Listeria monocytogenes

Transkrypt

1 Listeria monocytogenes

2 Klasyfikacja Domena Bacteria Typ Firmicutes Klasa Bacilli Rząd Bacillales Rodzina Listeriaceae Rodzaj Listeria Brochothrix

3 Rodzaj Listeria Klasyfikacja Listeria monocytogenes Listeria ivanovii Listeria innocua Listeria welshimeri Listeria seeligeri Listeria grayi Listeria marthii Listeria rocourtiae Listeria weihenstephanensis Listeria fleischmannii Listeria aquatica Listeria floridensis Listeria cornellensis Listeria grandensis Listeria riparia Listeria booria

4 Organizm Patogenność Liczba chromosomów Zawartość % GC Rozmiar (Mb) Geny Białka L.monocytgenes EGD-e patogenny dla ludzi i zwierząt L. innocua ATCC niepatogenny L. ivanovii patogenny głównie dla zwierząt L.seeligeri serovar 1/2b Str SLCC3954 niepatogenny L. welshimeri serovar 6b Str SLCC5334 niepatogenny L. grayi DSM niepatogenny L. marthii FSLS4-120 niepatogenny

5 Charakterystyka L. monocytogenes μm długości, μm szerokości regularne, nieprzetrwalnikujące, gramdodatnie pałeczki wykazujące tendencję do polimorfizmu względnie tlenowa nie wytwarza otoczek

6 Charakterystyka L. monocytogenes katalazo-dodatnia, oksydazo-ujemna posiada od 2 do 6 perytrychalnie ułożonych rzęsek zdolność ruchu w wąskim zakresie temp C; w temp. 37 C nieruchliwa na agarze z krwią wytwarza wąską strefę β hemolizy

7 Warunki wzrostu

8 Występowanie L. monocytogenes gleba przewody pokarmowe wielu gatunków zwierząt domowych dzikich wody powierzchniowe ścieki gnijące szczątki roślin kiszonki 2-10% zdrowych ludzi jest nosicielami

9 surowce pochodzenia zwierzęcego i roślinnego oraz produkty spożywcze: 1. surowe mleko 2. przetwory mleczne: sery (sery miękkie maziowe i pleśniowe), lody, masło 3. surowe mięso (wołowe, drobiowe, wieprzowe) 4. przetwory mięsne: surowe i półsurowe kiełbasy, próżniowo pakowane wędliny 5. świeże oraz mrożone warzywa i owoce 6. ryby, owoce morza środowisko zakładów przetwórstwa spożywczego szczególnie w miejscach chłodnych i wilgotnych przedmioty codziennego użytku (ścierki do naczyń, zlewozmywaki, chłodziarki, wanny)

10 Listerioza U zwierząt około 90% zachorowań na listeriozę jest spowodowane przez L. monocytogenes, a 10% przez L. ivanovii. U człowieka prawie wszystkie przypadki listeriozy wywołuje L. monocytogenes, rzadko L. seeligeri i L. ivanovii.

11 Wrota zakażenia u ludzi przewód pokarmowy uszkodzona skóra błony śluzowe układu oddechowego spojówki łożysko

12 Układ pokarmowy główne wrota wnikania L. monocytogenes do organizmu gospodarza Po przełamaniu bariery przewodu pokarmowego, bakterie wędrują wraz z krwią i limfą do węzłów chłonnych, śledziony i wątroby. W wątrobie, gdzie występuje najliczniej, większość niszczona jest przez makrofagi, a tylko część namnaża się w hepatocytach. Z wątroby może przedostać się do krwi (bakteriemia), prowadząc do posocznicy lub do inwazji mózgu lub łożyska.

