PL B1. Instytut Biotechnologii i Antybiotyków - IBA,Warszawa,PL BUP 14/00

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (51) Int.Cl. G01N 33/15 ( ) G01N 21/35 ( ) C07D 501/00 ( ) (54) Sposób oznaczania zawartości diastereoizomerów w estrach cefalosporyn (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 14/00 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 01/09 (73) Uprawniony z patentu: Instytut Biotechnologii i Antybiotyków IBA,Warszawa,PL (72) Twórca(y) wynalazku: Irena Oszczapowicz,Warszawa,PL Janusz Oszczapowicz,Warszawa,PL (74) Pełnomocnik: Kiewlicz Zofia, Instytut Biotechnologii i Antybiotyków IBA PL B1 (57) W jednym z rozwiązań sposób oznaczania zawartości diastereoizomerów w estrach cefalosporyn polega na tym, że dokonuje się pomiaru zawartości poszczególnych diastereoizomerów w preparatach estrów cefalosporyn, będących mieszaninami diastereoizomerów, przy zastosowaniu widm w podczerwieni, według prostej kilkuetapowej procedury na którą składają się kolejno: rejestracja widm w podczerwieni preparatów estrów cefalosporyn, jako zasadniczo czystych diastereoizomerów oraz ich mieszanin, pomiar natężeń absorpcji poszczególnych pasm w uzyskanych widmach w podczerwieni, wybór poszczególnych pasm w uzyskanych widmach w podczerwieni, obliczenie stosunków natężeń absorpcji wybranych par pasm i skorelowanie ich z zawartością danego diastereoizomeru, w wyniku czego uzyskuje się linie obrazujące zależność stosunków natężeń absorpcji w widmach IR od zawartości poszczególnych diastereoizomerów w preparatach estrów cefalosporyn.

