Ocena przydatności nowej metody oceny stanu śródbłonka. opartej o badanie fluorescencji NADH w następstwie zmian

Transkrypt

1 Ocena przydatności nowej metody oceny stanu śródbłonka opartej o badanie fluorescencji NADH w następstwie zmian przepływu krwi w naczyniach mikrokrążenia u pacjentów z chorobą wieńcową i u osób zdrowych Lek. Maria Tarnawska Rozprawa na stopień doktora nauk medycznych Promotor: Dr hab. med. Marcin Hellmann Wydział Lekarski Gdański Uniwersytet Medyczny Gdańsk 2017

2 Pragnę złożyć serdeczne podziękowania Mojemu Promotorowi, Panu dr hab. Marcinowi Hellmannowi za duże zaangażowanie, profesjonalizm, wsparcie i pomoc naukową podczas przygotowywania niniejszej pracy. Kierownikowi Zakładu Diagnostyki Chorób Serca II Katedry Kardiologii GUMed, Pani Profesor Marii Dudziak za możliwość prowadzenia badań naukowych. Kierownikowi I Katedry i Kliniki Kardiologii GUMed, Panu Profesorowi Marcinowi Gruchale za okazane zaufanie i pomoc w stawaniu pierwszych samodzielnych kroków klinicznych. Koleżankom i Kolegom z I Katedry i Kliniki Kardiologii GUMed za wsparcie i życzliwą pomoc. Szczególne Podziękowania składam moim Rodzicom, bez których miłości, poświecenia i starań, nie byłoby mnie tu gdzie jestem oraz Grzegorzowi za cierpliwość, wyrozumiałość i wsparcie. 2

3 3

4 Spis treści 1. Wykaz stosowanych skrótów Wykaz prac wchodzących w skład rozpraw Wprowadzenie Cele pracy Materiał i metodyka badań Omówienie publikacji wchodzących w skład rozprawy Publikacja Publikacja Publikacja Wnioski Streszczenie pracy w języku angielskim Introduction Objectives Material and methods Presentation of the publications that form part of dissertation Conclusions Wykaz cytowanego piśmiennictwa Publikacje wchodzące w skład rozprawy

5 5

6 1. Wykaz stosowanych skrótów ADMA - asymetryczna dimetylarginina (ang. assymetric dimethylarginine) CAD - choroba wieńcowa (ang. coronary artery disease) CV - współczynnik zmienności (ang. coefficient of variation) DM - cukrzyca (ang. diabetes mellitus) ELISA - test immunoenzymatyczny (ang. enzyme linked immunosorbent assay) ET-1 - endotelina-1 (ang. endothelin-1) FMSF - ang. flow mediated skin fluorescence HRmax - odpowiedź hiperemiczna (ang. hyperemic response) ICC - współczynnik korelacji wewnątrzklasowej (ang. intraclass correlation coefficient) IRmax - odpowiedź ischemiczna (ang. ischemic response) LV - lewa komora (ang. left ventricle) LVEF - frakcja wyrzutowa lewej komory (ang. left ventricular ejection fraction) NADH / NAD+ - dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy, forma zredukowana i utleniona (ang. nicotinamide adenine dinucleotide) NO - tlenek azotu (ang. nitric oxide) PORH - pookluzyjna reakcja przekrwienna (ang. post-occlusive reactive hyperemia) PWV - prędkość fali tętna (ang. pulse wave velocity) UV - światło ultrafioletowe (ang. ultraviolet light) 6

7 2. Wykaz prac wchodzących w skład rozprawy Rozprawa doktorska została opublikowana w recenzowanych czasopismach naukowych w formie trzech spójnych tematycznie prac: 1. Tarnawska M., Dudziak M., Hellmann M. Zastosowanie pookluzyjnej reakcji przekrwiennej w ocenie funkcji śródbłonka mikrokrążenia. Choroby Serca i Naczyń 2016;13: punktacja MNiSW: Hellmann M.*, Tarnawska M.*, Dudziak M., Dorniak K., Roustit M., Cracowski J.L. Reproducibility of flow mediated skin fluorescence to assess microvascular function. Microvascular Research 2017;113: * równorzędni pierwsi autorzy Impact Factor: 2.371; punktacja MNiSW: Tarnawska M., Dorniak K., Kaszubowski M., Dudziak M., Hellmann M. A pilot study with flow mediated skin fluorescence - a novel device to assess microvascular endothelial function in coronary artery disease. Cardiology Journal 2017 (praca zaakceptowana do druku) Impact Factor: 1.256; punktacja MNiSW: Łączna punktacja cyklu publikacji: Impact Factor: 3.627, punktacja MNiSW:

