Pochodzenie myszy laboratoryjnych

Transkrypt

1 Genetyka i modyfikacje genetyczne zwierząt laboratoryjnych na przykładzie myszy domowej Budowa myszy laboratoryjnej Marta Gajewska Zakład Genetyki Pracownia Hodowli Zwierząt Laboratoryjnych Centrum Onkologii Instytut im. Marii Skłodowskiej Curie w Warszawie Wykwalifikowany personel Zaplecze techniczne Mysz właściwa Pochodzenie myszy laboratoryjnych Spokrewnienie i inbred Współczynnik spokrewnienia określa, jaka część genów ocenianych osobników jest identyczna ze względu na pochodzenie od wspólnych przodków Współczynnik inbredu wskazuje na prawdopodobieństwo spotkania się w formie homozygotycznej alleli pochodzących od wspólnego przodka Yoshiki i Moriwaki, ILAR Journal (2006) 1

2 Podstawowe grupy hodowlane zwierząt laboratoryjnych Stado niekrewniacze Kolonia zamknięta Linia selekcyjna Szczep wsobny Zwierzęta krzyżówkowe Zasady hodowli stad niekrewniaczych Kojarzenia losowe lub kontrolowane (np. wg systemu hanowerskiego) Utrzymanie istniejącego poziomu zmienności genetycznej (zachowanie puli genowej) Minimalizacja przyrostu inbredu Utrzymanie odpowiednio liczebnej populacji Nazewnictwo stad niekrewniaczych Zasady hodowli linii selekcyjnych Symbol stada powinien składać się z 2-4 dużych liter poprzedzonych kodem hodowcy lub ośrodka. Kod składa się z 1-3 liter, z których tylko pierwsza jest duża i oddzielony jest dwukropkiem od symbolu stada. Han:NMRI Kod hodowcy przed nazwą stada jest znakiem rozpoznawczym stada niekrewniaczego Selekcja na wybraną cechę lub cechy Utrzymanie przez pokolenia tego samego systemu selekcji (dośrodkowa, odśrodkowa, kierunkowa) Precyzyjne określenie kryteriów selekcji Monitorowanie efektów selekcji Efekt plateau selekcyjnego 2

3 Zasady hodowli szczepu wsobnego Kojarzenia kierowane w najbliższym możliwym pokrewieństwie Minimalizacja zmienności genetycznej Minimalizacja zmienności środowiskowej Minimalizacja wpływu dryfu genetycznego (?) Selekcja (???) Szacowana wielkość poszczególnych chromosomów myszy Schemat rodowodu szczepu wsobnego 3

4 Nazewnictwo szczepów wsobnych C3H/W C57BL/6J Zarejestrowana nazwa szczepu missions/amsp_submission.cgi. Zarejestrowana nazwa laboratorium Nazewnictwo szczepów wsobnych C3, B6, D2 dopuszczalne skróty nazw szczepów C3H, C57BL/6, DBA/2 C3H/HeJ szczep C3H wyprowadzony w Heston (He), przeniesiony do Jackson Lab (J) CBA/W Lyst wab szczep CBA z COI Warszawa z mutacją wab w genie Lyst B6;129-Mpl hlb szczep mieszańcowy (B6 i 129) z mutacją hlb w genie Mpl Podstawowe typy szczepów wsobnych Szczepy kongeniczne i koizogeniczne Kongeniczne Konplastyczne Konsomiczne Koizogeniczne Rekombinowane Segregujące Inne 4

5 Wielkość mysiego genomu Schemat chromosomów myszy Zmiany genetyczne u myszy laboratoryjnych Mutacje spontaniczne Mutacje indukowane transgeny Mutacje somatyczne Mutacje germinalne 5

6 Mutacje chromosomowe liczbowe Aneuploidie zmiana liczby chromosomów homologicznych Duplikacje Delecje Euploidie wzrost liczby chromosomów o wartość n Triploidia Tetraploidia Mutacje genowe Liczba zmienionych nukleotydów Jednonukleotydowe Wielonukleotydowe Zmieniające sekwencje kodowanego białka Zmiany sensu Utraty sensu Zmiany ramki odczytu Zmiany długości ramki odczytu Niezmieniające sekwencji kodowanego białka Ciche Intronowe Mutacje innych rejonów niekodujących Mutacja punktowa zmiany sensu Przykład mutacji spontanicznej Mutacja punktowa C/T (tranzycja) CBA/W Lyst wab 6

