Tkankowo-specyficzne funkcje złącz szczelinowych

Transkrypt

1 Tkankowo-specyficzne funkcje złącz szczelinowych SprzęŜenie elektryczne; np. w miokardium, układzie nerwowym i innych tkankach pobudliwych Serce Koneksyna Cx40 Cx43 Cx45 Funkcja - międzykomórkowy transfer jonów wapnia -synchronizacja aktywności skurczowej kardiomiocytów Układ nerwowy Cx32 Cx37 Cx43 - przewodnictwo nerwowe - wewnątrzcytoplazmatyczny transfer metabolitów w komórkach Schwanna SprzęŜenie metaboliczne; np. wątroba i inne tkanki niepobudliwe Np. wątroba i trzustka Cx32 Cx36 - synchronizacja wydzielania insuliny przez komórki β trzustki - synchronizacja sekrecji glukozy przez hepatocyty

2 Czynniki determinujące funkcje złącz szczelinowych: - poziom I zaleŝny od typu i lokalizacji koneksyny w danej komórce - typ koneksyny budującej złącze i kompatybilność koneksonów zbudowanych z róŝnych koneksyn - selektywność kanałów złącz szczelinowych - poziom ekspresji danej koneksyny - transport do błony i wewnątrzkomórkowa lokalizacja koneksyn - poziom II zaleŝny od zewnętrznych regulatorów funkcji złącz szczelinowych - regulatory przepuszczalności kanałów złącz szczelinowych np. ph, stęŝenie wewnątrzkomórkowego wapnia - aktywność szlaków sygnałowych determinujących przepuszczalność kanałów poprzez zmiany poziomu fosforylacji koneksyn -stabilizacja złącz przez białka adhezji międzykomórkowej - stabilizacja mechaniczna

3 Ruchliwość komórek moŝe wpływać na funkcje złącz szczelinowych poprzez modyfikacje ich stabilności (I) Inkubacja komórek linii MAT-LyLu i B16 na podłoŝach pokrytych poli-l-lizyną powoduje spadek ich ruchliwości. Daniel et al., 2008

4 co skutkuje stabilizacją złącz szczelinowych i wzrostem wydajności międzykomórkowego transferu kalceiny Daniel et al., 2008

5 Kategorie składników kompleksu powierzchniowego regulujących funkcje złącz szczelinowych 1. Białka sygnałowe 2. Białka strukturalne Laird, 2005

6 Choroby związane z dysfunkcją złącz szczelinowych - Mutacje genu kodującego Cx37 wywołują niepłodność samic myszy, co wynika z roli Cx37 w komunikacji międzykomórkowej między oocytami, a komórkami granulosa - Zahamowanie funkcji genu kodującego Cx40 prowadzi do arytmii pracy mięśnia sercowego, poprzez upośledzenie przewodzenia bodźców elektrycznych między przedsionkami a komorami - Zahamowanie funkcji genu kodującego Cx43 wywołuje wady rozwojowe mięśnia sercowego, najprawdopodobniej wynikające ze zmian aktywności migracyjnej komórek grzebienia neuralnego - Spadek ekspresji Cx32 upośledza koordynację sekrecji glukozy przez hepatocyty wywołanej bodźcem elektrycznym, a takŝe znacznie zwiększa ryzyko rozwoju nowotworów wątroby - Mutacje genu kodującego Cx26 wywołują głuchotę, prawdopodobnie poprzez upośledzenie międzykomórkowego transferu jonów potasu w obrębie ucha wewnętrznego 6

7 Funkcja Cx32 w determinowaniu wewnątrzkomórkowego transferu metabolitów w obrębie komórek Schwanna Mutacje genu kodującego Cx32 (stwierdzono przynajmniej 90 ich typów!), wywołują u człowieka chorobę Charcot-Marie-Tooth (CMTX), polegającą na postępowej degeneracji nerwów peryferycznych, wynikającej z upośledzonej komunikacji między fałdami komórek Schwanna Xu, COCB 2004