8 3. Wprowadzenie Choroby układu sercowo-naczyniowego, a w szczególności choroba wieńcowa (CAD, coronary artery disease), stanowią główną przyczynę zgonów w krajach rozwiniętych. Istotną rolę w patogenezie chorób układu krążenia odgrywa dysfunkcja śródbłonka oraz zaburzenia mikrokrążenia [1]. Śródbłonek naczyniowy pełni ważne funkcje w procesach hamowania agregacji płytek krwi, koagulacji i fibrynolizie, jak również w utrzymywaniu prawidłowej perfuzji tkanek regulując napięcie ściany naczyń poprzez wydzielanie substancji wazoaktywnych [2]. W mikrokrążeniu zachodzi intensywna wymiana gazowa i metaboliczna, a optymalna reaktywność naczyń mikrokrążenia w odpowiedzi na niedokrwienie jest kluczowa, by ograniczyć stopień uszkodzenia tkanek. Dysfunkcja mikrokrążenia polega na zaburzeniu równowagi pomiędzy potencjałem wazodylatacyjnym i wazokonstrykcyjnym śródbłonka, osłabieniu mechanizmów antymitogennych i antytrombogennych oraz strukturalnym remodelingu naczyń mikrokrążenia [3]. Istnieją przekonujące dowody, że zaburzenie funkcji mikrokrążenia wyprzedza zmiany patologiczne w dużych naczyniach, a także manifestację kliniczną wielu chorób układu krążenia [4]. Naczynia mikrokrążenia stanowią obszerną część układu sercowo-naczyniowego, jednak ze względu na mikroskopijne wymiary, niejednorodną budowę oraz zróżnicowany przepływ krwi związany ze swoistym narządowo zapotrzebowaniem metabolicznym, jest to obszar, którego badania są skomplikowane, wymagają specjalistycznego sprzętu oraz dużego doświadczenia [5,6]. Stosunkowo łatwo dostępne mikrokrążenie obwodowe uznawane jest przez wielu badaczy za reprezentatywny obszar do oceny systemowej funkcji mikrokrążenia, mimo iż mechanizmy regulujące przepływ krwi różnią się między badanymi tkankami, bądź narządami [7-9]. Uważa się, iż ocena jedynie morfologii naczyń, bądź badanie przepływu krwi w spoczynku nie dostarcza istotnych informacji o stanie mikrokrążenia. Wartość badań nad mechanizmami regulacyjnymi mikrokrążenia istotnie wzrasta po zastosowaniu testów opartych o prowokację mechaniczną lub farmakologiczną [10]. 8

9 Pookluzyjna reakcja przekrwienna (PORH, post-occlusive reactive hyperemia) jest najbardziej fizjologicznym wśród testów stosowanych do oceny funkcji śródbłonka mikrokrążenia. Test ten polega na rejestracji zmian perfuzji mikrokrążenia w obszarze przedramienia przed, w trakcie oraz po kilkuminutowej okluzji tętnicy ramiennej. PORH dostarcza istotnych informacji o potencjale wazodylatacyjnym naczyń mikrokrążenia. W ocenie lokalnej perfuzji mikrokrążenia w odpowiedzi na zastosowany test stymulacyjny, najczęściej wykorzystywana jest nieinwazyjna metoda laserowodopplerowska. Technika ta umożliwia analizę w czasie rzeczywistym zmian wielkości przepływu krwi powstałych w wyniku zwolnienia okluzji naczynia tętniczego [11-13]. Od niedawna dostępna jest nowa nieinwazyjna metoda pozwalającą ocenić funkcję śródbłonka w odpowiedzi na zmiany przepływu krwi w mikrokrążeniu (FMSF, flow mediated skin fluorescence). Metoda FMSF opiera się na monitorowaniu fluorescencji dinukleotydu nikotynoamidoadeninowego (NADH, dihydronicotinamide adenine dinucleotide). Dzięki zastosowaniu okluzji tętnicy ramiennej, technika FMSF pozwala ocenić funkcję mikrokrążenia w okresie pookluzyjnym, ale dodatkowo pozwala na obserwację reakcji zachodzących w badanej tkance w okresie niedokrwienia, czego nie umożliwia żadna z dotychczas stosowanych metod oceny perfuzji [14,15]. Warto podkreślić, że NAD+ i jego zredukowana forma NADH pełnią ważną funkcję utleniania i redukcji w procesie oddychania komórkowego. Monitorowanie fluorescencji NADH in vitro celem oceny metabolicznego stanu mitochondriów było stosowane od połowy XX wieku. Udowodniono, że fluorescencja NADH o długości fali ok nm jest najsilniejszą komponentą emitowaną z naskórka ludzkiego w odpowiedzi na wzbudzenie światłem ultrafioletowym (UV) o długości fali 340 nm [16,17]. Rejestracja fluorescencji NADH in vivo przy pomocy nowej metody FMSF umożliwia monitorowanie procesów biochemicznych, które są zależne od funkcji mikrokrążenia. Istotnym novum techniki FMSF jest możliwość oceny odpowiedzi niedokrwiennej. Udowodniono, że w trakcie niedokrwienia dochodzi do nagromadzenia w komórce koenzymu NADH w odpowiedzi 9

