OKREŚLANIE IN VITRO I IN SILICO BIODOSTĘPNOŚCI ORAZ ABSORPCJI W JELICIE CZCZYM I CACO-2 WYBRANYCH SKŁADNIKÓW EKSTRAKTÓW ROŚLINNYCH

Transkrypt

1 OKREŚLANIE IN VITRO I IN SILICO BIODOSTĘPNOŚCI ORAZ ABSORPCJI W JELICIE CZCZYM I CACO-2 WYBRANYCH SKŁADNIKÓW EKSTRAKTÓW ROŚLINNYCH a K. E. STĘPNIK a, I. MALINOWSKA a, E. RÓJ b UMCS, Wydział Chemii, Katedra Chemii Fizycznej, Zakład Chromatografii Planarnej, Pl. Marii Curie Skłodowskiej 3, Lublin b INS w Puławach, Al. Tysiąclecia Państwa Polskiego 13a, Puławy Abstrakt Ocena jakości surowców stosowanych w komercyjnej produkcji dóbr jest ważnym czynnikiem umożliwiającym wyrób towarów mogących sprostać wymogom rynku międzynarodowego. Zbadano skład jakościowy bioaktywnych ekstraktów roślinnych otrzymanych metodą ekstrakcji nadkrytycznej z zastosowaniem CO 2. Ekstrakty te mogą zostać wykorzystane jako potencjalne surowce w produkcji komercyjnej różnorodnych dóbr o szerokiej gamie zastosowań. W badanych ekstraktach zidentyfikowano kwasy tłuszczowe nasycone oraz monoi wielonienasycone, fenolokwasy, a także naturalne polifenole (kwas chlorogenowy), których odpowiednia zawartość w produktach może determinować, prawidłowe bądź nie, funkcjonowanie organizmu człowieka. W niniejszych badaniach zastosowano metodę micelarnej chromatografii cieczowej (MLC) oraz chromatografii Biopartitioning (BMC). W prezentowanych badaniach skupiono się na najważniejszych deskryptorach aktywności biologicznej, z punktu widzenia wykorzystania badanych ekstraktów w medycynie, przemyśle farmaceutycznym, spożywczym czy kosmetyce, tj. biodostępność substancji po jej doustnym podaniu oraz absorpcja jelitowa, zarówno w jelicie czczym, jak i względem linii komórkowej Caco-2, imitującej ludzki nabłonek jelitowy. Kluczową barierą absorpcji leku podanego doustnie jest błona śluzowa jelit, gdzie leki są przyswajane na drodze dyfuzji biernej. Linia komórkowa nowotworu jelit Caco-2 jest powszechnie stosowanym obecnie systemem modelowym do badań farmaceutycznych przede wszystkim z uwagi na zdolność tworzenia monowarstwy komórek wykazującej funkcjonalne podobieństwo do nabłonka jelita cienkiego naturalnie występującego w warunkach in vivo. Otrzymane wartości tychże deskryptorów porównano z danymi retencyjnymi uzyskanymi metodą MLC oraz BMC, stosując model QRAR (Quantitative Retention Activity Relationships). Dane retencyjne zestawiono ponadto z różnego rodzaju innymi parametrami, np. deskryptorem lipofilowości logp o/w (współczynnik podziału w układzie n-oktanol/woda), a także parametrami ściśle związanymi ze strukturą oraz właściwościami fizykochemicznymi badanych związków, tj. polaryzowalność czy rozpuszczalność w wodzie. W tym celu zastosowano odpowiednie modele QSAR (Quantitative Structure Activity Relationships).