8 Funkcja Niszy czyli mikrośrodowiska komórek w transformacji nowotworowej Mediatory wymiany informacji między komórką a niszą wspomagające transformację nowotworową: Neo - zaburzenia funkcji endo- i egzogennych czynników humoralnych oddziaływania krynne - modyfikacje składu macierzy międzykomórkowej oraz ekspresji receptorów adhezji komórkowej, np. integryn i kadheryn - zmiany równowagi mechanochemicznej w obrębie niszy, prowadzące do zaburzeń wymiany bodźców mechanicznych między komórka a jej mikrośrodowiskiem Czyz J., Wobus A.M. Differentiation (2001) 68: deregulacja bezpośredniej wymiany metabolitów za pośrednictwem złącz szczelinowych

9 Cechy komórek nowotworowych Wykazują niekontrolowany wzrost, co objawia się: brakiem zahamowania kontaktowego proliferacji oraz; zaleŝności wzrostu od przyczepienia się do podłoŝa nie podlegają one takŝe anoikis; Wiele z nich wykazuje spadek ekspresji koneksyn w porównaniu z komórkami tkanki z ktorej pochodzą, co w powiązaniu z faktem, iŝ wyciszenie ekspresji koneksyn np. Cx32 u myszy powoduje wzrost podatności na kancerogenezę chemiczną sugeruje, Ŝe rozmowa między komórkami decyduje o socjalizacji ich zachowań - by-stander effect 9

10 Rozwój choroby nowotworowej w kontekście niszy 1. Akumulacja zmian genetycznych w komórkach macierzystych 2. Zaburzenia komunikacji między komórkami a ich mikrośrodowiskiem, czyli niszą Mediatory komunikacji międzykomórkowej w obrębie niszy I. - oddziaływania krynne P1 ECM P2 GFs II. - oddziaływania baryczne Banes et al,, 1995 III. - bezpośrednia międzykomórkowa wymiana metabolitów DiI Calcein Donor cell 22

11 Regulacja funkcji złącz szczelinowych - fosforylacja koneksyn NH 3 + COO _ E1 E2 Domeny: - wewnątrz-membranowe α-helisy konserwatywne - domeny zewnątrzkomórkowe - konserwatywne - N-końcowy łańcuch wewnątrzkomórkowy konserwatywny - domena wewnątrzkomórkowa zmienna - C-końcowy łańcuch wewnątrzkomórkowy wysoce zmienny Giepmans et al., 2004

12 Wpływ aktywności kinaz białkowych na obrót koneksyn Lampe & Lau, 2004, IJBCB 36: 1171 Kinazy białkowe fosforylując Cx43 wpływają na przebieg poszczególnych etapów cyklu Ŝyciowego tego białka

13 RóŜnice w intensywności GJIC między komórkami prawidłowymi i nowotworowymi Mikroiniekcja wybraną komórkę nastrzykuje się barwnikiem a następnie obserwuje się tempo jego rozchodzenia do komórek sąsiednich

14 Fosforylacja Cx43 (Ser262) przez PKC skutkuje zahamowaniem komunikacji międzykomórkowej w sposób zaleŝny od kontekstu komórkowego Sroka et al., 2008 Konkluzja: zmiany poziomu fosforylacji koneksyn wpływają na przepuszczalność złącz szczelinowych

15 Korelacja między ekspresją koneksyn a potencjałem proliferacyjnym komórek nowotworowych - Inicjacja - Promocja - Progresja inwazja/tworzenie przerzutów Tranfected connexin Rak sutka Cx26/Cx43 Przyhamowany wzrost in vitro/in vivo (Hirschi et al ) Rak szyjki macicy (HeLa) Cx43 Zahamowanie wzrostu niezaleŝnego od przyczepienia (King et al., 2000) Glioblastoma (U251T98G) Cx43 Zahamowana proliferacja in vitro (Huang et al. 1998) Hepatoma (SKHep1) Cx32 Przyhamowana zdolność do tworzenia guzów (Eghbali et al., 1991) Lung carcinoma (PG) Cx43 Zahamowana proliferacja in vitro (Zhang et al., 1998) Melanomas (UACC903) Cx43 Wzrost zaleŝny od przyczepienia (Su et al., 2000) Prostate cancer (LNCaP) Cx32/Cx43 Zahamowanie wzrostu (Mehta et al.., 1999) 15