10 na zmniejszone dostarczanie tlenu do tkanek [16]. Technika FMSF pozwala na analizę wielu parametrów krzywej fluorescencji NADH, jednak najistotniejsze wydają się: odpowiedź ischemiczna (IRmax, ischemic response) i odpowiedź hyperemiczna (HRmax, hyperemic response). IRmax to procentowy wzrost fluorescencji NADH w stosunku do linii bazowej, rejestrowany podczas okluzji naczynia. Wydaję się, iż odpowiedź ischemiczna określa sprawność mitochondriów oraz może odzwierciedlać wrażliwość tkanki na niedokrwienie. Natomiast HRmax to rejestrowany w okresie pookluzyjnym względny spadek fluorescencji NADH, który pozwala na ocenę potencjału wazodylatacyjnego mikrokrążenia min. zależnego od śródbłonka [14]. Reasumując, metoda FMSF stanowi cenne uzupełnienie dotychczasowych badań naczyń oraz funkcji śródbłonka. Śródbłonek naczyniowy określa się jako największy narząd wewnątrzwydzielniczy człowieka. Jego komórki produkują związki o działaniu wazoaktywnym takie jak tlenek azotu (NO, ang. nitric oxide), prostacyklina oraz endoteliny, które pełnią istotną rolę w utrzymaniu tonusu naczyniowego [18-20]. Wśród nich, NO jest najsilniej działającym związkiem o działaniu wazodylatacyjnym. Dodatkowo odpowiada on za utrzymanie prawidłowej hemostazy poprzez blokowanie agregacji płytek krwi oraz kontroluje procesy zapalne. Zmniejszona biodostępność NO uważana jest za istotny element zjawiska określanego mianem dysfunkcji śródbłonka. Asymetryczna dimetylarginina (ADMA, assymetric dimethylarginine) jest endogennym inhibitorem NO. Jej działanie polega zarówno na zmniejszeniu produkcji jak i biodostępności NO [21]. Spośród wszystkich substancji wydzielanych przez śródbłonek, endotelina-1 (ET-1, endothelin-1) jest najsilniej działającym związkiem wazokonstrykcyjnym. Dodatkowo, ET-1 wykazuje działanie mitogenne i proagregacyjne, biorąc udział w procesie rozwoju miażdżycy. Reasumując, NO i ET-1 działają w stosunku do siebie antagonistycznie, stanowiąc główne substancje odpowiedzialne za regulację tonusu naczyniowego [22,23]. Warto podkreślić, iż podwyższone osoczowe stężenie endogennego inhibitora NO (ADMA), jak i ET-1 obserwuje się w wielu schorzeniach sercowo-naczyniowych, a substancje te uważane są 10

11 za istotne wskaźniki dysfunkcji śródbłonka oraz ważne czynniki ryzyka chorób sercowo-naczyniowych [24,25]. 11