13 Grupa ryzyka Kobiety w ciąży Noworodki Osoby o obniżonej odporności układu immunologicznego Osoby zaawansowane wiekowo (> 65 lat)

14 Zakażenia u ludzi wywoływane przez L. monocytogenes Listerioza u człowieka charakteryzuje się zmianami chorobowymi o różnym umiejscowieniu. Występują cztery postacie kliniczne choroby: 1) postać żołądkowo-jelitowa 2) płodowa 2) posocznica noworodków 3) zakażenie ośrodkowego układu nerwowego charakteryzujące się zapaleniem mózgu, zapaleniem mózgu i opon mózgowych

15 Zakażenia u ludzi wywoływane przez L. monocytogenes Łagodny nieżyt żołądkowo-jelitowy (ang. listerial gastroenteritis) Objawy zakażenia - dolegliwości ze strony przewodu pokarmowego: dreszcze, bóle głowy, bóle brzucha, nudności, biegunka, bóle mięśni, wymioty, zmęczenie.

16 Ostra infekcja (ang. invasive listeriosis) kobiety w ciąży - infekcja manifestująca się łagodnymi objawami klinicznymi przypominającymi grypę (podwyższona temperatura, bóle głowy, bóle mięśni) lub zapalenie dróg moczowych noworodki: listerioza wczesna sepsa ujawniająca się bezpośrednio po urodzeniu lub w pierwszym tygodniu życia (śmiertelność 15-50%) listerioza późna objawy pojawiają się zwykle pomiędzy 8 a 30 dniem życia i jest to zwykle zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych (śmiertelność 10-20%)

17 osoby o obniżonej odporności immunologicznej i osoby starsze zakażenie ośrodkowego układu nerwowego (zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych) lub zakażenie ogólne z typowymi objawami posocznicy. Rzadziej występuje porażenie nerwów czaszkowych i ropnie mózgu. Często zmianom w ośrodkowym układzie nerwowym towarzyszą zaburzenia psychiczne, a u około 25% pacjentów ataki padaczkowe. inne możliwe powikłania to: ropnie gałki ocznej, zapalenie wsierdzia, zapalenie i ropnie wątroby, zapalenie otrzewnej, zapalenie żołądka i jelit, infekcje skórne i szkieletowe.

18 Antybiotykoterapia listeriozy Lekiem skutecznym w alternatywnym leczeniu, szczególnie u chorych wykazujących alergię na β laktamy, jest trimetoprim w połączeniu z sulfonamidami, takimi jak sulfametoksazol (tzw. kotrimoksazol) lub erytromycyna. W leczeniu bakteriemii u kobiet w ciąży z powodzeniem stosuje się wankomycynę i erytromycynę.

19 EFSA Journal, 2015; 13(12):4329

20

21 Liczba hospitalizacji i śmiertelność spowodowana przez czynniki zoonotyczne w 2104 r. EFSA Journal, 2015; 13(12):4329

22 Rozporządzenie Komisji (WE) nr 2073/2005 z dnia 15 listopada 2005 r. w sprawie kryteriów mikrobiologicznych dotyczących środków spożywczych Rozdział 1. Kryteria bezpieczeństwa żywności

23 Symbole oznaczają: n - liczba próbek pobranych do badań m - wartość równa lub poniżej której wszystkie wyniki uznawane są za zadowalające M - wartość maksymalna liczby drobnoustrojów. Wynik jest niezadowalający, jeśli liczba drobnoustrojów w jednej lub kilku próbkach ma wartość M lub ją przekracza. c - liczba próbek, w których dopuszcza się liczbę drobnoustrojów pomiędzy m i M. Wynik jest zadowalający jeśli liczba drobnoustrojów w pozostałych próbkach ma wartość m lub niższą.

24 Według prawa UE (EG) nr 2073/2005 producent musi badać różne artykuły spożywcze w obszarze produkcji na obecność patogenów, np. L. monocytogens. Metody EN ISO oparte na hodowli są wyraźnie przywołane w tym prawie. Jednakże uzyskanie wyniku ujemnego może wymagać > 4 dni (dla L. monocytogenes). (EG) nr 2073/2005 dopuszcza również zastosowanie metod alternatywnych, jeżeli ich walidacja w stosunku do metod ISO zapewnia równoważne wyniki.