16 Pierwotna funkcja złącz szczelinowych w rozwoju nowotworów 1. Zahamowanie funkcji złącz szczelinowych promuje rozwój choroby nowotworowej (Yamasaki, 1999, Loevenstein 1991) 2. Re-ekspresja koneksyn(y) prowadzi do choćby częściowej odbudowy fenotypu charakterystycznego dla komórek prawidłowych Mechanizmy: Oddziaływania koneksyn z elementami regulującymi cykl komórkowy Efekt sąsiedztwa 16

17 Proliferacja i cytoszkielet komórek prawidłowych i nowotworowych CHF MLL B16 XC Neo Norm Czyz et al.,

18 Point of no return Przejście G1/S Aktywacja ścieŝki MAP przez czynniki wzrostowe umoŝliwia przejście G1/S Ale czy tylko?

19 Schemat regulacji cyklu komórkowego Funkcja białka skp2 skp2 fosforylując białko p27 umoŝliwia jego degradację, co z kolei zwalnia blokadę dla przejścia G1/S Nature 2005

20 Wpływ wariantów Cx43 na proliferację komórek i poziom ekspresji skp2 Zhang et al., 2003 Wniosek: Cx43 moŝe synergistycznie wpływać na proliferację komórek w sposób zaleŝny i niezaleŝny od GJIC Zhang et al., 2003

21 Funkcja złącz szczelinowych w rozwoju nowotworów W początkowych etapach nowotworzenia (inicjacja, propagacja) zahamowanie połączeń za pomocą złącz szczelinowych uwalnia komórki spod reŝimu mikrośrodowiska Neo Czyz J., Wobus A.M. Differentiation (2001) 68: a to wspomaga transformację nowotworową 21

22 Rola złącz szczelinowych w rozwoju nowotworów Efekt hamujący : 1. Spadek ekspresji koneksyn obserwowany jest na wczesnych etapach rozwoju nowotworów. 2. Re-ekspresja koneksyn w komórkach transformowanych przynajmniej częściowo przywraca fenotyp charakterystyczny dla komórek prawidłowych. 3. Koneksyny wpływają na aktywność szlaków sygnałowych zaleŝnych od cyklin, w sposób niezaleŝny od komunikacji międzykomórkowej Efekt promujący: 1. Wiele linii komórek nowotworowych cechuje wysoki poziom ekspresji koneksyn i wysoka intensywność komunikacji międzykomórkowej za pośrednictwem złącz szczelinowych (Trosko, 2002) 22

23 Aby komunikacja za pośrednictwem złącz szczelinowych mogła w ogóle zaistnieć potrzebna jest fizyczna obecność kompatybilnych koneksonów w błonach sąsiednich komórek Komórki B16 DNA Cx43 Daniel et al., 2008

24 Jakościowa analiza intensywności komunikacji międzykomórkowej za pośrednictwem złącz szczelinowych techniką wizualizacji międzykomórkowego transferu kalceiny

25 Ilościowa analiza intensywności komunikacji międzykomórkowej za pośrednictwem złącz szczelinowych techniką pomiaru międzykomórkowego transferu kalceiny z wykorzystaniem cytometrii przepływowej DiI Calcein Donor cell 2h Analiza funkcji złącz szczelinowych oparta na wykorzystaniu kalceiny w połączeniu z kwantyfikacją transferu barwnika za pomocą cytometrii przepływowej stanowi alternatywę dla innych technik np. mikroiniekcji fluorochromu, co przede wszystkim wynika z moŝliwości zobiektywizowanej analizy międzykomórkowej komunikacji w układach heterotypowych i heterologicznych. CzyŜ et al., 2000

