Kompleks powierzchniowy

Transkrypt

1 Kompleks powierzchniowy Kardiomiocyt - aktyna - miozyna Kompleks powierzchniowy Konglomerat wzajemnie powiązanych ze sobą systemów regulacyjnych zakotwiczonych w błonie komórkowej, obejmujących receptory macierzy zewnątrzkomórkowej (np. integryny), i czynników wzrostowych, białka adhezji międzykomórkowej (np. kadheryny) oraz determinanty bezpośredniej międzykomórkowej wymiany informacji (np. koneksyny) 1 1

2 Mutacje genów powodujących nadaktywność ścieżek zależnych od czynników wzrostowych powodują zanik zależności wzrostu od przyczepienia komórki do podłoża Mutacje genu kodującego białko Ras powodują zanik wrażliwości komórek na fizyczny kontakt z mikrośrodowiskiem Collaborative cancerous signalling 2 2 Comoglio et al., 2003

3 Wpływ aktywności receptorów czynników wzrostowych na ruchliwość komórek HGF i EGF regulują ruchliwość komórek poprzez wpływ na status funkcjonalny kompleksów cytoszkieletarnych związanych z integrynami Comoglio et al.,

4 Patologiczna nadaktywność ścieżek zależnych od HGF i EGF powoduje wzrost ruchliwości komórek Collaborative cancerous signalling HGF, EGF i TNF-alfa wpływają na inwazyjność komórek nowotworowych poprzez wpływ na status funkcjonalny kompleksów cytoszkieletarnych związanych z integrynami Comoglio et al.,

5 Przejście epitelialno-mezenchymalne Epithelial-Mesenchymal Transition (EMT) Radisky, D. C. J Cell Sci 2005;118: EMT regulowane jest przez szlaki sygnałowe zależne od b-kateniny, oraz białek z rodziny Snail i Slug a te regulowane są przez szereg cytokin i czynników wzrostowych np. HGF, TGF, EGF, FGF, Wnt itd. W jego wyniku obserwowane są: 2. Zmiany morfologiczne m. in. polaryzacja komórki góra-dół zastępowana jest przez polaryzację przódtył 3. Związana z tym jest indukcja ruchliwości komórek oraz: 4. Zmiany ekspresji genów kodujących białka adhezji komórkowej, m.in. z rodziny integryn i kadheryn Radisky, D. C. J Cell Sci 2005;118: Komórki o morfologii mezenchymalnej cechuje zwiększony poziom ekspresji N-kadheryny i integryny a v b 3 A549 Epi Int Mes 5

6 Promocja i progresja nowotworu Primary tumour Lymphocyte Platelets TSC TIC Secondary tumour Clonal expansion, proliferation, heterogeneity, angiogenesis Tissue invasion Intravasation Capillary arrest Extravasation EMT: epithelial-mesenchymal transition (przejście epitelialno-mezenchymalne) - zmiany morfologiczne - aktywacja białek z rodziny Snail - zmiany ekspresji genów (E-cadherin -> N-cadherin) Oddziaływania z komórkami ukladu odpornościowego -limfocyty -płytki krwi -monocyty/makrofagi Angiogenesis Metastasis 6

7 Immune system in carcinogenesis (-) Increased risk of cancer after: a) Immunosuppression b) Chronic inflammation (+) Presence of monocytes in solid tumours: a) monocytes migrating to tumours undergo phenotypic transition into tumourinfiltrating macrophages (TIMs) b) TIMs may constitute up to 80% of the tumour mass c) TIMs (M2) represent a tumour-promoting phenotype i.e. secrete factors promoting cancer expansion Monocytes in cancer progression: - Monocytes induce the invasion of mammary and hepatoma cancer cells by means of EGF (Wyckoff et al., 2004; Lin et al. 2002; Condeelis and Pollard, 2006) - Microglia-derived TGF-b is an inducer of glioma cell invasion (Śliwa et al., 2007; Wesołowska et al ) 7

8 Pętle parakrynne między makrofagami a nowotworem Condeelis&Pollard,

9 Komórki HPC-4 (rak trzustki) HPC-4 cells - Linia ustalona w 1993 (Siedlar et al., 1994) - fenotyp epithelioidalny - linia inwazyjna in vivo - komórki HPC- indukują sekrecję cytokin prozapalnych przez monocyty/makrofagi, w tym IL-12 i TNF-a (Zembala et al., 1993) Jak monocyty wpływają na ruchliwość komórek HPC-4 w ko-hodowli? 9