2 Wprowadzenie Micelarna chromatografia cieczowa (MLC), której początek datuje się umownie na rok 1980 [1], jest jedną z odmian chromatografii cieczowej, w której podstawowym składnikiem fazy ruchomej są jonowe lub niejonowe surfaktanty o stężeniu wyższym od krytycznego stężenia micelizacji (cmc). Od narodzin metody chromatografii micelarnej minęło już ponad trzydzieści lat, ale liczne publikacje wskazują na niesłabnące i coraz bardziej powszechne nią zainteresowanie. Warto podkreślić, że metoda ta stanowi jedną z odmian chromatografii cieczowej w odwróconym układzie faz, jednak specyficzne cechy układów micelarnych czynią ją unikatową, przesądzając o możliwości zastosowania jej m.in. w bezpośredniej analizie składu płynów ustrojowych oraz związków wykazujących aktywność biologiczną. Amfifilowa budowa głównego składnika fazy ruchomej (surfaktantu) sprawia, że po przekroczeniu cmc w roztworze tworzą się micele (normalne bądź odwrócone) o rozmaitej budowie i zróżnicowanych rozmiarach, które mają zdolność do organizowania się w większe skupiska (agregaty) [2]. Dzięki amfifilowej budowie surfaktantów w roztworach wodnych zaobserwować można zjawisko solubilizacji towarzyszące układom micelarnym. Polega ono na utworzeniu termodynamicznie trwałego izotropowego roztworu substancji nierozpuszczalnej lub słabo rozpuszczalnej w danym rozpuszczalniku, np. wodzie, po dodaniu amfifilu o stężeniu powyżej cmc [3]. W wyniku solubilizacji obserwuje się wzrost rozpuszczalności związków trudno rozpuszczalnych w danym środowisku [4]. Szczególnym rodzajem chromatografii micelarnej jest chromatografia Biopartitioning (BMC), w której niejonowy surfaktant Brij35, eter laurylowy glikolu polioksyetylenowego (23), stanowi podstawowy składnik fazy ruchomej, zaś najczęściej używaną fazą stacjonarną jest żel krzemionkowy modyfikowany fazą oktadecylową (RP-18). Metoda BMC może być użyteczna w opisywaniu zachowań o charakterze biologicznym, biochemicznym czy biopodziałowym różnego rodzaju związków organicznych w żywym organizmie, tj. penetracja bariery krew-mózg, absorpcja jelitowa, przenikalność przez skórę i błony biologiczne czy też proces dystrybucji leków [5 11]. Chromatografia BMC pełni zatem rolę pewnego rodzaju instrumentu predykcji in vitro zjawisk i procesów związanych z szeroko rozumianym funkcjonowaniem żywego organizmu. Użyteczność BMC w konstruowaniu dobrych modeli predykcji może wynikać z faktu, że charakterystyki układów BMC są podobne do barier biologicznych i płynów pozakomórkowych, tj. osocze krwi i limfy, płyn mózgowo rdzeniowy czy płyn tkankowy [12]. Szczególną właściwością układów micelarnych jest zdolność do modyfikacji powierzchni fazy stacjonarnej przez monomeryczne cząsteczki surfaktantu obecne w fazie ruchomej. Retencja związków w MLC, podobnie jak w BMC, zależy od rodzaju oddziaływań pomiędzy zmodyfikowaną surfaktantem fazą stacjonarną a micelami obecnymi w fazie ruchomej. Złożony mechanizm retencji w chromatografii micelarnej nie jest do końca wyjaśniony przede wszystkim z uwagi na wspomnianą już możliwość modyfikacji powierzchni fazy stacjonarnej oraz występowanie w skomplikowanych układach micelarnych wielu oddziaływań o charakterze hydrofobowym, elektrostatycznym i sterycznym [13-14]. Chromatografia micelarna kładzie główny nacisk na badania leków i innych związków wykazujących aktywność biologiczną w wielu obszarach. Zanim związek chemiczny zostanie zarejestrowany jako lek, musi zostać poddany licznym