7 Efekt plejotropowy myszy CBA/W Lyst wab Najprostszy przykład efektu tła Mysz C3H/W i C3H wad/w (tło genetyczne: A, Tyrp1 b(w) ) Myszy wad/wad, wad/wt, wt/wt Tło genetyczne: a, Tyrp1 b (w) Stwierdzone mutacje utrwalone różniące szczepy C3H/W i C3H/W - wad Ramotowska E. 2015, praca inżynierska Konsekwencja Liczba % Wariant synonimiczny 51 43,22% Wariant missens 51 43,22% Wariant splicingowy 14 11,86% Wariant intronowy 12 10,17% Zmiana ramki odczytu 2 1,69% Nabyty kodon stop 1 0,85% Typ zmiany Liczba % T<->G 9 7,32% T<->A 10 8,13% T<->C 37 30,08% A<->G 44 35,77% A<->C 11 8,94% G<->C 7 5,69% Insercje 1 0,81% Delecje 4 3,25% Zmiany indukowane Mutacje indukowane Czynnikami chemicznymi Czynnikami fizycznymi Czynnikami biologicznymi nie prowadzą do powstania GMO Modyfikacja genetyczna- świadome wprowadzenie do genomu biorcy fragmentu materiału genetycznego pochodzącego od innego organizmu metodą inną niż procedura hodowlana prowadzi do powstania GMO 7

8 Schematy tworzenia myszy GMO GMO - przykłady Transgeneza niekierukowa losowe wprowadzenie konstruktu do genomu biorcy Transgeneza kierunkowa celowane wprowadzenie konstruktu do genomu biorcy Wyłączenie genu (knock-out) Konstytutywne Selektywne Wprowadzenie konkretnej mutacji (knock-in) Konstytutywne Selektywne Techniki transpozomalne Przykłady modyfikacji genetycznych 8

9 Knock-out konstytutywny Fragment genu lub cały gen zastąpiony konstruktem powodującym unieczynnienie genu Brak ekspresji we wszystkich komórkach organizmu Knock out kondycjonowany Cre - lox Fragment genu otoczony sekwencjami loxp Sekwencje loxp wycinane przez rekombinazę Cre System cre lox Knock in konstytutywny Wymaga przekrzyżowania 2 szczepów szczepu niosącego konstrukt i szczepu posiadającego rekombinazę Cre pod odpowiednim promotorem (tkankowo lub organowo- specyficznym) Wprowadzenie konkretnej mutacji w konkretny punkt genu zmiana występuje we wszystkich komórkach organizmu 9

10 Knock in kondycjonowany Mutanty bezwektorowe Wstawienie mutacji w konkretny punkt genu Jej uaktywnienie po wycięciu fragmentów loxp przez rekombinazę Cre Generowanie pęknięć dwuniciowych w wybranym fragmencie genu Naprawa pęknięcia niehomologiczna (NHEJ) lub homologiczna (HR) Planowanie doświadczenia Planowanie doświadczenia Podstawowe pytanie: co mnie interesuje? Gen Typ zmiany Konstytutywna Kondycjonowana Miejsce Czas Współdziałanie alleliczne Współdziałanie niealleliczne (efekt tła) Podstawowe pytanie: co mnie interesuje? Cecha Podłoże genetyczne Cecha jednogenowa Cecha wielogenowa Typ zmiany Współdziałania w obrębie genomu Modelowanie fenotypu Modelowanie genetyczne, by zwierzę spontanicznie rozwinęło pożądany fenotyp Modelowanie genetyczne, by zwierzę rozwijało pożądany fenotyp po ingerencji badacza 10

11 Źródło Znaczenie ujednolicenia nomenklatury genetycznej Jednoznaczna identyfikacja locus Jednoznaczna identyfikacja alleli, wariantów i mutacji Identyfikacja genu jako członka rodziny genów Identyfikacja genów ortologicznych między gatunkami Pisownia w publikacjach Na przykład Symbole elementów genetycznych pisane są kursywą Symbole genów i markerów mysich rozpoczynają się wielką literą (z nielicznymi wyjątkami!) Symbole genów i markerów człowieka składają się wyłącznie z wielkich liter Symbole białek kodowanych przez poszczególne geny pisane są czcionką prostą Kit mysi gen kit oncogen KIT ludzki gen v-kit Hardy- Zuckerman 4 feline sarcoma viral oncogene homolog Kit produkt białkowy genu Kit 11

12 Nazwa genu Odniesienie do cechy lub cech fenotypowych powodowanych zmianą w danym genie np. microrchidia (małe jądra) gen Microrchidia 1 Odniesienie do rodziny genów gen Microrchidia 2 Odniesienie do genu współdziałającego np. Kit ligand Symbol genu Nazewnictwo fenotypów Unikalny (przynajmniej w obrębie danego gatunku); pomiędzy gatunkami takie same symbole mogą mieć geny homologiczne Krótki, zazwyczaj 3-5 znakowy, nie dłuższy niż 10 znaków Składający się jedynie z liter alfabetu rzymskiego i cyfr arabskich Krótka informacja o najważniejszych przejawach fenotypu np. spotting ruby eye Nie musi odnosić się do wszystkich elementów, które ulegają zmianie Powinien dawać się łatwo zapamiętać (!?!) np. ker od keratynizacja 12

13 Nazewnictwo alleli Mutacje GMO Podawane w indeksie górnym po symbolu genu Symbole alleli dominujących rozpoczynają się wielką literą Symbole alleli recesywnych rozpoczynają się małą literą Allel dziki oznaczany jest symbolem + Symbol tm w indeksie górnym oznacza targeted mutation Ponadto w symbolu znajduje się numer kolejny wygenerowanego allelu i symbol laboratorium, w którym został on wytworzony np. Kit tm1w Mutacje typu knock out często opisywane skrótowo jako KO Mutacje ze wstawieniem fragmentu innego genu (knock-in) Mutacje endonukleazowe (np. TALENs, CRISPR-Cas9) Kit tm1(tyr)w Kit em1w Kit tm2(tyr)w 13

14 Transgeny Symbol składa się z 4 elementów: Tg symbolizuje transgen W nawiasie znajduje się symbol wprowadzonego genu Następnie określenie linii laboratoryjnej I wreszcie symbol samego laboratorium badawczego np. Tg(Kit)CL1W Możliwe jest również wskazanie promotora, pod jakim znajduje się transgen Np. Tg(Kit-cre)CL1W transgen cre pod promotorem Kit Kit c.d. 14

15 15

16 Według nowej Ustawy o ochronie zwierząt wykorzystywanych do celów naukowych i edukacyjnych Należy UZYSKAĆ ZGODĘ WŁAŚCIWEJ LKE na działania mogące doprowadzić do urodzenia zwierząt z tzw. szkodliwym fenotypem, a także na utrzymanie linii (szczepu) zwierząt GENETYCZNIE ZMODYFIKOWANYCH ze szkodliwym fenotypem Według nowej Ustawy o ochronie zwierząt wykorzystywanych do celów naukowych i edukacyjnych Nie jest wymagana zgoda na hodowlę lub/i wytworzenie zwierząt GMO z genem reporterowym (np. GFP) Nie jest wymagana zgoda na hodowlę zwierząt ZE SZKODLIWYM FENOTYPEM, które nie są organizmami GMO Istnieje rozbieżność między zapisami Ustawy i rozporządzeń rozporządzenia nakazują raportowanie zwierząt genetycznie zmienionych czyli także mutantów spontanicznych i indukowanych Użyteczne adresy Mouse Genome Informatics Rat Genome Database Institute for Laboratory Research Europhenome Mouse Phenotyping Resource Mouse Phenome Database Federation of International Mouse Resources International Mouse Phenotype Consortium Knockout Mouse Project Mouse Genomes Project RIKEN BRC Experimental Animal Division PolLASA 16