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest sposób oznaczania zawartości diastereoizomerów w estrach cefalosporyn przy zastosowaniu widm w podczerwieni. Estry cefalosporyn zawierające asymetryczny atom węgla w grupie estrowej występują w postaci mieszaniny diastereoizomerów. Przykładowo estry odszczepialne in vivo i ulegające enzymatycznej hydrolizie do macierzystych antybiotyków w postaci wolnych kwasów, takie jak ester 1acetoksyetylowy cefuroksymu o wzorze 1 /patent polski nr /, ester piwaloilooksyetylowy cefdaloksymu o wzorze 2/ A. Hutt, J. O Grady, J. Antimicrob. Chemother. 37, 7, 32, 1996/, ester 1/izopropoksykarbonylooksy/etylowy cefpodoksymu o wzorze 3 /W.M. Todd. International Journal of Antimicrob. Agents 4, 37, 1994/ oraz ester 1/cykloheksylokarbonylooksy/etylowy cefotiamu o wzorze 4/ A. Imada, S. Hirai International Journal of Antimicrob. Agents 5, 85, 1995/ występują w postaci mieszaniny diastereoizomerów o absolutnej konfiguracji 1 S, 6R, 7R odpowiednio wzór 1a, 2a, 3a i 4a oraz 1 R, 6R, 7R odpowiednio wzór 1b, 2b, 3b i 4b. Ester 1acetoksyetylowy cefuroksymu jest stosowany w terapii w postaci mieszaniny diastereoizomerów o stosunku od 0,9:1 do 1,1:1 /Farmakopea USP 23, str. 215/. W ostatnich latach rozwija się tendencja do stosowania w lecznictwie czystych izomerów optycznych tj. enancjomerów lub diastereoizomerów, natomiast racematy traktowane są jako związki zawierające około 50% zanieczyszczeń. Przykładowo ilość pojedynczych izomerów optycznych stosowanych w lecznictwie Japonii wzrosła od 20% w 1991 r. do 33% w 1995 r. /Drugs, 52, Suppl. 5, 1, 1996/. Stosowanie enancjomerów lub diastereoizomerów związane jest m.in. z uzyskaniem selektywności działania leku z uproszczeniem farmakokinetyki lub ze zmniejszeniem działań ubocznych. Istotne jest, że szereg izomerów optycznych różni się działaniem biologicznym między innymi może wykazywać silniejsze lub słabsze działanie tego samego rodzaju. Izomery takie nazywane są odpowiednio eutomerami i diastomerami. W wielu przykładach jednak obserwuje się zupełnie odmienne działanie biologiczne, przykładowo S//propranolol jest pblokerem, zaś jego R/+/ izomer wykazuje działanie antykoncepcyjne, natomiast Styroksyna jest hormonem tarczycy, zaś jej izomer R wpływa na poziom cholesterolu w organizmie. Izomery optyczne mogę wykazywać także różnice w toksyczności. Przykładami mogę być S// penicylamina, stosowana jako lek przeciwartretyczny, podczas gdy jej R/+/ izomer odznacza się wysoką toksycznością, i nie jest stosowany w lecznictwie, izomer SS etambutolu jest lekiem tuberkulostatycznym, zaś jego izomer RR wywołuje ślepotę, a także powszechnie znany izomer R/+/talidomidu, który wykazuje działanie uspakajające, natomiast S// izomer odznacza się silnym działaniem teratogennym. W przypadku antybiotyków βlaktamowych, występujących w postaci wolnych kwasów lub soli, obserwuje się również wyraźne zależność działania biologicznego od chiralności. Przykładowo Dampicylina /odpowiadająca, konfiguracji R/ wykazuje 25 silniejsze działanie wobec szeregu mikroorganizmów w porównaniu do izomeru L tego antybiotyku, Dcefaleksyna jest znacznie lepiej absorbowana z przewodu pokarmowego niż jej Lizomer, zaś aktywność przeciwbakteryjna izomeru R moksalaktamu, będącego cefalosporyną drugiej generacji, jest około dwukrotnie wyższa niż dla izomeru S. Występują także różnice w wiązaniu z białkiem i tak frakcje nie związane wynoszą 0,47 i 0,43 odpowiednio dla R i S izomerów moksalaktamu. /A.J. Hutt. O.O Grady, J. Antimicrob. Chemother. 37, 7, 1996/. W przypadku estru 1acetoksyetylowego cefuroksymu diastereoizomer o absolutnej konfiguracji 1 R, 6R, 7R wykazuje w stosunku do diastereoizomeru 1 S, 6R, 7R wyższą aktywność przeciwbakteryjną. Wobec klinicznych szczepów Staphylococcus aureus i Escherichia coli diastereoizomer ten jest odpowiednio 6krotnie i około 5krotnie bardziej aktywny w stosunku do diastereoizomeru 1 S, 6R, 7R oraz 23krotnie bardziej aktywny w odniesieniu do preparatu handlowego, będącego mieszaniną wymienionych diastereoizomerów. Ponadto diastereoizomer 1 R, 6R, 7R po podaniu dożołądkowym wykazuje w stosunku do diastereoizomeru 1 S, 6R, 7R, przeszło 3krotnie wyższe poziomy cefuroksymu w surowicy krwi szczurów oraz poziomy o 20% wyższe w stosunku do mieszaniny tych diastereoizomerów /I. Oszczapowicz i inni, Acta Pol. Pharm. 52, 6, 471, 1995/. Powyższe różnice mogą być spowodowane odmiennym przebiegiem enzymatycznej hydrolizy obu diastereoizomerów, zachodzącej z wydzieleniem cefuroksymu wolnego kwasu, w przypadku diastereoizomeru 1 R, 6R, 7R tworzy się głównie nieaktywny izomer Δ 2 cefuroksymu, natomiast diastereoizomer 1 R, 6R, 7R hydrolizuje do aktywnego biologicznie izomeru Δ 3 cefuroksymu /B. Tejchman i inni Acta Pol. Pharm. 52, 6, 477, 1995/.