25 Konwencjonalne metody mikrobiologiczne znormalizowane metody PN ISO* (International Organization for Standarization) uznane urzędowo identyfikacja drobnoustrojów do poziomu rodzaju i/lub gatunku

26 Konwencjonalne metody mikrobiologiczne ICS: Mikrobiologia żywności PN-EN ISO 7218:2008 Mikrobiologia żywności i pasz. Wymagania ogólne i zasady badań mikrobiologicznych. PN-EN ISO 7218:2008/A1: (oryg.) PKN-CEN ISO/TS :2009 Mikrobiologia żywności i pasz. Wytyczne dotyczące przygotowania i wytwarzania pożywek. Część 1: Ogólne wytyczne dotyczące kontroli jakości pożywek przygotowywanych w laboratorium. ISO/TS :2003/A1:2011 Microbiology of food and animal feeding stuffs. Guidelines on preparation and production of culture media. Part 2: Practical guidelines on performance testing of culture media

27 Konwencjonalne metody mikrobiologiczne ICS: Mikrobiologia żywności PN-EN ISO :2000 Mikrobiologia żywności i pasz. Przygotowanie próbek, zawiesiny wyjściowej i rozcieńczeń dziesięciokrotnych do badań mikrobiologicznych. Ogólne zasady przygotowania zawiesiny wyjściowej i rozcieńczeń dziesięciokrotnych. PN-EN ISO :2005 Mikrobiologia żywności i pasz. Przygotowanie próbek, zawiesiny wyjściowej i rozcieńczeń dziesięciokrotnych do badań mikrobiologicznych. Część 2: Specyficzne zasady przygotowania mięsa i przetworów mięsnych. PN-EN ISO :2005 Mikrobiologia żywności i pasz. Przygotowanie próbek, zawiesiny wyjściowej i rozcieńczeń dziesięciokrotnych do badań mikrobiologicznych. Część 3: Specyficzne zasady przygotowania ryb i przetworów rybnych. PN-EN ISO :2005 Mikrobiologia żywności i pasz -- Przygotowanie próbek, zawiesiny wyjściowej i rozcieńczeń dziesięciokrotnych do badań mikrobiologicznych. Część 4: Specyficzne zasady przygotowania produktów innych niż mleko i przetwory mleczne, mięso i przetwory mięsne oraz ryby i przetwory rybne.

28 Konwencjonalne metody mikrobiologiczne ICS: Mikrobiologia żywności PN-EN ISO 7932:2005 Mikrobiologia żywności i pasz. Horyzontalna metoda oznaczania liczby przypuszczalnych Bacillus cereus. Metoda liczenia kolonii w temperaturze 30 stopni C. PN-EN ISO :2007 Mikrobiologia żywności i pasz. Horyzontalna metoda wykrywania obecności i oznaczania liczby Campylobacter spp. Część 1: Metoda wykrywania. PN-EN ISO 13720:2010 (oryg.) Mięso i przetwory mięsne. Oznaczanie liczby przypuszczalnych Pseudomonas sp.

29 Konwencjonalne metody mikrobiologiczne ICS: Kosmetyki. Środki higieny osobistej PN-EN ISO 21148:2009 (oryg.) Kosmetyki Mikrobiologia. Ogólne wytyczne badań mikrobiologicznych PN-EN ISO 11930:2012 (oryg.) Kosmetyki - Mikrobiologia. Test skuteczności i ocena zakonserwowania produktów kosmetycznych PN-EN ISO 16212:2011(oryg.) Kosmetyki-Mikrobiologia. Oznaczenie liczby drożdzy i pleśni. PN-EN ISO 18416:2009 (oryg.) Kosmetyki-Mikrobiologia. Wykrywanie Candida albicans