26 Ilościowa analiza intensywności komunikacji międzykomórkowej za pośrednictwem złącz szczelinowych z wykorzystaniem cytometrii przepływowej C r = N green /N red Wykorzystanie cytometrii przepływowej umoŝliwia zobiektywizowaną analizę funkcji złącz szczelinowych w populacjach komórek prawidłowych i nowotworowych BICR/M1R k Cx43 RIN 3T3/SV40 HeLa Cx43 Hela Cx40 HeLa CzyŜ et al., Exp. Cell Res. (2000),255:40-46

27 Podstawowy model rozwoju nowotworu GUZ PIERWOTNY TSC Ekspansja klonalna, wzrost, dywersyfikacja, angiogeneza Właściwości komórek nowotworowych Limfocyt Płytki krwi Inwazja tkanki i intrawazacja Oddziaływania z komórkami limfatycznymi 1. Brak zaleŝności wzrostu od lokalnej adhezji i funkcji czynników wzrostowych 2. Zanik wraŝliwości na czynniki hamujące proliferację komórek 3. Zanik zdolności do apoptozy GUZ WTÓRNY Adhezja do śródbłonka i błony podstawnej 4. WzmoŜona ruchliwość Ekstrawazacja (Hanahan&Weinberg, 2000) Angiogeneza Błona podstawna Macierz zewnątrzkomórkowa Proliferacja 27

28 Analiza potencjału metastatycznego i proliferacji szczepów linii HeLa róŝniących się ekspresją Cx43 HeLa Cx wt G 1-36% S - 33% G 2-31% Apo - 0.5% Cx43 G 1-50% S - 31% G 2-19% Apo - 0,6% HeLa wt 0 0 N C 10 5 HeLa wt HeLa Cx Time/h wt Cx43 HeLa wt HeLa Cx43 Czyz J., Madeja Z., Irmer U., Korohoda W., Huelser D.F. Int. J. Cancer. (2005), 114:

29 Efekt sąsiedztwa bystander effect HeLa wt G 1-36% S - 33% G 2-31% Apo - 0.5% A G 1-55% S - 22% G 2-23% Apo - 2.4% 250 B C D 125 G 1-47% S - 19% G 2-34% Apo - 23% G 1-42% S - 18% G 2-40% Apo - 44% HeLa Cx G 1-50% S - 31% G 2-19% Apo - 0,6% E F G H 200 G 1-63% S - 19% G 2-18% Apo - 6,1% G 1-50% S - 18% G 2-32% Apo - 43% G 1-39% S - 23% G 2-38% Apo - 61%

30 ZaangaŜowanie komunikacji międzykomórkowej za pośrednictwem złącz szczelinowych w procesach inwazji nowotworowej i determinowaniu potencjału metastatycznego komórek nowotworowych 1. Wykazano, iŝ szereg linii komórek nowotworowych o wysokim potencjale metastatycznym cechuje wysoki poziom ekspresji koneksyn (np. komórki raka sutka, glejaki, czerniaki...) A E B F C G D H 30

31 Z drugiej strony: Koneksyny mogą wpływać na progresję nowotworową niezaleŝnie od komunikacji międzykomórkowej za pośrednictwem złącz szczelinowych

32 Zdolność koneksyn do ukierunkowania ruchu komórek nerwowych w rozwoju układu nerwowego Wniosek: Elias et al., Nature, Cx43 uczestniczy w ukierunkowaniu ruchu komórek w sposób niezaleŝny od GJIC

33 Wpływ Cx43 na migrację komórek glejaka Bates, D. C., Sin, W. C., Aftab, Q., and Naus, C. C. Connexin43 enhances glioma invasion by a mechanism involving the carboxy terminus. Glia 55 (2007)

34 Prostata Funkcja paneksyn w komunikacji między erytrocytami a komórkami śródbłonka Dahl et al., 2006 Wniosek: Paneksyny tworzą kanały błonowe łączące cytoplazmę z otoczeniem komórki, a nie z jej sąsiadem Podobną cechę zasugerowano dla koneksonów zbudowanych z klasycznych koneksyn Locovei et al., 2006

35 DU-145 PROSTATE CARCINOMA CELLS THAT SELECTIVELY TRANSMIGRATE NARROW OBSTACLES EXPRESS ELEVATED LEVELS OF CX43 Szpak et al., 2011

36 Pętle sprzęŝenia zwrotnego między sztywnością podłoŝa a aktywnością mechaniczną cytoszkieletu komórek nowotworowych Elastyczność sub-populacji komórek DU-145 M. Sarna, J. Czyz, in prep..

37 Źródła heterogenności komórek nowotworowych Biochim Biophys Acta January; 1805(1): 105. Published online 2009 November 18. doi: /j.bbcan

38 Sub-populacje komórek raka płuca (A549) Bechyne, Szpak, Madeja, Czyz; Cell Biol. Int., 2011

39 ZaaangaŜowanie Cx43 w stabilizację mikrotubul Wpływ na polaryzację ruchu komórek PLoS One. 2011; 6(10): e Published online 2011 October 14. doi: /journal.pone

40 DU-145 PROSTATE CARCINOMA CELLS THAT SELECTIVELY TRANSMIGRATE NARROW OBSTACLES DISPLAY INCREASED GJIC A C C r DU-145 DU-145_48 DU-145_72 B D t [min] Szpak et al., 2011

41 Ekspresja Cx43 w komórkach śródbłonka i podścieliska promuje ekstrawazację komórek krwi CzyŜ, 2007 Wzrost ekspresji Cx43 w komórkach śródbłonka w miejscach stanu zapalnego moŝe promować ekstrawazację komórek nowotworowych wykazujących (re)ekspresję tego białka 41 Wang et al., 2006

42 Cx43 i komunikacja między komórkami nowotworowymi a śródbłonkiem ułatwia transmigrację komórek nowotworowych przez warstwę endothelium Pollmann et al., 2006 GJIC Transmigracja

43 Rola złącz szczelinowych w rozwoju nowotworów-rozwinięcie Wiele linii komórek nowotworowych cechuje wysoki poziom ekspresji koneksyn i wysoka intensywność komunikacji międzykomórkowej za pośrednictwem złącz szczelinowych Efekt promujący: CzyŜ,

44 Współdziałanie systemów pośredniczących w interakcjach między daną komórką a jej niszą P1 ECM P2 GFs I. Wymiana bodźców chemicznych za pośrednictwem czynników humoralnych Funkcja międzykomórkowej wymiany bodźców chemicznych (za pośrednictwem czynników humoralnych) wpływająca na fizjologię komórek, w tym wzór jej proliferacji, róŝnicowania a takŝe podatność na procesy apoptozy, modulowana jest przez interakcje komórek z macierzą zewnątrzkomórkową i sąsiednimi komórkami II. Oddziaływania mechaniczne między komórkami a macierzą zewnątrzkomórkową 44

45 Elementy kompleksu powierzchniowego integrują reakcje komórek na bodźce płynące z niszy w sposób wzajemnie od siebie zaleŝny Banes et al., kanały jonowe - receptory macierzy zewnątrzkomórkowej - receptory czynników wzrostowych - koneksony i złącza szczelinowe 45

46 Czyz J., Wobus A.M. Differentiation (2001) 68: Neo

47 Model ontogenezy, organogenezy i karcinogenezy organizmów wielokomórkowych funkcja niszy Interakcje między komórkami a ich niszą czyli mikrośrodowiskiem komórki pozostającym w stanie ciągłej z nią wymiany informacji decydują o przebiegu ontogenezy i organogenezy organizmów wielokomórkowych Zaburzenia komunikacji między komórkami a ich niszą decydują o toku rozwoju nowotworu

48 Od komórki do organu Od komórki do guza