego w długim ramieniu chromosomu 1 (1q23-25). Gen AT (SERPINC1) stanowi 13,4 kb genomowego DNA, wyodrębniono w nim 7 eksonów oraz 6 otaczających je sekwencji intronowych [1]. WyróŜnia się dwa typy niedoboru AT. Typ I oznacza zmniejszoną zawartość prawidłowego białka (defekt ilościowy), typ II zmniejszoną aktywność białka przy prawidłowej zawartości jego antygenu (defekt jakościowy). W obrębie jakościowego defektu wyróŝniono następujące podtypy: II-RS (reactive site) defekt miejsca reaktywnego, II-HBS (heparin binding site) defekt miejsca wiązania heparyny oraz II-PE (pleiotropic effect) powoduje defekt plejotropowy. Osoby obarczone wrodzonym niedoborem AT zwykle są heterozygotami wobec nieprawidłowego genu i charakteryzują się zmniejszoną aktywnością niedoborowego białka w osoczu granicach 40 60% normy. Z wyjątkiem podtypu II-HBS, homozygotyczny niedobór AT jest letalny. Wrodzony niedobór AT jest uwaŝany za jeden z najwaŝniejszych czynników ryzyka rozwoju śchzz. Wyniki dotychczasowych badań wskazują, Ŝe niedobór AT zwiększa 20-krotnie ryzyko wystąpienia zakrzepicy Ŝylnej [2]. Częstość występowania wrodzonego niedoboru AT oszacowano na 1:500 1:5000 ogólnej populacji [3]. Badania przeprowadzone przez Mahmoodi i wsp. [4], Sanson i wsp. [5] oraz Vossen i wsp. [6] wykazały, Ŝe niedobór antytrombiny wykrywa się u 1,7 4% pacjentów z wywiadem ZśG oraz, Ŝe ryzyko wystąpienia śśg u nosicieli niedoboru AT jest wyŝsze niŝ u osób obarczonych wrodzonym niedoborem PC lub PS. Ponad 90% mutacji wykrywanych w genie SERPINC1, powodujących typ I i II niedoboru AT, to mutacje punktowe, zwykle wynikające z zamiany pojedynczych nukleotydów. Rzadko opisywanymi defektami, głównie w typie I, są małe delecje lub insercje, natomiast najrzadziej wykrywane są delecje większych fragmentów bądź całego genu. Celem obecnego badania jest ustalenie podłoŝa genetycznego wrodzonego niedoboru antytrombiny w grupie 21 pacjentów ze zmniejszoną aktywnością antytrombiny, zarejestrowanych w rejestrze chorych na wrodzoną trombofilię, prowadzonym w Instytucie Hematologii i Transfuzjologii w Warszawie. MATERIAŁ I METODY Do badania włączono 21 pacjentów z niedoborem AT z 18 rodzin, w tym 11 męŝczyzn i 10 kobiet, w wieku lat. Dziewiętnastu pacjentów, reprezentujących 17 rodzin, doznało co najmniej jednego epizodu śchzz, zaś u dwóch osób bez wywiadu zakrzepowego niedobór AT został wykryty w trakcie badań rodzinnych. Zebrano wywiad obejmujący m.in.: 1) wiek w chwili wystąpienia pierwszego epizodu śchzz, 2) umiejscowienie zakrzepicy, 3) rodzinną skłonność do śchzz. W kaŝdym przypadku zakrzepica została potwierdzona badaniem ultrasonograficznym, tomografią komputerową bądź badaniem rezonansu magnetycznego. Aktywność AT w osoczu oznaczono metodą chromogenną za pomocą zestawu Berichrom Antithrombin III (A) (Siemens, Niemcy). Zawartość antygenu określono metodą immunodyfuzji radialnej z uŝyciem testu Nor Partigen Antitrombin III (Siemens, Niemcy). U wybranych pacjentów przeprowadzono pełną diagnostykę w kierunku wrodzonej trombofilii, która objęła: oznaczenie aktywności PC i zawartości antygenu wolnego PS, poszukiwanie mutacji Leiden genu czynnika V (factor V Leiden, FVL) oraz mutacji G20210A genu protrombiny. W celu identyfikacji mutacji sprawczych w genie SERPINC1, produkty reakcji PCR wszystkich 7 eksonów oraz regionów splajsingowych poddano sekwencjonowaniu z wykorzystaniem urządzenia ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA), stosując BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems, USA) zgodnie z zaleceniami producenta.

3 PodłoŜe genetyczne wrodzonego niedoboru antytrombiny 521 WYNIKI Wiek w chwili wystąpienia pierwszego epizodu śchzz zawierał się w przedziale lat, średnio 29,9±9,0 lat. Pierwszym epizodem śchzz u wszystkich objawowych pacjentów była ZśG kończyn dolnych. U 9 chorych ZśG była powikłana objawowym ZTP. Dwudziestu pacjentów miało pozytywny wywiad rodzinny w kierunku skłonności do śchzz. Aktywność AT zawierała się w przedziale j.m./dl (n j.m./dl), natomiast zawartość antygenu mieściła się w granicach j.m./dl (n j.m./dl). Na podstawie oznaczeń aktywności i zawartości antygenu AT w osoczu, postawiono wstępne rozpoznanie niedoboru AT typu I u 16 pacjentów oraz niedoboru typu II u dwóch pacjentów. W trzech przypadkach nie oznaczono zawartości antygenu antytrombiny, zatem nie było moŝliwe wstępne określenie typu niedoboru AT. Sekwencjonowanie genu SERPINC1 pozwoliło zidentyfikować 10 róŝnych mutacji u 16 pacjentów z 13 rodzin (Tabela 1). U 5 pacjentów nie zidentyfikowano mutacji sprawczej w genie SERPINC1. Cztery mutacje [His120Arg (c.5355 A>G); Ile354Thr (c.9805 T>C); Ala404Pro (c G>C); c *del.ctt ( )] nie były dotąd opisane. Tabela 1. Charakterystyka pacjentów i wyniki badań laboratoryjnych Table 1. Patient characteristics and lab test results Rodzina Nr Pacjent Nr Aktywność AT [j.m./dl] (n j.m./dl) Antygen AT [j.m./dl] (n j.m./dl) Defekt współ istniejący [j.m./dl] Mutacja sprawcza Wiek w chwili wystąpienia pierwszego epizodu śchzz Klasyfikacja niedoboru AT (potwierdzona badaniami genetycznymi) I nw 32 n.o. II III IV FVL (het) V VI 7 39 n.o. VII VIII FVL (het) FVL (het) 9 50 n.o IX n.o. X PC 40 PS XI Arg393His /c G>A/ Arg393His /c G>A/ Phe402Leu /c T>C/ Phe402Leu /c T>C/ Ala 404 Pro /c G>C/ c del.ctt ( ) 27 II-RS 27 b.o II-RS II-PE 49 II-PE 41 II-PE 31 I nw 30 n.o. His120Arg /c.5355 A>G/ His120Arg /c.5355 A>G/ 26 I 19 I nw 13 n.o. c del.ctt ( ) c del.ctt ( ) Arg 359 Stop /c.9819 C>T/ 28 I 33 I 20 I

4 522 E. ODNOCZKO i wsp. XII XIII Arg393His /c G>A/ Pro407Thr /c C>A/ 31 II-RS 32 II-PE XIV nw b.o. n.o. XV XVI XVII Arg129Stop /c.5381 C>T/ Arg393Cys /c C>T/ Ile354Thr /c.9805 T>C/ 48 I 28 II-RS 22 I XVIII PC-56 nw 32 n.o. Objaśnienia skrótów: nw nie wykryto; b.o. bez objawów; n.o. nie określono; FVL mutacja Leiden genu czynnika V (R506Q); PC białko C; PS białko S; het heterozygota; nw undetected, b.o. asymptomatic; n.o. not recognized; FVL Factor V Leiden mutation (R506Q); PC protein C; PS protein S; het heterozygous; U 6 spośród 16 pacjentów z niedoborem AT typu I, badania genetyczne potwierdziły wstępne rozpoznanie typu niedoboru. W pozostałych 10 przypadkach, u 6 pacjentów zweryfikowano rozpoznanie typu I na typ II, zaś u 4 pacjentów nie wykryto Ŝadnej mutacji w genie SERPINC1. Ponadto, u dwóch pacjentów, u których typ II został wstępnie rozpoznany na podstawie oznaczeń aktywności i stęŝenia antygenu AT w osoczu, analiza genetyczna potwierdziła obecność defektu jakościowego. Spośród trzech pacjentów z nieokreślonym typem niedoboru AT, mutacje sprawcze zidentyfikowano w dwóch przypadkach; u tych pacjentów rozpoznano typ I niedoboru AT. Wykrycie mutacji sprawczych pozwoliło rozpoznać podtyp II-RS u 4 pacjentów i podtyp II-PE takŝe u 4 pacjentów. U Ŝadnego pacjenta nie wykryto podtypu II-HBS. Pierwszy epizod ZśG u pacjentów z typem I wystąpił w wieku średnio 28 lat, a w typie II 29 lat (w podtypie II-RS 28 lat, w podtypie II-PE 31 lat). U 5 pacjentów wykryto inne defekty hemostazy odpowiedzialne za trombofilię. W trzech przypadkach była to mutacja typu Leiden genu czynnika V, w jednym niedobór PC i takŝe w jednym złoŝony niedobór PC i PS. Mutacji sprawczej w genie SERPINC1 nie udało się określić u jednego pacjenta z FVL, u jednego z niedoborem PC i u jednego ze złoŝonym niedoborem PC i PS. OMÓWIENIE WYNIKÓW W diagnostyce wrodzonej trombofilii, rutynowo oznacza się aktywność oraz zawartość antygenu AT w osoczu pacjenta. Identyfikację mutacji sprawczych w genie SERPINC1 przeprowadzają tylko wyspecjalizowane ośrodki. Do chwili obecnej opisano blisko 130 róŝnych mutacji sprawczych w genie SERPINC1. Dotychczasowe dane piśmiennictwa wskazują, Ŝe wśród pacjentów z wrodzonym niedoborem AT, tylko w 12% wykrywane są defekty molekularne odpowiedzialne za niedobór typu I, zaś w 88% mutacje typu II, przy czym dominuje podtyp II-HBS. Choć autorzy dotychczas opublikowanych prac nie skupiali się na analizie klinicznej wrodzonego niedoboru AT, to moŝna jednak wyciągnąć wniosek, Ŝe największe ryzyko wystąpienia pierwszego epizodu zakrzepicy wiąŝe się z mutacjami wywołującymi typ I oraz podtypy II-RS i II-PE [7]. Stosunkowo najmniejsze ryzyko wystąpienia epizodu śchzz stwierdzono u pacjentów z defektem II-HBS [8]. Przeprowadzone przez Bucciarelli i wsp. [9] badania wykazały, Ŝe pierwszy epizod śchzz u pacjentów ze zmniejszoną aktywnością antytrombiny występuje przeciętnie w wieku około 35 lat, u pacjentów z niedoborem PC - około 36 lat, a u pacjentów z PS juŝ około 30 rŝ. Wedle naszej wiedzy, obecna praca jest pierwszą w piśmiennictwie polskim analizą podłoŝa genetycznego wrodzonego niedoboru AT. Mimo, Ŝe naszymi badaniami objęto dotychczas stosunkowo małą

5 PodłoŜe genetyczne wrodzonego niedoboru antytrombiny 523 liczebnie grupę pacjentów, to jednak udało się wykryć 10 róŝnych mutacji, z których 4 nie były poprzednio opisane. Wskazuje to na duŝą heterogenność molekularną niedoboru AT w Polsce. Wyniki ostatnio opublikowanych analiz zdają się wskazywać na duŝą heterogenność niedoboru AT takŝe i w innych krajach [10]. Nasze badania pozwoliły ustalić podłoŝe genetyczne niedoboru AT u 16 (13 rodzin) z 21 (18 rodzin) badanych pacjentów. Zidentyfikowano 6 wcześniej poznanych mutacji sprawczych (Arg129Stop, Arg359Stop, Arg393His, Arg393Cys, Phe402Leu, Pro407Thr) oraz 4 dotychczas nie opisane. Trzy wśród nowo wykrytych mutacji, to mutacje zmiany sensu [His120Arg (c.5355 A>G), Ile354Thr (c.9805 T>C), Ala404Pro (c G>C)], zaś jedna to trójnukleotydowa delecja w eksonie 3 [c *del.ctt ( )]. Wszyscy pacjenci ze zidentyfikowanymi mutacjami w genie SERPINC1 byli heterozygotami wobec