(2)Data zgłoszenia:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: (2)Data zgłoszenia: (51) IntCl6: A61K 39/12 C12N 7/00 Kompozycja wirusowa do szczepionki do zapobiegania infekcyjnej chorobie torebek, u drobiu, szczepionka do zapobiegania infekcyjnej chorobie torebek u drobiu ( 5 7 ) oraz sposób otrzymywania szczepionki do zapobiegania infekcyjnej chorobie torebek u drobiu (30) Pierwszeństwo: , IL, (73) Uprawniony z patentu: ABIC LTD, Netanya, IL (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 12/94 (72) Twórca wynalazku: Bezalel Gutter, Jerozolima, IL (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 11/99 (74) Pełnomocnik: Kuźnicka-Łukomska Barbara (57) 1. Kompozycja wirusowa do szczepionki do zapobiegania infekcyjnej chorobie torebek u drobiu, znamienna tym, że zawiera atenuowany szczep wirusa infekcyjnej choroby torebek wybrany ze szczepów zdeponowanych w ECACC pod nr V (MB), nr V (MB-2) lub nr V (MB-1), w postaci liofilizowanej. 2. Szczepionka do zapobiegania infekcyjnej chorobie torebek u drobiu zawierająca skuteczną uodporniająco ilość żywego atenuowanego wirusa infekcyjnej choroby torebek oraz znane substancje pomocnicze, znamienna tym, że zawiera wirus wybrany ze szczepów zdeponowanych w ECACC pod nr V (MB), nr V (MB-2) lub nr V (MB-1) albo mieszaninę co najmniej dwu z tych szczepów. 10. Sposób otrzymywania szczepionki do zapobiegania infekcyjnej chorobie torebek u drobiu polegający na hodowaniu wirusa infekcyjnej choroby torebek w zawierających zarodek jajkach kurzych, fibroblastach zarodków kurczaków albo linii komórkowej vero, zebraniu materiału wirusowego i homogenizowaniu przez dodanie stabilizatora stosowanego zwykle w żywych szczepionkach, znamienny tym, że hoduje się co najmniej jeden wirus infekcyjnej choroby torebek, którym jest wirus jednego ze szczepów zdeponowanych w ECACC pod nr V (MB), nr V (MB-1) lub nr V (MB-2).

2 Kompozycja wirusowa do szczepionki do zapobiegania infekcyjnej chorobie torebek u drobiu, szczepionka do zapobiegania infekcyjnej chorobie torebek u drobiu oraz sposób otrzymywania szczepionki do zapobiegania infekcyjnej chorobie torebek u drobiu Zastrzeżenia patentowe 1. Kompozycja wirusowa do szczepionki do zapobiegania infekcyjnej chorobie torebek u drobiu, znamienna tym, że zawiera atenuowany szczep wirusa infekcyjnej choroby torebek wybrany ze szczepów zdeponowanych w ECACC pod nr V (MB), nr V (MB-2) lub nr V (MB-1), w postaci liofilizowanej. 2. Szczepionka do zapobiegania infekcyjnej chorobie torebek u drobiu zawierająca skuteczną uodporniająco ilość żywego atenuowanego wirusa infekcyjnej choroby torebek oraz znane substancje pomocnicze, znamienna tym, że zawiera wirus wybrany ze szczepów zdeponowanych w ECACC pod nr V (MB), nr V (MB-2) lub nr V (MB-1) albo mieszaninę co najmniej dwu z tych szczepów. 3. Szczepionka według zastrz. 2, znamienna tym, że zawiera żywy atenuowany szczep wirusa infekcyjnej choroby torebek zdeponowany w ECACC pod nr V (MB). 4. Szczepionka według zastrz. 2, znamienna tym, że zawiera żywy atenuowany szczep wirusa infekcyjnej choroby torebek zdeponowany w ECACC pod nr V (MB-2). 5. Szczepionka według zastrz. 2, znamienna tym, że zawiera żywy atenuowany szczep wirusa infekcyjnej choroby torebek zdeponowany w ECACC pod nr V (MB-1). 6. Szczepionka według zastrz. 2, znamienna tym, że zawiera wodę jako nośnik. 7. Szczepionka według zastrz. 2, znamienna tym, że zawiera skuteczną uodporniająco ilość wynoszącą od około do EID50 na dawkę. 8. Szczepionka według zastrz. 2, znamienna tym, że zawiera skuteczną uodporniająco ilość co najmniej jednego dodatkowego wirusa choroby drobiu. 9. Szczepionka według zastrz. 8, znamienna tym, że wspomniany dodatkowy wirus choroby drobiu jest lentogenicznym wirusem choroby New Castle lub wirusem choroby Ma reka, lub infekcyjnym wirusem bronchitu. 