12 4. Cele pracy Celem pracy było ustalenie przydatności klinicznej nowej metody FMSF w ocenie mikrokrążenia i funkcji śródbłonka u pacjentów z chorobą wieńcową i osób zdrowych. Podjęto próbę ustalenia związku między głównymi parametrami uzyskiwanymi metodą FMSF podczas niedokrwienia oraz w okresie pookluzyjnym, a uznanymi markerami funkcji śródbłonka naczyniowego. W związku z powyższym przeprowadzono badania, które miały pozwolić na: 1) Ocenę powtarzalności i odtwarzalności pomiarów dokonywanych nową metodą FMSF oraz określenie zgodności pomiarów dokonywanych przez dwóch różnych operatorów. 2) Określenie różnic między badanymi populacjami w zakresie parametru IRmax i HRmax. 3) Ocenę wpływu czasu okluzji na wartość parametrów FMSF oraz ustalenie związku parametrów FMSF z lokalną perfuzją mikrokrążenia. 4) Analizę korelacji między parametrami uzyskiwanymi metodą FMSF tj. IRmax i HRmax, a biochemicznymi markerami funkcji śródbłonka tj. ADMA i endoteliną-1. 12

13 5. Materiał i metodyka badań Grupę badaną stanowiło 50 pacjentów ze stabilną chorobą wieńcową (CAD), potwierdzoną w badaniu angiograficznym, pozostających pod opieką Poradni Kardiologicznej Uniwersyteckiego Centrum Klinicznego w Gdańsku. Natomiast grupa kontrolna składała się z 30 zdrowych ochotników obydwu płci w wieku powyżej 18 lat. Kryteria wykluczające z protokołu badawczego stanowiły: okres ciąży i karmienia piersią, obecność schorzeń przewlekłych takich jak nowotwór, niewydolność oddechowa, niewydolność nerek oraz nadciśnienie płucne. Wszystkie osoby obciążone CAD znajdowały się w stabilnym stanie klinicznym przez ostatnie 3 miesiące przed włączeniem do badania oraz nie modyfikowano u nich w tym okresie dotychczasowej farmakoterapii. W pierwszym dniu badania, u każdej włączonej osoby wykonano badanie EKG, pomiar ciśnienia tętniczego oraz ocenę prędkości fali tętna (PWV, pulse wave velocity) aparatem SphygmoCor (AtCor Medical, Sydney, Australia). Dodatkowo, w pierwszym dniu badania, w grupie pacjentów pobrano krew celem wykonania oznaczeń biochemicznych asymetrycznej dimetyloargininy (ADMA) oraz endoteliny-1 (ET-1) metodą immunoenzymatyczną (ELISA, enzyme linked immunosrobent assay). Badania mikrokrążenia przeprowadzano w pozycji siedzącej aparatem AngioTester (SN M, Angionica, Łódź, Polska), w pomieszczeniu z kontrolowaną temperaturą powietrza (24 +/- 1 C), po co najmniej 15- minutowym okresie adaptacji. Przez pierwsze 3 minuty rejestrowano spoczynkowe wartości fluorescencji NADH emitowane z naskórka przedramienia. Następnie zastosowano okluzję tętnicy ramiennej pompując mankiet aparatu 50 mmhg powyżej wartości ciśnienia skurczowego. Podczas 3 minutowej okluzji monitorowano wzrost fluorescencji NADH uzyskując wartość odpowiedzi ischemicznej w postaci parametru IRmax [w %]. Następnie zwalniano okluzję powodując spadek fluorescencji i uzyskanie parametru odpowiedzi hyperemicznej tj. HRmax [w %]. Fluorescencję NADH rejestrowano w sposób ciągły. 13