wykrytych defektów. W związku z tym, Ŝe w pięciu przypadkach nie wykryto mutacji sprawczej, moŝna przypuszczać, Ŝe niedobór AT u tych pacjentów ma charakter nabyty lub jest wynikiem występowania duŝych rearanŝacji genowych, do wykrycia których konieczne jest zastosowanie innych technik biologii molekularnej, np. MLPA [11]. Trzy z czterech nowo opisanych mutacji wywołały niedobór antytrombiny typu I, zaś czwarta była odpowiedzialna za wystąpienie podtypu II-PE niedoboru AT. U pacjentów 7,12,13, wykryto mutację polegającą na delecji trzech nukleotydów c *del.ctt, która spowodowała usunięcie z sekwencji białka fenyloalaniny. W tej grupie pacjentów pierwszy epizod ZśG wystąpił odpowiednio w 31, 28 i 33 rŝ. Inni autorzy opisali występowanie w tym samym miejscu genu 9-nukleotydowej delecji (c *delctt), której wynikiem jest brak 3 aminokwasów w pozycjach U pacjentki z tą mutacją pierwszy epizod ZśG wystąpił w 24 rŝ. [12]. Pacjenci 9 i 10, z nowo wykrytą mutacją His120Arg, pierwszy epizod ZśG przebyli odpowiednio w 26 rŝ. i 19 rŝ. Trzecią nowo wykrytą mutacją jest Ala404Pro, skutkująca jakościowym defektem plejotropowym cząsteczki AT. Mutacja ta spowodowała wystąpienie pierwszego epizodu zakrzepicy u pacjenta 6 w wieku 41 lat. Czwarta nie opisana dotychczas mutacja to wykryta u pacjenta 20 Ile354Thr, która doprowadziła do wystąpienia ZśG w wieku 22 lat. W odróŝnieniu od wcześniej opublikowanych prac dowodzących częstego występowania podtypu II-HBS wśród pacjentów z wrodzonym niedoborem AT, w naszym materiale zabrakło pacjentów z tym podtypem niedoboru AT. Jedną z potencjalnych przyczyn niewykrycia przez nas podtypu II-HBS moŝe być zastosowana w obecnej pracy metoda oznaczania aktywności AT. Wykorzystaliśmy, bowiem metodę opartą o zjawisko neutralizacji trombiny (cz.iia), której czułość w wykrywaniu niedoboru AT typu II spowodowanego mutacjami w miejscu wiązania heparyny jest wyraźnie mniejsza w porównaniu do czułości metody opartej na neutralizacji czynnika Xa (cz.xa), równie często wykorzystywanej zarówno w pracach naukowych jak i rutynowej diagnostyce [13]. Obie metody pomiarowe cechują się podobną skutecznością w wykrywaniu nabytego i wrodzonego niedoboru antytrombiny typu I. Metoda wykorzystująca neutralizację cz.xa nie jest jednak pozbawiona wad, albowiem poza jej zasięgiem pozostają defekty odpowiedzialne za wybrane warianty niedoboru AT podtypu II-RS (np. Cambridge II, Denver, Stockholm) [14]. NaleŜy zatem zgodzić się z innymi autorami, Ŝe zastosowanie obu metod oznaczania aktywności AT we wstępnej diagnostyce niedoboru AT mogłoby zwiększyć prawdopodobieństwo wykrycia wszystkich podtypów defektu jakościowego [15]. PODSUMOWANIE Wykrycie mutacji sprawczej w genie SERPINC1 jest jedynym pewnym sposobem potwierdzenia genetycznego podłoŝa niedoboru antytrombiny i prawidłowego sklasyfikowania typów i podtypów niedoboru AT. Ponadto, określenie rodzaju mutacji odpowiedzialnej za wystąpienie niedoboru AT mo- Ŝe być pomocne w przewidywaniu cięŝkości przebiegu klinicznego tej choroby.

6 524 E. ODNOCZKO i wsp. PIŚMIENNICTWO 1. Perry DJ, Carrell RW. Molecular genetics of human antithrombin deficiency. Human Mutation 1996; 7: van Boven HH, Vandenbroucke JP, Briet E, Rosendaal FR. Gene-gene and gene-environment interactions determine risk of thrombosis in families with inherited antithrombin deficiency. Blood 1999; 94: Patnaik MM, Moll S. Inherited antithrombin deficiency: a review. Haemophilia 2008; 14: Mahmoodi BK, Brouwer JLP, Ten Kate MK i wsp. A prospective cohort study on the absolute risks of venous thromboembolism and predictive value of screening asymptomatic relatives of patients with hereditary deficiencies of protein S, protein C or antithrombin. Journal of Thrombosis and Haemostasis 2010; 8: Sanson BJ, Simioni P, Tormene D. i wsp. The incidence of venous thromboembolism in asymptomatic carriers of a deficiency of antithrombin, protein C, or protein S: A prospective cohort study. Blood 1999; 94: Vossen CY, Conard J, Fontcuberta J i wsp. Risk of a first venous thrombotic event in carriers of a familial thrombophilic defect. The European Prospective Cohort on Thrombophilia (EPCOT). Journal of Thrombosis and Haemostasis 2005; 3: Lane DA, Bayston T, Olds RJ i wsp. Antithrombin mutation database: 2nd (1997) update - For the plasma coagulation inhibitors subcommittee of the scientific and standardization committee of the international society on thrombosis and haemostasis. Thrombosis and Haemostasis 1997; 77: Perry DJ. Antithrombin and its inherited deficiencies. Blood Reviews 1994; 8: Bucciarelli P, Rosendaal FR, Tripodi A i wsp. Risk of venous thromboembolism and clinical manifestations in carriers of antithrombin, protein C, protein S deficiency, or activated protein C resistance - A multicenter collaborative family study. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology 1999; 19: Luxembourg B, Delev D, Geisen C i wsp. Molecular basis of antithrombin deficiency. Thrombosis and Haemostasis 2011; 105: Picard V, Chen JM, Tardy B i wsp. Detection and characterisation of large SERPINC1 deletions in type I inherited antithrombin deficiency. Human Genetics 2010; 127: Steiner M, Steiner B, Rolfs A i wsp. Antithrombin gene mutation *delCTT with type I deficiency and earlyonset thrombophilia and a brief review of the antithrombin alpha-helix D molecular pathology. Annals of Hematology 2005; 84: Tripodi A, Mannucci PM. Laboratory investigation of thrombophilia. Clinical Chemistry 2001; 47: Jennings I, Cooper P. Screening for thrombophilia: a laboratory perspective. British Journal of Biomedical Science 2003; 60: Ungerstedt JS, Schulman S, Egberg N i wsp. Discrepancy between antithrombin activity methods revealed in Antithrombin Stockholm: do factor Xa-based methods overestimate antithrombin activity in some patients? Blood 2002; 99: Praca wpłynęła do Redakcji r. i została zakwalifikowana do druku r. Adres Autora: Edyta Odnoczko Zakład Hemostazy i Chorób Metabolicznych, Instytut Hematologii i Transfuzjologii, ul. I. Gandhi Warszawa, Tel. (022) ; eodnoczko@ihit.waw.pl