Streptavidin Alkaline Phosphatase

Transkrypt

1 Dako LSAB 2 System-AP Code K ml Code K ml Cel uŝycia Tylko do diagnostyki in vitro. Instrukcje przedstawione poniŝej dotyczą systemu wizualizacji Dako LSAB 2 System, Alkaline Phosphatase (LSAB2 System, AP) stosowanego z pierwotnymi króliczymi i mysimi przeciwciałami, które uŝytkownik musi nabyć sam. Sytem ten, składający się z odczynników znakowanych strepatawidyna biotyna (LSAB), przeznaczony jest do jakościowego uwidaczniania antygenów na parafinowych skrawkach tkankowych, mroŝonych skrawkach tkankowych oraz preparatach komórkowych. System nadaje się do próbek zawierających wysoką aktywność wewnętrznej peroksydazy. Tkanki utrwalone w wielu utrwalaczach ( etanol, B-5, płyn Bouina, naturalnie buforowana formalina) nadają się uŝytku z tym systemem. Stosować zgodnie z: Podstawowymi instrukcjami dla barwień immunohistochemicznych lub zbiorem instrukcji dla procedur immunohistochemiczych: (1) Zasady ogólne procedur, (2) Materiały wymagane, lecz niedostarczone w zestawie, (3) Sposób przechowywania, (4) Przygotowanie próbek, (5) Procedury barwienia, (6) Kontrola jakości, (7) Pozbywanie się problemów, (8) Interpretacja wyników barwienia, (9) Podstawowe ograniczenia. Krótki opis produktu Techniki immunohistochemiczne ułatwiają wizualizacji antygenów tkankowych (komórkowych). Systemy LSAB2 wykorzystują wyszukaną technikę awidyna-biotyna, w której wtórne biotynizowane przeciwciało reaguje z kilkoma cząsteczkami streptawidyny złączonej z fosfatazą alkaliczną. 1 LSAB2 System, AP oferuje wszechstronny sposób barwienia, który umoŝliwia jednoczasową, w czasie krótszym niŝ jedna godzina, obróbkę wielu tkanek. Pierwotne przeciwciała, wytworzone przez królika lub mysz, reagują w biotynizowanym przeciwciałem łączącym dostarczonym w tych zestawach. Całkowity czas inkubacji trwający około 40 minut, pozwala na opracowywanie duŝej ilości próbek. Substrat chromogen Fuksyna dostarczany jest w 15mL LSAB2 System, AP (nr kat. K0676) i powoduje powstanie częściowo rozpuszczalnego osadu koloru fuksyny w miejscu antygenu. Fuchsin Substrate-Chromogen System (nr kat. K0624, 110 ml) jest dostępny jako produkt pomocniczy i zaleca się go stosować z 110 ml LSAB2 System, AP (nr kat. K0674). Podstawy procedury Odczynniki dostarczone Technika stosowana w tym systemie oparta jest na metodzie LSAB. 2 Badana próbka jest najpierw poddawana inkubacji 10-cio minutowej z odpowiednio określonym i rozcieńczonym króliczym lub mysim pierwotnym przeciwciałem, które uŝytkownik nabywa osobno. Następnie przeprowadza się kolejno 10-minutowe inkubacje z dostarczonym biotynizowanym przeciwciałem łączącym i streptawidyną znakowaną fosfatazą alkaliczną. Barwienie jest zakończone po 10-minutowej inkubacji z roztworem substrat-chromogen. Nr kat. K0674: W zestawie dostarczono, niŝej opisane odczynniki, które wystarczą na 1100 skrawków tkankowych, przy załoŝeniu, ze uŝyto 100 µl odczynnika na skrawek Ilość 1x110 ml Opis Link Biotynizowane anty-królicze i anty-mysie immunoglobuliny w słonym buforze fosforanowym (PBS) zawierającym białko stabilizujące i mol/l azydku sodu. 1x110 ml Streptavidin Alkaline Phosphatase Streptawidyna złączona z fosfatazą alkaliczną w słonym buforze fosforanowym (PBS) zawierającym białko stabilizujące i mol/l azydku sodu. Zalecane zgodne systemy substratowe: Nazwa Nr kat. Liczba dostępnych testów Kolor FUCHSIN K testów i 1100 testów Fuksyna FAST RED K testów i 1100 testów Czerwony BCIP/NBT K testów Niebieski/ purpurowy BCIP/NBT/INT K testów Brązowy ( ) PL_001 s. 1/6

2 Nr kat. K0676: W zestawie dostarczono, niŝej opisane odczynniki, które wystarczą na 150 skrawków tkankowych, przy załoŝeniu, ze uŝyto 100 µl odczynnika na skrawek: Ilość 1x15 ml Opis Link Biotynizowane anty-królicze i anty-mysie immunoglobuliny w słonym buforze fosforanowym (PBS) zawierającym białko stabilizujące. 1x15 ml Streptavidin Alkaline Phosphatase Streptawidyna skonjugowana z fosfatazą alkaliczną w słonym buforze fosforanowym (PBS) zawierającym białko stabilizujące i mol/l azydku sodu. 1x2 ml Fuchsin Chromogen W HCl. 1x2 ml Fuchsin Activating Agent W roztworze wodnym. 1x15 ml Fuchsin Substrate Buffer Fosforan naftolu w buforze Tris. Akcesoria 1 Kalibrowana tuba testowa. Materiały wymagane, lecz niedostarczone w zestawie Pierwotne przeciwciało i odczynnik do kontroli negatywnej ( niedostarczone z systemem K0674 lub K0676) Tkanka kontrolna ( pozytywna i negatywna) Ksylen, toluen lub substytuty ksylenu. Etanol: absolutny i 95%. Woda destylowana Butelki czyste chemicznie Buforowy roztwór do przemywania Ściereczki absorbujące Naczynia lub wanienki do barwienia Drugi barwnik na bazie wody, taki jak hematoksylina Mayera w modyfikacji Lilie ( nr kat. S3309) mol/l wodorotlenek amonowy Klej, taki jak Glycergel Mounting Medium (nr kat. C0563), Faramount, Aqueous Mounting Medium, Ready-touse (nr kat. S3025) lub trwały klej wodny, Ultramount (nr kat. S1964) Szkiełka nakrywkowe Mikroskop świetlny (powiększenie 20x-800x) Szkiełka podstawowe, pokryte poly-l-lysiną lub silanizowane (nr kat. S3003) Dodatkowe, wymagane materiały, lecz niedostarczone: Pióro PAP (nr kat. S2002) Środki ostroŝności 1. Do uŝytku tylko przez wykwalifikowanych pracowników laboratoriów. 2. Produkt ten zawiera azydek sodu (NaN 3), który w czystej formie jest wysoce toksyczny. Azydek sodu nie jest obecny w stęŝeniu toksycznym w tym produkcie, ale moŝe on reagować z ołowiem i miedzią w instalacjach wodociągowych tworząc bardzo wybuchową mieszaninę azydków metali. Usuwanie resztek odczynnika ze sprzętu powinno odbywać się z uŝyciem duŝą ilości wody, aby zapobiec tworzeniu się azydków metali. 3,11 3. W celu uniknięcia fałszywie dodatnich odczynów naleŝy chronić substraty reakcji przed zanieczyszczeniami biologicznymi. 4. Stosować indywidualne środki ochrony oczu i skóry 5. Roztwory, które nie zostały zuŝyte naleŝy niszczyć stosowanie do instrukcji i zgodnie z prawem obowiązującym w danej instytucji /kraju. 6. Instrukcja bezpieczeństwa jest dostępna na Ŝądanie wykwalifikowanych pracowników laboratoriów. Dane o ryzyku i bezpieczeństwie K0676 Fuchsin Activating Agent czynnik aktywujący fuksynę R22 Szkodliwy w przypadku połknięcia. ( ) PL_001 s. 2/6

3 Sposób przechowywania Odczynniki LSAB2 System, AP przechowywać w temperaturze 2 8 C. Nie zamraŝać. Nie uŝywać po upłynięciu daty waŝności wydrukowanej na fiolkach i opakowaniach Nie ma Ŝadnych oczywistych dowodów wskazujących na nietrwałość tego produktu. Niemniej jednak przed kaŝdorazowym uŝycie do badań diagnostycznych próbek pochodzących od pacjentów, naleŝy przeprowadzić kontrolę pozytywną jak i negatywną. W przypadku wystąpienia niespodziewanych problemów, których nie moŝna wytłumaczyć błędami w procedurze laboratoryjnej a równocześnie pojawi się podejrzenie, Ŝe przyczyną tego jest jakość przeciwciała naleŝy skontaktować się z Działem Pomocy Dako. Odczynniki dostarczone Zaleca się przygotowanie odczynników przed barwieniem. Roztwór do płukania Zarówno w przypadku stosowania procedur zautomatyzowanych jak i