14 Każdej badanej osobie wykonano dwukrotnie badanie FMSF podczas pierwszej wizyty oraz kolejny pomiar po 7 ( +/- 2 dni) w celu określenia powtarzalności i odtwarzalności pomiarów. Ponadto, u 10 zdrowych osób wykonano czterokrotnie badanie FMSF w odstępach 15 minutowych, stosując różne czasy okluzji (1, 2, 3 i 5 minut) celem oceny wpływu czasu okluzji na uzyskiwane parametry IRmax i HRmax. U kolejnych 10 zdrowych ochotników przeprowadzono dodatkowe dwa badania FSMF przed i po miejscowym ochłodzeniu badanego obszaru przedramienia do temperatury 15 C, celem oceny związku parametrów IRmaxi HRmax z lokalną perfuzją naczyń mikrokrążenia. Analizie poddano parametr IRmax rejestrowany w trakcie okluzji tętnicy ramiennej oraz parametr HRmax rejestrowany po zwolnieniu okluzji. IRmax wyraża procentowy wzrost intensywności fluorescencji NADH w stosunku do względnej linii bazowej rejestrowanej przed okluzją, natomiast HRmax definiowany jest jako maksymalny spadek fluorescencji NADH do linii bazowej rejestrowanej po zakończeniu okluzji naczynia. Analiza statystyczna została wykonana przy użyciu oprogramowania SPSS wersja 21.0 (IBM Corp., Armonk, NY, USA) oraz Statistica wersja 12.0 (StatSoft, Tulsa, OK, USA). Zmienne o charakterze ciągłym przedstawiono jako średnią arytmetyczną ± odchylenie standardowe. Przeprowadzono analizę rozkładu normalnego za pomocą testu Shapiro-Wilka. Porównań pomiędzy grupami dokonano przy pomocy testu t-studenta lub testu Mann-Whitney a. Korelacje pomiędzy różnymi parametrami oceniane zostały przy pomocy współczynnika korelacji Pearsona. Powtarzalność (repeatability) pomiarów została wyrażona jako współczynnik korelacji wewnątrzklasowej (ICC, intraclass correlation coefficient), natomiast odtwarzalność (reproducibility) została przedstawiona jako współczynnik zmienności (CV, coefficient of variation). Ponadto, zastosowano metodę Blanda-Altmana do oceny zgodności między pomiarami. W pracy przyjęto poziom istotności statystycznej p<0.05. Badania realizowane w ramach pracy doktorskiej uzyskały zgodę Niezależnej Komisji Bioetycznej przy Gdańskim Uniwersytecie Medycznym (nr zgody NKBBN/252/2016). 14

15 Wszyscy uczestnicy otrzymali pisemną informację o protokole badania oraz wyrazili świadomą i pisemną zgodę na udział w badaniu, uzyskując jednocześnie prawo do wycofania się z badania w każdej chwili. 15

16 6. Omówienie publikacji wchodzących w skład rozprawy Rozprawa doktorska została przedstawiona w trzech pracach opublikowanych w recenzowanych czasopismach naukowych. Pierwsza praca poglądowa stanowi wprowadzenie do tematyki oceny zaburzeń mikrokrążenia w chorobach układu krążenia. Kolejne dwie prace oryginalne, prezentują badania funkcji śródbłonka mikrokrążenia za pomocą rejestracji fluorescencji NADH u pacjentów z chorobą wieńcową i osób zdrowych. Warto podkreślić, iż wyniki przedstawione w pracy doktorskiej zostały wcześniej zaprezentowane na zjeździe krajowym (Interdyscyplinarne Seminarium Naukowe pt. Ocena mikrokrążenia techniką FMSF: aspekty techniczne, metodyczne i kliniczne Łódź, kwiecień 2017) oraz międzynarodowym sympozjum ( 2nd Joint Meeting of the European Society for Microcirculation and European Vascular Biology Organisation Genewa, czerwiec 2017) dotyczącym tematyki mikrokrążenia. 6.1 Publikacja 1 Wstęp do cyklu prac stanowi artykuł poglądowy pt. Zastosowanie pookluzyjnej reakcji przekrwiennej w ocenie funkcji śródbłonka mikrokrążenia opublikowany w Chorobach Serca i Naczyń w 2016 roku. W pracy tej omówiono mechanizmy regulacyjne testu prowokacyjnego opartego o okluzję naczynia tętniczego tj. PORH oraz metody służące do jego oceny. Podkreślono, że w wielu chorobach układu krążenia odpowiedź wazodylatacyjna w teście PORH jest upośledzona, natomiast ulega ona poprawie po włączeniu terapii hipotensyjnej, hipolipemizującej oraz przeciwcukrzycowej. Ponadto, zwrócono po raz pierwszy w polskim piśmiennictwie uwagę na nową nieinwazyjną metodę FMSF w ocenie funkcji mikrokrążenia. Technika opiera się na monitorowaniu fluorescencji NADH w odpowiedzi na zmiany przepływu krwi w naczyniach mikrokrążenia. Podkreślono dodatkowe walory nowej metody, która jako pierwsza pozwala badać nie tylko zmiany zachodzące w przepływie w okresie hyperemii, ale także zachodzące zmiany biochemiczne w czasie niedokrwienia 16