30 Konwencjonalne metody mikrobiologiczne ICS: Mikrobiologia wody PN-EN ISO 8199:2010 Jakość wody. Ogólne wytyczne oznaczania liczby bakterii metodą hodowli PN-EN ISO :2002 Jakość wody. Wykrywanie i oznaczanie ilościowe enterokoków kałowych. Część 1: Zminiaturyzowana metoda do badania wód powierzchniowych i ścieków (najbardziej prawdopodobna liczba bakterii) PN-EN ISO :2004 Jakość wody. Wykrywanie i oznaczanie ilościowe enterokoków kałowych. Część 2: Metoda filtracji membranowej

31 Konwencjonalne metody mikrobiologiczne namnożenie drobnoustrojów na odpowiednich podłożach namnażająco-wybiórczych (metody jakościowe) analiza wielu cech morfologicznych, biochemicznych czy serologicznych bakterii, które wyrosły w postaci kolonii na podłożach agarowych

32 PN-EN ISO :1999+A1:2005

33 Bulion pół-frasera i Frasera - podłoża do selektywnego namnażania Listeria sp. Oprócz składników odżywczych (peptony, ekstrakty) zawierają eskulinę i chlorek litu. Do podłoża po sterylizacji wprowadzany jest roztwór cytrynianu amonowo-żelazowego i dodatek selektywny w postaci roztworu: akryflawiny i kwasu nalidyksowego (w bulionie pół-frasera jest go połowę mniej). Antybiotyki i chlorek litu silnie hamują wzrost bakterii gramujemnych i większość gramdodatnich. Dodatkowo chlorek litu jest czynnikiem wybiórczym, ze względu na tolerancję wyższych stężeń tej soli przez Listeria spp. Szczepy Listeria hydrolizują eskulinę do eskuletyny i glukozy. Eskuletyna tworzy czarny kompleks z żelazem (III) pochodzącym z cytrynianu. Hodowla na tym podłożu po namnożeniu pałeczek Listeria spp. przybiera czarnoszarą lub czarną barwę. wzrost L.mnocytogenes na podłożu bulion Frasera

34 podłoże chromogenne ALOA (agar Listeria wg Ottaviani i Agosti) chromogenny substrat: 5-bromo-3-chloro-3-indoxyl- -D-glukopiranozyd wykrywanie aktywności - -D-glukozydazy = kolonie niebieskozielone (wszystkie gatunki Listeria) substrat L- -fosfatydyloinozytol wykrywanie aktywności fosfolipazy C specyficznej dla fosfatydyloinozytolu (PI-PLC) = mętne halo Dodatkowo zawiera: mieszaninę antybiotyków (kwas nalidyksowy, ceftazidim, polimyksynę B, cykloheksimid lub amfoterycynę B), chlorek litu.

35 podłoże agar Oxford podłoże agar Palcam podłoże wybiórczo-różnicujące zawierające w swoim składzie m in. mieszaninę antybiotyków (polimyksynę B, ceftazidim) akryflawinę, mannitol, czerwień fenolową, glukozę, eskulinę, chlorek litu, cytrynian amonowożelazowy(iii). podłoże wybiórczo-różnicujące zawierające w swoim składzie m. in. mieszaninę antybiotyków (siarczan kolistyny, cefotetan, fosfomycynę, cykloheksymid), akryflawinę, eskulinę, chlorek litu i cytrynian amonowo-żelazowy(iii).

36 Testy potwierdzające dla Listeria spp. barwienie Grama katalaza zdolność ruchu Testy potwierdzające dla L. monocytogenes test na hemolizę test CAMP fermentacja ramnozy i ksylozy

37 Test CAMP S - Staphylococcus aureus Christie Atkins Munch Peterson test R S (ATCC lub 49444; NCTC 7428 lub 1803) R - Rhoodococcus equi (ATCC 6939 lub NCTC 1621) L. ivanovii R s L. innocua s R L. monocytogenes

38