10. Sposób otrzymywania szczepionki do zapobiegania infekcyjnej chorobie torebek u drobiu polegający na hodowaniu wirusa infekcyjnej choroby torebek w zawierających zarodek jajkach kurzych, fibroblastach zarodków kurczaków albo linii komórkowej vero, zebraniu materiału wirusowego i homogenizowaniu przez dodanie stabilizatora stosowanego zwykle w żywych szczepionkach, znamienny tym, że hoduje się co najmniej jeden wirus infekcyjnej choroby torebek, którym jest wirus jednego ze szczepów zdeponowanych w ECACC pod nr V (MB), nr V (MB-1) lub nr V (MB-2). * * * Przedmiotem wynalazku jest kompozycja wirusowa do szczepionki do zapobiegania infekcyjnej chorobie torebek u drobiu, szczepionka do zapobiegania infekcyjnej chorobie torebek u drobiu oraz sposób otrzymywania szczepionki do zapobiegania infekcyjnej chorobie torebek u drobiu (Infectious Bursal Disease - IBD). Infekcyjna choroba torebek w drobiarstwie jest powodowana wirusem, który należy do grupy wirusów BIRNA. Te wirusy są względnie trwałe w niskim ph, eterze oraz chloroformie. Zawierają dwa fragmenty podwójnie splecionego RNA, który koduje ich wirusowe białka. Znane są dwa typy serologiczne, mianowicie typ serologiczny I, który powoduje chorobę IBD u kurczaków i typ serologiczny II, wyodrębniony z indyków, nie powodujący choroby

3 kurczaków. Rodzime przeciwciała jednego typu nie zabezpieczają przeciwko typowi drugiemu. Homologiczne przeciwciała zabezpieczają jednakże kurczęta przeciwko chorobie. Infekcja chorobowa torebek u drobiu jest rozpowszechniona i powoduje ogromne straty ekonomiczne. Dotknięte chorobą kurczaki cierpią na biegunkę, krwotok mięśniowy, nerkozę torebki Fabriciusa i ciężkie uszkodzenie systemu immunologicznego. Śmiertelność jest wysoka, a kurczęta przeżywające chorobę wolniej rosną i są bardzo wrażliwe na inne choroby. Przez lata udoskonalono żywe, o osłabionym działaniu szczepionki. Na przykład rozwiązanie według patentu USA nr ujawnia skuteczną szczepionkę przeciwko IBD, zawierającą osłabione wirusy IBD, uzyskane w drodze wielokrotnych przeniesień z organizmu do organizmu. Opis patentowy USA nr ujawnia skuteczną szczepionkę przeciwko IBD, zawierającą osłabione wirusy IBD, otrzymane w drodze wyodrębniania z młodych myszy. Opis patentowy USA nr ujawnia żywą lub nieaktywną szczepionkę skuteczną przeciwko IBD w drobiarstwie przez jednorazowe podanie szczepionki ptakom w określonym wieku, która zawiera wirusy zdeponowane pod nr ATCC VR Ta szczepionka nie jest chorobotwórcza i może bezpośrednio przebić się przez rodzime przeciwciała wytwarzane na zwykłym poziomie, bez uszkodzenia rodzimej odporności ptaków na tę chorobę, dlatego jest używana w drobiarstwie. Szczepionkę uzyskuje się w 4 operacjach oczyszczania zarazków, dwukrotnie przenoszonych w jajach. Opis patentowy USA nr ujawnia szczepionkę skuteczną przeciwko IBD w drobiarstwie, zawierającą osłabiony lub nieaktywny wirus IBD szczepu VR 2161 i nośnik lub rozpuszczalnik wirusa, która może być podana drobiowi bez wywoływania symptomów IBD u zaszczepionych ptaków. Takie szczepionki były zazwyczaj podawane w wodzie do picia i aż do roku 1988 wywoływały dobrą odporność. Zgłoszenie patentowe PCT nr WO ujawnia szczepionkę zabezpieczającą drób przed IBD, powodowaną przez szczepy bakteryjne niewrażliwe na znane wówczas szczepionki (szczepy nieznane), zawierającą zabity lub osłabiony, nowo oczyszczony wirus IDB opisany w zgłoszeniu. W 1988 roku, początkowo w Anglii i Holandii, a później w innych częściach świata, ujawnił się nowy szczep, będący bardzo chorobotwórczym, powodował dużo wyższą śmiertelność niż poprzednie szczepy. Istniejące żywe osłabione szczepionki już nie chroniły przed nowymi szczepami. Nowe szczepy wyodrębnione w Europie, jak się okazało, nie są antyge nowo różne ód znanych, zwanych klasycznymi. Z drugiej strony, w USA został wyodrębniony wariant szczepów, który różnił się od klasycznych szczepów, kiedy go sprawdzono systemem jednoklonowych przeciwciał. Izraelskie wyodrębnienia, będące przedmiotem wynalazku zostały przetestowane, są podobne do europejskich szczepów. Nieskuteczność starych szczepionek przeciwko nowym szczepom jest spowodowana, między innymi, przez najbardziej chorobotwórczy z nowych szczepów, będący w stanie przenikać przez rodzime przeciwciała, przenosząc się z kur niosek na kurczaki. Po szczepieniu nowo wyklutych piskląt stare wirusy wprowadzone w ten sposób są nieaktywne z powodu rodzimych przeciwciał. Okres połowicznego zaniku roztworu rodzimych przeciwciał wynosi po wykluciu około 5 dni. Jeśli szczepienie jest przesunięte do wieku, w którym żadne rodzime przeciwciała nie mogą być wykryte, kurczaki są narażone na bardzo duże ryzyko: mogą być zainfekowane przez chorobotwórcze środowisko szczepu, zanim zostaną uodpornione przez szczep szczepionki. Dlatego właśnie wierzono, że szczepionki powinny być w pewnym stopniu chorobotwórcze, aby mogły przebić się przez rodzime przeciwciała zanim środowisko szczepu zadziała, mianowicie powinny być średnio zjadliwe. Ostatnio, H. J. Tsai i Y. M. Saif [Avian Diseases 36: (1992)] opisali dwa warianty szczepów IBD (IN and E), które zostały przystosowane i przeniosły się do sieci komórkowej małpiej nerki (BGM-70). Pasażowanie w linii komórkowej daje zmniejszenie chorobotwórczości, podczas gdy antygenowość i immunogenność zostały utrzymane. Jednakże żadna ochrona przeciwko chorobie nie została wywołana, kiedy pasażowane wirusy zostały podane kurczakom wolnym od specyficznego czynnika chorobotwórczego (SPF), jako żywe szczepionki. W przeciwieństwie, niniejszy wynalazek dotyczy wirusów, które po pasażowaniu straciły nieco ze swojej chorobotwórczości, ale zatrzymały antygenowość i nadają odporność drobiowi.

4 Przedmiotem wynalazku jest kompozycja wirusowa do szczepionki do zapobiegania infekcyjnej chorobie torebek u drobiu, która charakteryzuje się tym, że zawiera atenuowany szczep wirusa infekcyjnej choroby torebek wybrany ze szczepów zdeponowanych w ECACC pod nr V (MB), nr V (MB-2) lub nr V (MB-1), w postaci liofilizowanej. Wynalazek dotyczy także szczepionki do zapobiegania infekcyjnej chorobie torebek u drobiu, zawierającej skuteczną uodporniająco ilość żywego atenuowanego wirusa infekcyjnej choroby torebek oraz znane substancje pomocnicze. Szczepionka według wynalazku charakteryzuje się tym, że zawiera wirus wybrany ze szczepów zdeponowanych w ECACC pod nr V (MB), nr V (MB-2) lub n r V (MB-1) albo mieszaninę co najmniej dwu z tych szczepów. Szczepionka według wynalazku może zawierać wodę jako nośnik. Skuteczna uodporniająco ilość może wynosić od około 101 do EID50 na dawkę. Szczepionka może zawierać żywy atenuowany szczep wirusa infekcyjnej choroby torebek zdeponowany w ECACC pod nr V (MB); żywy atenuowany szczep wirusa infekcyjnej choroby torebek zdeponowany w ECACC pod nr V (MB-2) lub żywy atenuowany szczep wirusa infekcyjnej choroby torebek zdeponowany w ECACC pod nr V (MB-1). Wynalazek obejmuje trzy nowe szczepy wirusowe zdeponowane w ECACC pod nr V (MB), nr V (MB-2) i nr V (MB-1). Szczepionka według wynalazku może zawierać skuteczną uodporniająco ilość co najmniej jednego dodatkowego wirusa choroby drobiu. Dodatkowym wirusem choroby drobiu może być lentogeniczny wirus choroby New Ca stle lub wirus choroby Mareka, lub infekcyjny wirus bronchitu. Wynalazek dotyczy również sposobu otrzymywania żywej szczepionki do zapobiegania infekcyjnej chorobie torebek u drobiu, zawierającej skuteczną uodporniająco ilość wirusa zdeponowanego w ECACC pod nr V (MB) i/lub nr V (MB-2) i/lub nr V (MB-1). Sposób otrzymywania szczepionki do zapobiegania infekcyjnej chorobie torebek u drobiu polegający na hodowaniu wirusa infekcyjnej choroby torebek w zawierających zarodek jajkach kurzych, fibroblastach zarodków kurczaków albo linii komórkowej vero, zebraniu materiału wirusowego i homogenizowaniu przez dodanie stabilizatora stosowanego zwykle w żywych szczepionkach, charakteryzuje się tym, że hoduje się co najmniej jeden wirus infekcyjnej choroby torebek, którym jest wirus jednego ze szczepów zdeponowanych w ECACC pod nr V (MB), nr V (MB-1) lub nr V (MB-2). Jak stwierdzono powyżej, skuteczne szczepienie drobiu powinno mieć miejsce we wczesnym wieku, przed zaniknięciem rodzimych przeciwciał, aby umknąć narażania kurcząt na wysokie ryzyko zainfekowania przez chorobotwórcze szczepy. Dlatego sądzi się, że skuteczny szczep powinien utrzymywać pewną chorobotwórczość, aby móc przebić się przez matczyne przeciwciała. Trzy nowe szczepy według wynalazku, MB, MB-2 i MB-1, mają żądane parametry, będąc średnio chorobotwórczymi, przebijając się przez matczyną odporność, ale nie będąc tak zakaźnymi aby spowodować chorobę. Kiedy testowano kurczaki SPF pozbawione przeciwciał IBD, szczep MB-1 był nieco mniej chorobotwórczy niż szczep MB, zaś szczep MB-2 jeszcze mniej chorobotwórczy. Wszystkie trzy szczepy wywołują dobrą odporność, kiedy są podawane w wodzie pitnej, nawet we wczesnym wieku 1-2 tygodni i nie są szkodliwe dla brojlerów o rodzimej odporności lub zastępczego rodzica i niosek. W następstwie szczepienia występuje jednak w pewnym stopniu atrofia torebek. Oryginalne szczepy zostały wyodrębnione z torebek Fabriciusa brojlerów, które padły z powodu IBD na dwóch fermach w środkowej części Izraela na przestrzeni roku Ten wirus może wzrastać w zawierających zarodek jajkach kurzych, jak również w hodowlach komórkowych, takich jak hodowla tkankowa fibroblastów zarodków kurczaków (CEF), linia komórkowa vero i inne odpowiednie hodowle. Komórki hoduje się do 80% wzrostu w butelkach, kolbach, mikronośnikach lub w inny sposób, służący wzrostowi. 3-4 dni po infekcji

5 cyłopatologiczny efekt (CPE) jest uformowany i wirus zbiera się przez zamrożenie i odmrożenie, a następnie odwirowanie z małą prędkością. Do supernatantu dodaje się stabilizatory dla procesu suszenia sublimacyjnego. Atenuowanie i propagacja wirusa będzie opisana szczegółowo w następujących przykładach. Przygotowanie szczepionki Jaja zawierające zarodek szczepi się, zbiera zarodki i błony, a żywą szczepionkę przygotowuje z otrzymanego z nich jednorodnego materiału, z dodatkiem stabilizatora normalnie używanego w żywych ptasich szczepionkach, takiego jak pepton, laktoza, mleko w proszku itp. Stosowane dawkowanie, w przypadku żywych szczepionek, może zawierać się w przedziale EID50 (EID50 = dawka zakaźna jajka w 50%). Żywa szczepionka według wynalazku może zawierać pojedynczy szczep wspomnianego wirusa lub mieszaninę dwóch wspomnianych szczepów lub nawet mieszaninę wszystkich wspomnianych szczepów wirusowych. Każda z żywych szczepionek według wynalazku może także zawierać inne wirusy, np. wirus New Castle, wirus choroby Mareka lub infekcyjny wirus bronchitu (Infectious Bronchitis virus). Szczepionkę podaje się kurczakom poprzez możliwe sposoby szczepienia, np. w wodzie pitnej, przez wkraplanie do oka, sposoby aerozolowe lub inne sposoby rozpylania, przez podawanie kropli do nosa i każdy inny odpowiedni znany sposób szczepienia. Szczepione kurczęta żywą szczepionką zawierającą wirus MB i/lub MB-2 i/lub MB-1 reagują wydzielaniem i specyficznego rodzaju neutralizowaniem przeciwciał, zostają uodpornione na następne infekcje izraelskim zakaźnym wirusowym szczepem IBD, jak również na infekcje europejskich szczepów bakteryjnych. W