3 badaniom laboratoryjnym i klinicznym. W dzisiejszych czasach niezmiernie istotną płaszczyznę wiedzy stanowią badania z zakresu farmakologii leków sensu largo. Niemało uwagi poświęca się tu aspektom zarówno etycznym, jak i ekonomicznym badań farmakokinetycznych nowych leków, które prowadzone są z zastosowaniem metod in vivo na myszach, szczurach, królikach, a nawet psach. Tak prowadzona metodologia jest droga i czasochłonna, dlatego też coraz częściej akcentuje się potrzebę rozwijania metod predykcji wybranych deskryptorów aktywności biologicznej in vitro i in silico, mających na celu zredukowanie do minimum liczby eksperymentów prowadzonych na żywych organizmach, a także obniżenie kosztów badań. Losy leku w organizmie można zamknąć w akronimie ADME [15], w którym A oznacza absorpcję (Absorption), D dystrybucję (Distribution), M metabolizm (Metabolism), E wydalanie (Elimination). W badaniach farmakologicznych to właśnie procesy mieszczące się w pojęciach ADME są głównym przedmiotem zainteresowań. W niniejszej pracy skupiono się na badaniu bioaktywnych składników ekstraktów roślinnych otrzymanych metodą ekstrakcji nadkrytycznej z zastosowaniem CO 2. W wyniku tak prowadzonego procesu ekstrakcji otrzymuje się cenne gospodarczo produkty zawierające oleje wielonienasycone, flawonoidy, antocyjany, barwniki, których odpowiednia zawartość w ekstraktach przesądza o możliwości ich wykorzystania w różnych gałęziach przemysłu, np. w przemyśle farmaceutycznym, kosmetycznym czy medycynie. Dla testowanych składników ekstraktów roślinnych, tj. kwasy tłuszczowe mono- i wielonienasycone, nasycone kwasy tłuszczowe, fenolokwasy oraz polifenole, oszacowano wielkość ich absorpcji w jelicie czczym oraz absorpcję względem linii komórkowej Caco-2, a także określono ich biodostępność po podaniu doustnym. Leki o działaniu ogólnym podaje się doustnie. Głównym mechanizmem wchłaniania leków podanych drogą doustną jest dyfuzja bierna, zaś miejscem ich wchłaniania błona śluzowa przewodu pokarmowego, najczęściej jelit i żołądka. W ostatnich latach do opisu in vitro transportu jelitowego substancji coraz powszechniej stosuje się linię komórkową Caco-2, która jest najbardziej rozpowszechnionym systemem komórkowym imitującym ludzki nabłonek jelitowy. Warto podkreślić, że w przeciwieństwie do wielu innych ustalonych linii komórkowych, linia Caco-2 wykazuje zdolność do tworzenia monowarstwy komórek morfologicznie, funkcjonalnie i strukturalnie podobnej do nabłonka jelita cienkiego naturalnie występującego w warunkach in vivo [16]. Obecnie wiele koncernów farmaceutycznych traktuje linię komórkową Caco-2 jako narzędzie przesiewowe w określaniu absorpcji jelitowej różnego rodzaju substancji [10]. Jednakże oprócz badań farmaceutycznych przy opracowywaniu coraz bezpieczniejszych i aktywnych leków, kultury Caco-2 stanowią model komórkowy wykorzystywany w wielu innych kierunkach badawczych, tj. badania adhezji bakterii probiotycznych i chorobotwórczych do komórek nabłonka jelitowego, badania nad odpowiedzią immunologiczną na obecność alergenów pokarmowych, metabolizmem toksyn, a także działaniem związków mutagennych i kancerogennych [16]. Kluczowym czynnikiem decydującym o absorpcji leków jest ich hydrofobowość, określana najczęściej poprzez logarytm współczynnika podziału w układzie n-oktanol/woda (logp o/w ). Wyznaczono wartości parametru lipofilowości logp o/w, a także parametrów sterycznych, tj. masa molowa, objętość molowa,

4 refrakcja molowa i parachora. Korzystając z modeli empirycznych QSAR i QRAR, oszacowano wielkość absorpcji jelitowej wybranych składników badanych ekstraktów. Dane retencyjne uzyskane metodą chromatografii Biopartitioning, porównano z parametrami lipofilowości, sterycznymi i wybranymi deskryptorami aktywności biologicznej. Część eksperymentalna Analizie poddano ekstrakty z nasion czarnej porzeczki, aronii, róży pomarszczonej, maliny, truskawki oraz z owoców palmy sabałowej, otrzymane metodą ekstrakcji nadkrytycznej z zastosowaniem CO 2. Celem pierwszego etapu badań była identyfikacja w badanych ekstraktach kwasów tłuszczowych, fenolokwasów i kwasu chlorogenowego, istotnych z punktu widzenia funkcjonowania organizmu człowieka. W badanych ekstraktach roślinnych największy udział w grupie kwasów tłuszczowych przypada kwasom nienasyconym: oleinowemu, linolowemu (LA) oraz -linolenowemu (ALA) i -linolenowemu (GLA). Identyfikacja nienasyconych kwasów tłuszczowych w ekstraktach roślinnych może przesądzać o możliwości ich zastosowania jako surowców w produkcji rozmaitych dóbr w przemyśle spożywczym, kosmetycznym czy medycynie. Analizowane wielonienasycone kwasy tłuszczowe (kwas LA, ALA oraz GLA) należą bowiem do grupy tzw. niezbędnych nienasyconych kwasów tłuszczowych (NNKT), z grupy kwasów omega 3 i 6, których doniosła rola w prawidłowym funkcjonowaniu organizmu człowieka jest powszechnie znana. Warto też dodać, że rodzina kwasów chlorogenowych obejmuje estry trans cynamonowych kwasów oraz kwasu chinowego i stanowi dominującą frakcję polifenoli w kawie, truskawkach, jabłkach, słoneczniku czy jagodach [17]. Najistotniejsze składniki badanych ekstraktów, zgodnie z doniesieniami literaturowymi, przedstawiono w Tabeli 1. Tabela 1. Najistotniejsze składniki badanych ekstraktów. kwasy tłuszczowe nasycone laurynowy kwasy tłuszczowe nienasycone jedno- dwu- trój- cztero- oleinowy - linolenowy (ALA) fenolokwasy 2- hydroksycynamonowy (kumarowy) polifenole kwas chlorogenowy mirystynowy palmitynowy stearynowy kaprylowy kaprynowy erukowy oleopalmitynowy linolowy - linolenowy (GLA) stearydynowy (SDA) 3- hydroksycynamonowy 4- hydroksycynamonowy (ester kwasu chinowego i kawowego) Optymalizacja układów chromatograficznych dla rozdziału składników badanych ekstraktów polegała na doborze techniki chromatograficznej oraz doborze

5 fazy stacjonarnej i ruchomej. Na tym etapie wszystkie pomiary prowadzono z zastosowaniem techniki chromatografii cienkowarstwowej TLC (Thin Layer Chromatography) oraz wysokosprawnej techniki cienkowarstwowej HPTLC (High Performance Thin Layer Chromatography), wykorzystując klasyczne układy chromatografii cieczowej, tj, układ faz normalny i odwrócony (RP). Wykonanie analizy TLC obejmowało następujące czynności: przygotowanie próbek do analizy, zaaplikowanie badanego roztworu na fazę stacjonarną, rozwinięcie chromatogramu, wizualizacja (detekcja) chromatogramu, analizę wyników (oznaczenie jakościowe składników próbki) Przygotowanie próbek do analizy Sporządzono roztwory wyjściowe badanych ekstraktów, a także standardów odpowiednich kwasów tłuszczowych, fenolokwasów i kwasu chlorogenowego w acetonitrylu, uzyskując stężenia próbek ok. 1mg*mL -1. Dozowana objętość roztworów wyjściowych ekstraktów każdorazowo wynosiła 6μL, a standardów kwasów 4μL (zawartość substancji w plamce to ok. 4 μg). Wizualizacja chromatogramów Do wywoływania chromatogramów w prowadzonej analizie stosowano alkoholowy roztwór aldehydu anyżowego. Wywołane chromatogramy oglądano w świetle UV = 254 nm lub 366 nm, a następnie archiwizowano za pomocą wideokamery Reprostar 3 z oprogramowaniem WinCats. Podstawowy parametr chromatograficzny uzyskany metodą TLC, tj. współczynnik opóźnienia R F (retardation factor) wyznaczono stosując oprogramowanie Video Scan. Opracowanie wyników Identyfikacja podstawowych składników badanych ekstraktów Najbardziej optymalne układy do separacji składników badanych ekstraktów zebrano w Tabeli 2. Tabela 2. Układy chromatografii HPTLC i TLC do rozdziału składników badanych ekstraktów. Technika Faza Faza ruchoma Detekcja chromatograficzna stacjonarna HPTLC HPTLC RP-18 HPTLC RP-18 HPTLC heptan izopropanol kwas mrówkowy(100:10;0.5 v/v/v) acetonitryl izopropanol (20:10 v/v) acetonitryl metanol (10:10 v/v) heksan aceton (25:4 v/v) TLC heksan eter dietylowy kwas octowy (70:30:1 v/v/v) heksan aceton kwas mrówkowy (25:4:0.5 v/v/v) toluen aceton (95:5 v/v) heptan izopropanol kwas mrówkowy (100:10;0.5 v/v/v) toluen octan etylu (95:5 v/v) aldehyd anyżowy

6 I. heksan aceton kwas mrówkowy (25:4:0.5 v/v/v) II. heksan I. chloroform metanol kwas octowy (90:10:1 v/v/v) II. heksan eter dietylowy aceton (60:40:5 v/v/v) III. heksan eter dietylowy (17:3 v/v) Po przeprowadzeniu rozdziału składników badanych ekstraktów dokonano identyfikacji kwasów tłuszczowych, fenolokwasów i kwasu chlorogenowego stosując metodę porównawczą danych retencyjnych, w której obok ekstraktów roślinnych przedmiotem badań były wzorce wybranych związków. Zidentyfikowano nienasycone kwasy tłuszczowe we wszystkich badanych ekstraktach, a szczególnie kwas oleinowy w ekstraktach z nasion maliny i truskawki i kwas linolowy oraz ALA i GLA w ekstraktach z nasion maliny, truskawki i czarnej porzeczki. Spośród kwasów nasyconych stwierdzono największą ilość w badanych ekstraktach kwasu palmitynowego oraz stearynowego w nasionach czarnej porzeczki, maliny i truskawki. Fenolokwasy, a wśród nich kwasy hydroksycynamonowe znajdują się w największej ilości w ekstraktach z nasion aronii, maliny, truskawki i czarnej porzeczki. Kwas chlorogenowy, naturalny polifenol i antyoksydant o szerokim spektrum działania obecny był przede wszystkim w ekstraktach z nasion aronii i truskawki. Chromatografia micelarna oznaczonych składników badanych ekstraktów W celu zbadania aktywności biologicznej oznaczonych składników ekstraktów przetestowano wiele układów chromatografii micelarnej. Optymalizacja układów MLC jest czasochłonnym i żmudnym procesem, bowiem wymaga jednoczesnego doboru wielu parametrów, tj. faza stacjonarna, rodzaj i stężenie surfaktantu w fazie ruchomej, rodzaj i stężenie modyfikatora organicznego oraz ph fazy ruchomej. Układy wykorzystane w badaniach zaprezentowano w Tabeli 3: Tabela 3. Zoptymalizowane układy MLC i BMC. Faza ruchoma Faza stacjonarna modyfikator surfaktant organiczny CN F x10 CN F x10 CN F x10 SDS (dodecylosiarczan sodu) CTAB (bromek cetylotrimetyloamoniowy) Brij35 eter laurylowy glikolu polioksyetylenowego (23) tetrahydrofuran aceton dioksan acetonitryl acetonitryl Stężenie w fazie ruchomej surfaktantu 0,04M, 0,06M, 0,08M, 0,1M, 012M 0,04M, 0,06M, 0,08M, 0,1M, 012M 0,04M, 0,06M, 0,08M, 0,1M, 012M modyfikatora organicznego Charakter surfaktantu 20% v/v anionowy 20% v/v kationowy 0%, 5%, 10%, 15%, 20% v/v obojętny Stosowaną techniką badawczą była tu chromatografia TLC. Wszystkie analizowane roztwory faz ruchomych były buforowane. Stosowano bufor cytrynowo

7 fosforanowy o ph 7.4. Tak dobrane ph pozwala na lepszą i pełniejszą imitację układów biologicznych żywego organizmu, bowiem jest to ph ludzkiej krwi. W przypadku układów zawierających jonowe surfaktanty: SDS i CTAB, zbadano wpływ stężenia surfaktantu na retencję badanych związków, a w przypadku układów z SDS oceniono także wpływ rodzaju modyfikatora organicznego na retencję. Układy chromatografii BMC przetestowano pod kątem stężenia zarówno surfaktantu, jak i modyfikatora organicznego w fazie ruchomej. Detekcji chromatogramów dokonano po uprzednim rozwinięciu i wysuszeniu płytek chromatograficznych w parach jodu. Dla wszystkich przebadanych układów micelarnych wykreślono zależności 1/k vs. C M (zależności odwrotności współczynnika retencji od stężenia surfaktantu w micelach, C M = C cmc, gdzie C całkowite stężenie surfaktantu). Krytyczne stężenie micelizacji (cmc) wyznaczono eksperymentalnie dla testowanych faz ruchomych metodą pomiaru napięcia powierzchniowego. Wybrane zależności 1/k vs. C M dla badanych układów BMC przedstawiono na Rys. 1. 1/k 0,6 0,3 kwas linolowy kwas 4- hydroksycynamo nowy kwas alfa linolenowy kwas gamma linolenowy 0 0 0,05 0,1 0,15 C M [mol/dm 3 ] Rys. 1. 1/k vs. C M w testowanych układach BMC dla wybranych składników badanych ekstraktów. Zgodnie z klasyfikacją Armstronga i Stine a wszystkie badane (z wyjątkiem jednego) w niniejszej pracy związki należą do grupy analitów wiążących, bowiem następuje spadek ich retencji (wzrost 1/k) wraz ze wzrostem stężenia surfaktantu w micelach. Jedynie kwas 4-hydroksycynamonowy zachowuje się w odmienny sposób. Retencja jego rośnie wraz ze wzrostem stężenia C M i zgodnie z wyżej wspomnianą klasyfikacją należy on do grupy analitów antywiążących. Determinantą tych różnic jest typ oddziaływań analitu z micelą. Warto nadmienić, że kwas 4-hydroksycynamonowy jest analitem antywiążącym względem surfaktantów jonowych (SDS i CTAB). Jednak względem niejonowego Brij35 zachowuje się on jak analit wiążący. Kluczową rolę odgrywają tu zatem oddziaływania o charakterze elektrostatycznym.

8 biodostępność po podaniu doustnym (%) Chromatografia Biopartitioning w przewidywaniu biodostępności badanych związków po ich doustnym podaniu Leki o działaniu ogólnym podaje się doustnie (per os). Szybkość absorpcji leku z miejsca podania zależy od dawki, właściwości fizykochemicznych leku oraz od wielkości i stopnia unaczynienia powierzchni absorpcyjnej [18]. W celu oszacowania wielkości wchłaniania leków podanych drogą doustną skorzystano z modelu QRAR, łączącego wielkość absorpcji wybranych substancji z danymi retencyjnymi uzyskanymi metodą BMC dla fazy ruchomej zawierającej 0.1M Brij35 bez dodatku modyfikatora organicznego (ph 7.4). Z uwagi na utrudnioną detekcję nasyconych kwasów tłuszczowych, nie określono dla nich wielkości biodostępności. Dla pozostałych związków oszacowano ich biodostępność po podaniu doustnym wyrażoną jako ułamek dawki leku, jaki przechodzi do krążenia ogólnego. Biodostępność po podaniu doustnym (%) = [10] n = 74, SE = 9.8, R 2 = 0.72, F = 3174, k BMC - współczynnik retencji wybranych związków w układzie CN/0.1M Brij35 (bez dodatku modyfikatora organicznego). 100 R² = k BMC (0.1M Brij35) Rys. 2. Biodostępność związku podanego drogą doustną (%) obliczony na podstawie danych retencyjnych dla kwasów: linolowego (LA), -linolenowego (ALA), -linolenowego (GLA), 3-hydroksycynamonowego oraz 4-hydroksycynamonowego. Wyznaczono także wielkość biodostępności wybranych związków stosując dane retencyjne dla faz ruchomych BMC różniących się zawartością modyfikatora organicznego (Tabela 4). Tabela 4. Biodostępność związku podanego drogą doustną (%) obliczona dla faz ruchomych BMC. Kwas Zawartość acetonitrylu w fazie ruchomej 0% v/v 5% v/v 10% v/v 15% v/v 20% v/v LA 94,1 89,7 85,3 81,3 78,7 ALA 91,2 89,5 87,7 86,1 84,5 GLA 87,1 85,3 84,3 83,2 82,5 3-hydroksycynamonowy 73,9 71,6 66,9 65,0 62,4 4-hydroksycynamonowy 79,9 77,1 70,4 67,5 63,5

9 Substancje o współczynniku retencji logk > 1 są szybko i całkowicie wchłaniane z biodostępnością ponad 90 %. Z Tabeli 4 wynika również, że wyżej wskazany model QRAR najlepiej opisuje biodostępność badanych związków na podstawie danych retencyjnych BMC uzyskanych z faz ruchomych nie zawierających w ogóle (lub zawierających w niewielkim stopniu) dodatku modyfikatora organicznego. Fazy ruchome zawierające wyłącznie buforowany roztwór (ph 7.4) surfaktantu Brij35 najlepiej i najwłaściwiej imitują układy biologiczne żywego organizmu. Modele predykcji QRAR biodostępności związków po ich podaniu doustnym mogą okazać się bardzo użyteczne w początkowym stadium badań nad nowymi lekami. Dzieje się tak dlatego, ponieważ retencja w BMC może świadczyć o właściwościach transportowych danego związku, jeżeli za jego absorpcję odpowiedzialny jest mechanizm dyfuzji biernej. QSAR a wchłanianie badanych kwasów w jelicie czczym. Model Caco-2. Wchłanianie leków podanych drogą doustną ma najczęściej miejsce w jelicie cienkim w zakresie ph od 4.5 do 8. Jednakże przyjmuje się, że leki o charakterze słabych kwasów powinny absorbować się lepiej w jelicie czczym, zaś związki o charakterze słabych zasad, w jelicie krętym. Wyznaczono in silico wielkości pasywnej absorpcji jelitowej badanych kwasów, składników ekstraktów roślinnych, w jelicie czczym człowieka. Tabela 5. Absorpcja pasywna wybranych składników badanych ekstraktów w ludzkim jelicie czczym (ph 6.5) oraz absorpcja względem linii komórkowej Caco-2. Kwas Absorpcja Absorpcja pasywna w względem Caco-2 jelicie czczym [*10-4 [*10 cm/s] cm/s] laurynowy mirystynowy palmitynowy stearynowy linolowy oleinowy kumarowy hydroksycynamonowy hydroksycynamonowy alfa linolenowy gamma linolenowy chlorogenowy Jak wspomniano wcześniej, linia komórkowa Caco-2 jest powszechnie stosowanym obecnie systemem modelowym przede wszystkim do badań farmaceutycznych, lecz także do badań nad transportem produktów trawienia ze światła przewodu pokarmowego do krwi lub limfy. Model Caco-2 został tu wykorzystany do badania wchłaniania wybranych kwasów, składników ekstraktów roślinnych. Z Tabeli 5 wynika, że najmniejszą wielkością absorpcji w jelicie czczym charakteryzują się fenolokwasy (kwasy hydroksycynamonowe), zaś brak wchłaniania względem Caco-2 wykazuje kwas stearynowy i chlorogenowy. Należy jednak podkreślić, że wielkość absorpcji może być zdeterminowana przez fizyczne

10 absorpcja względem Caco-2 [*10-6 cm/s] właściwości substancji, a przede wszystkim przez lipofilowość związków. W Tabeli 6 zebrano najistotniejsze parametry steryczne, elektronowe i fizykochemiczne z punktu widzenia oznaczanych deskryptorów aktywności biologicznej. Tabela 6. Parametry fizykochemiczne badanych związków. Kwas Masa molowa[g/m ol] Parametry steryczne Paracho ra [cm 3 ] Objęto ść molow a [Å 3 ] Parametry elektronowe Polaryzowaln ość [*10-24 cm 3 ] Właściwości fizyczne Rozpuszczaln ość w wodzie logs w [mol/l] Właściwo ści lipofilowe logp o/w laurynowy mirystynowy palmitynowy stearynowy linolowy oleinowy kumarowy hydroksycynamon owy 4- hydroksycynamon owy alfa linolenowy gamma linolenowy chlorogenowy Wszystkie badane związki są słabo rozpuszczalne w wodzie i także wszystkie, z wyjątkiem jedynie kwasu chlorogenowego, posiadają własności lipofilowe. Należy też podkreślić, że większość badanych kwasów tłuszczowych, zarówno nasyconych, jak i nienasyconych należą do grupy związków silnie lipofilowych (logp o/w >6). Aby prześledzić wpływ parametrów związanych ze strukturą badanych związków na ich absorpcję względem linii komórkowej Caco-2, dokonano odpowiednich korelacji. Skorelowano wielkość absorpcji wyznaczonej in silico z parametrem lipofilowości logp o/w (Rys. 3). 6,5 4 R² = 0,98 1, logp o/w Rys. 3. Wielkość absorpcji względem Caco-2 vs. logp o/w.