10 Metodyka N Non-polarised N N N Polarised P P P P Morfometria Wideomikroskopia Mikroskopia fluorescencyjna 10

11 % of adhered cells Adhezja i ruchliwość monocytów w kohodowli z komórkami HPC-4 Adhezywność monocytów 50 Kontrola Mo + HPC actin vinculin Control Mo + HPC Mo +cond. - indukcja adhezji - polaryzacja przód-tył monocytów (PBM) 11

12 % of adhered cells Adhezja i ruchliwość monocytów w obecności medium warunkowanego Adhezywność monocytów 50 Kontrola Mo + CM actin vinculin Control Mo + HPC Mo +cond. Monocyte-macrophage transition Czyz, J, Siedlar M.,(unpublished) 12

13 Zachowanie komórek HPC-4 w kohodowli z monocytami krwi obwodowej Kontrola Ko-kultura 13

14 TLCD [um/h] Wpływ monocytów/macrofagów na ruchliwość komórek HPC TLCD VCM Control VCM [um/h] 0 Control HPC + Mo 0 HPC-4 + Mo Baran, B., Bechyne, I., Siedlar, M., Szpak, K., Mytar, B., Sroka, J., Laczna, E., Madeja, Z., Zembala, M., and Czyz, J. Eur. J. Cell Biol. 88 (2009)

15 Wpływ monocytów/makrofagów na morfologię komórek HPC-4 Control HPC-4 + Mo - indukcja ruchliwości - rozproszenie kolonii - polaryzacja przód-tył } EMT??? Baran, B., Bechyne, I., Siedlar, M., Szpak, K., Mytar, B., Sroka, J., Laczna, E., Madeja, Z., Zembala, M., and Czyz, J. Eur. J. Cell Biol. 88 (2009)

16 TNF [pg/ml] Mediatory wymiany informacji między komórkami HPC-4 i makrofagami Monocyty/makrofagi aktywowane przez komórki HPC-4 wydzielają TNFalfa (Szaflarska, 2004) MO MO+LPS MO+neo 0 W zależności od kontekstu komórkowego TNF-alfa może hamować lub promować rozwój nowotworu 16

17 Mediatory wymiany informacji między komórkami HPC-4 i makrofagami Inhibitory TNF obniżają reaktywność komórek HPC-4 17 na obecność monocytów/makrofagów

18 Egzogenny TNF indukuje ruchliwość komórek HPC-4 Baran, B., Bechyne, I., Siedlar, M., Szpak, K., Mytar, B., Sroka, J., Laczna, E., Madeja, Z., Zembala, M., and Czyz, J. Eur. J. Cell Biol. 88 (2009)

19 Egzogenny TNF indukuje ruchliwość komórek HPC-4 Control TNF 19

20 Morfologia i architektura cytoszkieletu komórek HPC-4 w obecności TNF HPC-4 + Mo HPC-4 + TNF Baran, B., Bechyne, I., Siedlar, M., Szpak, K., Mytar, B., Sroka, J., Laczna, E., Madeja, Z., Zembala, M., and Czyz, J. Eur. J. Cell Biol. 88 (2009)

21 Funkcja czynników transkrypcyjnych z rodziny Snail 21

22 EMT? Control 10 u/ml TNF 100 u/ml TNF 1000 u/ml TNF TNF-alpha induces expression of Snail-1 22

23 Wnioski Monocyty wspomagają proces progresji nowotworu trzustki TNF jest zaangażowany w pętle parakrynne regulujące te współzależność TNF indukuje EMT w komórkach nowotworowych 23

24 Przejście epitelialno-mezenchymalne Epithelial-Mesenchymal Transition (EMT) Radisky, D. C. J Cell Sci 2005;118:

25 Interakcje między szlakami sygnałowymi zależnymi od czynników humoralnych a białkami adhezji międzykomórkowej z rodziny kadheryn Comoglio,

26 Model inwazji nowotworowej GUZ PIERWOTNY TSC TIC Ekspansja klonalna, wzrost, dywersyfikacja, angiogeneza Właściwości komórek nowotworowych Limfocyt Płytki krwi Inwazja tkanki i intrawazacja Oddziaływania z komórkami limfatycznymi 1. Brak zależności wzrostu od lokalnej adhezji i funkcji czynników wzrostowych 2. Zanik wrażliwości na czynniki hamujące proliferację komórek 3. Zanik zdolności do apoptozy GUZ WTÓRNY Adhezja do śródbłonka i błony podstawnej 4. Wzmożona ruchliwość Ekstrawazacja (Hanahan&Weinberg, 2000) Angiogeneza Błona podstawna Macierz zewnątrzkomórkowa Proliferacja 26 26