17 tkanki. W pracy przedstawiono zasadę działania metody FMSF, omówiono przebieg badania oraz sposób analizy i interpretacji wyników. 6.2 Publikacja 2 W pracy oryginalnej pt. Reproducibility of flow mediated skin fluorescence to assess microvascular function opublikowanej w czasopiśmie Microvascular Research w 2017 roku, przedstawiono wyniki walidacji nowej metody FMSF. Do badań włączono chorych obciążonych stabilną chorobą wieńcową oraz zdrowych ochotników. Głównym celem podjętych badań było określenie powtarzalności i odtwarzalności dokonywanych pomiarów oraz określenie różnic między badanymi populacjami w zakresie parametrów IRmax i HRmax. W tym celu u każdego badanego wykonano pierwszego dnia badanie FMSF, które następnie powtórzono po 7 dniach (+/- 2 dni). Dodatkowo w podgrupach osób zdrowych wykonano testy mające na celu wykazanie związku zmiany fluorescencji NADH z miejscowym przepływem w mikrokrążeniu. W pierwszej podgrupie, u 10 zdrowych osób wykonano 4 kolejne pomiary FMSF w odstępie 15 minut, stosując różne czasy okluzji. U kolejnych 10 zdrowych ochotników wykonano dwa dodatkowe pomiary FMSF, przed oraz po miejscowym ochłodzeniu skóry przedramienia do temperatury 15 C. Na podstawie przeprowadzonych badań wykazano bardzo dobrą powtarzalność i odtwarzalność pomiarów dla parametrów IRmax i HRmax z zastosowaniem 3-minutowej okluzji naczynia tętniczego, zarówno u osób zdrowych jak i w grupie pacjentów z chorobą wieńcową (IRmax zdrowi: ICC=0.88, CV=18; IRmax CAD: ICC=0.98, CV=11; HRmax zdrowi: ICC=0.97, CV=5; HRmax CAD: ICC=0.94, CV=9). Dodatkowo, wykazano, iż zarówno parametr IRmax, jak i HRmax pozwalają na różnicowanie osób zdrowych od chorych CAD, a wartość tych parametrów istotnie ujemnie koreluje z wiekiem badanych. W grupie osób zdrowych w stosunku do pacjentów CAD uzyskano istotnie statystycznie wyższe parametry zarówno odpowiedzi ischemicznej (14.7 ± 6.8% vs 6.7 ± 4.8%, p<0.001), jak i odpowiedzi hyperemicznej (19.5 ± 5.4% vs 11.6 ± 3.6%, p<0.001). 17

18 Dodatkowo, dzięki zastosowaniu testów prowokacyjnych, wykazano zależność zmian fluorescencji NADH od zmian przepływu w mikrokrążeniu. Uzyskano istotny statystycznie, zależny od czasu okluzji wzrost wartości parametrów IRmax i HRmax. Jednocześnie wykazano istotne zmniejszenie odpowiedzi hyperemicznej (9.8 ± 4.2% vs 17.8 ± 2,5%, p<0.001) oraz wzrost odpowiedzi ischemicznej (23 ± 15% vs 11.8 ± 6.4%, p<0.028) po sprowokowaniu wazokonstrykcji w mikrokrążeniu, po miejscowym ochłodzeniu badanego obszaru tkanki. Powyższa praca jest pierwszym doniesieniem weryfikującym kliniczne zastosowanie nowej metody oceny mikrokrążenia. W pracy podkreślono, iż niezbędne są dalsze badania oceniające związek parametrów FMSF z biochemicznymi markerami funkcji śródbłonka. 6.3 Publikacja 3 Kolejna praca oryginalna A pilot study with flow mediated skin fluorescence - a novel device to assess microvascular endothelial function in coronary artery disease opublikowana w Cardiology Journal w 2017, przedstawia analizę korelacji pomiędzy parametrami funkcji mikrokrążenia otrzymanymi za pomocą pomiaru fluorescencji NADH, a uznanymi biochemicznymi markerami funkcji śródbłonka u pacjentów ze stabilną chorobą wieńcową. Na podstawie przeprowadzonych badań, wykazano istotną statystycznie ujemną korelację pomiędzy osoczowym stężeniem ADMA, a parametrem HRmax (r=-0.534, p=0.003). Uzyskane wyniki pokazują wyraźnie, że wysokie stężenia ADMA u pacjentów z CAD są związane z niższymi wartościami odpowiedzi hyperemicznej, świadczącymi o zmniejszonym potencjale wazodylatacyjnym mikrokrążenia, wynikającym najprawdopodobniej ze zmniejszonej biodostępność NO. Dodatkowo, analiza korelacji wykazała istotną odwrotną zależność między osoczowym poziomem ET-1, a parametrem IRmax (r=-0.575, p=0.001). W trakcie okluzji naczynia, dochodzi do zmniejszenia dostępności tlenu, a w następstwie tego wzrasta stężenie NADH w komórce. Wydaje się, iż obserwowana amplituda odpowiedzi ischemicznej odzwierciedla funkcję mitochondriów oraz 18

