Hemoglobina ROZDZIAŁ 19. Elżbieta Kotrys Puchalska. Teresa Jurczak

Transkrypt

1 ROZDZIAŁ 19 Hemoglobina Elżbieta Kotrys Puchalska Teresa Jurczak Hemoglobina (Hb) jest metaloproteiną. Białko to stanowi 95% suchej masy erytrocytów, bardzo słabo rozpuszcza się w wodzie, a dużo lepiej w słabych zasadach. Najważniejszym zadaniem Hb jest jej udział w przenoszeniu tlenu. Hb składa się z czterech polipepdydowych łańcuchów globinowych. Do każdego z łańcuchów przyłączony jest osobnym wiązaniem koordynacyjnym hem. W cząsteczce hemoglobiny znajdują się dwa łańcuchy globinowe (141 aminokwasów) i dwa, lub (146 aminokwasów). Grupa prostetyczna hem, składa się z protoporfiryny IX i jednego atomu dwuwartościowego żelaza (Fe 2+ ). Cztery wiązania koordynacyjne atomu żelaza wiążą się z czterema atomami azotu w pierścieniach pirolowych hemu, piąte służy do połączeń z białkiem przez pierścień imidazolowy histydyny, a do szóstego może być dołączony odpowiedni ligand, np.: tlen, tlenek węgla lub tlenek azotu. Jedna cząsteczka hemoglobiny może wiązać 4 cząsteczki O 2, a także CO lub NO. Stężenie hemoglobiny we krwi pełnej oznacza się po hemolizie krwinek czerwonych i konwersji barwnika do cyjanmethemoglobiny lub oksyhemoglobiny. Stężenie to jest zależne od: liczby krwinek czerwonych we krwi, średniej zawartości Hb w erytrocycie, płci i wieku, stanu fizjologicznego. 273

2 Zmniejszone stężenie hemoglobiny występuje w niedokrwistościach oraz w stanach przewodnienia. Niedokrwistością określa się stan, który charakteryzuje się obniżeniem stężenia hemoglobiny we krwi krążącej w stosunku do wartości uznanych za prawidłowe dla danego wieku i płci. Niedokrwistości na podstawie ich przyczyn powstawania dzielimy na: 1. Niedokrwistości spowodowane nadmierną utratą krwi - pokrwotoczne: utrata krwi (krwotoki), utrata krwi przewlekła (krwawienia jawne lub ukryte z różnych przyczyn). 2. Niedokrwistości na skutek nieprawidłowego wytwarzania erytrocytów lub hemoglobiny: niedoborowe np. niedobór żelaza, witaminy B 12, kwasu foliowego, pirydoksyny, aminokwasów, różnych pierwiastków śladowych np. miedzi, spowodowane nieprawidłowym wykorzystaniem lub wadliwym metabolizmem żelaza (tzw. niedokrwistości syderoachrestyczne) i innych czynników niezbędnych w krwiotworzeniu, hipo- i aplastyczne związanie z nieprawidłowym wytwarzaniem erytrocytów przez szpik lub uszkodzeniem szpiku. 3. Niedokrwistości spowodowane nadmiernym rozpadem krwinek, czyli wrodzone lub nabyte zespoły hemolityczne: zaburzenia wewnątrzpochodne (wrodzone) defekt lub niedobór enzymów (np. kinazy pirogronianowej, dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej): defekt strukturalny krwinek czerwonych, obecność nieprawidłowej hemoglobiny w erytrocytach (np. niedokrwistość sierpowatokrwinkowa). zaburzenia zewnątrzpochodne (nabyte) np.: autoimmunologiczne, polekowe, popromienne. 4. Objawowe - towarzyszące różnym chorobom (zakażeniom, kolagenozom, ołowicy, nowotworom) oraz spowodowane stosowaniem cytostatyków lub promieniowaniem jonizującym. Powyższy podział jest najwygodniejszy ze względów praktycznych, ale w większości przypadków niedokrwistości istnieje kilka czynników równocześnie np. niedokrwistość w przebiegu przewlekłych krwawień może być jednocześnie niedokrwistością niedoborową z powodu wyczerpania zapasów żelaza. 274