3 PL B1 3 W przypadku estru piwaloilooksyetylowego cefdaloksymu biodostępność diastereoizomeru 1 S, 6R, 7R u psów jest około 3krotnie wyższa niż w przypadku podania diastereoizomeru 1 R, 6R, 7R /D. Isert at al, Abstracts of the TwentySecond Interscience Conference on Antimicrobial Agent s and Chemotherapy, Anahein C.A. 1992, Abstract 188, p. 142, American Society for Microbiology, Waschington, D.C./. W związku z powyższym wydaje się korzystne stosowanie w terapii czystych izomerów optycznych szeregu antybiotyków βlaktamowych, w tym także estrów cefalosporyn. Wymienione dane wykazują, że problem oznaczania czystości optycznej poszczególnych diastereoizomerów omawianych antybiotyków jest bardzo istotny. Znane sposoby oznaczania izomerów optycznych obejmuję m.in. metody chiralooptyczne do których należy polarymetria oraz dichroizm kołowy /CD/, znane metody chromatograficzne takie jak wysokociśnieniowa chromatografia kolumnowa /HPLC/, chromatografia gazowa /GC/ oraz chromatografia cienkowarstwowa /TLC/, a takie rezonans magnetyczny zarówno protonowy jak i fluorowy / 1 H NMR oraz 19 F NMR/. W przypadku diastereoizomerów, które różnią się właściwościami fizykochemicznymi, oznaczenia zawartości mogą być przeprowadzone bezpośrednio, natomiast przy pomiarach zawartości enancjomerów, różniących się jedynie skręcalnością, konieczne jest zastosowanie kolumn chiralnych /HPLC, GC/ lub odczynników derywatyzujących, dzięki którym enancjomery są przeprowadzane w diastereoizomery, lub też użycie chiralnych odczynników przesunięcia chemicznego /NMR/. /Analysis of Chiral Organic Molecules. P. Schreier A. Bernreuther, M. Huffer, Walter de Gruyter Berlin New York 1995, str. 17, 21, 26, 27, 37, 42, 62, 68, 135, 234/. Wymienione metody wymagają specjalistycznej aparatury, a ponadto są stosunkowo kosztowne i czasochłonne, zaś ich czułość sięga nawet 6%, zwłaszcza w przypadku zastosowania odczynników derywatyzujących i wtórnego oznaczania wytworzonych diastereoizomerów. W badaniach nad sposobem oznaczania zawartości izomerów optycznych opracowano metodę ilościowego pomiaru zawartości poszczególnych diastereoizomerów w estrach cefalosporyn w oparciu o zróżnicowanie widm IR czystych diastereoizomerów oraz ich mieszanin. Widma zapisuje się w postaci stałej, przy czym do pomiarów używa się ogólnie dostępne w pracowniach analitycznych spektrofotomery IR. W trakcie prowadzonych prac zauważono, że przy wzroście zawartości jednego z diastereoizomerów w preparacie estru cefalosporyny dla niektórych pasm absorpcji występuje wyraźna zmiana natężenia, zarówno w kierunku wzrostu jak i obniżenia ich wartości. Stwierdzono również, że natężenia niektórych pasm pozostają niezmienione, lub też ulegają zmianie w niewielkim stopniu. Istotne jest także, że przy określonej zawartości jednego z diastereoizomerów w mieszaninie diastereoizomerów estrów cefalosporyn, niektóre pasma pojawiają się, a niektóre zanikają. Według wynalazku sposób oznaczania zawartości diastereoizomerów w estrach cefalosporyn polega na tym, że dokonuje się pomiaru zawartości poszczególnych diastereoizomerów w preparatach estrów cefalosporyn, będących mieszaninami diastereoizomerów, przy zastosowaniu widm w podczerwieni, według prostej kilkuetapowej procedury, na które składają się kolejno: rejestracja widm w podczerwieni estrów cefalosporyn jako zasadniczo czystych diastereoizomerów oraz ich mieszanin, pomiar natężeń absorpcji poszczególnych pasm w uzyskanych widmach w podczerwieni, wybór poszczególnych pasm w uzyskanych widmach w podczerwieni, obliczenie stosunków natężeń absorpcji wybranych par pasm i skorelowanie ich z zawartością danego diastereoizomeru; w wyniku czego uzyskuje się linie obrazujące zależność stosunków natężeń absorpcji pasm w widmach IR od zawartości poszczególnych diastereoizomerów w preparatach estrów cefalosporyn. W wersji sposobu według wynalazku sposób oznaczania zawartości diastereoizomerów w estrach cefalosporyn polega na tym, że dokonuje się pomiaru zawartości poszczególnych diastereoizomerów w preparatach estrów cefalosporyn, będących mieszaniną diastereoizomerów, przy zastosowaniu widm w podczerwieni, według prostej kilkuetapowej procedury, na które składają się kolejno: rejestracja widm w podczerwieni estrów cefalosporyn jako zasadniczo czystych diastereoizomerów oraz ich mieszanin, pomiar natężeń transmisji poszczególnych pasm w uzyskanych widmach w podczerwieni, wybór poszczególnych pasm w uzyskanych widmach w podczerwieni, obliczenie stosunków natężeń transmisji wybranych par pasm i skorelowanie ich z zawartością danego diastereoizomeru, w wyniku czego uzyskuje się linie obrazujące zależność stosunków natężeń transmisji pasm w widmach IR od zawartości poszczególnych diastereoizomerów w preparatach estrów cefalosporyn.

4 4 PL B1 Sposobem według wynalazku oznacza się ilościowo zawartość diastereoizomerów w preparatach estrów cefalosporyn stanowiących mieszaninę diastereoizomerów, istniejących w wyniku obecności asymetrycznego atomu węgla w grupie estrowej. Zgodnie ze sposobem według wynalazku zapisuje się widma w podczerwieni mieszanin diastereoizomerów w preparatach estrów cefalosporyn, zawierających od 0,01 do 99,9% jednego z diastereoizomerów. Sposobem według wynalazku widma w podczerwieni preparatów estrów cefalosporyn w postaci zasadniczo czystych diastereoizomerów oraz ich mieszanin zapisuje się dla postaci stałej jako pastylki, korzystnie w KBr lub jako zawiesiny, korzystnie w oleju parafinowym /Nujol/. Zgodnie z wynalazkiem oblicza się natężenia absorpcji lub transmisji poszczególnych pasm w widmach IR zasadniczo czystych diastereoizomerów preparatów estrów cefalosporyn oraz ich mieszanin. Do obliczenia stosunków natężeń absorpcji lub transmisji poszczególnych pasm widm IR zarówno zasadniczo czystych diastereoizomerów oraz ich mieszanin wybiera się korzystnie te pasma, które przy zwiększaniu zawartości jednego z diastereoizomerów w preparatach estrów cefalosporyn wykazuję największe zmiany natężenia absorpcji lub transmisji lub też pasma o niezmiennym lub prawie niezmiennym natężeniu absorpcji lub transmisji. Przykładowo zależność natężenia absorpcji/transmisji poszczególnych pasm od zawartości diastereoizomerów 1 R, 6R, 7R w estrze 1acetoksyetylowym cefuroksymu ilustrują figury 1 i 2, gdzie przedstawiono widma IR omawianego związku zawierającego od 2 do 90% /co 5% lub 10% wymienionego diastereoizomeru/, w zakresach cm 1 /figura 1/ i cm 1 /figura 2/. Do obliczenia stosunków natężeń absorpcji lub transmisji poszczególnych pasm widm IR sposobem według wynalazku stosuje się korzystnie te pary pasm, z których jedno, przy wzroście zawartości jednego diastereoizomeru w preparatach estrów cefalosporyn, będących mieszaninę diastereoizomerów, wykazuje wyraźne zmianę natężenia absorpcji lub transmisji w stosunku do pasma o niezmiennym lub prawie niezmiennym natężeniu absorpcji lub transmisji lub też pary pasm, których zmiany natężenia absorpcji lub transmisji zachodzą w przeciwnych kierunkach, to jest pasmo o stopniowo zwiększającym się natężeniu absorpcji lub transmisji w stosunku do pasma o stopniowo zmniejszającym się natężeniu absorpcji lub transmisji lub też odwrotnie. Sposobem według wynalazku do uzyskania najbardziej korzystnych natężeń absorpcji lub transmisji par pasm widm IR estru cefalosporyn stosuje się korzystnie pasma wybrane spośród zakresów częstości i cm 1. Sposobem według wynalazku linie obrazujące stosunki natężeń absorpcji lub transmisji poszczególnych pasm w widmach IR obejmują zakres od 0 do 100% zawartości jednego z diastereoizomerów lub też jedynie jego część, ze względu na występowanie szeregu pasm tylko przy pewnej zawartości wymienionego diastereoizomeru. Dokładność metody opracowanej sposobem według wynalazku wynosi ± 2%. Sposobem według wynalazku można oznaczyć zarówno zawartość poszczególnych diastereoizomerów jak również zawartość amorficznej i krystalicznej postaci jednego z diastereoizomerów w mieszaninie amorficznej i krystalicznej postaci danego diastereoizomeru. Możliwość oznaczania poszczególnych postaci danego diastereoizomeru jest bardzo istotna ze względu na lepsze wchłanianie z przewodu pokarmowego postaci amorficznej /I. Oszczapowicz i inni Acta Pol. Pharm. 52, 6, 471, 1995/. Przykładowo zależność natężenia absorpcji/transmisji poszczególnych pasm w widmach IR zapisanych dla amorficznych preparatów diastereoizomeru 1 R, 6R, 7R cefuroksymu zawierających od 0,01 do 99,9% postaci krystalicznej ilustrują figury 3 i 4. Figura 3 przedstawia widma IR w zakresie cm 1, natomiast figura 4 odpowiednio w zakresie cm 1. Sposobem według wynalazku pomiar zawartości jednego z diastereoizomerów w estrze cefalosporyn, będącego mieszaniną zasadniczo czystych diastereoizomerów, dokonywany jest w wyniku szeregu pomiarów stosunków natężeń absorpcji lub transmisji wybranych pasm lub tylko jednego pasma w widmie IR badanego preparatu i na tej podstawie odczytanie poszukiwanej zawartości ze standardowych linii lub tylko z jednej standardowej linii ilustrującej w sposób graficzny lub matematyczny zależność stosunku natężeń absorpcji lub transmisji danych pasm w widmach IR od zawartości jednego diastereoizomeru w preparatach estrów cefalosporyn, będących mieszaninę diastereoizomerów. Sposobem według wynalazku pomiar zawartości postaci krystalicznej w amorficznym diastereoizomerze estru cefalosporyny dokonywany jest w wyniku szeregu pomiarów stosunków natężeń absorpcji lub transmisji wybranych pasm lub tylko jednego pasma w widmie w podczerwieni badanego diastereoizomeru i na tej podstawie odczytanie poszukiwanej zawartości ze standardowych linii lub

5 PL B1 5 tylko z jednej standardowej linii, ilustrującej w sposób graficzny lub matematyczny zależność stosunku natężeń absorpcji lub transmisji danych pasm w widmach w podczerwieni od zawartości postaci krystalicznej w amorficznych preparatach poszczególnych diastereoizomerów estrów cefalosporyn. Zaletami opracowanej metody są: ilościowe oznaczenie zawartości jednego z diastereoizomerów w preparatach estrów cefalosporyn, będących mieszaniną diastereoizomerów, drogą zastosowania widm w podczerwieni, stosunkowo duża dokładność metody wynosząca ± 2%, krótki czas analizy, przykładowo 24 razy krótszy niż w przypadku zastosowania metody NMR lub HPLC, stosowanie powszechnie dostępnej aparatury, to jest spektrofotometrów IR, kilkakrotnie niższy koszt analizy niż przy stosowaniu metod HPLC, GC lub NMR, możliwość oznaczenia zawartości postaci krystalicznej w amorficznym diastereoizomerze preparatu estru cefalosporyny z dokładnością wyższą niż w przypadku stosowania metody rentgenograficznej. Poniższe przykłady ilustrują wynalazek nie ograniczając w żadnym stopniu jego zakresu. P r z y k ł a d I. Do sporządzenia stosunków natężeń absorpcji pasm widm w podczerwieni użyto krystaliczny diastereoizomer 1 R, 6R, 7R estru 1acetoksyetylowego cefuroksymu o zawartości estru 99,1%, zawartości rozpuszczalników 0,3% i o czystości izomerycznej 95,8% oraz diastereoizomer 1'S, 6R, 7R wymienionego estru, o zawartości estru 99,2%, zawartości rozpuszczalników 0,2% i o czystości izomerycznej 98%. Z wymienionych preparatów otrzymano mieszanki zawierające 2, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 75, 80 i 90% wagowych diastereoizomeru 1 S, 6R, 7R. Z uzyskanych mieszanek oraz z wyjściowych diastereoizomerów przygotowano identyczne naważki, a następnie zapisano widma IR /KBr/ przy użyciu spektrofotometru Magna IR 550, Nicolet. Do oznaczania stosunków natężeń absorpcji wybrano pasma przy 3416, 2944, 1626, 1616 i 1483 cm 1. Uzyskano dane dla stosunków natężeń absorpcji pasm 3416/2944 oraz 1626/1483 i 1616/1483 przedstawiono w tabeli 1, przy czym podano zawartość badanego diastereoizomeru w % wagowych bez uwzględnienia i z uwzględnieniem czystości izomerycznej. P r z y k ł a d II. Zapisano widmo w podczerwieni krystalicznego diastereoizomeru 1 R, 6R, 7R, estru 1acetoksyetylowego cefuroksymu, zawierającego diastereoizomer 1 S, 6R, 7R, przy użyciu spektrofotometru podanego w przykładzie I. Obliczono stosunek natężeń absorpcji pasm 3416/2944 wynoszący 2,308. W oparciu o dane przedstawione w tabeli 1 obliczono zawartość krystalicznego diastereoizomery 1 S, 6R, 7R estru 1acetoksyetylowego cefuroksymu wynoszącą 11,16%, przy czym według oznaczeń metodą HPLC zawartość ta wynosiła 11,3%. T a b e l a 1 Stosunki natężeń absorpcji wybranych pasm widm w podczerwieni krystalicznych postaci diastereoizomerów 1 R, 6R, 7R oraz 1 S, 6R, 7R estru 1acetoksyetylowego cefuroksymu. Zawartość krystalicznego diastereoizomeru 1 S, 6R, 7R w mieszaninie krystalicznych diastereoizomerów 1 S, 6R, 7R oraz 1 R, 6R, 7R estru 1acetoksyetylowego cefuroksymu Stosunki natężeń absorpcji pasm widm w podczerwieni w % w % /z uwzględnieniem czystości izomerycznej/ 3416/ / / ,200 6,076 8,890 13,520 18,270 22,960 32,340 41,720 51,100 60,480 69,850 74,550 79,240 88,620 98,000 2,368 2,352 2,328 2,287 2,246 2,205 2,114 2,083 1,924 1,829 1,732 1,685 1,639 1,426 1,419 1,409 1,396 1,383 1,370 1,344 1,316 1,287 1,256 1,051 1,167 1,273 1,386 1,502 1,616 1,674 1,733 1,853 1,985

6 6 PL B1 P r z y k ł a d III. Postępowano analogicznie jak w przykładzie II i obliczono stosunek natężeń absorpcji pasm 1626/1483 wynoszący 1,389. Na podstawie wyników zamieszczonych w tabeli 1 obliczono zawartość krystalicznego diastereoizomeru 1 S, 6R, 7R estru 1acetoksyetylowego cefuroksymu wynoszącą 16,08%. Zgodnie z oznaczeniami metodę HPLC zawartość ta wynosiła 16,3%. P r z y k ł a d IV. Postępowano analogicznie jak w przykładzie II i obliczono stosunku natężeń absorpcji pasm 3416/2944 i 1626/1483 wynoszące odpowiednio 2,348 i 1,417. W oparciu o dane przedstawione w tabeli 1 obliczono zawartości krystalicznego diastereoizomeru 1 S, 6R, 7R estru 1acetoksyetylowego cefuroksymu wynoszące odpowiednio 6,55 i 6,59% średnio 6,57%. Zawartość diastereoizomeru 1 S, 6R, 7R zgodnie z oznaczeniami metodą HPLC wynosiła 6,9%. P r z y k ł a d V. Postępowano analogicznie jak w przykładzie II i obliczono stosunki natężeń absorpcji pasm 1616/1483 i 1626/1483 wynoszące odpowiednio 1,056 i 1,369. W oparciu o wyniki przedstawione w tabeli 1 obliczono zawartości krystalicznego diastereoizomeru 1 S, 6R, 7R estru 1acetoksyetylowego cefuroksymu wynoszący odpowiednio 23,37 i 23,32% średnio 23,35%. Według oznaczeń metodą HPLC zawartość ta wynosiła 23,18%, P r z y k ł a d VI. Postępowano jak w przykładzie I i zapisano widma w podczerwieni analogicznych mieszanek diastereoizomerów 1 R, 6R, 7R oraz 1 S, 6R, 7R estru 1acetoksyetylowego cefuroksymu o zawartości i czystości izomerycznej podanej w przykładzie I. Do oznaczenia stosunków natężeń transmisji wybrano pasma 3416, 2944, 1626, 1616 i 1528 cm 1. Uzyskane dane dla stosunków natężeń pasm 3416/2944, 1626/1528 oraz 1616/1528 przedstawiono w tabeli 2, przy czym podano zawartość badanego diastereoizomeru w % wagowych bez uwzględnienia i z uwzględnieniem czystości izomerycznej. P r z y k ł a d VII. Zapisano widmo w podczerwieni krystalicznego diastereoizomeru 1 R, 6R, 7R estru 1acetoksyetylowego cefuroksymu zawierającego krystaliczny diastereoizomer 1 S, 6R, 7R przy użyciu spektrofotometru podanego w przykładzie I. Obliczono stosunek natężeń pasm transmisji 1616/1528 wynoszący 1,375. W oparciu o dane przedstawione w tabeli 2 obliczono zawartość krystalicznego diastereoizomeru 1 S, 6R, 7R estru 1acetoksyetylowego cefuroksymu wynoszącą 17,77%. Zgodnie z oznaczeniem metodą HPLC zawartość ta wynosiła 17,7% P r z y k ł a d VIII. Postępowano analogicznie jak w przykładzie VII i obliczono stosunki natężeń transmisji pasm 1626/1528 oraz 1616/1528 wynoszące odpowiednio 1,902 i 1,427. Na podstawie danych z tabeli 2 obliczono zawartości krystalicznego diastereoizomeru 1 S, 6R, 7R estru 1acetoksyetylowego cefuroksymu wynoszący odpowiednio 24,18 i 24,23%, średnio 24,20%. Według oznaczeń metodą HPLC zawartość ta wynosiła 24,35%. T a b e l a 2 Stosunki natężeń transmisji wybranych pasm widm w podczerwieni krystalicznych postaci diastereoizomeru 1 R, 6R, 7R oraz 1 S, 6R, 7R estru 1acetoksyetylowego cefuroksymu. Zawartość krystalicznego diastereoizomeru 1 R, 6R, 7R w mieszaninie krystalicznych diastereoizomerów 1 R, 6R, 7R oraz 1 S, 6R, 7R estru 1acetoksyetylowego cefuroksymu Stosunki natężeń transmisji pasm widm w podczerwieni w % w % /z uwzględnieniem czystości izomerycznej/ 3416/ / / ,200 6,076 8,890 13,520 18,270 22,960 32,340 41,720 51,100 60,480 69,850 74,550 79,240 88,620 98,000 0,455 0,462 0,473 0,492 0,511 0,530 0,567 0,598 0,643 0,679 0,716 0,734 0,751 1,922 1,771 1,648 1,580 1,416 1,310 1,254 1,183 1,088 1,001 1,266 1,281 1,304 1,341 1,379 1,416 1,496 1,582 1,681 1,792 P r z y k ł a d IX. Do sporządzenia stosunków natężeń absorpcji pasm w podczerwieni użyto krystaliczną postać diastereoizomeru 1 R, 6R, 7R estru 1acetoksyetylowego cefuroksymu o zawarto

7 PL B1 7 ści estru 99,1%, zawartości rozpuszczalników 0,3% i o czystości izomerycznej 95,8% oraz amorficzną postać tego diastereoizomeru o zawartości estru 98,9%, zawartości rozpuszczalników 0,23% i o czystości izomerycznej 95,8%. Z wymienionych preparatów sporządzono mieszanki zawierające 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 i 90% wagowych krystalicznej postaci diastereoizomeru 1 R, 6R, 7R. Z uzyskanych mieszanek oraz z wyjściowych postaci diastereoizomeru 1 R, 6R, 7R przygotowano naważki i zapisano widma IR /KBr/ jak w przykładzie I. Do oznaczenia stosunków natężeń absorpcji wybrano pasma 3485, 3217, 2944, 980 i 945 cm 1. Otrzymane dane dla stosunków natężeń absorpcji pasm 3485/2944, 3217/2944 oraz 945/980 przedstawiono w tabeli 3. P r z y k ł a d X. Zapisano widmo w podczerwieni amorficznej postaci diastereoizomeru 1 R, 6R, 7R estru 1acetoksyetylowego cefuroksymu zawierającego krystaliczną postać tego diastereoizomeru przy użyciu spektrofotometru podanego w przykładzie I. Obliczono stosunki pasm 3485/2944 i 3217/2944 wynoszące odpowiednio 1,734 i 1,189. W oparciu o dane zawarte w tabeli 3 obliczono zawartość krystalicznej postaci w amorficznym diastereoizomerze 1 R, 6R, 7R estru 1acetoksyetylowego cefuroksymu wynoszącą odpowiednio 10,98 i 10,91% średnio 10,94%. Zawartość postaci krystalicznej oznaczona metodą rentgenograficzną wynosiła 11,0%. T a b e l a 3 Stosunki natężeń absorpcji wybranych pasm widm w podczerwieni krystalicznej i amorficznej postaci diastereoizomeru 1 R, 6R, 7R estru 1acetoksyetylowego cefuroksymu. Zawartość krystalicznej postaci diastereoizomeru 1 R, 6R, 7R w amorficznej postaci tego diastereoizomeru estru 1acetoksymetylowego cefuroksymu Stosunki natężeń absorpcji pasm widm w podczerwieni w % 3485/ / / ,756 1,746 1,736 1,725 1,704 1,683 1,666 1,652 1,180 1,226 1,250 1,306 1,365 1,425 1,484 1,547 1,603 1,660 1,722 1,533 1,525 1,546 1,560 1,581 1,623 1,653 1,696 1,734 1,778 1,824 1,866 1,901 P r z y k ł a d XI. Postępowano analogicznie jak w przykładzie X i obliczono stosunek natężeń absorpcji pasm 945/980 równy 1,700. W oparciu o wyniki zamieszczone w tabeli 3 obliczono zawartość krystalicznej postaci diastereoizomeru 1 R, 6R, 7R wynoszącą 51,05%. Zgodnie z oznaczeniami metodą rentgenograficzną zawartość postaci krystalicznej wynosiła 52%. Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób oznaczania zawartości diastereoizomerów w estrach cefalosporyn, znamienny tym, że dokonuje się pomiaru zawartości poszczególnych diastereoizomerów w preparatach estrów cefalosporyn, będących mieszaninami diastereoizomerów, przy zastosowaniu widm w podczerwieni, według prostej kilkuetapowej procedury na które składają się kolejno: rejestracja widm w podczerwieni preparatów estrów cefalosporyn, jako zasadniczo czystych diastereoizomerów oraz ich mieszanin, pomiar natężeń absorpcji poszczególnych pasm w uzyskanych widmach w podczerwieni, wybór poszczególnych pasm w uzyskanych widmach w podczerwieni, obliczenie stosunków natężeń absorpcji wybranych par pasm i skorelowanie ich z zawartością danego diastereoizomeru, w wyniku czego uzyskuje się linie obrazujące zależność stosunków natężeń absorpcji w widmach IR od zawartości poszczególnych diastereoizomerów w preparatach estrów cefalosporyn.

8 8 PL B1 2. Sposób oznaczania zawartości diastereoizomerów w estrach cefalosporyn, znamienny tym, że dokonuje się pomiaru zawartości poszczególnych diastereoizomerów w preparatach estrów cefalosporyn, będących mieszaninami diastereoizomerów, przy zastosowaniu widm w podczerwieni, według prostej kilkuetapowej procedury na którą składają się kolejno: rejestracja widm w podczerwieni preparatów estrów cefalosporyn, jako zasadniczo czystych diastereoizomerów oraz ich mieszanin, pomiar natężeń transmisji poszczególnych pasm w uzyskanych widmach w podczerwieni, wybór poszczególnych pasm w uzyskanych widmach w podczerwieni, obliczenie stosunków natężeń transmisji wybranych par pasm i skorelowanie ich z zawartością danego diastereoizomeru, w wyniku czego uzyskuje się linie obrazujące zależność stosunków natężeń transmisji w widmach IR od zawartości poszczególnych diastereoizomerów w preparatach estrów cefalosporyn. 3. Sposób według zastrz. 1 lub 2, znamienny tym, że oznacza się ilościowo zawartość poszczególnych diastereoizomerów w preparatach estrów cefalosporyn, stanowiących mieszaniny tych diastereoizomerów, istniejących w wyniku obecności asymetrycznego atomu węgla w grupie estrowej. 4. Sposób według zastrz. 1 lub 2, znamienny tym, że zapisuje się widma w podczerwieni mieszanin diastereoizomerów w preparatach estrów cefalosporyn, zawierających od 0,1 do 99,9% jednego z diastereoizomerów. 5. Sposób według zastrz. 1 lub 2, znamienny tym, że widma w podczerwieni preparatów estrów cefalosporyn w postaci zasadniczo czystych diastereoizomerów oraz ich mieszanin zapisuje się dla postaci stałej jako pastylki, korzystnie w KBr lub jako zawiesiny korzystnie w oleju parafinowym /Nujol/. 6. Sposób według zastrz. 1 lub 2, znamienny tym, że oblicza się natężenia absorpcji lub transmisji poszczególnych pasm w widmach IR zasadniczo czystych diastereoizomerów preparatów estrów cefalosporyn oraz ich mieszanin. 7. Sposób według zastrz. 1 lub 2, znamienny tym, że do obliczania stosunków natężeń absorpcji lub transmisji poszczególnych pasm widm IR zarówno zasadniczo czystych diastereoizomerów oraz ich mieszanin wybiera się korzystnie te pasma, które przy zwiększaniu zawartości jednego z diastereoizomerów w preparatach estrów cefalosporyn wykazują największe zmiany natężenia absorpcji lub transmisji w podanych warunkach, lub też pasma o niezmiennym lub prawie niezmiennym natężeniu absorpcji lub transmisji. 8. Sposób według zastrz. 1 lub 2, znamienny tym, że do obliczania stosunków natężeń absorpcji lub transmisji poszczególnych pasm widm IR stosuje się korzystnie te pary pasm, z których jedno przy wzroście zawartości jednego z diastereoizomerów w preparatach estrów cefalosporyn stanowiących mieszaninę diastereoizomerów wykazuje wyraźne zmianę natężenia absorpcji lub transmisji w stosunku do pasma o niezmiennym lub prawie niezmiennym natężeniu absorpcji lub też pary pasm, których zmiany natężeń absorpcji lub transmisji zachodzą w przeciwnych kierunkach, to jest pasmo o stopniowo zwiększającym się natężeniu absorpcji lub transmisji w stosunku do pasma o stopniowo zmniejszającym się natężeniu absorpcji lub transmisji lub odwrotnie. 9. Sposób według zastrz. 1 lub 2, znamienny tym, że do uzyskania najbardziej korzystnych stosunków natężeń absorpcji lub transmisji par pasm widm IR preparatów estrów cefalosporyn stosuje się korzystnie pasma wybrane spośród zakresów częstości i cm Sposób według zastrz. 1 lub 2, znamienny tym, że linie obrazujące stosunki natężeń absorpcji lub transmisji poszczególnych pasm w widmach podczerwieni mogę obejmować zakres od 0 do 100% zawartości jednego z diastereoizomerów lub tylko jego część, ze względu na występowanie szeregu pasm tylko przy pewnej zawartości wymienionego diastereoizomeru. 11. Sposób według zastrz. 1 lub 2, znamienny tym, że oznacza się zawartość amorficznej i krystalicznej postaci jednego z diastereoizomerów w mieszaninie krystalicznej i amorficznej postaci danego diastereoizomeru.

9 PL B1 9 Rysunki

10 10 PL B1

11 PL B1 11

12 12 PL B1

13 PL B1 13

14 14 PL B1

15 PL B1 15

16 16 PL B1 Departament Wydawnictw UP RP Cena 4,00 zł.