11 Otrzymany wysoki współczynnik dopasowania potwierdza duży wpływ własności lipofilowych badanych związków na wielkość ich absorpcji względem Caco-2 w organizmie człowieka. Podobne porównanie przeprowadzono dla wielkości absorpcji w jelicie czczym. Otrzymany współczynnik korelacji R 2 > 0.60 może świadczyć o tym, że lipofilowość związku nie jest tu kluczowym czynnikiem determinującym wchłanianie substancji. Znacznie większy wpływ na absorpcję w jelicie czczym wywiera polaryzowalność związku (R 2 ~ 0.9). Wnioski W niniejszej pracy oznaczono najistotniejsze składniki ekstraktów roślinnych, a następnie poddano je analizie pod kątem ich właściwości biologicznych i biopodziałowych, dając tym samym informacje o możliwości ich wykorzystania jako surowców w produkcji dóbr o szerokiej gamie zastosowań. Oszacowano in vitro i in silico wielkość absorpcji wybranych składników ekstraktów roślinnych w ludzkim jelicie czczym oraz względem linii komórkowej Caco-2, a także oznaczono ułamek biodostępności związków po ich doustnym podaniu. Badane deskryptory aktywności biologicznej porównano z parametrami lipofilowości, sterycznymi, elektronowymi oraz parametrami fizykochemicznymi. Chromatografia micelarna, a zwłaszcza chromatografia Biopartitioning, stanowi dobrą alternatywę dla odmiennego od metod klasycznych rodzaju badań oznaczania aktywności biologicznej związków. Ten rodzaj chromatografii jest niewątpliwie cennym narzędziem predykcji kierunku i rozmiaru różnego rodzaju procesów zachodzących w żywym organizmie, przede wszystkim z uwagi na możliwość imitacji środowiska komórkowego. W dobie powszechnej dyskusji nad względami etycznymi i ekonomicznymi badań in vivo, to właśnie metoda BMC wydaje się być obiecująca, szczególnie z uwagi na możliwość całkowitej redukcji lub przynajmniej znacznego ograniczenia liczby eksperymentów wykonywanych na żywych organizmach, a także z uwagi na relatywnie niskie koszty badań. Literatura 1. D.W. Armstrong, S.J. Henry, J. Liq. Chromatogr., 3 (1980) A. Berthod, M.C. García Alvarez Coque, Micellar Liquid Chromatography, Marcel Dekker, New York, 2000, s A. Szymański, Badania retencyjne i oznaczanie wybranych sulfonamidów w środkach spożywczych metodą micelarnej chromatografii cieczowej, Wydawnictwo Naukowe UAM w Poznaniu, Poznań R. Nagarajan, Curr. Opin. Colloid In., 1 (1996) M. Molero Monfort, Y. Martín Biosca, S. Sagrado, R.M. Villanueva Camañas, M.J. Medina Hernández, J. Chromatogr. A, 870 (2000) J.J. Martínez Pla, Y. Martín Biosca, S. Sagrado, R.M. Villanueva Camañas, M.J. Medina Hernández, Biomed. Chromatogr., 17 (2003) L. Escuder Gilabert, M. Molero Monfort, R.M. Villanueva Camañas, S. Sagrado, M.J. Medina Hernández, J. Chromatogr. B, 807 (2004) L. Escuder Gilabert, J.J. Martínez Pla, S. Sagrado, R.M. Villanueva Camañas, M.J. Medina Hernández, J. Chromatogr. B, 797 (2003) 21.

12 9. J.J. Martínez Pla, Y. Martín Biosca, S. Sagrado, R.M. Villanueva Camañas, M.J. Medina Hernández, J. Chromatogr. A, 1047 (2004) M. Molero Monfort, L. Escuder Gilabert, R.M. Villanueva Camañas, S. Sagrado, M.J. Medina Hernández, J. Chromatogr. B, 753 (2001) M. Cuenca Benito, S. Sagrado, R.M. Villanueva Camañas, M.J. Medina Hernández, J. Chromatogr. A, 814 (1998) C. Quiñones Torrelo, S. Sagrado, R.M. Villanueva Camañas, M.J. Medina Hernández, J. Med. Chem., 42 (1999) D.W. Armstrong, F. None, Anal Chem., 53 (1981) M.J. Medina Hernández, M.C. García Alvarez Coque, Analyst, 117 (1992) D. Butina, M.D. Segall, K. Frankcombe, Drug Discov. Today, 7 (2002) S A. Olejnik, M. Schmidt, K. Wojnarowska, W. Grajek, Żywność. Nauka. Technologia. Jakość, 46 (2006) U. Gawlik Dziki, Żywność. Nauka. Technologia. Jakość, 41 (2004) R. Gryglewski, E. Kostka Trąbka, J. Spławiński, J. Robak, Farmakologia, Wydawnictwo Akademii Medycznej im. Mikołaja Kopernika w Krakowie, Kraków 1990.