manualnych zaleca się stosowanie do płukania buforowanego roztworu TBST mol/l Tris Buffered Saline with Tween (nr kat. S3006). TBS, 0.05 mol/l Tris Buffered Saline (nr kat. S1968) i PBS, 0.02 mol/l Phosphate Buffered Saline (nr kat. S3024) są buforami przydatnymi do płukania w przypadku barwienia manualnego. Do wypłukiwania chromogenu jak i drugiego barwnika moŝe być uŝywana woda destylowana. Roztwór nieuŝywany przechowywać w temperaturze 2 8 C. Roztwór ze śladami zmętnienia nie nadaje się do uŝytku. Pierwotne przeciwciało Systemy LSAB2 przystosowane są do wykorzystania wielu pierwotnych przeciwciał Primary Antibodies oraz odczynników do kontroli negatywnych Negative Control Reagents (linia N-Series). Dako oferuje takŝe przeciwciał w postaci ich koncentratów (zagęszczone). Wtedy jednak optymalne stęŝenia muszą zostać ustalone eksperymentalnie przez uŝytkownika. Rozcieńczenia naleŝy przygotowywać uŝywając 0.05 mol/l buforu Tris-HCl, o ph , zawierającego 1% albuminy surowicy bydlęcej (Antibody Diluent, nr kat. S0809). 1 Odczynniki do kontroli negatywnej Universal Negative Control(s) zalecane są jako odczynniki do kontroli negatywnej, jeśli stosuje się przeciwciała Dako N-Series ready-to-use antibodies. Przystosowane są one do uŝytku zarówno z mysimi (nr kat. N1698) jaki i króliczymi (nr kat. N1699) przeciwciałami N-Series ready-to-use antibodies. Idealnym rozwiązaniem jest, aby uŝywać w kontroli negatywnej przeciwciał, których ekspresja nie jest charakterystyczna dla ludzkich tkanek (nie stwierdza się jego ekspresji w komórkach ludzkich). Pracując ze skoncentrowanymi przeciwciałami, naleŝy stosować odczynnik do kontroli negatywnej, którego ekspresja nie jest charakterystyczna dla ludzkich tkanek ani prawidłowej/niezimmunizowanej surowicy na tym samym podłoŝu/matriksie, jak dla pierwotnych przeciwciał. Zaleca się, aby przeciwciało, które nie wchodzi w reakcję z ludzkimi komórkami było tej samej podklasy, co pierwotne przeciwciało i powinno pochodzić od tego samego gatunku zwierzęcia. NaleŜy je rozcieńczyć w takim samym stopniu i przy uŝyciu tego samego rozcieńczalnika jak w przypadku przeciwciała pierwotnego. Zaleca się, aby czas inkubacji przeciwciał dla kontroli negatywnej był taki sam jak pierwotnych przeciwciał/surowic. Roztwór Substrat-Chromogen (zawarty w K0676) Zaleca się Fuchsin (nr kat. K0624) w systemie LASB2, AP. Roztwór substrat-chromogen powinien zostać zuŝyty w ciągu 30 minut od przygotowania. Dla lepszego efektu naleŝy przygotować na krótko przed uŝyciem. PoniŜszy protokół pozwala uzyskać 2 ml roztworu. Objętość ta powinna wystarczyć na 20 skrawków tkankowych lub rozmazów komórkowych. Roztwór Substrate-Chromogen KROK 1 Przenieść 3 krople (120µL) Fuchsin Chromogen do kalibrowanej tuby testowej. Dla lepszego efektu, wkraplać powoli, delikatnie wyciskając. KROK 2 Dodać 3 krople (120 µl) Activating Agent a nastepnie wymieszać delikatnie. Dla lepszego efektu, wkraplać powoli, delikatnie wyciskając. KROK 3 Inkubować przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. KROK 4 Dodać buforowanego substratu do objętości 2 ml (1.76 ml). Wymieszać i od razu nakładać na szkiełka.* Uwaga: Nie dotykać palcami nasadki zakraplacza, aby nie nanieść zanieczyszczeń. Zaleca się stosowanie rękawiczek w razie potrzeby nasadzania lub usuwania nasadki na zakraplacz. Przemyć dokładnie tubę testową po kaŝdorazowym uŝywaniu. *Wewnętrzna aktywność fosfatazy alkalicznej moŝe powodować w niektórych tkankach fałszywie dodatnie wyniki. Dodanie mol/l Levamisole (nr kat. X3021) do substratu-chromogen moŝe zahamować wewnętrzną aktywność. Lewamizol nie hamuje fosfatazy alkalicznej w jelitach oraz łoŝysku, dlatego jest nie przydatny w przypadku barwienia tkank pochodzących z tych narządów. ( ) PL_001 s. 3/6

4 Dostępne są dodatkowe chromogeny zgodne z fosfatazą alkaliczna. Fast Red Substrate System (nr kat. K0597) tworzy rozpuszczalny czerwony kolor w miejscu poszukiwanego antygenu. BCIP/NBT Substrate System (nr kat. K0598) jest produktem gotowym do uŝycia. Tworzy on nierozpuszczalny produkt reakcji, o kolorze niebiesko-purpurowym w miejscu poszukiwanego antygenu. BCIP/NBT/INT Substrate System (nr kat. K0599) jest takŝe produktem gotowym do uŝycia. Tworzy on rozpuszczalny produkt reakcji. Przygotowanie próbek. Instrukcja barwienia Stosować zgodnie z: Podstawowymi instrukcjami dla barwień immunohistochemicznych lub zbiorem instrukcji dla procedur immunohistochemiczych. Uwagi waŝne dla uŝytkownika Zaleca się dokładne zapoznanie się z instrukcjami oraz zawartością zestawu przed rozpoczęciem pracy z systemem, zwłaszcza z kolorami odczynników, opisanych w formie klucza na dołączonej zalaminowanej instrukcji. Dostarczone w systemie odczynniki i instrukcje są przygotowane w celu uzyskania jak najlepszego efektu. Dalsze rozcieńczanie odczynników lub zmiany czasów inkubacji oraz temperatury mogą dawać błędne wyniki. Wszystkie odczynniki z zestawu powinny być ogrzane do temperatury pokojowej (20 25 C) przed przystąpieniem do procedury; podobnie wszystkie inkubacje powinny być przeprowadzone w temperaturze pokojowej. Nie wolno pozwolić wyschnąć skrawkom tkankowym w czasie procedury barwienia. Chronić preparaty przed nadmiernym przepływem powietrza. Jeśli wykonuje się długotrwałe inkubacje, to tkanki naleŝy umieścić w wilgotnym środowisku. Jeśli zachodzi konieczność przerwania realizowanej procedury, to moŝna trzymać szkiełka w buforowanej kąpieli, po inkubacji z Link, przez okres jednej godziny. Przerwa ta nie ma to wpływu na końcowy efekt barwienia. Sposób barwienia KROK 1 PIERWOTNE PRZECIWCIAŁO I ODCZYNNIK DO KONTROLI NEGATYWNEJ Usunąć nadmiar buforu ze szkiełka, i osuszyć je. Nanieść odpowiednią ilość optymalnie rozcieńczone przeciwciało lub odczynnik do kontroli negatywnej, tak aby cały preparat pokryć odczynnikiem. Inkubować przez 10 minut, chyba ze wskazany jest inny czas. OstroŜnie przemyć preparat uŝywając buforu przechowywanego w chemicznie czystej butelce (uwaga: nie kierować głównego strumienia płynu bezpośrednio na tkankę), a następnie umieścić preparat w świeŝej kapieli z buforu. KROK 2 LINK Usunąć nadmiar buforu ze szkiełka, i osuszyć je Nanieść odpowiednią ilość śółtych kropli, aby pokryły preparat. Inkubować przez 10 minut. Przemyć preparaty jak w kroku 1. KROK 3 STREPTAVIDIN ALKALINE PHOSPHATASE Osuszyć szkiełka jak poprzednio Nanieść odpowiednią ilość CZERWONYCH kropli (Streptavidin-AP), aby pokryły preparat. Inkubować przez 10 minut. Przemyć preparaty jak poprzednio. KROK 4 ROZTWÓR SUBSTRATE-CHROMOGEN Przygotować roztwór substrat chromogen (patrz Przygorowanie odczynników) Osuszyć preparaty jak poprzednio. Nanieść odpowiednią ilość roztworu substrat-chromogen na preparat. Inkubować przez 10 minut. OstroŜnie przemyć preparat uŝywając buforu przechowywanego w chemicznie czystej butelce (uwaga: nie kierować głównego strumienia płynu bezpośrednio na tkankę), a następnie umieścić preparat w świeŝej kąpieli z wody destylowanej. STEP 5 WYBARWIANIE POZOSTAŁYCH STRYKTUR I KLEJENIE Fuchsin (nr kat. K0624) tworzy produkt końcowy, który jest częściowo rozpuszczalny w związkach organicznych. Z tego powodu zaleca się hematoksyliny Mayera albo Gilla ewentualnie Lillie w modyfikacji Mayera (nr kat. S3309) do wybarwiania pozostałych struktur oraz kleje oparte na bazie wodnej, taki jak: Glycergel (nr kat. C0563), Faramount (nr kat. S3025) lub Ultramount (nr kat. S1964). Po wybarwieniu hematoksyliną pozostałych struktur naleŝy całkowicie przemyć preparaty wodą destylowaną, a następnie umieścić je w kąpieli z mol/l wody amonowej. ( ) PL_001 s. 4/6

5 Dla optymalnego zaklejenia, umieścić preparaty dwukrotnie na czas od 15 sekund do 2 minut w: 1. 95% alkoholu % alkoholu 3. Zalecane są substytuty ksylenu. Ksylen moŝna stosować do czyszczenia, ale moŝe on powodować utratę barwienia. Do zaklejania stosować trwałe kleje oparte na rozpuszczalnikach organicznych. Zmniejszona ekspozycja na organiczne rozpuszczalniki moŝe zachować intensywność barwienia. W celu wytworzenia dodatkowego sygnału, czas inkubacji z Fuchsin Chromogen moŝna wydłuŝyć do 30 minut. Długie przechowywanie preparatów moŝe spowodować zmniejszenie intensywność barwienia końcowego, zwłaszcza, gdy preparaty były wystawione na działanie światła słonecznego. Kontrola jakości Niezbędnym jest przeprowadzania kontroli wewnątrz laboratoryjnej, poniewaŝ róŝnice w opracowaniu tkanek, a takŝe odmienności stosowanych technik przygotowawczych skutkują duŝą zmiennością uzyskiwanych efektów realizowanych procedur. Dalsze informacje dotyczące kontroli pozytywnych jak i negatywnych zawarte są w Podstawowych instrukcjach dla barwień immunohistochemicznych. Interpretacja wyników barwienia Ogólne ograniczenia Charakterystyczne ograniczenia produktu. Wytyczne dotyczące interpretacji wyników barwienia zawarte są Podstawowych instrukcjach dla barwień immunohistochemicznych. Opis ogólnych ograniczeń produktu zawarty jest w Podstawowych instrukcjach dla barwień immunohistochemicznych. Wewnętrzna aktywność wiąŝąca awidyne ( ang. endogenous avidin-binding activity EABA) zaobserwowano w mroŝonych skrawkach wątroby (ang. entire hepatic nodul ) oraz nerki (nabłonek wałeczkowy), a takŝe zarówno w mroŝonej jak i utrwalonej w formalinie tkance limfatycznej (histiocyty przykorowe). 5,8 Zahamowanie EABA uzyskuje się przez 10-minutową inkubację, przed procedurą barwienia, najpierw z 0.1% awidyną, a następnie z 0.01% biotyną w 0.05 mol/l buforze Tris-HCl, o ph , Biotin Blocking System (nr kat. X0590). Lewamizol moŝe zahamować aktywność wewnętrzną większości znanych typów fosfatazy alkalicznej, za wyjątkiem alkaliczne fosfatazy j jelitowej i łoŝyskowej. 7 Jeśli w preparacie obserwuje się aktywność wewnętrznej fosfatazy alkalicznej to zalecane jest dodanie Levamizole (nr kat. X3021), do roztworu substratu, do maksymalnego stęŝenia 0.2 mmol/l. Pozbywanie się problemów Problem Prawdopodobna przyczyna Zalecane postępowanie 1. Brak ekspresji na 1a. Powtórnie nałoŝyć odczynniki którymkolwiek ze szkiełek 1a. Zła kolejność stosowanych odczynników. 1b. Nieprawidłowe zmieszanie odczynników substratchromogen. 1b. Przygotować świeŝy roztwór substrat-chromogen wg instrukcji Przygotowanie odczynników. 2. Słaba ekspresja na wszystkich szkiełkach. 3. Nadmierne zabarwienie tła na wszystkich szkiełkach 2a. Na skrawkach pozostało zbyt duŝo roztworu po kąpieli myjącej. 2b. Roztwór substrat-chromogen ma więcej niŝ 30 minut. 2c. Za krótki czas inkubacji z przeciwciałami lub mieszaniną substratów. 3a. Nadmierna aktywność endogennej peroksydazy w skrawkach tkankowych. 3b. Skrawki nie zostały całkowicie odparafinowane 3c. Skrawki nie zostały prawidłowo przepłukane. 2a. Usunąć delikatnie nadmiar roztworu ze szkiełka przed osuszeniem go. 2b. Przygotować świeŝy roztwór substrat-chromogen. 2c. Powtórnie przeprowadzić inkubację w zalecanym czasie. 3a. Dodać roztworu Lewamizolu do roztworu substrat-chromogen (patrz Charakterystyczne ograniczenia produktu). 3b. UŜyć świeŝe kąpiele z ksylenu oraz toluenu. Jeśli kilka skrawków jest barwionych jednocześnie, druga kąpiel powinna być ze świeŝego ksylenu. 3c. Zastosować kąpiel ze świeŝego buforu oraz nowe czyste chemicznie butelki. Sprawdzić czy zastosowano odpowiedni bufor ( ) PL_001 s. 5/6

6 3d. Przyśpieszona reakcja z substrat-chromogenem jako efekt podwyŝszonej temperatury w pomieszczeniu. 3e. Skrawki zostały wysuszone podczas barwienia 3f. Nieswoista ekspresja odczynników na skrawkach tkankowych. 3d. Czas inkubacji z roztworem substrat-chromogen powinna trwać krócej. 3e. Zaleca się stosowanie komory wilgotnej. Osuszać najwyŝej trzy lub cztery szkiełka przed nałoŝeniem odczynnika. 3f. Nanieść roztwór blokujący zawierający białko ( patrz Charakterystyczne ograniczenia produktu) UWAGA: W przypadku wystąpienie problemów, które nie zostały uwzględnione wśród wyŝej wymienionych kategorii lub jeśli zaproponowane rozwiązanie problemu nie przynosi oczekiwanego skutku, naleŝy skontaktować się z działem Pomocy Technicznej Dako po dalsze wskazówki. Dodatkowe informacje na temat technik barwienia oraz przygotowania próbek moŝna znaleźć podręcznikach pt.: Handbook Immunochemical Staining Methods 8 (dostępny w Dako) oarz Atlas of Immunohistology 9 lub Immunoperoxidase Techniques, A Practical Approach to Tumor Diagnosis. 10 Piśmiennictwo 1. Guesdon JL, Ternynck T, Avrameas S. The use of avidin-biotin interaction in immunoenzymatic techniques. J Histochem Cytochem 1979; 27(8): NCCLS. Quality assessment for immunocytochemistry; Proposed guideline. 1997; 17(10):MM4-P 3. Department of Health, Education and Welfare, National Institute for Occupational Safety and Health, Rockville, MD. Procedures for the decontamination of plumbing systems containing copper and/or lead azides. DHHS (NIOSH) Publ. No , Current 13. August 16, Protection of laboratory workers from instrumentation biohazards and infectious disease transmitted by blood, body fluids, and tissue; approved guideline. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Villanova, PA 1997; Order code M29-A 5. Wood GS, Warnke R. Suppression of endogenous avidin-binding activity in tissues and its relevance to biotin-avidin detection systems. J Histochem Cytochem 1981; 29: Banerjee D and Pettit S. Endogenous avidin-binding activity in human lymphoid tissue. J Clin Pathol 1984; 37: Ponder BA and Wilkinson MM. Inhibition of endogenous tissue alkaline phosphatase with the use of alkaline phosphatase conjugates in immunohistochemistry. J Histochem Cytochem 1981; 29(8): Naish SJ (ed). Handbook Immunochemical staining methods. Carpinteria: Dako Tubbs RR, Gephardt GM, Petras RE. Specimen processing and quality assurance. In: Atlas of immunohistology. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press Nadji M and Morales AR. Immunoperoxidase techniques, a practical approach to tumor diagnosis. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press Center for Disease Control Manual Guide Safety Management, No. CDC-22, Atlanta, GA. Decontamination of laboratory sink drains to remove azide salts. April 30, 1976 Edition 05/07 ( ) PL_001 s. 6/6