27 Strategie migracji komórek Cancer Science Volume 96, Issue 7, pages , 29 JUL 2005 DOI: /j x 27

28 AFM Ostrze noża Mikroskop AFM Wnętrze głowicy 28

29 Principle of AFM 1 min Cytospin 12 h Culture Komórki uzyskano 2 metodami; 1 min Cytospin, 12 h Culture Cross et al

30 Ddetektor AFM L Dioda lasera Ostrze noża Preparat 30

31 Sztywność mechaniczna komórek B16 Cross et al

32 Mutacje genów powodujących nadaktywność ścieżek zależnych od czynników wzrostowych powodują zanik zależności wzrostu od przyczepienia komórki do podłoża CHF Collaborative cancerous signalling B Comoglio et al., 2003

33 Wizualizacja statycznych i dynamicznych sił wywieranych na podłoże przez komórki Podłoża elastyczne 33 33

34 Funkcja Niszy czyli mikrośrodowiska komórek w transformacji nowotworowej Mediatory wymiany informacji między komórką a niszą wspomagające transformację nowotworową: Neo - zaburzenia funkcji endo- i egzogennych czynników humoralnych oddziaływania krynne P modyfikacje składu macierzy międzykomórkowej oraz ekspresji receptorów adhezji komórkowej, np. integryn i kadheryn Wnts S P2 P zmiany równowagi mechanochemicznej w obrębie niszy, prowadzące do zaburzeń wymiany bodźców mechanicznych między komórka a jej mikrośrodowiskiem -deregulacja bezpośredniej wymiany metabolitów za pośrednictwem złącz szczelinowych 34 Czyz J., Wobus A.M. Differentiation (2001) 68:

35 Tensegralny model architektury cytoszkieletu komorek HSF B16 35

36 Tensegrity Integryny i kadheryny łącząc domeny cytoszkieletarne sąsiadujących komórek za pośrednictwem adhezji międzykomórkowej Tensegralność Alberts et al., 2005 pośredniczą w tworzeniu wielokomórkowych kontinuów mechanochemicznych 36 36

37 Adhezja komórkowa za pośrednictwem kompleksów białkowych związanych z cytoszkieletem aktyna winkulina białka strukturalne białka funkcjonalne Kontakty zogniskowane to wyspecjalizowane kompleksy białkowe uczestniczące w stabilizacji adhezji komórkowej ale również w przenoszeniu generowanych przez komórki bodźców mechanicznych na mikrośrodowisko 37

38 ORIENTACJA WIĄZEK MIKROFILAMENTÓW DECYDUJE O KIERUNKU SIŁ MECHANICZNYCH GENEROWANYCH PRZEZ KOMÓRKI 38

39 Regulacja ruchu komórek nowotworowych poprzez reorganizację aktyny Cancer Science Volume 96, Issue 7, pages , 29 JUL 2005 DOI: /j x 39

40 Adhezja komórkowa za pośrednictwem kompleksów białkowych związanych z cytoszkieletem aktyna winkulina białka strukturalne białka funkcjonalne Kontakty zogniskowane uczestniczą w przenoszeniu bodźców mechanicznych generowanych przez mikrośrodowisko do komórki 40

41 Nisza jako mikrośrodowisko komórek pozostające z nimi w stanie ciągłej wymiany informacji P Mediatory wymiany informacji między komórką a niszą : - czynniki humoralne (np. czynniki wzrostowe i cytokiny oddziaływania krynne S P2 2 - adhezja komórkowa (ścieżki sygnałowe zależne od integryn, kadheryn etc. Wnts Czyz J., Wobus A.M. Differentiation (2001) 68: P wymiana bodźców mechanicznych (za pośrednictwem białek adhezji międzykomórkowej i receptorów ECM) -bezpośrednia wymiana metabolitów (złącza szczelinowe) 41

42 Oddziaływania autobaryczne i parabaryczne Banes et al,,

43 Biomechaniczna kontrola morfogenezy Nisza Prog. Biophys. Mol. Biol. (2008) 97:

44 Nisza jako mikrośrodowisko komórek pozostające z nimi w stanie ciągłej wymiany informacji Mediatory wymiany informacji między komórką a niszą : - czynniki humoralne (np. czynniki wzrostowe i cytokiny oddziaływania krynne - adhezja komórkowa (ścieżki sygnałowe zależne od integryn, kadheryn etc. - wymiana bodźców mechanicznych (za pośrednictwem białek adhezji międzykomórkowej i receptorów ECM) -bezpośrednia wymiana metabolitów (złącza szczelinowe) Czyz J., Wobus A.M. Differentiation (2001) 68: