Ocena makroprolaktynemii po precypitacji glikolem polietylenowym porównanie różnych wariantów wirowania

Transkrypt

1 diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics Diagn Lab 2015; 51(3): Praca oryginalna Original Article Ocena makroprolaktynemii po precypitacji glikolem polietylenowym porównanie różnych wariantów wirowania Evaluation of macroprolactinaemia after precipitation with polyethylene glycol the assessment of the various spin variants Karolina Beda-Maluga, Aleksandra Cendlewska, Hanna Pisarek, Jacek Świętosławski, Katarzyna Winczyk Zakład Neuroendokrynologii, Międzywydziałowa Katedra Diagnostyki Laboratoryjnej i Molekularnej, Uniwersytet Medyczny w Łodzi Streszczenie Wstęp: Jedną z przyczyn hiperprolaktynemii, czyli podwyższonego stężenia prolaktyny (PRL) we krwi może być obecność znacznej ilości makroprolaktyny (MaPRL). Do wykrywania makrocząsteczek najczęściej stosowana jest metoda precypitacji glikolem polietylenowym (PEG). W literaturze przedmiotu brak jest jednak danych na temat wpływu parametrów wirowania mieszaniny PEG-u i badanej surowicy na ilość cząsteczek MaPRL wytrącanych w procesie precypitacji. Cel: Celem pracy było zbadanie, czy skrócenie czasu wirowania przy odpowiednio zmodyfikowanej prędkości rotacji próbki ma wpływ na ilość osadzonych makrocząsteczek. Materiał i metody: Badaniu poddano 86 surowic: z prawidłowym stężeniem PRL grupa A, z hiperprolaktynemią nie przekraczającą 100 ng/ml grupa B i z hiperprolaktynemią powyżej 100 ng/ml grupa C. Mieszaniny surowicy i glikolu wirowano w trzech wariantach: I 3000 rpm/30 min, II 6000 rpm/8 min, III 9000 rpm/4 min. W nadsączach oznaczono PRL i oceniono zarówno wartość rzeczywistego stężenia PRL, jak i procentowy odzysk aktywnej cząsteczki hormonu. Pomiaru stężenia PRL dokonano na analizatorze Immulite 1000 (Siemens). Wyniki: Różnice pomiędzy rzeczywistymi stężeniami PRL i procentowymi odzyskami hormonu uzyskane po zastosowaniu różnych wariantów wynosiły: w grupie A 0,65 ng/ml i 3,18%, w grupie B 1,30 ng/ml i 2,76%, a w grupie C 16,54 ng/ml i 4,23%. We wszystkich badanych grupach uzyskane różnice były istotne statystycznie, ale większość z nich mieściła się w granicach błędu zestawu pomiarowego. Wnioski: Zmiana prędkości i czasu wirowania powoduje wytrącanie odmiennych ilości makroform PRL, jednakże małe różnice liczbowe nie zmieniają klinicznej oceny wyniku. Zatem, skrócenie czasu wirowania przy odpowiednio zwiększonej prędkości rotacji pozwala utrzymać właściwą efektywność sedymentacji. Summary Introduction: One of the causes of hyperprolactinemia, that means elevated prolactin (PRL) level, can be a significant amount of macroprolactin (MaPRL) in the blood. The most common method of macromolecules detection is precipitation with polyethylene glycol (PEG). However, there is no data concerning the influence of spinning parameters of PEG and serum mixture on the number of precipitated MaPRL particles. Aim: The aim was to check whether the shortened spinning time with a suitably modified speed affects the amount of sedimented macromolecules. Material and methods: The study involved 86 sera: with normal serum PRL level group A, with hyperprolactinaemia below 100 ng/ ml group B and with hyperprolactinaemia above 100 ng/ml group C. Serum and PEG mixtures were centrifuged at three variants: I 3000 rpm/30 min, II 6000 rpm/8 min, III 9000 rpm/4 min. In supernatants the PRL level was determined and then both the real PRL concentration and the percentage recovery of the hormone were evaluated. PRL concentrations were determined with Immulite 1000 (Siemens). Results: The difference between the real PRL concentration and the percentage recovery of hormone obtained with use different variants of spinning were (averaged): in group A 0.65 ng/ml and 3.18%, in group B 1.30 ng/ml and 2.76%, in group C ng/ml and 4.23%. In all groups differences were statistically significant, but most of them were within the range of coefficient of variation of used immunotest. Conclusion: Change of spin speed and time causes precipitation of different amounts of PRL macroforms, but the small numerical differences do not alter the clinical assessment of the results. Therefore, shortened spin time with appropriately increased rotation speed let to maintain the proper sedimentation efficiency. 203

2 Słowa kluczowe: Key words: hiperprolaktynemia, makroprolaktyna, polietylenoglikol, precypitacja. hyperprolactinaemia, macroprolactin, polyethylene glycol, precipitation. Wstęp Hiperprolaktynemia, czyli podwyższone stężenie prolaktyny (PRL) we krwi, najczęściej jest objawem zaburzeń czynnościowych lub chorób ogólnoustrojowych takich, jak niedoczynność tarczycy, niewydolność wątroby czy nerek. Może także być następstwem zmian organicznych w okolicy podwzgórzowo-przysadkowej (głównie prolactinoma) lub mieć charakter polekowy. Jednak podwyższone stężenie hormonu może również wynikać ze zwiększonej ilości makroform PRL we krwi. Makroprolaktyna (MaPRL) to kompleks monomerycznej cząsteczki hormonu z przeciwciałem anty-prl. W warunkach fizjologicznych stanowi ona nie więcej niż 2% całkowitej ilości krążącej PRL [1-7]. Makroforma ta nie wywołuje efektów biologicznych, jest jednakże, podobnie jak monomeryczna postać hormonu, rozpoznawana przez przeciwciała zawarte w zestawach diagnostycznych. Z tego powodu, jej zwiększona ilość we krwi może powodować w badaniach laboratoryjnych zawyżenie stężenia PRL do wartości przekraczających zakresy referencyjne i prowadzić do rozpoznania hiperprolaktynemii u osób z prawidłową ilością aktywnych biologicznie form hormonu [8-11]. Obecnie więc, w procesie ustalania przyczyn podwyższonego stężenia PRL zarówno Polskie Towarzystwo Endokrynologiczne, jak i Endocrine Society zalecają wykonanie badań oceniających makroprolaktynemię [4, 12]. Najczęściej stosowaną techniką wykrywania makroform we krwi jest, prosta w wykonaniu i niezbyt kosztowna, precypitacja kompleksów MaPRL za pomocą glikolu polietylenowego (PEG). Zgodnie z większością publikacji wartość odzysku hormonu mniejsza niż 40% świadczy o dominacji MaPRL w badanej próbce [2, 13, 14]. Jednakże, według ostatnich doniesień literaturowych, bardziej przydatnym diagnostycznie sposobem oceny hiperprolaktynemii jest analiza wartości PRL po precypitacji makroform, tj. rzeczywistego stężenia hormonu. Pomiar rzeczywistego stężenia PRL, czyli ilości monomerycznej aktywnej biologicznie formy hormonu, pozwala odróżnić hiperprolaktynemię prawdziwą od rzekomej (wywołanej przez MaPRL) [15, 16, 17]. Opisywane w literaturze warianty techniczne metody precypitacji są dość zróżnicowane odmienność dotyczy przede wszystkim parametrów wirowania mieszaniny surowicy i glikolu. W pierwszych opublikowanych pracach związanych z tym tematem próbki wirowano z niewielką prędkością przez dość długi czas (nawet do 30 minut). Natomiast obecnie, wraz z rosnącymi możliwościami technicznymi aparatury laboratoryjnej, preferowane jest stosowanie krótszego czasu wirowania przy zwiększonej prędkości [10, 18, 19, 20]. Brak jest jednak danych, czy zmiana parametrów rotacji próbek ma wpływ na efektywność sedymentacji makroform PRL. W związku z tym, celem pracy było zbadanie, czy zastosowanie krótszego czasu wirowania próbki (umożliwiające szybsze uzyskanie wyniku) przy odpowiednio zmodyfikowanej prędkości zmienia ilość makrocząsteczek osadzonych po zastosowaniu polietylenoglikolu. Materiały i metody Do badania wykorzystano surowice krwi żylnej uzyskane od pacjentów leczonych w Poradni Endokrynologicznej Uniwersyteckiego Szpitala Klinicznego im. WAM Centralnego Szpitala Weteranów w Łodzi lub hospitalizowanych w Klinice Endokrynologii Katedry Endokrynologii Uniwersytetu Medycznego w Łodzi. Krew pobierano rano, na czczo, a następnie oznaczano stężenie PRL. Pozostałą surowicę zamrażano w temp. -20 C do momentu przeprowadzenia doświadczenia. Łącznie badaniu poddano 86 próbek, które w zależności od wyjściowego stężenia PRL w surowicy krwi podzielono na trzy grupy: grupa A: 30 surowic z prawidłowym stężeniem PRL tzn. mieszczącym się w zakresie wartości referencyjnych podanych przez producenta zestawu Prolactin Immulite (kobiety: 1,9 25 ng/ml, mężczyźni: 2,5 17 ng/ml); grupa B: 44 surowice z podwyższonym stężeniem PRL, w których wartość hormonu nie przekraczała 100 ng/ml; grupa C: 12 surowic z podwyższonym stężeniem PRL, w których wartość hormonu była wyższa niż 100 ng/ml. Stężenie PRL w surowicy krwi zarówno przed, jak i po precypitacji PEG-iem oznaczano metodą chemiluminescencji wzmocnionej enzymatycznie (EACLIA) na platformie analizatora immunochemicznego Immulite 1000 firmy Siemens. Zakres liniowości metody zawarty jest w granicach 0,5 150 ng/ml. Współczynnik zmienności CV, określający powtarzalność wyników uzyskanych za pomocą testu Prolactin Immulite, w zależności od wyjściowego stężenia PRL, waha się w granicach 5,7 6,8% [21]. Do przeprowadzenia precypitacji wykorzystano opis procedury przedstawiony przez Olukogę i wsp. [18] w modyfikacji własnej [17, 22]. Jednakowe objętości (200 µl) świeżo przygotowanego 25% roztworu PEG-u (Sigma-Aldrich, nr kat. P2139) i badanych surowic poddawano 10-sekundowemu mieszaniu na mieszadle typu Vortex i inkubowano przez 10 minut w temperaturze pokojowej. W celu zbadania wpływu parametrów wirowania na ilość wytrącanych makroform PRL, próbki wirowano stosując trzy różne prędkości i czasy rotacji: I wariant: prędkość 3000 rpm (2000 g), czas 30 min II wariant: prędkość 6000 rpm (8000 g), czas 8 min III wariant: prędkość 9000 rpm ( g), czas 4 min Powstały po odwirowaniu nadsącz, zawierający monomeryczne cząsteczki hormonu, mieszano z diluentem w celu uzyskania końcowego 10-krotnego rozcieńczenia i, podobnie jak w surowicy natywnej (przed precypitacją PEG-iem), oznaczano stężenie PRL. Następnie oceniano wartość rzeczywistego stężenia PRL i procentowy odzysk aktywnej biologicznie cząsteczki hormonu, wyliczony wg następującego wzoru [2]: % odzysku PRL = x 100% PRL PEG [ng/ml] PRL [ng/ml] gdzie: PRL PEG stężenie prolaktyny w supernatancie uzyskanym po precypitacji PEG-iem, PRL stężenie prolaktyny w próbce natywnej surowicy 204

3 Diagn Lab 2015; 51(3): Część doświadczalną pracy wykonano w Pracowni Diagnostyki Hormonalnej Laboratorium Endokrynologicznego Uniwersyteckiego Szpitala Klinicznego im. Wojskowej Akademii Medycznej Centralnego Szpitala Weteranów w Łodzi. Na przeprowadzenie badania uzyskano zgodę Komisji Bioetyki Uniwersytetu Medycznego w Łodzi z dnia roku nr RNN/732/13/KB. go płata przysadki), czynnościowym (choroba tarczycy, zespół policystycznych jajników) lub wynikających z przyjmowania leków (tabela I). W grupie osób z prawidłowym wyjściowym stężeniem hormonu najwyższe wartości zarówno rzeczywistych stężeń, jak i procentowych odzysków PRL po precypitacji z zastosowaniem poszczególnych wariantów wirowania obserwowano Uzyskane dane zapisano w arkuszach programu Excel (MS Office 2007). Analizę statystyczną wykonano przy użyciu programu statystycznego Statistica 10. Przeprowadzono test różnic wartości średnich stężeń dla poszczególnych wariantów wirowania. Za poziom istotności przyjęto p<0,05. Na podstawie danych podanych przez producenta zestawu wyznaczono zależność funkcyjną wartości współczynnika zmienności wewnątrzseryjnej od mierzonej wielkości. Korzystając z uzyskanego wzoru, obliczono wielkości przedziałów, zbadano jaki odsetek wyników mieścił się w granicach błędu metody EACLIA. głównie (24/30 surowic) w przypadku wirowania próbek z najmniejszą prędkością i przez najdłuższy okres czasu tj rpm/30min. Natomiast najniższe stężenia i najmniejsze procentowe odzyski hormonu odnotowano w ponad połowie surowic (18/30) wirowanych z prędkością 9000 rpm przez 4 minuty. Wśród 44 surowic z hiperprolaktynemią nie przekraczającą 100 ng/ml, najwyższe rzeczywiste stężenia i procentowe odzyski hormonu po precypitacji uzyskano w 20 próbkach wirowanych wg wariantu II, w 16 surowicach po zastosowaniu wariantu III i tylko w 8 przy wykorzystaniu parametrów wariantu I. Z kolei, najniższe stężenia i procentowe odzyski PRL Wyniki Grupę badaną stanowiły 74 kobiety i 12 mężczyzn w wieku od 19 do 83 lat diagnozowanych z powodu zaburzeń hormonalnych o podłożu organicznym (guz przysadki, niedoczynność przednie- odnotowano głównie (32 próbki) po wirowaniu z prędkością 3000 rpm przez 30 minut (I wariant). W grupie pacjentów z wyjściowym stężeniem PRL powyżej 100 ng/ml najwyższe wartości stężeń i procentowych odzysków monomeru hormonu po precypitacji PEG-iem odnotowano Tabela I. Charakterystyka osób objętych badaniem. grupa A PRL 25 (K) grupa B PRL 100 grupa C PRL > 100 Razem głównie (10/12 surowic) po wirowaniu z największą prędkością PRL 17 (M)* w najkrótszym czasie K (9000 rpm/4 min), natomiast M większość wartości wiek [lata] najniższych (9/12 surowic) (średnia) (~40) (~35) (~45) (~38) stwierdzono w próbkach PRL [ng/ml] 16,9 24,4 31,8 99, , (średnia ± SEM) (20,0 ± 0,89) (49,2 ± 2,77) (370,7± 142,59) (112,9 ± 34,73) wirowanych z prędkością 3000 rpm przez 30 minut. * zakresy wartości prawidłowych podane przez producenta zestawu Prolactin Immulite, kobiety: 1,9 25 ng/ml, mężczyźni: 2,5 17 ng/ml; PRL stężenie prolaktyny w surowicy krwi; K kobieta; M mężczyzna. Podsumowanie wyników uzyskanych w trzech różnych wariantach wirowania Tabela II. Podstawowe parametry statystyczne wyliczone dla rzeczywistych stężeń PRL [ng/ml] i dla wartości odzysków [%] otrzymanych po zastosowaniu różnych wariantów wirowania próbek w poszczególnych grupach badanych i w całej populacji. przedstawia tabela II. stężenie PRL / odzysk I II I II I II I II średnia 11,82 / 59,9 11,33 / 57,5 11,02 / 55,8 29,16 / 60,6 30,17 / 62,5 29,84 / 62,0 269,88 / 71,7 283,53 / 73,3 289,58 / 76,3 77,65 / 62,9 81,09 / 63,9 82,14 / 64,0 SEM 1,43 / 6,8 1,35 / 6,4 1,31 / 6,3 1,74 / 2,2 1,88 / 2,3 1,78 / 2,3 101,27 / 5,4 108,30 / 5,3 109,23 / 5,6 25,78 / 2,2 27,46 / 2,3 27,81 / 2,3 max 19,00 / 90,5 17,80 / 82,4 17,10 / 84,4 53,00 / 76,0 54,10 / 84,2 54,00 / 80,1 1336,00 / 97,3 1413,00 / 92,2 1439,00 / 102,0 1336,00 / 97,3 1413,00 / 92,2 1439,00 / 102 min 4,84 / 24,1 4,90 / 21,6 4,88 / 22,5 8,97 / 14,4 10,00 / 16,1 10,10 / 16,3 33,60 / 14,9 34,80 / 15,5 38,30 / 17,0 4,84 / 14,4 4,90 / 15,5 4,88 / 16,3 Oceniając bezwzględne wartości różnic pomiędzy stężeniami i procentowymi odzyskami PRL po wirowaniu wg poszczególnych wariantów, w grupie A i C największe różnice odnotowano pomiędzy wynikami otrzymanymi po zastosowaniu parametrów wariantu I i III, natomiast w grupie B po wirowaniu według wariantu I i II. We wszystkich badanych grupach najmniejsze bezwzględne różnice między stężeniami i procentowymi odzyskami hormonu po precypitacji grupa A grupa B grupa C cała grupa 205

4 zaobserwowano pomiędzy wartościami uzyskanymi po wirowaniu próbek wg wariantu II i wariantu III tabela III. dzono test różnic. Wykazano, że w grupach badanych znamienne statystycznie (tzn. poziom istotności p<0,05) są różnice pomiędzy wynikami uzyskanymi po Tabela III. Parametry statystyczne wyliczone dla wartości bezwzględnych różnic pomiędzy wynikami uzyskanymi po zastosowaniu wirowaniu wg I i III wariantu, trzech badanych wariantów wirowania w poszczególnych grupach badanych i w całej populacji. a dodatkowo w grupach A i B różnice pomiędzy stężenie PRL / odzysk średnia max min wartościami otrzymanymi w. I vs. w. II 0,61 / 3,00 1,36 / 8,05 0,06 / 0,31 po zastosowaniu wariantów w. I vs. w. III 0,86 / 4,33 1,90 / 9,14 0,04 / 0,21 I i II. grupa A w. II vs. w. III 0,42 / 2,20 1,20 / 6,86 0,02 / 0,10 Wyliczono, jaki procent w. I vs. w. II 1,49 / 3,00 4,40 / 8,19 0,00 / 0,00 wyjściowej wartości PRL w. I vs. w. III 1,25 / 2,79 3,60 / 9,60 0,10 / 0,13 stanowi różnica między w. II vs. w. III 1,18 / 2,49 5,40 / 8,06 0,00 / 0,00 rzeczywistymi stężeniami hormonu w danej próbce w. I vs. w. II 19,54 / 4,29 77,00 / 11,67 1,00 / 0,53 otrzymanymi po zastosowaniu w. I vs. w. III 19,70 / 4,67 103,00 / 8,95 1,00 / 0,71 dwóch wariantów w. II vs. w. III 10,39 / 3,75 42,00 / 16,34 0,00 / 0,00 wirowania tj. względne w. I vs. w. II 5,20 / 3,27 77,00 / 11,67 0,00 / 0,00 różnice pomiędzy rzeczywistymi stężeniami w. I vs. w. III 5,13 / 3,47 103,00 / 9,60 0,04 / 0,13 PRL. Wyniki te porównano w. II vs. w. III 3,02 / 2,71 42,00 / 16,34 0,00 / 0,00 z przeciętną wartością współczynnika zmienności W celu oceny, czy bezwzględne różnice pomiędzy stężeniami PRL i pomiędzy wartościami procentowego odzysku hormonu po precypitacji makroform są istotne statystycznie, przeprowa- (CV = 6%) podaną przez producenta zestawu Prolactin Immulite dla oznaczeń hormonu metodą EACLIA. Wykazano, że spośród 258 wyników (86 surowic x 3 oznaczenia) PRL po precypitacji, grupa B grupa C cała grupa Rycina 1. Rozkład względnych wartości różnic [%] pomiędzy stężeniami PRL otrzymanymi po zastosowaniu trzech wariantów wirowania próbki w zależności od wyjściowego stężenia hormonu i w porównaniu ze współczynnikiem zmienności (CV) podawanym przed producenta testu Immulite

5 Diagn Lab 2015; 51(3): (81,4%) wartości różnic mieściły się w zakresie błędu metody oznaczania hormonu (±6%), a w 48 (18,6%) przypadkach różnice te były większe niż wartość współczynnika CV (rycina 1). Dyskusja Wykrywanie MaPRL za pomocą metody precypitacji PEG-iem stosowane jest od lat 90-tych ubiegłego wieku. Początkowo próbki wirowano przez dość długi czas około 30 minut ze stosunkowo małą prędkością około 2000 g [8, 18, 23]. Z kolei, w ostatnio publikowanych pracach stosowano przeważnie krótki czas (od 2 do 10 minut) i dużą prędkość wirowania ( g) [10, 24, 25]. W metodyce publikowanych prac brak jest jednakże uzasadnienia wyboru danego wariantu wirowania. Można założyć, że modyfikacje techniczne procesu precypitacji z jednej strony wynikają z rosnących możliwości aparaturowych, a z drugiej są związane ze stawianymi współczesnej diagnostyce laboratoryjnej oczekiwaniami jak najszybszego uzyskania wyniku badania. Co więcej, w piśmiennictwie brak jest danych na temat wpływu różnych parametrów wirowania na efektywność precypitacji PEG-iem. Jest to dość zastanawiające, gdyż wiadomo, że od ilości osadzonych makrocząsteczek zależy wartość rzeczywistego stężenia PRL i jej procentowego odzysku. Na podstawie tych wartości stwierdza się także, czy przyczyną hiperprolaktynemii jest nadmiar MaPRL, czy nadmiar aktywnej biologicznie monomerycznej postaci PRL we krwi. Brak danych literaturowych na temat zależności efektywności precypitacji od czasu i prędkości wirowania ogranicza prowadzenie typowej dyskusji, dlatego w tej części pracy zostaną dokładnie przeanalizowane wyniki badań z uwzględnieniem ich wykorzystania w rutynowej pracy laboratoryjnej. Ustalając parametry dla poszczególnych wariantów wirowania, zgodnie z prawami fizyki przyjęto, że w standardowym roztworze ilość makrocząsteczek osadzonych przy zastosowaniu różnych parametrów wirowania powinna być porównywalna, o ile parametry te zostaną ustalone w oparciu o równanie Lamma opisujące natężenie sedymentacji w zależności od prędkości i czasu wirowania. Według tego równania, skracając czas wirowania i dążąc do całkowitego osadzenia się wytrąconych makrocząsteczek, należy odpowiednio zwiększyć prędkość rotacji [26]. Zatem, odpowiedni dobór prędkości i czasu wirowania powinien skutkować otrzymaniem porównywalnych wyników. Wyniki naszej pracy wskazują, że w grupie osób z prawidłowym stężeniem PRL najwięcej makroform uległo sedymentacji podczas wirowania z największą prędkością w krótkim czasie, a najmniej przy zastosowaniu najmniejszej prędkości i długiego okresu rotacji próbek. Z drugiej strony, wśród pacjentów z hiperprolaktynemią przekraczającą 100 ng/ml zależność pomiędzy efektywnością sedymentacji a parametrami wirowania była odwrotna. Stwierdzone różnice wynikają prawdopodobnie z fizycznych oddziaływań cząsteczek podczas procesu sedymentacji. Jeśli ilość cząstek w roztworze jest niewielka tak jak w przypadku próbek z prawidłowymi stężeniami PRL to osadzanie przebiega w sposób swobodny, gdyż na opadające cząsteczki nie oddziałują inne molekuły znajdujące się w roztworze. W przypadku, gdy stężenia hormonu są wysokie tak jak u osób z hiperprolaktynemią powyżej 100 ng/ml sedymentacja jest ograniczona, bowiem duże zagęszczenie molekuł powoduje, że cząstki w wyniku wzajemnych oddziaływań utrudniają swobodną sedymentację [27]. Możemy założyć, że w przypadku dużej ilości cząstek w surowicy krwi, nie prędkość a czas wirowania ma kluczowe znaczenie dla efektywności sedymentacji i wówczas zastosowanie dłuższego okresu rotacji pozwala wytrąconym przez PEG makrocząsteczkom na właściwą sedymentację. Potwierdzeniem powyższego założenia jest także fakt, że w całej grupie ze średnimi wartościami PRL (do 100 ng/ml) nie zaobserwowano dominującej zależności między zmianą parametrów wirowania a ilością osadzanych cząstek. Jednakże, w próbkach ze stężeniem PRL przekraczającym 50 ng/ ml większą efektywność wirowania stwierdzono po zastosowaniu niskiej prędkości i długiego czasu rotacji. Uzyskane przez nas wartości wskazują, że zarówno stężenia, jak i procentowe odzyski PRL po precypitacji PEG-iem różnią się w poszczególnych próbkach w zależności od zastosowanego wariantu wirowania. Przeprowadzona analiza wykazała, że różnice te, w większości przypadków, są znamienne statystycznie, co sugerowałoby, że modyfikacja procedury precypitacji glikolem wpływa na efektywność przeprowadzanego procesu. Jednakże, oceniając wartości rzeczywistych stężeń i procentowych odzysków hormonu uzyskane w trzech badanych wariantach, można zauważyć, że są one zbliżone. U osób ze stężeniami PRL poniżej 100 ng/ml otrzymane wartości różnią się, co najwyżej, o kilka procent lub ng/ ml. W grupie chorych z hiperprolaktynemią powyżej 100 ng/ml odnotowano większe rozbieżności pomiędzy uzyskanymi wartościami, lecz rząd wielkości zarówno rzeczywistych stężeń, jak i procentowych odzysków hormonu nie uległ zmianie. Sugeruje to zatem, że skrócenie czasu rotacji przy odpowiednio dostosowanej prędkości, pozwala uzyskać podobną efektywność precypitacji. Należy także zaznaczyć, że większość względnych różnic (81,4%) między oznaczeniami PRL po precypitacji PEG-iem mieściła się w granicach błędu zestawu pomiarowego dla PRL. Wydaje się zatem, że różnice wynikające z zastosowania różnych parametrów wirowania nie mają, większego niż zmienność metody, wpływu na uzyskany wynik. Zależności zaobserwowane w poszczególnych grupach badanych (szczególnie w próbkach z prawidłowym stężeniem PRL i próbkach ze stężeniem hormonu przekraczającycm 100 ng/ ml) mogły wynikać ze wspomnianych oddziaływań fizycznych pomiędzy cząsteczkami, ale mogły także być spowodowane wytrącaniem przez PEG nie tylko cząsteczek MaPRL, ale także różnych izoform PRL, m.in. dimerów czy oligomerów. Przypuszczalnie, stosowanie wysokich obrotów podczas wirowania w przypadku surowic z prawidłowym stężeniem PRL, ale zawierających dimery i/lub oligomery hormonu, może powodować szybsze opadanie cząsteczek, szczególnie tych o większej masie cząsteczkowej. Tłumaczyło by to uzyskanie najniższych stężeń PRL i najmniejszych procentowych odzysków w przypadku wirowania próbek z największą prędkością, ale przez krótki czas (II). Z kolei, w surowicach z hiperprolaktynemia przekraczającą 100 ng/ml najwięcej cząsteczek ulegało osadzeniu po wirowaniu z niewielką prędkością, ale przez dłuższy czas. Jeżeli założymy, że w próbkach tych występowały dimery i/lub oligomery PRL, można przypuszczać, że większe znaczenie w procesie sedymentacji cząsteczek 207

6 ma ich zagęszczenie w roztworze i czas rotacji próbek niż występowanie różnych postaci hormonu. Jednakże zweryfikowanie tej tezy wymaga dalszych szczegółowych badań. Podsumowując, można stwierdzić, że ze względu na różnice w sedymentacji cząsteczek w zależności od ich zagęszczenia w roztworze, optymalnym rozwiązaniem metodycznym dla procedury precypitacji byłoby dopasowywanie parametrów wirowania do wyjściowego stężenia PRL. Jednakże, z praktycznego punktu widzenia taki sposób postępowania zdecydowanie utrudniłby codzienną pracę laboratoryjną. Z drugiej strony, wykazano, że modyfikacja parametrów wirowania nie powoduje istotnych diagnostycznie i klinicznie różnic między wynikami pomiarów hormonu, jeżeli prędkość i czas rotacji próbek są dobrane względem siebie zgodnie z prawami fizyki. Dlatego też, w rutynowej pracy laboratoryjnej poprawne byłoby stosowanie dla wszystkich badanych próbek jednego wariantu z krótkim czasem wirowania i odpowiednio zwiększoną prędkością rotacji. Pozwoliłoby to spełnić wymagania w zakresie szybkości wykonywania oznaczeń stawiane współczesnej diagnostyce laboratoryjnej, przy jednoczesnym zachowaniu odpowiedniej jakości badań. Praca finansowana z działalności statutowej Zakładu Neuroendokrynologii nr 503/ / Piśmiennictwo 1. Pawlikowski M. Zarys Endokrynologii Klinicznej. Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 1996; Bartoszewicz Z. Makroprolaktynemia hiperprolaktynemia charakteryzująca się obecnością wysokocząsteczkowej makroprolaktyny. LabForum 2003; 14: Lewiński A. Podwzgórze i przysadka [w:] Endokrynologia ogólna i kliniczna. Greenspan FS, Gardner DG, red. nauk. wyd. pol. Lewiński A. Wydawnictwo Czelej, Lublin 2004; Zgliczyński W, Zdunowski P. Hiperprolaktynemia pułapki w oznaczaniu PRL. Endokrynol Pol 2005; 6: Karasek M, Pawlikowski M, Lewiński A. Hiperprolaktynemia: przyczyny, diagnostyka, leczenie. Endokrynol Pol 2006; 6: Jeske W. Przyczyny rozbieżności wyników oznaczeń prolaktyny i powody prawdziwej albo pozornej niezgodności ze stanem klinicznym. Endokrynol Pol 2008; 59: Dembińska-Kieć A, Naskalski JW. Diagnostyka laboratoryjna z elementami biochemii klinicznej. Podręcznik dla studentów medycyny. Wydanie III poprawione i uzupełnione. Elsevier Urban & Partner, Wrocław 2010: , Smith TP, Suliman AM, Fahie-Wilson MN, et al. Gross-variability in the detection of prolactin in sera containing big big prolactin (macroprolactin) by commercial immunoassays. J Clin Endocrinol Metab 2002; 87: De Schepper J, Schiettecatte J, Velkeniers B, et al. Clinical and biological characterization of macroprolactinemia with and without prolactin-igg complexes. Eur J Endocrinol 2003; 149: Beltran L, Fahie-Wilson MN, McKenna TJ, et al. Serum total prolactin and monomeric prolactin reference intervals determined by precipitation with polyethylene glycol: evaluation and validation on common immunoassay platforms. Clin Chem 2008; 54: Beda K, Winczyk K. Makroprolaktyna występowanie, metody diagnostyczne i znaczenie kliniczne. Fol Med Lodz 2009; 36: Melmed S, Casanueva F, Hoffman A, et al. Diagnosis & Treatment of Hyperprolactinemia: An Endocrine Society Clinical Practice Guideline. J Clin Endocrinol Metab 2011; 96: Leslie H, Courtney CH, Bell PM, et al. Laboratory and clinical experience in 55 patients with macroprolactinemia identified by a simple polyethylene glycol precipitation method. J Clin Endocrinol Metab 2001; 86: Germano L, Mormile A, Filtri L, et al. Evaluation of polyethylene glycol precipitation as screening test for macroprolactinemia using Architect immunoanalyser. Biol Spéc 2005; 20: Suliman AM, Smith TP, Gibney J, et al. Frequent misdiagnosis and mismanagement of hyperprolactinemic patients before the introduction of macroprolactin screening: application of a new strict laboratory definition of macroprolactinemia. Clin Chem 2003; 49: Fahie-Wilson M, Smith TP. Determination of prolactin: The macroprolactin problem. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab 2013; 27: Beda-Maluga K, Pisarek H, Komorowski J, et al. Evaluation of hyperprolactinaemia with the use of the intervals for prolactin after macroforms separation. J Physiol Pharmacol 2014: 65: Olukoga AO, Kane JW. Macroprolactinaemia: validation and application of the polyethylene glycol precipitation test and clinical characterization of the condition. Clin Endocrinol 1999; 51: Rivero A, Alonso E, Grijalba A. Decision cut-off of the polyethylene glycol precipitation technique in screening for macroprolactinemia on Immulite Clin Chem Lab Med 2004; 42: Jeske W, Glinicki P, Kapuścińska R, et al. 140 Cases of Macroprolactinemia: Selected Clinical and Technical Laboratory Aspects. Int J Endocrinol Metab 2012; 10: Materiały informacyjne dołączone do zestawu Immulite/Immulite 1000 Prolactin. Siemens Healthcare Diagnostic Products. 22. Beda-Maluga K, Pisarek H, Komorowski J, et al. The detection of macroprolactin by precipitation and ultrafiltration methods. Endokrynol Pol 2011; 62: Hattori N. The frequency of macroprolactinemia in pregnant women and the heterogeneity of its etiologies. J Clin Endocrinol Metab 1996; 81: Kavanagh-Wright L, Smith TP, Gibney J, et al. Characterization of macroprolactin and assessment of markers of autoimmunity in macroprolactinaemic patients. Clin Endocrinol 2009; 70: Hattori N, Adachi T, Ishihara T, et al. The natural history of macroprolactinaemia. Eur J Endocrinol 2012; 166: Badanie procesu sedymentacji [w:] Mechanika płynów laboratorium. Adres do korespondencji: dr n. med. Karolina Beda-Maluga Zakład Neuroendokrynologii Międzywydziałowa Katedra Diagnostyki Laboratoryjnej i Molekularnej Uniwersytet Medyczny w Łodzi Łódź, ul. Sterlinga 3 tel karolina.beda@umed.lodz.pl Zaakceptowano do druku: