Aktywności enzymatyczne i parametry kinetyczne. Abstract. Streszczenie

Transkrypt

1 Streszczenie Jednym z celów wielu badań było scharakteryzowanie aktywności wielu izoenzymów cytochromu P450 u wielu gatunków zwierząt w celu znalezienia praktycznego sposobu porównania tego ważnego etapu metabolicznego pomiędzy zwierzętami testowymi a człowiekiem. Porównuje się w tym celu parametry kinetyczne enzymów i ich aktywności oraz profile inhibicji uzyskane u różnych gatunków zwierząt z danymi otrzymanymi z badań wątroby ludzkiej w celu znalezienia gatunku zwierzęcia najbardziej zbliżonego do człowieka pod względem aktywności różnych aktywności enzymatycznych izoform cytochromu P450. W tym celu oznacza się in vitro wątrobową aktywność związaną z izoformami cytochromu P450 dla wielu substancji takich, jak O-deetylacja fenacetyny, 7-hydroksylacja kumaryny, hydroksylacja tolbutamidu, 4 -hydroksylacja S-mefenytoiny, O-demetylacja dekstrometorfanu, 6-hydroksylacja chlorzoksazonu czy 6 β-hydroksylacja testosteronu a także bada wpływ selektywnych inhibitorów izoform cytochromu P450 na aktywność enzymów w mikrosomach wątroby różnych zwierząt. Stwierdzono, że praktycznie żadne z badanych gatunków zwierząt nie było podobne do człowieka we wszystkich badanych aktywnościach enzymatycznych izoform cytochromu P450. U każdego z gatunków jedynie kilka spośród aktywności CYP może być rozważane jako porównywalne do człowieka. Abstract It was the aim of many investigations to characterize the activity of the izoenzymes cytochome P450 at different animal species in order to find practical way of the comparison of this important metabolic stage among tested animals and human. To achive this one compare kinetic parameters of enzymes and their activities as well as inhibition profile recived at different species with datas recived from researchs of human liver. In vitro, in human and animal liver were estimated cytochromes P450 izoenzyme dependent activities for different drugs: phenacetin O-deethylase, coumarin 7-hydroxylase, tolbutamide hydroxylase, S-mephenytoin 4 - hydroxylase, dextromethorphan O-demetylase, chlorzoxazone 6- hydroxylase and testosterone 6 β- hydroxylase and was investigated effect of specific inhibitors. Today we know no animals species in which xenobiotic metabolizm is similar to human (in all investigated activities), in every species only some CYP activities are comparable with human. Key words: animals species, human, enzyme activities, kinetic parameters, inhibition, cytochrome P450, CYP Słowa kluczowe: gatunek zwierząt, człowiek, aktywność enzymatyczna, parametry kinetyczne, inhibicja, cytochrom P450, CYP Aktywności enzymatyczne i parametry kinetyczne Używanie związków chemicznych jako inhibitorów przynosi wiele korzyści w związku z łatwością użycia i powszechną dostępnością. Główną wadą tego postępowania jest konieczność ustalenia właściwych warunków doświadczenia w celu zapewnienia selektywności inhibicji tylko dla jednej izoformy cytochromy P450. Dla przykładu, wykazano, że ketokonazol, bardzo silny inhibitor CYP3A4, użyty w wysokim stężeniu może również hamować aktywność katalityczną innych izoform cytochromu P450 [1].

2 Właśnie dlatego jednym z celów tej pracy jest scharakteryzowanie aktywności wielu izoenzymów cytochromu P450 u wielu gatunków zwierząt w celu znalezienia praktycznego sposobu porównania tego ważnego etapu metabolicznego pomiędzy zwierzętami testowymi a człowiekiem. Po pierwsze, aktywności enzymatyczne i parametry kinetyczne zostały określone z użyciem takich substratów, jak 7-etoksyrezorufina, kumaryna, 7-etoksy-4- triflurometylokumaryna, diklofenak, S-mefenytoina, bufuralol, chlorzoksazon, testosteron, kwas laurynowy i inne, w mikrosomach wątroby myszy, szczura, królika, psa, świnki morskiej i miniaturowej, małpy, kota, psa, konia oraz człowieka. Użyte ksenobiotyki są dobrze znanymi substratami markerowymi dla ludzkich izoenzymów cytochrom P450. Po drugie, określono profile inhibicji z użyciem przeciwciał skierowanych do różnych izoenzymów cytochromu P450 oraz inhibitorów chemicznych takich, jak α-naftoflawon, furafilina, pilocarpina, sulfafenazol, chinidyna, chinina, dietyloditiokarbaminian czy ketokonazol. W ten sposób stwarzamy nadzieję, że kolejne badania dostarczą wiele nowych informacji na temat międzygatunkowego metabolizmu porównawczego. Porównuje się w tym celu parametry kinetyczne enzymów, aktywności enzymów oraz profile inhibicji uzyskane u różnych gatunków zwierząt z danymi otrzymanymi z badań mikrosomów wątroby ludzkiej w celu znalezienia gatunku najbardziej zbliżonego do człowieka pod względem aktywności różnych aktywności enzymatycznych cytochromu P450. Do tej pory nie do końca wiadomo, które izoenzymy P450 odgrywają wiodącą rolę w metabolizmie leków w wątrobie rzadko wykorzystywanych w tym celu zwierząt, takich jak małpa, świnia, koń, pies czy kot, mimo iż stwierdzono u nich obecność wielu izoform cytochromu P450. W grupie zwierząt domowych najlepiej poznano metabolizm leków u psa ze względu na to, iż stanowi on wzorcowy model zwierzęcy w badaniach przedklinicznych i analizach toksyczności. Jak dotąd u psa określono aktywności katalityczne izoform z użyciem określonych sond dla CYP1A1/1A2, 2A6, 2C19, 2D6, 2E1 i 3A4 [2, 3]. Charakterystyka sekwencji aminokwasowych niektórych cytochromów P450 wykazała i potwierdziła, iż CYP należące do podrodzin P450 1A, P450 2C, P450 3A i P450 2D występują u psa [3-6]. Dane na temat aktywności enzymatycznych izoform cytochromu P450 u konia i kota są bardzo fragmentaryczne. Jednak już na początku lat siedemdziesiątych ubiegłego wieku Yeary i Gerken [7] przedstawili krótkie doniesienie na temat biotransformacji niektórych substancji w mikrosomach wątrobowych konia, a w kilka lat później Martmez-Zedillo i wsp. [8] opublikowali badania dotyczące metabolizmu in vitro po traktowaniu parationem u tego samego zwierzęcia. Dopiero dwie dekady później Komori i wsp. [9] sporządzili charakterystykę P450 mikrosomów wątroby konia, izolując białka należące do podrodzin cytochromu P450. Był to okres badań nad cytochromem P450, kiedy to izolowano i oczyszczano różne jego izoformy u wielu gatunków zwierząt. Z tego okresu pochodzą pierwsze dane na temat metabolizmu leków u kotów, które można znaleźć w międzygatunkowym (w tym między innymi, chomik, małpa, królik mysz, szczur i oczywiście człowiek) badaniu dotyczącym substratów CYP2A i 3A [10-13]. Pomimo upływu wielu lat, prawdopodobnie żadna izoforma cytochromu P450 nie została wyizolowana i w pełni scharakteryzowana u kota. Dopóki pełna charakterystyka katalitycznych sond i chemicznych inhibitorów dotyczy wyłącznie organizmu ludzkiego [14, 15] oraz szczura, myszy i królika i dopóki nadal tak mało wiemy na temat metabolizmu ksenobiotyków związanego z cytochromem P450 u takich zwierząt, jak koń, kot, świnka morska, małpa i w pewnym stopniu pies, dopóty będzie zasadne używanie tych narzędzi w celu głębszego poznania procesów I fazy biotransformacji u wyżej wymienionych zwierząt. W tym celu oznacza się in vitro wątrobową aktywność związaną z izoformami cytochromu P450 dla wielu substancji takich, jak O-deetylacja fenacetyny, 7-hydroksylacja kumaryny, hydroksylacja tolbutamidu, 4 -hydroksylacja S-mefenytoiny, O-demetylacja dekstrometorfanu, 6-hydroksylacja chlorzoksazonu czy 6β-hydroksylacja testosteronu a także bada wpływ selektywnych inhibitorów izoform cytochromu P450 na aktywność enzymów w mikrosomach wątroby nie tylko człowieka, ale też takich zwierząt jak małpa, koń, pies, kot i inne. Cytochrom P450 u człowieka i innych ssaków Nadrodzina cytochromu P450 bierze udział w wielu reakcjach oksydacji i często odgrywa decydującą rolę w metabolizmie i ocenie kinetyki ksenobiotyków. Modele zwierzęce są używane do przewidywania kinetyki i toksyczności u człowieka. Międzygatunkowe porównanie napotyka jednak na dwie zasadnicze trudności. Po pierwsze, w narządach człowieka istnieją duże wewnątrzpopulacyjne wariacje pomiędzy poszczególnymi izoformami CYP, jako konsekwencja różnic fenotypowych na skutek polimorfizmu genetycznego. Po drugie, pomimo, że izoformy cytochromu P450 są zaklasyfikowane do odrębnych podrodzin na podstawie podobieństwa w sekwencji aminokwasów, to wysoki stopień podobieństwa sekwencji nie oznacza automatycznie podobnej specyficzności katalitycznej. Nawet pojedyncza substytucja aminokwasów może spowodować zmianę specyficzności substratu. Dlatego ortologiczne geny i/lub enzymy nie pozwalają automatycznie na porównanie specyficzności katalitycznej pomiędzy gatunkami. W dodatku bardzo różne izoenzymy CYP mogą katalizować te same aktywności. W związku z ekstrapolacją gatunek-gatunek, ważna jest wiedza na temat, które podobieństwa lub różnice istnieją pomiędzy izoenzymami i podrodzinami cytochromu P450, jak również poziomami ich ekspresji. U ludzi najważniejsze izoenzymy podrodzin CYP, które biorą udział w metabolizmie ksenobiotyków i związków endogennych to CYP: 1A1, 2A6, 2B6, 2C9, 2D6, 2E1 i 3A4, ze względu na ich znaczący udział w całkowitym wątrobowym stężeniu cytochromu P450, który wynosi odpowiednio 13, 4, 1, 8, 15, 16 i 30%. U zwierząt poziomy powiązanych aktywności izoenzymów określonych podrodzin mogą być bardzo różne. Na przykład aktywności 7-hydroksylazy kumaryny u ludzi są do 200 razy wyższe niż u szczura. Odnośnie aktywności CYP3A u szczurów opisano różnice pod względem płci, gdzie osobniki męskie mają 5-10 razy wyższą aktywność niż żeńskie, podczas gdy podobne aktywności CYP3A ob-

3 CYP Substraty endogenne aktywujące Tab. IA. Niektóre wybrane cechy charakterystyczne izoform cytochromu P450 u człowieka (zmodyfikowane na podstawie [20, 46, 47]) 1A1 1A2 1B1 6β-Hydroksylacja testosteronu, ω-2 oksydacja prostaglandyn, C-2-hydroksylacja 6β-Hydroksylacja testosteronu, C2-hydroksylacja 6β-, 16α-Hydroksylacja testosteronu, C 2A6-2B6 16α-,16β-, 17- Hydroksylacja testosteronu Policykliczne węglowodory aromatyczne, benzo[a]piren Acetaminofen, 2-AAF, aflatoksyna B1 Aminy heterocykliczne, areny arylowe, nitroareny Aflatoksyna B1, nikotyna, benzo[a] piren, N-nitrozodietyloamina, NNK Styren, cyklofosfamid, 6-aminochryzen, ifosfamid, azobenzen 2C8 - - metabolizowane 7-Etoksykumaryna, 7-etoksyrezorufina, 8-hydroksylacja R-warfaryny 7-Etoksyrezorufina, kaffeina, fenacetyna, 6-hydroksylacja R-warfaryny, imipramina Induktor(y) 3-MC, BNF, TCDD, dym tytoniowy, omeprazol, 3-MC, BNF, TCDD, dym tytoniowy, omeprazol Inhibitor(y) 7,8-Benzoflawon, apigenina, α-naftoflawon Furafilina, izosafrol, 7,8- benzoflawon, apigenina 7-Etoksyrezorufina - - 1,3-Butadien, kumaryna Benzofetamina, diazepam, pentoksyrezorufina, fenantren, benzyloksyrezorufina Fenytoina, retinol, kwas retinowy, tolbutamid, S-mefenytoiny - Fenobarbital Rifampicyna Kumaryna, metoksalen, 8-metoksypsoralen α-naftoflawon, metyrapon Sulfafenazol serwowano u ludzi i samców szczurzych. Dlatego, aby przewidzieć kinetykę i toksyczność u ludzi, różnice gatunkowe pomiędzy izoenzymami CYP powinny być wzięte po uwagę podczas selekcji zwierząt do badań in vitro i in vivo. Tylko w części badań podawane są informacje na temat, u których gatunków badano różnice odnośnie aktywności izoenzymów cytochromu P450. W części tych badań zaledwie dwa lub trzy gatunki zwierząt były poddane badaniu porównawczemu, a w innych badano tylko jeden lub dwa substraty. Ponadto, nie zawsze były używane najbardziej powszechne substraty dla izoform cytochromu P450. Dlatego też podane różnice międzygatunkowe odnośnie aktywności izoenzymów CYP wydają się być fragmentaryczne. Celem tego opracowania jest podkreślenie roli znaczących izoform cytochromu P450 u ssaków ze zwróceniem uwagi na ich ekspresję, indukcyjność, charakter inhibicji, preferencje substratowe, szczególnie analizując te informacje w ujęciu toksykologii ludzi. Ze względu na ograniczone możliwości pracy nie jest możliwe podanie całej odnoszącej się do tematu literatury, dlatego czytelnik będzie musiał się odwołać do innych prac zawierających bardziej szczegółowe informacje [16-22]. Informacje z tych i innych publikacji zostały użyte, jako materiał źródłowy i zgromadzone w tabeli I, podsumowując niektóre z ważniejszych cech kilku związanych ze sobą izoform cytochromów P450. Aktywność metaboliczna Celem jednej z unikalnych prac w tym zakresie było scharakteryzowanie aktywności dziewięciu izoform cytochromu P450 u siedmiu gatunków zwierząt, w celu porównania tego ważnego etapu metabolicznego pomiędzy różnymi badanymi w laboratoriach zwierząt a człowiekiem [21]. Aktywności enzymów i parametry kinetyczne były w wielu badaniach oznaczane w stosunku do dobrze znanych substratów markerowych dla izoenzymów ludzkiego cytochromu P450. Skoro wiemy, że różne izoenzymy cytochromu P450 mogą katalizować tą samą aktywność [23], dodatkowe informacje są konieczne, aby ustalić gatunki zwierząt najbardziej zbliżone do człowieka pod względem aktywności enzymów cytochromu P450. Dlatego też, profile inhibicji zostały ocenione dla szerokiego zakresu zarówno przeciwciał jak i inhibitorów chemicznych. Im bliższy będzie profil inhibicji u danego gatunku zwierzęcia w porównaniu do człowieka, tym samym bliższa będzie specyficzność katalityczna cytochromu P450 tego gatunku. Zarówno parametry kinetyczne enzymów, jak i aktywności enzymatyczne lub poziomy ich ekspresji, jak i profile inhibicji (katalityczne specyficzności) były użyte do postawienia prognozy w odniesieniu do gatunków zwierząt najbardziej podobnych do ludzkich. Ponadto, musimy wziąć pod uwagę, że u ludzi

4 Tabela IB. Niektóre wybrane cechy charakterystyczne izoform cytochromu P450 u człowieka ciąg dalszy (na podstawie [20, 46, 47]) CYP Substraty endogenne aktywujące 2C C C D6 - NNK 2E1 3A4 4A9/11 Alkohole, nitrozoaminy 6β- Hydroksylacja testosteronu, 6β-hydroksylacja progesteronu, 2-hydroksylacja β-oksydacja i ω-hydroksylacja kwasów tłuszczowych Acetaminofen, benzen, akrylonitryl, chloroform, styren, nitrozoaminy Acetaminofen, aflatoksyna B1, benzo[a] piren, ifosfamid, cyklofosfamid - metabolizowane Chloramfenikol, ibuprofen, fenytoina, diklofenak, heksobarbital, S-mefenytoiny, naproksen N-Demetylacja diazepamu, S-mefenytoiny, p-hydroksylacja fenytoiny Diazepam, omeprazol, heksobarbital, N-demetylacja imipraminy, S-mefenytoiny Kodeina, sparteina, amitryptylina, bufarolol, imipramina, sparteina, dekstrometorfan Acetaminofen, enfluran, halotan, akrylonitryl, izoniazyd, chlorzoksazon, p-nitrofenol, etanol Antypiryna, DEX, chinina, diazepam, erytromycyna, nifedypina, cyklosporyna A C12-Hydroksylacja kwasu laurynowego Induktor(y) Rifampicyna Inhibitor(y) Sulfafenazol, warfaryna Rifampicyna - Rifampicyna - Alkohol, aceton, pirazol, izoniazyd, głodzenie, Fenobarbital, DEX, karbamazepina, fenytoina, rifampicyna, erytromycyna Sulfafenazol, omeprazol, tranylcypramina Chinidyna, chinina, paroksentyna Disulfiram, 4-metylopirazol, dietyloditiokarbaminian Troleandomycyna, TAO, ketokonazol - Estry ftalowe, ciprofibrat różne poziomy izoform cytochromu P450 pokazują szeroki zakres aktywności spowodowanych osobniczą zmiennością i/lub polimorfizmem genetycznym [24, 25]. Szerzej do tego problemu wrócimy w części trzeciej tego opracowania. W kilku badaniach zajmowano się różnicami gatunkowymi w ocenie aktywności enzymatycznych izoenzymów cytochromu P450 [np ]. Ogólnie rzecz biorąc wyniki opisane w tych badaniach są podobne bez względu na to, z jakiego laboratorium pochodziły. Jednakże, obserwowano pewne różnice, np. w odniesieniu do metabolizmu tolbutamidu i inhibicji aktywności hydroksylacji tego związku [21], w porównaniu do metabolizmu diklofenaku. Odmienne wyniki uzyskał Eagling i wsp. [33], którzy badali uruchamianą przez szereg substancji, inhibicję aktywności 4-hydroksylazy tolbutamidu, w reakcji katalizowanej przez CYP2C9 z mikrosomów wątroby człowieka i szczura. Furafilina, inhibitor ludzkiego CYP1A2, nie powodowała inhibicji aktywności 4-hydroksylazy tolbutamidu w mikrosomach wątroby ludzkiej, a w mikrosomach wątroby szczura hamowanie ujawniało się dopiero przy wysokich stężeniach inhibitora. W laboratorium Bogaardsa i wsp. [21], diklofenak został użyty, jako substrat dla CYP2C9. Używając tego substratu nie stwierdzono inhibicji wywołanej przez furafilinę w mikrosomach wątroby szczura. Dlatego też diklofenak może być lepszym substratem niż tolbutamid dla białek homologicznych z CYP2C9 u szczura. Sharer i wsp. [26] porównali aktywność 4-hydroksylazy tolbutamidu u ludzi z mikrosomami małpy oraz psa rasy beagle. U psa nie stwierdzili oznaczalnej aktywności 4-hydroksylazy tolbutamidu. Jednakże, w przeciwieństwie do metabolizmu tolbutamidu, została u tego gatunku stwierdzona aktywność 4-hydroksylazy diklofenaku. Chociaż Sharer i wsp. [26] stwierdzili podobną wartość V max u ludzi i małp, co potwierdzają wyniki laboratorium Bogaardsa i wsp. [21], to K m dla metabolizmu tolbutamidu u małpy okazało się 4-krotnie wyższe niż w ludzkich mikrosomach. W przypadku metabolizmu diklofenaku zostało stwierdzone 25-35krotnie wyższe K m, wskazując na znacznie większe powinowactwo ludzkiego CYP2C9 w stosunku do diklofenaku niż białka związane z CYP2C9 u małpy w stosunku do tolbutamidu.

5 W laboratorium Chauret i wsp. [19] nie stwierdzono znamiennych statystycznie różnic w aktywności O-deetylazy fenacetyny u człowieka, psa, kota i konia. Również Sharer i wsp. [26] nie zaobserwowali znamiennych rozbieżności w aktywności innego markera katalitycznego dla ludzkiego CYP1A1/2 tj., O-deetylazy etoksyrezorufiny w mikrosomach człowieka i psa. Zmienność uzyskanych wyników dla człowieka obserwowana w badanych aktywnościach u człowieka jest ogromna, aczkolwiek zgodna z innymi danymi pochodzącymi z innych laboratoriów [35, 36]. Przyczyna aż tak dużej zmienności może wynikać na przykład z ekspozycji części osobników na induktory CYP1A1/1A2 [36, 37]. Innym czynnikiem, który w tym przypadku powinien być brany pod uwagę jest polimorfizm genetyczny. Genetyczna zmienność w obrębie ludzkich izoform cytochromów P450 została już dobrze udokumentowana a warianty alleli dla genów cytochromów P450 zostały też zidentyfikowane. Wiele z tych genetycznych wariantów charakteryzowało się substytucjami w regionach niekodujących odpowiednich genów, np. w obrębie intronów lub regionów flankujących. Ponadto, warianty genetyczne określające precyzyjnie charakter funkcjonalny i strukturalny zostały również scharakteryzowane w obrębie danej populacji. Względne częstości występowania odpowiednich alleli często różnią się w zależności od regionu etnicznego. Genetycznie zaprogramowane różnice w profilu ekspresji cytochromu P450 prawdopodobnie prezentują ważną determinantę ryzyka chemicznej toksyczności. U człowieka zaobserwowano znamiennie większą aktywność 7-hydroksylazy kumaryny w porównaniu z kotem (8-krotna), psem (6-krotna) i koniem (4-krotna), podczas gdy pomiędzy innymi gatunkami nie wykazano znamiennych różnic. W laboratorium Chauret i wsp. [19] aktywność 7-hydroksylazy kumaryny w mikrosomach wątroby psa i człowieka była analogiczna do obserwacji Sharera i wsp. [26]. Pearce i wsp. [27] podali, iż wskaźnik aktywności 7-hydroksylazy kumaryny układa się w szeregu człowiek > pies > kot, co pokrywa się z innymi wynikami [19, 21]. W laboratorium Chauret i wsp. [19] u konia stwierdzono znamiennie wyższą aktywność hydroksylazy tolbutamidu niż u kota (34-krotnie), psa (10-krotnie) i człowieka (2-krotnie). U człowieka zaobserwowano 20-krotnie znamiennie wyższą aktywność tej hydroksylazy niż u kota i 6-krotnie wyższą u psa, podczas gdy nie stwierdzono znamiennych różnic między psem i kotem. Aktywność hydroksylazy tolbutamidu obserwowana w laboratorium Chauret i wsp. [19] w ludzkich mikrosomach wątrobowych była analogiczna do obserwowanej przez innych badaczy [26, 38]. W tym samym laboratorium [19] zanotowano niskie lub niewykrywalne ilości aktywności hydroksylazy tolbutamidu w inkubatach mikrosomów psa, co potwierdzono w badaniach Sharera i wsp. [26]. Nie zaobserwowano znamiennych różnic w aktywności 4 -hydroksylazy S-mefenytoiny wśród wielu badanych gatunków zwierząt. Yasumori i wsp. [39] odnotowali różnice gatunkowe w stereoselektywnym metabolizmie mefenytoiny z udziałem CYP2C. Na przykład, u człowieka jest 17-krotnie większa preferencja dla 4 -hydroksylacji S-mefenytoiny, podczas gdy u psa 3-krotnie większa preferencja dla 4 -hydroksylacji R-mefenytoiny. W laboratorium Chauret i wsp. [19] badano wyłącznie metabolizm S-mefenytoiny, a uzyskane przez nich wyniki dla psa i człowieka były zgodne z podawanymi przez Sharera i wsp. [26]. Zaobserwowano też dużą zmienność u człowieka, co obserwowano już wcześniej przez innych i zapewne wynika to z faktu, iż CYPC19 jest polimorficzny [40]. Odnośnie aktywności O-demetylazy dekstrometorfanu, zdecydowanie największą aktywność ze wszystkich gatunków zwierząt domowych zanotowano u konia. Przewyższała ona 22-krotnie poziom obserwowany u człowieka, 52-krotnie u psa i 24-krotnie u kota. Poziom aktywności tej demetylazy zmierzony w ludzkich mikrosomach Chauret i wsp. [19] był zgodny z wcześniej odnotowanymi wartościami dla tej izoformy [38]. U konia występuje znamiennie wyższa aktywność 6-hydroksylazy chlorzoksazonu w stosunku do człowieka, kota i psa, ale nie zaobserwowano znamiennych różnic tego markera CYP2E1 między psem, kotem i człowiekiem [19]. Sharer i wsp. [26] również nie znaleźli znamiennych różnic między człowiekiem i psem używając innego markera CYP2E1, tj. N-demetylazy N-nitrozodimetylaminy. W ludzkich inkubatach mikrosomalnych była 7-krotnie wyższa aktywność 6β-hydroksylazy testosteronu niż u konia, kota i psa [19]. Odmienne wyniki przedstawili Sharer i wsp. [26]. W badaniach zespołu Chauret i wsp. [19] mikrosomy psa wykazały znamiennie wyższe niż u człowieka aktywności dwóch markerów katalitycznych dla CYP3A, tj. aktywność l'-hydroksylazy midazolamu i N-demetylazy erytromycyny. Z drugiej strony, autorzy innych laboratoriów donoszą [41, 42], iż niektóre aktywności związane z CYP3A4 zarówno u psa jak i kota w porównaniu z odpowiednimi wartościami u człowieka są mniejsze, co pokrywa się z badaniami zespołu Chauret i wsp. [19]. Niwa i wsp. [43] podają, że wskaźnik tworzenia 6β-hydroksytestosteronu u psa wynosi 0.59 nmol/(mg-min), czyli więcej niż w laboratorium Chauret i wsp. [19], podczas gdy Komori i wsp. [44] uzyskali aktywność 0.24 nmol/(mg-min) w mikrosomach konia, co jest zgodne z wynikami laboratoriom Chauret [19]. Generalnie rzecz biorąc, żaden z badanych gatunków zwierząt domowych i doświadczalnych nie wykazywał wzmożonej aktywności metabolicznej dla badanych substancji, mimo iż u konia obserwowano raczej znamiennie wyższe aktywności niż u pozostałych gatunków zwierząt. U człowieka i konia zaobserwowano większą zmienność aktywności metabolicznej niż u psa i kota. Wynika to z faktu, iż badania u ludzi i konia przeprowadzono na populacji generalnej, natomiast psy i koty pochodziły z laboratoryjnych szczepów wsobnych. Z tego powodu wśród zwierząt laboratoryjnych były mniejsze różnice genetyczne. Także takie samo środowisko i dieta, eliminujące niektóre czynniki, mogły przyczynić się do odmiennej indukcji niektórych izoform cytochromu P450 [45]. Gdyby niniejsze badanie przeprowadzić na psach i kotach z populacji generalnej, można by oczekiwać większej zmienności danych metabolicznych. Piśmiennictwo 1. Newton DJ, Wang RW, Lu AYH. Cytochrome P450 inhibitors: evaluation of specificities in the in vitro metabolism of therapeutic agents by human liver microsomes. Drug Metab Dispos 1995; 23:

6 2. Sharer JE i wsp. Comparisons of phase I and phase II in vitro hepatic enzyme activities of human, dog, rhesus monkey, and cynomolgus monkey. Drug Metab Dispos 1995; 23: Nakamura A i wsp. Purification and characterization of a dog cytochrome P450 isozyme belonging to the CYP2D subfamily and development of its antipeptide antibody. Drug Metab Dispos 1995; 23: Uchida T i wsp. Isolation of cdnas coding for three different forms of liver microsomal cytochrome P-450 from polychlorinated biphenyl-treated beagle dogs. Mol Pharmacol 1990; 38: Shiraga i wsp. Isolation and characterization of four cytochromes P450 isozymes from untreated and phenobarbital-treated beagle dogs. Biol Pharm Bull 1994; 17: Lamba JK i wsp. Genetic contribution to variable human CYP3A-mediated metabolism. Adv Drug Deliv Rev 2002; 54: Yeary RA, Gerken D. Hepatic drug metabolism in vitro in the horse. Biochem Pharmacol 1971; 20: Martmez-Zedillo G i wsp. Cytochrome P-450 and parathion metabolism in the fetal and adult gonads of the horse. Life Sci 1979; 25: Komori M i wsp. Purification and characterization of a form of P450 from horse liver microsomes. J Biochem 1993; 114: Pearce R, Greenway D, Parkinson A. Species differences and interindividual variation in liver microsomal cytochrome P450 2A enzymes: effects on coumarin, dicumarol, and testosterone oxidation. Arch Biochem Biophys 1992; 298: Miyazawa M, Sugie A, Shimada T. Roles of human CY- P2A6 and 2B6 and rat CYP2C11 and 2B1 in the 10- hydroxylation of (-)-verbenone by liver microsomes. Drug Metab Dispos 2003; 31: Voorman RL i wsp. Metabolism of delavirdine, a human immunodeficiency virus type-1 reverse transcriptase inhibitor, by microsomal cytochrome P450 in humans, rats, and other species: probable involvement of CYP2D6 and CYP3A. Drug Metab Dispos 1998; 26: Miyazawa M, Shindo M, Shimada T. Roles of cytochrome P450 3A enzymes in the 2-hydroxylation of 1,4- cineole, a monoterpene cyclic ether, by rat and human liver microsomes. Xenobiotica 2001; 31: Guengerich FP. Characterization of human cytochrome P450 enzymes. FASEB J 1992; 6: Wrighton SA i wsp. In vitro methods for assessing human hepatic drug metabolism: their use in drug development. Drug Metab Rev 1993; 25: Dogra SC, Whitelaw ML, May BK. Transcriptional activation of cytochrome P450 genes by different classes of chemical inducers. Clin Exp Pharmacol Physiol 1998; 25: Pelkonen O, Raunio H. Metabolic activation of toxins: Tissue-specific expression and metabolism in target organs. Environ Health Perspect 1997; 105(suppl.4): Rendic S, Di-Carlo FJ. Human cytochrome P450 enzymes: A status report summarizing their reactions, substrates, inducers, and inhibitors. Drug Metab Rev 1997; 29: Chauret N i wsp. In vitro comparison of cytochrome P450-mediated metabolic activities in human, dog, cat, and horse. Drug Metab Dispos 1997; 25: Omiecinski CJ, Remmel RP, Hosagrahara VP. Concise review of the cytochrome P450s and their roles in toxicology. Toxicol Sci 1999; 48: Bogaards JJ i wsp. Determining the best animal model for human cytochrome P450 activities: a comparison of mouse, rat, rabbit, dog, micropig, monkey and man. Xenobiotica 2000; 30: Gaikovitch EA i wsp. Polymorphisms of drug-metabolizing enzymes CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP1A1, NAT2 and of P-glycoprotein in a Russian population. Eur J Clin Pharmacol 2003; 59: Guengerich FP. Comparisons of catalytic selectivity of cytochrome P450 subfamily enzymes from different species. Chem Biol Interact 1997; 106: Snawder JE, Lipscomb JC. Interindividual variance of cytochrome P450 forms in human hepatic microsomes: correlation of individual forms with xenobiotic metabolism and implications in risk assessment. Regul Toxicol Pharmacol 2000; 32: Yamazaki H i wsp. Inter-individual variation of cytochrome P4502J2 expression and catalytic activities in liver microsomes from Japanese and Caucasian populations. Xenobiotica 2006; 36: Sharer JE i wsp. Comparisons of phase I and phase II in vitro hepatic enzyme activities of human, dog, rhesus monkey, and cynomolgus monkey. Drug Metab Dispos 1995; 23: Pearce R, Greenway D, Parkinson A. Species differences and interindividual variation in liver microsomal cytochrome P450 2A enzymes: effects on coumarin, dicumarol, and testosterone oxidation. Arch Biochem Biophys 1992; 298: Tomlinson ES i wsp. Dexamethasone metabolism in vitro: species differences. J Steroid Biochem Mol Biol 1997; 62: Zhang L i wsp. Species difference in stereoselective involvement of CYP3A in the mono-n-dealkylation of disopyramide. Xenobiotica 2001; 31: Remmel RP i wsp. Studies on the metabolism of the novel, selective cyclooxygenase-2 inhibitor indomethacin phenethylamide in rat, mouse, and human liver microsomes: identification of active metabolites. Drug Metab Dispos 2004; 32: Anzenbacher P i wsp. Presence and activity of cytochrome P450 isoforms in minipig liver microsomes. Comparison with human liver samples. Drug Metab Dispos 1998; 26: Gut I i wsp. Metabolism of new-generation taxanes in human, pig, minipig and rat liver microsomes. Xenobiotica 2006; 36: Eagling VA, Tjia JF, Back DJ. Differential selectivity of cytochrome P450 inhibitors against probe substrates in human and rat liver microsomes. Br J Clin Pharmacol 1998; 45: Vaclavikova R i wsp. Different in vitro metabolism of paclitaxel and docetaxel in humans, rats, pigs, and minipigs. Drug Metab Dispos 2004; 32:

7 35. Yang TJ i wsp. Inhibitory monoclonal antibodies to human cytochrome P450 1A2: analysis of phenacetin O- deethylation in human liver. Pharmacogenetics 1998; 8: Hewitt NJ, Lecluyse EL, Ferguson SS. Induction of hepatic cytochrome P450 enzymes: methods, mechanisms, recommendations, and in vitro-in vivo correlations. Xenobiotica 2007; 37: Walsky RL, Boldt SE. In vitro cytochrome P450 inhibition and induction. Curr Drug Metab 2008; 9: Rodrigues AD. Prioritization of clinical drug interaction studies using in vitro cytochrome P450 data: proposed refinement and expansion of the rank order approach. Drug Metab Lett 2007; 1: Yasumori T i wsp. Species differences in stereoselective metabolism of mephenytoin by cyto chrome P450 (CYP2C and CYP3A). J Pharmacol Exp The. 1993; 264: Wrighton SA i wsp. In vitro methods for assessing human hepatic drug metabolism: their use in drug development. Drug Metab Rev 1993; 25: Eberhart DC i wsp. Species differences in the toxicity and cytochrome P450 IIIA-dependent metabolism of digitoxin. Mol Pharmacol 1991; 40: Shimada T i wsp. Cytochrome P450-dependent drug oxidation activities in liver microsomes of various animal species including rats, guinea pigs, dogs, monkeys, and humans. Arch Toxicol 1997; 71: Niwa T i wsp. Species and sex differences of testosterone and nifedipine oxidation in liver microsomes of rat, dog and monkey. Xenobiotica 1995; 25: Komori M i wsp. Purification and characterization of a form of P450 from horse liver microsomes. J Biochem 1993; 114: Nelson DR. Cytochrome P450 nomenclature, Methods Mol Biol 2006; 320: Michalets EL. Update: clinically significant cytochrome P450 drug interactions. Pharmacotherapy. 1998; 18: Tredger JM, Stoll S. Cytochromes P450 their impact on drug treatment. Hospital Pharm. 2002; 9: data otrzymania pracy: r. data akceptacji do druku: r. Adres do korespondencji: dr hab. Andrzej Plewka Zakład Proteomiki, Śląski Uniwersytet Medyczny Sosnowiec, ul. Ostrogórska 30 telefon: aplewka@sum.edu.pl