3 Podział niedokrwistości oparty na kryteriach morfologicznych uzyskany na podstawie obrazu mikroskopowego krwi obwodowej: mikrocytowe (np. z niedoboru żelaza), makrocytowe (np. niedobór witaminy B 12 lub kwasu foliowego), normocytowe (np. aplastyczne i hemolityczne). Wzrost stężenia hemoglobiny we krwi występuje w różnych postaciach nadkrwistości. Zwiększone stężenie hemoglobiny o charakterze fizjologicznym może występować u osób przebywających na dużych wysokościach. Nadkrwistości o charakterze patologicznym mogą być spowodowane niewydolnością krążenia, wadami serca, czerwienicą, hemoglobinopatiami, nowotworami. Pozorne zwiększenie stężenia hemoglobiny obserwuje się także w zaburzeniach gospodarki wodno-elektrolitowej. Pochodne hemoglobiny Hemoglobina pod wpływem różnych czynników może przekształcać się w pochodne przedstawione na rys utlenienie HCl HEM HEMATYNA HEMINA redukcja NaOH Hb CO + H O 2 (środowisko wodne) +CO +2 Hb(Fe ) utlenienie 3+ Met-Hb(Fe ) KCN Cyjan-Met-Hb redukcja +O 2 Hb O 2 denaturacja denaturacja utlenienie HEMOCHROMOGEN HEMICHROMOGEN redukcja Rysunek Przemiany hemoglobiny i jej pochodnych. 275

4 Do pochodnych hemoglobiny o istotnym znaczeniu biologicznym należą: oksyhemoglobina HbO 2, karbohemoglobina HbCO 2, hemoglobina tlenkowęglowa (HbCO), methemoglobina (MetHb). Mniejsze znaczenie mają hemoglobina tlenkoazotowa (HbNO) i sulfhemoglobina (SHb). Oksyhemoglobina - jest to Hb utlenowana, która bez zmiany wartościowości żelaza może wiązać 4 cząsteczki O 2. Hemoglobina dzięki swej tetramerycznej budowie jest zdolna do znacznych odkształceń allosterycznych podczas przyłączania lub odłączania tlenu. Stopień wysycenia hemoglobiny tlenem zależy od ciśnienia parcjalnego O 2 i CO 2, ph, temperatury, stężenia 2,3-difosfoglicerynianu oraz stężenia soli w środowisku. Hemoglobina utlenowana jest silniejszym kwasem niż hemoglobina odtlenowana. Stąd pobór tlenu w płucach przez erytrocyty wiąże się z obniżeniem w nich ph, co ułatwia pozbycie się przez nie CO 2 transportowane z tkanek. Z drugiej strony w środowisku tkanek obwodowych, gdzie ciśnienie parcjalne CO 2 jest większe, łatwiej dochodzi do odłączenia się O 2 od hemoglobiny. Zjawisko to nosi nazwę efektu Bohra. Krzywa wiązania tlenu przez hemoglobinę ma kształt sigmoidalny. Karbo- lub karbaminohemoglobina - jest to Hb połączona z CO 2. Dwutlenek węgla związany z grupami aminowymi globiny tworzy połączenia karbaminowe. Rola HbCO 2 dla ogólnego transportu CO 2 przez krew jest drugorzędna, ponieważ tylko 20% dwutlenku węgla jest transportowane w postaci karbaminianów. Karboksyhemoglobina - jest to Hb związana z CO. Szybkość reakcji Hb z CO jest około 200 razy większa niż szybkość tworzenia HbO 2. Połączenie HbCO blokuje czynność przyłączania przez hemoglobinę tlenu oraz transport tego gazu. Toksyczność tlenku węgla jest wprost proporcjonalna do ilości tego gazu w powietrzu i czasu działania. Stężenie HbCO u ludzi zdrowych nie przekracza 3% całkowitej zawartości hemoglobiny. Objawy zatrucia spowodowane niedotlenieniem tkanek występują przy zawartości 20% HbCO we krwi. Zatrucie tlenkiem węgla spowodowane wzrostem HbCO we krwi do ponad 60% przebiega z utratą świadomości i jest zwykle śmiertelne. Połączenie Hb z CO jest odwracalne, gdyż HbCO może się rozkładać pod wpływem podwyższonego ciśnienia O 2. Methemoglobina - powstaje w wyniku utlenienia Fe 2+ hemoglobiny (np. żelazicyjankiem potasu) do Fe 3+ bez denaturacji białka. MetHb może in vitro ulec redukcji do Hb przy użyciu środków redukujących np. podsiarczynu sodu. Nie odgrywa ona roli w oddychaniu, gdyż nie łączy się z tlenem. U ludzi zdrowych występuje około 0,7-1,7% methemoglobiny, która pojawia się w wyniku autooksydacji w starzejących się krwinkach. Zwiększenie stężenia 276

5 MetHb może mieć charakter wrodzony lub znacznie częściej nabyty. Przyczyną methemoglobinemii nabytej są substancje zawarte w diecie o działaniu utleniającym np.: azotan(iii) sodowy, chloran(v) potasu, leki pochodne amin aromatycznych (sulfonamidy) i nitrogliceryna. Naturalnymi czynnikami zapobiegającymi powstawaniu MetHb w organizmie są reduktaza methemoglobinowa oraz zredukowany glutation. Podłożem methemoglobinemii wrodzonej jest niedobór reduktaz methemoglobiny lub występowanie patologicznych hemoglobin M, które w obecności tlenu szczególnie łatwo przechodzą w MetHb. Cyjanomethemoglobina (Cyjan-Met-Hb) jest pochodną MetHb powstałą w wyniku jej połączenia z jonami cyjankowymi. Reakcja ta jest podstawą ilościowego oznaczania Hb we krwi metodą Drabkina. W warunkach in vivo Cyjan-Met-Hb może powstać w wyniku reakcji methemoglobiny z jonami cyjankowymi w przypadku zatrucia tymi związkami. Hemoglobina tlenkoazotowa inaczej nitrozyl hemoglobiny (HbNO) powstaje w wyniku reakcji zarówno hemoglobiny, jak i methemoglobiny z NO. Widmo absorpcyjne HbNO w jego części widzialnej charakteryzują dwie smugi absorpcyjne dla długości fali 567 i 542 nm. HbNO odgrywa rolę w transporcie endogennego NO, który ze śródbłonka przenika do erytrocytów i wiąże się z Hb. Ilość powstałej HbNO odzwierciedla stężenie NO i dlatego ta pochodna hemoglobiny coraz częściej jest stosowana jako nieinwazyjny marker oceny funkcji i stanu śródbłonka. Do określenia stężenia HbNO wykorzystuje się metodę EPR (elektronowy rezonans paramagnetyczny). Nitrozylacja hemoglobiny wiąże się także z korzystnym udziałem tego białka w reakcjach chroniących organizm przed wolnymi rodnikami. Sulfhemoglobina (SHb) jest pochodną Hb, która powstaje w wyniku reakcji oksyhemoglobiny z siarkowodorem, siarczanami lub siarczkami. Pojawienie się sulfhemoglobiny we krwi w stężeniu od 3 do 5% jest objawem sulfhemoglobinemii. Przyczyną tego stanu chorobowego jest długotrwałe stosowanie niektórych leków np. fenacetyny lub sulfonamidów. Mioglobina jest barwnikiem oddechowym tkanki mięśniowej, gdzie występuje w ilości 500 mg na 100 g tkanki. Mioglobina wykazuje budowę monomeryczną dzięki czemu ma duże powinowactwo do tlenu. Krzywa wiązania tlenu przez mioglobinę ma kształt hiprboliczny Jest białkiem magazynującym, a nie transportującym tlen. We krwi w warunkach fizjologicznych występuje w ilościach śladowych. Mioglobinurie obserwujemy w wypadkach zmiażdżenia, głębokich oparzeniach, zawale mięśnia sercowego, kolagenozach i porażeniach prądem. 277

6 Odmiany hemoglobiny Część białkowa hemoglobiny składa się z 4 łańcuchów polipeptydowych połączonych wiązaniami jonowymi. W prawidłowych hemoglobinach ludzkich stwierdzono występowanie 5 łańcuchów:,,,,. Prawidłowe Hb ludzkie HbA 1 97,0% [2, 2] HbA 2 2,5% [2, 2] HbF (płodowa) 0,5% [2, 2], we krwi płodu 75% Hb embrionalne Hb Gower I [4] Hb Gower II [2, 2] Pochodne glikowane HbA A 1a1 (0,19%) A 1b (0,48%) A 1a2 (0,19%) A 1c (3,3%) (Wartości procentowe określają fizjologiczny udział poszczególnych hemoglobin we krwi) W stanach chorobowych mogą występować wrodzone zaburzenia dotyczące łańcuchów polipeptydowych, powodujące powstawanie hemoglobin nieprawidłowych. Występowanie w krwinkach zmienionych hemoglobin jest z kolei przyczyną hemoglobinopatii. Rozróżniamy hemoglobinopatie ilościowe i jakościowe: Hemoglobinopatie ilościowe (talasemie) spowodowane są wrodzonym niedostatecznym wytwarzaniem jednego lub dwóch łańcuchów polipeptydowych lub w cząsteczce hemoglobiny. Podłożem molekularnym tych zmian jest delecja fragmentów DNA lub mutacje punktowe. Hemoglobinopatie jakościowe są to genetycznie uwarunkowane zmiany sekwencji aminokwasów w łańcuchach polipeptydowych hemoglobiny. W wyniku mutacji punktowej dochodzić może najczęściej do: o zmiany prawidłowej sekwencji aminokwasów w łańcuchu, o pojawianie się innego łańcucha w miejsce prawidłowego, o braku lub dodatku jednego lub kilku aminokwasów. Odkryto ponad 120 rodzajów hemoglobin patologicznych posiadających zmiany w składzie aminokwasowym łańcuchów, lub. Nawet niewielkie zmiany w strukturze łańcuchów globiny nadają całej Hb odmienne od prawidłowej, właściwości fizykochemiczne, które mogą 278

7 dawać objawy kliniczne np. anemię i żółtaczki. Ze względu na częstość występowania duże znaczenie praktyczne mają hemoglobiny S i M. Najbardziej rozpowszechnioną hemoglobinopatią, szczególnie w Afryce, jest występowanie hemoglobiny S związanej z anemią sierpowatokrwinkową. Metody badania hemoglobiny Metody jakościowe (wykrywanie obecności krwi) Otrzymywanie kryształów Teichmana (kryształki heminy). Odszczepiony hem pod wpływem tlenu z powietrza i w obecności jonów chlorkowych przekształca się w chlorek hematyny, tzw. heminę, która krystalizuje w formie brunatnych igieł. Próba benzydynowa. Hemoglobina ze względu na swą budowę (obecność hemu) może zachowywać się jak peroksydaza tzn. katalizuje reakcję pomiędzy H 2 O 2, a substancjami ulegającymi utlenieniu np. benzydyną. Powstaje niebieski barwnik. Hemoglobina wchodzi w tą reakcję nawet po ogrzaniu do wrzenia. Próba benzydynowa jest mało specyficzna, ale bardzo czuła i znalazła szerokie zastosowanie przy wykrywaniu śladów krwi np. w moczu, soku żołądkowym. Ilościowe oznaczanie hemoglobiny Metody kolorymetryczne metoda Drabkina. Metody chemiczne polegają na określeniu ilości żelaza w próbce i wyliczeniu na tej podstawie Hb, która zawiera 0,336% Fe. Metody gazometryczne określają ilość tlenu zawartego w badanej próbie. Na tej podstawie wylicza się Hb, której 1 g może wiązać 1,34 ml O 2. Badania widm hemoglobiny i jej pochodnych Każdy związek chemiczny z grupy hemoprotein cechuje się własnym charakterystycznym widmem absorpcji światła. Widma absorpcyjne powstają, jeżeli na drodze światła pochodzącego ze źródła o widmie ciągłym znajduje się warstwa pochłaniająca, np. barwnej cieczy. Widma absorpcyjne składają się z czarnych prążków i pasm (promieniowanie pochłonięte), które występują na tle promieniowania przepuszczonego. Wiązka światła białego ulega rozszczepieniu w spektroskopie na barwy składowe mające określoną długość fal. Badając widma różnych typów hemoglobin, stwierdza się w nim pasma absorpcyjne zawarte między określonymi liniami Fraunhoffera i odpowiadające pochłonięciu przez roztwory charakterystycznych dla nich długości fal (rys ). Niezależnie od widm 279