19 wyraża wrażliwość tkanki na hipoksję. Warto podkreślić, iż w eksperymentalnym modelu zwierzęcym wykazano, że dysfunkcja mitochondriów powoduje wzrost ekspresji ET-1, co uzasadnia otrzymane korelacje. Na podstawie przeprowadzonych analiz, nie wykazano związku pomiędzy poziomem w osoczu krwi ADMA i IRmax (r=0.028, p=0.889), oraz poziomem ET-1 i HRmax (r=0.048, p=0.810). Dodatkowo, w podgrupie pacjentów z obniżoną funkcją skurczową lewej komory (LVEF, left ventricular ejection fraction) w porównaniu do osób z zachowaną funkcją skurczową lewej komory uzyskano niższe wartości zarówno parametru IRmax (6.6 ± 3.2 vs. 9.6 ± 5.2, p=0.075), jak i HRmax (10.9 ± 6.3 vs ± 3.4, p=0.181). Podobny trend zaobserwowano u pacjentów obciążonych cukrzycą (DM, diabetes mellitus) w stosunku do osób bez cukrzycy w wywiadzie IRmax (7.1 ± 4.9 vs. 9.5 ± 3.8, p=0.087), HRmax (10.3 ± 4.3 vs ± 5.2, p< 0.05). Jednocześnie, w przeprowadzonych analizach wykazano wyższe wartości IRmax i HRmax w podgrupie pacjentów z zachowaną LVEF i DM w stosunku do u osób z obniżoną LVEF i DM: IRmax (8.6 ± 3.5 vs. 4.2 ± 1.7, p<0.05) oraz HRmax (12.6 ± 3.1 vs. 5.6 ± 1.7, p<0.001), odpowiednio. Reasumując, odpowiedzi IRmax i HRmax są znacząco upośledzone u pacjentów z CAD z obniżoną LVEF oraz współwystępującą cukrzycą, co sugeruje istotne zaburzenie funkcji śródbłonka mikrokrążenia u tych pacjentów. W przedstawionej pracy, stosując metodę Blanda-Altmana oraz analizę współczynnika korelacji wewnątrzklasowej (ICC) wykazano wysoką zgodność pomiarów IRmax i HRmax dokonywanych przez dwóch niezależnych operatorów. ICC dla pomiarów IRmax wyniósł (p<0.001), a dla HRmax (p<0.001). 19

20 7. Wnioski 1. Metoda FMSF umożliwia ilościową ocenę odpowiedzi niedokrwiennej (IRmax) i przekrwiennej (HRmax) oraz cechuje się bardzo dobrą powtarzalnością i odtwarzalnością pomiarów zarówno u osób zdrowych, jak i pacjentów z chorobą wieńcową. Ponadto, wykazano wysoką zgodność pomiarów dokonywanych przez dwóch różnych operatorów. 2. Parametry IRmax i HRmax pozwalają różnicować osoby zdrowe od pacjentów ze chorobą wieńcową, a ich wartości odpowiadają stopniowi zaawansowania choroby. 3. Wartości parametrów IRmax i HRmax są zależne od zastosowanego czasu okluzji oraz zmian przepływu w naczyniach mikrokrążenia. 4. Parametry oceniane metodą FMSF wykazują związek z biochemicznymi markerami funkcji śródbłonka. Wykazano istotną odwrotną zależność pomiędzy wartościami IRmax i poziomem ET-1 oraz HRmax i ADMA. 20