ten sposób szczepionki według wynalazku wywołują powszechną odporność przeciwko IBD. Przykład I. Atenuowanie szczepów. Oryginalne wirusy zostały wyodrębnione z torebek Fabriciusa brojlerów, które padły z powodu IBD na dwóch fermach w środkowej części Izraela w ciągu roku Torebki zostały zmielone, odwirowane i przefiltrowane przez sączek o oczkach 0,2 mikrometra. Filtraty zostały wstrzyknięte do jamy omoczniowej 1 1-dniowych zarodków w jajach kurzych SPF. Po okresie inkubacji przez godzin, zarodki i błony zostały zebrane, poddane homogenizacji i ponownie wstrzyknięte seryjnie do zawierających zarodki jaj kurzych w celu atenuowania. Szczep MB (ECACC nr V ) był pasażowany 43 razy, szczep MB-1 (ECACC nr V ) był pasażowany 94 razy i szczep MB-2 (ECACC nr V ), wyodrębniony z innej fermy, był pasażowany 71 razy. Pasażowane szczepy były liofilizowane i użyte do wykorzystania. Przykład II. Szczepienie kurcząt brojlerów posiadających rodzimą odporność szczepionką MB. Kurczęta brojlerów (15 w grupie) zostały zaszczepione w różnym wieku: pojedyncze szczepienia w 2, 7 lub 14 dniu, lub dwa szczepienia w 2 i 14 dniu (Tabela 1). Kurczęta zostały odizolowane w grupach podczas prowadzonego eksperymentu. Szczepionki podawano w wodzie pitnej systemem 103,35 EID 50 MB wirusów w dawce. Rodzimych przeciwciał w 2, 7 i 14 dniu po wylęgnięciu było 11/11, 6/10 i 2/10 odpowiednio (ilość AGP dodatniego/ilość przetestowanych; AGP = Agar Gel Percippitin - osad żelowatego agaru). Oszacowano skuteczność w 28 dniu dwiema metodami. (a) Reakcji serologicznej: opadania przeciwciał (AGP) lub enzymatyczne oznaczanie połączeń sorbentów odpornościowych (ELISA). Znaleziono bardzo dobrą korelację obu systemów. (b) Ochrona przeciwko próbie szczepienia: w wieku 28 dni ptakom podano doocznie izraelski zjadliwy szczep wirusowy IBD EID50 na każde kurczę. Podano także w próbie wirus Weybridge 52/70 szczepu bakteryjnego. Trzy dni później ptaki zostały poświęcone (zabite) i ich torebki Fabriciusa przetestowane na obecność wirusa IBD za pomocą testu AGP. Uodpornione ptaki miały ujemne serum, podczas gdy podatność ich była pozytywna. Identyczne rezultaty uzyskano dla próby zjadliwego izraelskiego szczepu IBD i Weybridge 52/70

6 szczepów. W ten sposób szczepionki według wynalazku wywołują odporność przeciwko izraelskim i europejskim szczepom. Proporcja wagowa torebka/ciało została obliczona i torebki zostały przetestowane dla określenia uszkodzeń histopatologicznych. Wszystkie grupy były także zaszczepione żywą dostępną w handlu szczepionką choroby New Castle (NDV) w wieku 14 dni. Szczepienie w wieku (dni) Reakcja serologiczna na IBD AGP ELISA Tabela 1 Ptaki chronione przeciwko próbie Przeciwciała do NDV (HI) Waga ciała (g) 2 0/14* 1/14 2/12** 3,6 ± 0, ± /14 13/14 14/14 3,1 ± 0, ± /14 7/14 14/14 3,5 ± 0, ± /15 15/15 14/14 3,8 ± 0, ± 83 kontrol. 0/8 0/8 0/8 3,8 ± 0,9 995 ± 88 * ilość dodatnich/ilość testowanych ** ilość chronionych/ilość testowanych Z wyników pokazanych w tabeli 1 można zauważyć, że kurczęta były chronione, kiedy zostały zaszczepione szczepionką szczepu bakteryjnego MB w wieku 7 dni lub starsze. W 7 dniu około połowa zareagowała serologicznie i wszystkie z nich były chronione przeciwko próbie. W 14 dniu wszystkie ptaki były uodpornione, jak widać serologicznie i na próbkę. Żadna ochrona nie została zaobserwowana, kiedy szczepienie miało miejsce w wieku 2 dni. Proporcja wagowa torebka/ciało 3 dni po wystawieniu na działanie zjadliwego wirusa była bliska 25% w niechronionych grupach (sprawdzane i szczepione w 2 dniu) i wynosiła 0,07% w chronionych grupach (2 ± 14, 7 i 14 dni). Ta liczba wskazuje, że wirus przerwał się przez matczyne przeciwciała i spowodował zanik choroby. Sprawdzian histopatologiczny ujawnił łagodne zubożenie limfocytów. Reakcja na szczepienie NDV w grupach zaszczepionych szczepionką IBD była podobna do kontrolowanej grupy. Waga ciała zaszczepionych szczepionką IBD ptaków w końcu eksperymentu była statystycznie różna niż kontrolowanej grupy. Przykład III. Szczepienie doustne lub aerozolowe kurcząt brojlerów szczepionką MB i MB-1. Kurczęta odizolowane od 1 dnia zostały zaszczepione w wieku 12 dni (grupa 1 i 2, szczepionka MB lub MB-1) lub w wieku dni (grupa 3 i 5, szczepionka MB) dawką 103,65 EID50. Ptaki zostały zaszczepione żywą szczepionką NDV (szczep VH) w wieku dni drogą dooczną (grupy 1-4) lub w wieku dni drogą aerozolową (grupy 5-6). W grupie 5 zastosowano kombinację szczepienia aerozolowego szczepionką IBDV (MB) indv (VH). Kurczęta zostały próbnie zaszczepione w wieku 29 dni i zabite 3 dni później. Dnia 1 10/10 kurcząt miało rodzime przeciwciała. Szczepionki MB i MB-1 wywołały wspaniałą ochronę przeciwko próbnemu szczepieniu i umiarkowaną serologiczną reakcję, kiedy podane zostały w wodzie do picia lub aerozolowo. Wydaje się z tego i poprzedniego przykładu, że jedno szczepienie w wieku dni uodparnia tak dobrze jak dwa szczepienia w wieku 1 i dni. Żaden przeciwny efekt wagi ciała lub NDV nie mógł być zaobserwowany, mimo że pewien stopień zaniku choroby był zaobserwowany. Wniosek z tego jest taki, że jednoczesne szczepienie szczepem MB Gumbro i szczepionką choroby New Castle jest możliwe, prowadząc do podobnych wyników jak przy oddzielnych szczepieniach.

7 Tabela 2 Szczepienie IBD Reakcja serol. Szczep Grupa Dni Sposób AGP ELISA Ptaki chronione przeciwko próbie Przeciwciała do NDV (HI) Waga ciała (g) 1 12 dw* MB-1 7/8 7/8 8/8 4,8 ± 0, ± dw MB 7/8 8/8 0/8 4,6 ± 1, ± dw MB 10/16 9/16 16/16 4,3 ± 0, ± kontr /8 0/8 0/8 4,2 ± 0, ± aerozol** MB 10/16 10/16 16/16 4,0 ± 0, ± 99 6 kontr /14 0/14 0/14 4,7 ± 0, ± 102 dw* = woda do picia ** kombinacja szczepionek IBDV + N DV To kombinowane szczepienie zostało podane drogą oddechową przy użyciu techniki aerozolowej, która jest polecana dla szczepienia NDV. Dalej jest pokazane, że szczepienie aerozolowe jest dobrym sposobem masowych szczepień szczepionką MB. Przykład IV. Porównanie szczepu bakteryjnego MB z osłabionym szczepem Win terfield. 14-dniowe kurczęta brojlerów zostały zaszczepione drogą dooczną szczepionką szczepu MB (103,75 EID50 na 1 kurczę) lub szczepem Winterfield (104,28 EID50 na 1 ptaka). Winterfield jest osłabionym szczepem, który nie ochrania stada przeciwko obecnym bardziej chorobotwórczym wirusom. Dwie kontrolowane grupy nie były szczepione szczepionką IBDV. Trzy grupy były szczepione szczepionką NDV w 1 i 17 dniu. W wieku 31 dni wszystkie ptaki były próbnie szczepione. Wyniki są zebrane w tabeli 3. Tabela 3 Szczepienie Przeciwciała przeciwko IBDV NDV IBDV NDV Ochrona przeciwko próbie MB VH 10/10 5,2 10/10 Winterfield VH 0/10 5,1 0/10 - VH 0/18 4,7 0/ /20 2,3 0/20 Z tabeli 3 widać, że: (a) szczep Winterfield nie chroni przeciwko próbnemu szczepieniu ani nie powoduje wytworzenia przeciwciał; (b) szczep MB udziela ochrony i powoduje wysoki poziom przeciwciał; (c) szczep MB nie powodował efektu przeciwnego do efektu przeciwciał NDV. Przykład V. Szczepienie kurcząt szczepionką MB lub MB-2 użytą w różnych dawkach. Szczepienie przeprowadzono w odizolowanej klatce (jedna klatka na 1 grupę poddaną eksperymentowi) metodą wpuszczania kropli do oczu w wieku 7 lub 12 dni. Różne dawki od 101,0 do 103,35 E ID 50 były użyte. W tym przykładzie kurczęta brojlerów przemysłowych, jak i kurczęta SPF zostały zaszczepione, a wyniki są zebrane odpowiednio w tabeli 4 i tabeli 5. W wieku 21 dni (9 lub 14 dni po szczepieniu) ptakom podano próbki. 4 dni później zostały poświęcone, ich torebki przetestowane dla antygenów IBD i proporcja wagowa torebka/ciało została policzona.

8 Tabela 4 Kurczęta brojlerów M.I. Szczepionka Wiek szczepienia (dni) Dawka EID50 Reakcja serologiczna Ochrona przeciwko próbie Proporcja wag. torebki do ciała (%) Waga ciała (g) MB 7 103,35 14/17 17/17 0,07 ± 0, ± 69 MB ,35 9/10 10/10 0,07 ± 0, ± 95 MB ,35 9/11 11/11 0,07 ±0, ± 86 kontrol. - 0/11 0/11 0,29 ± 0, ± 72 MB ,0 5/10 10/10 0,07 ± 0, ± 88 MB ,0 5/10 10/10 0,07 ± 0, ± 94 MB ,0 4/10 10/10 0,10 ± 0, ± 93 Tabela 5 Wiek szczepienia (dni) Dawka EID50 Szczepionka Śmiertelność po szczepieniu Reakcja serologiczna Ochrona przeciwko próbie Proporcja wag. torebki do ciała (%) Waga ciała (g) MB 7 103,35 5/18 7/7 7/7 0,12 ± 0, ± 40 MB ,35 4/15 5/6 6/6 0,11 ± 0, ± 20 MB ,35 4/15 5/6 6/6 0,14 ± 0, ± 33 kontrol. - 0/15 0/3* 0/ 8* 0,43 ± 0, ± 13 MB ,0 0/15 5/8 8/8 0,11 ± 0, ± 27 MB ,0 0/15 7/8 8/8 0,03 ± 0, ± 44 MB ,0 0/15 6/8 8/8 0,12 ± 0, ± 17 * 5 kurczaków odrzucono z 8 padłych w wyniku próby. Antygeny znaleziono w 3 pozostałych przy życiu. Żadna śmierć nie wydarzyła się z powodu próby w jakiejkolwiek z grup zaszczepionych. Można zauważyć (tabela 4 i 5), że szczepionki MB i MB-2 wywołują wspaniałą ochronę przeciwko próbie już w 9 dni po szczepieniu i dobrą reakcję serologiczną, nawet przy dawce tak niskiej jak 101EID50. MB-2 jest mniej chorobotwórcza niż MB (patrz na śmiertelność po szczepieniu kurcząt SPF, tabela 5), wywołuje nieco słabszą reakcję serologiczną. Przykład VI. Szczepienie 1-dniowych kurcząt SPF szczepem MB, MB-1 i MB-2. 1-dniowe kurczęta SPF zostały zaszczepione w odizolowanych klatkach drogą wkro plenia doocznego, 10 EID50 w dawce. W siódmym dniu po szczepieniu część każdej grupy została poświęcona i proporcja wagowa torebki do ciała została obliczona. W wieku 21 dni pozostałe kurczaki zostały poddane próbie, procedura była podobna do opisanej w przykładzie V.

9 Szczepionka 7 dpi* torebka/ciało (proporc. %) Tabela 6 Śmiertelność po szczepieniu Reakcja serologiczna IBD Ochrona przeciwko próbie MB 0,12 ± 0,3 8/18 2/6 6/6 MB-1 0,15 ± 0,4 3/18 0/7 7/7 MB-2 0,12 ± 0,3 0/18 2/9 9/9 Kontrol. 0,29 ± 0,5 0/15 0/8 0/8 *dpi = dni po uodpornieniu. Można zauważyć z tabeli 6, że stopień chorobotwórczości 1-dniowych kurcząt SPF (mierzony proporcją śmiertelności) jest wyższy dla MB, niższy dla MB-1 i wynosi 0 dla MB-2. Ochrona przeciwko próbie jest bardzo dobra dla wszystkich szczepów bakteryjnych. Przykład VII. Identyfikacja wirusowych białek dla analizy. A. Przygotowanie wirusowych białek dla analizy. Kurczęta były hodowane w odizolowaniu aż do wieku 4 tygodni, podzielone w grupy, zainfekowane jak poniżej: grupa 1 była zainfekowana wirusem typu dzikiego patogenicznego, wyodrębnionym w Izraelu, grupa 2 była zainfekowana innym wyodrębnionym IBDV, z którego szczep MB według wynalazku został rozwinięty w drodze przejścia na jaja, grupa 3 była zainfekowana szczepem MB, grupa 4 była zainfekowana następnym wyodrębnionym IBDV, z którego MB-2 został rozwinięty w drodze przejścia na jaja, grupa 5 była zainfekowana szczepem MB-2. Trzy dni po infekcji kurczaki zostały zabite i ich torebki zostały zhomogenizowane, zamrożone i odtajone. Wirusowe cząsteczki każdej grupy stanowiły od 40 do 60% sacharozy podczas ultrawirowania. B. Analiza Western Biota. Poddane terapii SDS białka zostały oddzielone na SDS-PAGE (siarczan, dodecyl, sód poliakrylan, amid, żel, elektroforeza) przez 14 godzin w 9 W. Połowa każdego żelu została zabarwiona na niebiesko i połowa przepuszczona przez filtr hybond-c dla reakcji z ujemnym serum SPF (żel A) lub serum kurczaków powracających do zdrowia (żel B). Żele poddano reakcji z króliczym serum przeciwko kurczętom i z peroksydazą. Zdjęcie 1 jest reprezentatywnym przykładem takiego eksperymentu. Tory 1-5 w każdym żelu odpowiadają w powyżej opisanych szczegółowo grupach 1-5. vp = wirusowe białka. Ze zdjęcia 1 można zauważyć, że zdrowiejące serum (żel B) zareagowało z VP2 i VP3 wirusów IBD, wobec tego ujemne serum SPF nie zareagowało z tymi zawirusowanymi białkami (żel A). Ponadto, można zobaczyć, że: a) VP2 MB i jego sprawcę szczep - tor 2 i 3 - różni wymiar od szczepu dzikiego typu (tor 1), b) VP2 osłabionego szczepu MB-2 (tor 5) zareagował ze zdrowiejącym serum mniej intensywnie niż VP2 jego sprawcę, szczepu (tor 4). Jego położenie w żelu jest podobne do VP2 wszystkich wirusów z wyjątkiem MB i sprawcę MB. Ogromnie ważnym było dowiedzieć się, że MB-2 różni się wyraźnie od jego szczepu sprawczego i że MB różni się bardzo od innych wirusów IBD wyodrębnionych w Izraelu. Przykład VIII. Brak utraty zjadliwości. Celem tego przykładu jest pokazanie, że stopień chorobotwórczości szczepu MB nie zmienia się podczas przechodzenia wirusa z ptaka do ptaka. 15 SPF kurcząt zostało zaszczepionych w wieku 1 dnia szczepionką MB (103,65 EID50 na 1 kurczę). 3 dni później 5 kurcząt zostało poświęconych i ich torebka posłużyła dla infekcji drugiej grupy 1-dniowych kurcząt. 7 dni po każdej infekcji zjadliwość wirusa została zmierzona przez:

10 a) proporcję wagową torebek/ciała; i b) histopatologiczny sprawdzian torebki. Wystąpiło 5 takich kolejnych przeniesień zarazków z ptaka do ptaka. Z każdym przeniesieniem sprawdzana grupa była zainfekowana szczepem MB i zostało dokonane porównanie pomiędzy chorobotwórczością wirusa przeniesionego na kurczę i chorobotwórczością posiewu infekcyjnego MB. Chorobotwórczość pierwszej infekcji MB, wyrażona przez dwa wskaźniki, tj. proporcja wagowa torebka/ciało i rachunek histopatologiczny, została zdecydowanie określona jako 1,00 i nosi nazwę "wskaźnik chorobotwórczości" w tabeli 7. Tabela 7 Roztwór IBDV EID50/ dawka Wskaźnik chorobotwórczościa Torebka/ciało prop.b Histopatologiac Pierwsza MB infekcja 103,65 1,00 1,00 Pierwsze przeniesienie na ptaka > 106,9 0,93 0,88 Drugie przeniesienie na ptaka 105,62 0,92 0,96 Trzecie przeniesienie na ptaka 104,92 1,00 0,96 Czwarte przeniesienie na ptaka 1 0 4,9 3 1,07 1,04 Piąte przeniesienie na ptaka 104,65 0,93 1,04 * wskaźnik chorobotwórczości: chorobotwórczość wirusa przeniesionego na ptaka odpowiada chorobotwórczości pierwszej infekcji MB (określonej jako 1,00), b proporcja torebka/ciało pierwszego zainfekowanego kurczaka m ieściła się od 0,12% do 0,15%, podczas gdy siedmiodniowego ptaka nie zakażonego wyniosła 0,30%, c histopatologiczny wynik: 0 - normalny, bez zubożenia limfocytów, 4 - ciężkie zubożenie lim focytów. Histopatologiczny wynik pierwszej infekcji MB wynosił od 2,5 do 2,9, podczas gdy niezainfekowanej - 0,23. Można z tego wnioskować - tabela 7 - że chorobotwórczość szczepu MB nie wzrosła podczas pięciu przeniesień z ptaka do ptaka. Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 2,00 zł.