8 specyficznych dla poszczególnych hemoprotein, każda z nich wykazuje obecność szerokiego pasma absorpcji przy nm. Jest to tzw. pasmo Soreta, zależne od obecności pierścienia porfirynowego. Analiza widmowa hemoglobin przy użyciu spektroskopu ma praktyczne zastosowanie w medycynie sądowej np. do szybkiego rozpoznania zatrucia tlenkiem węgla. Różnice w zdolności pochłaniania światła przez pochodne hemoglobiny można także analizować przy pomocy spektrofotometru. Zarejestrowane graficznie widma absorpcyjne różnią się między sobą ilością i położeniem maksimów (tzw. pików) odpowiadających liczbie pasm absorpcyjnych charakterystycznych dla określonej hemoglobiny. Elektroforeza hemoglobin Metodą elektroforezy można wykryć nieprawidłowe hemoglobiny o zmienionym ładunku elektrycznym, m.in. hemoglobiny C, D, M, S. Techniką tą można też rozdzielić prawidłowe hemoglobiny: A, A 2 i F. Elektroforezę hemoglobin wykonuje się na żelu skrobiowym, agarozowym, bibule chromatograficznej lub octanie celulozy. Chromatografia na DEAE celulozie Przy ph = 8,5 HbA adsorbuje się silniej na DEAE celulozie niż HbA 2. Pozwala to na rozdział tych hemoglobin. Metody strąceniowe Niektóre hemoglobiny w określonych warunkach (ph, temperatura) szybciej wytrącają się z roztworu lub pozostają w nim dłużej. Po odwirowaniu tak rozdzielone hemoglobiny oznacza się ilościowo metodą Drabkina. Metody strąceniowe służą do oznaczania hemoglobiny płodowej (HbF), karboksyhemoglobiny (HbCO) oraz hemoglobin nietrwałych. 280

9 B C D E b F nm żółta zielona niebieska oksyhemoglobin a 555 hemoglobina methemoglobina obojętna karboksyhemoglobin a hematyna kwaśna 620 hematyna zasadowa hematyna zredukowana hemochromogen porfiryny w roztworze kwaśnym Rysunek Schematyczne przedstawienie widm absorbcyjnych barwnika krwi i niektórych jego pochodnych. 281

10 CZĘŚĆ PRAKTYCZNA ĆWICZENIE 1 Oznaczanie stężenia hemoglobiny we krwi metodą Drabkina ZASADA METODY Wszystkie pochodne hemoglobiny poza sulfhemoglobiną ulegają pod wpływem żelazicyjanku potasu utlenieniu do methemoglobiny, która z cyjankiem potasu daje cyjanomethemoglobinę o barwie czerwonobrunatnej. MATERIAŁ BADANY Krew ODCZYNNIKI Odczynnik Drabkina (preparat handlowy) o następującym składzie: NaHCO 3-1 g, K 2 CO 3-0,1 g, KCN - 0,05 g, K 3 [Fe(CN) 6 ] - 0,2 g, woda destylowana do 1000 ml Wzorcowy roztwór cyjanomethemoglobiny (preparat handlowy) WYKONANIE Do trzech probówek dodać następujące odczynniki: Odmierzyć (ml) Próba badana Próba wzorcowa Próba odczynnikowa wzorzec - 2,0 - woda destylowana - - 0,02 odczynnik Drabkina 5,0-5,0 krew 0, Zawartość probówek wymieszać, po 20 min zmierzyć absorbancję prób wzorcowej i badanej względem próby odczynnikowej, przy długości fali 540 nm. Uwaga Dokładnie odpipetować małą objętość krwi, specjalną pipetą hematologiczną! 282

11 Obliczenia Stężenie Hb we krwi obliczyć według wzoru: c A A B W st. wzorca( g / dl) ĆWICZENIE 2 Oznaczanie stężenia hemoglobiny w surowicy metodą Drabkina Zwiększone stężenie hemoglobiny i jej pochodnych w osoczu (surowicy) występuje w niedokrwistościach hemolitycznych z hemolizą wewnątrznaczyniową po przetoczeniu krwi niecałkowicie zgodnej grupowo, w napadowej nocnej hemoglobinurii, po wzmożonym wysiłku. Hb pozakrwinkowa utrzymuje się w osoczu tylko przez kilka do kilkunastu godzin po epizodzie hemolizy. ZASADA METODY Jak w ćwiczeniu 1. MATERIAŁ BADANY Surowica ODCZYNNIKI Jak w ćwiczeniu 1. WYKONANIE Do trzech próbówek dodać następujące odczynniki: Odmierzyć (ml) Próba badana Próba wzorcowa Próba odczynnikowa wzorzec - 2,0 - woda destylowana - 0,5 odczynnik Drabkina 2,0-2,0 surowica 0,5 - - Zawartość probówek wymieszać, po 20 min zmierzyć absorbancję prób wzorcowej i badanej względem próby odczynnikowej, przy długości fali 540 nm. 283

12 Obliczenia Stężenie Hb w surowicy obliczyć według wzoru: c A A B W st. wzorca( mg / dl) ĆWICZENIE 3 Oznaczanie zawartości hemoglobiny tlenkowęglowej (karboksyhemoglobiny) metodą Wolffa ZASADA METODY Karboksyhemoglobina jest bardziej odporna na strącanie w podwyższonej temperaturze (55 o C) przy ph=5 w porównaniu z innymi barwnikami krwi. Po koagulacji i odwirowaniu innych składników krwi, COHb pozostaje w roztworze. Stężenie niewytrąconej hemoglobiny tlenkowęglowej oznaczamy metodą Drabkina. MATERIAŁ BADANY Krew nasycona tlenkiem węgla ODCZYNNIKI Odczynnik Drabkina Bufor octanowy Wolffa o ph 5,0 WYKONANIE Do dwóch próbówek zawierających po 4 ml buforu octanowego ph=5 dodać po 1 ml krwi zwykłej oraz nasyconej tlenkiem węgla. Próby z buforem wstawić na 5 min. Do łaźni wodnej o temp. 55 o C, następnie ochłodzić i odwirować (3000 obr./min przez 5 min.). Porównać zabarwienie supernatantów. W supernatancie z karboksyhemoglobiną oznaczyć stężenie hemoglobiny metodą Drabkina. UWAGA Uwzględniając rozcieńczenie trzeba wziąć 100 l supernatantu do 4,9 ml odczynnika Drabkina. 284

13 Obliczyć procentową zawartość karboksyhemoglobiny w stosunku do hemoglobiny całkowitej. ĆWICZENIE 4 Badanie widma hemoglobiny i jej pochodnych przy pomocy spektrofotometru Przy pomocy spektofotometru narysować widma hemoglobiny i jej pochodnych w zakresie 400 do 700 nm. Określić położenie maksimów i porównać z danymi literaturowymi wypełniając tabelkę: Rodzaj hemoglobiny Hb HbO 2 HbCO MetHb Cyjan-Met-Hb Długość fali dla maksimum teoretyczna:555 nm praktyczna: teoretyczna:541 nm 577 nm - - praktyczna: teoretyczna:540 nm 559 nm 570 nm - praktyczna: teoretyczna:500 nm 542 nm 578 nm 630 nm praktyczna: teoretyczna:540 nm praktyczna: ĆWICZENIE 5 Ocena spektroskopowa widm hemoglobiny i wybranych jej pochodnych Przy pomocy spektroskopu zaobserwować różnice w ilości pasm absorpcyjnych w widmach wybranych pochodnych hemoglobiny. 285