21 Wykaz cytowanego piśmiennictwa 1. Hellmann M., Roustit M., Cracowski J.L. Skin microvascular endothelial function as a biomarker in cardiovasculr diseases? Pharmacol. Rep. 2015;67: Holowatz L.A., Thompson-Torgerson C.S., Kenney W.L. The human cutaneous circulation as a model of generalized microvascular function. J. Appl. Physiol. 2008;105: Abularrage C.J., Sidawy A.N., Aidinian G., Singh N., Weiswasser J.M., Arora S. Evaluation of the microcirculation in vascular disease. J. Vasc. Surg. 2005;42: Flammer A.J., Anderson T., Celermajer D.S. i wsp. The assessment of endothelial function: from research into clinical practice. Circulation 2012;126: Hellmann M., Dudziak M. Analiza kontrastu obrazu spekli laserowych - nowa metoda oceny mikrokrążenia. Choroby Serca i Naczyń 2013;10: Roustit M., Hellmann M., Cracowski C., Blaise S., Cracowski J.L. Sildenafil increases digital skin blood flow during all phases of local cooling in primary Raynaud s phenomenon. Clin. Pharmacol. Ther. 2013;91: Blaise S., Hellmann M., Roustit M., Isnard S., Cracowski J.L. Oral sildenafil increases skin hyperaemia induced by iontophoresis of sodium nitroprusside in healthy volunteers. Br. J. Pharmacol. 2010;160: Abraham P., Bourgeau M., Camo M. i wsp. Effect of skin temperature on skin endothelial function assessment. Microvasc. Res. 2013;88: Mahe G., Humeau-Heurtier A., Durand S., Leftheriotis G., Abraham P. Assessment of skin microvascular function and dysfunction with laser speckle contrast imaging. Circ. Cardiovasc. Imaging 2012;5: Tesselaar E., Sjoberg F. Transdermal iontophoresis as an in-vivo technique for studying microvascular physiology. Microvasc. Res. 2011;81:

22 11. Roustit M., Cracowski J.L. Assessment of endothelial and neurovascular function in human skin microcirculation. Trends Pharmacol. Sci. 2013;34: Roustit H., Cracowski J.L. Non-invasive assessment of skin microvascular function in humans: an insight into methods. Microcirculation 2012;19: Cracowski J.L., Roustit M. Current methods to assess human cutaneous blood flow: an updated focus on laser-based techniques. Microcirculation 2016;23: Piotrowski L., Urbaniak M., Jedrzejczak B., Marcinek A., Gebicki J. Flow mediated skin fluorescence - a novel technique for evaluation of cutaneous microcirculation. Rev. Sci. Instrum. 2016;87: Gebicki J., Marcinek A., Zielonka J. Transient species in the stepwise interconversion of NADH an NAD+. Acc. Chem. Res. 2004;37: Mayevsky A., Rogatsky G.G. Mitochondrial function in vivo evaluated by NADH fluorescence: from animal models to human studies. Am. J. Phys. Cell Phys. 2007;292:C615-C Mayevsky A., Chance B. Oxidation-reduction states of NADH in vivo: from animals to clinical use. Mitochondrion 2007;7: Blann A.D. Assessment of endothelial dysfunction: focus on atherothrombotic disease. Pathophysiol. Haemost. Thromb. 2004;33: Januszewicz W., Sznajderman M. Modification of endothelial function - new method of antihypertensive treatment. Arterial Hypertension 2000;4: Neubauer-Geryk J., Bieniaszewski L. Metody oceny funkcji śródbłonka. Wazodylatacja tętnicy ramiennej po niedokrwieniu. Choroby Serca i Naczyń 2007;4: Sibal L., Agarwal S.C., Home P.D. i wsp. The role of assymetric dimethylarginine (ADMA) in endothelial dysfunction and cardiovascular disease. Curr. Cardiol. Rev. 2010;6: Gras A., Belaidi E., Briancom-Marjollet A. i wsp. Endothelin-1 mediates intermittent hypoxiainduced inflamatory vascular remodeling through HIF-1 activation. J. Appl. Physiol. 2016;120:

23 23. Spieker L.E., Luscher T.F., Noll G. ETA receptors mediate vasocontriction of large conduit arteries during reduced flow in humans. J. Cardiovasc. Pharmacol. 2003;42: Hsu C.P., Lin S.J., Chung M.Y. i wsp. Asymmetric dimethylarginine predicts clinical outcomes in ischemic chronic heart failure. Atherosclerosis 2012;225: Yuki K., Miyauchi T., Kakinuma Y. i wsp. Mitochondrial dysfunction increases expression of endothelin-1 and induces apoptosis through caspase-3 activation in rat cardiomyocytes in vitro. J. Cardiovasc. Pharmacol. 2000;36:

24 10. Publikacje wchodzące w skład rozprawy 24

25 25