Farmaceutyczny. Przegląd Naukowy. Scientific Review in Pharmacy. lat. Cena 24,50 zł

Transkrypt

1 Miesięcznik copyright 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN Farmaceutyczny Cena 24,50 zł Przegląd Naukowy IC Value - Current 4,55 MNiSW 4 ROK VII (XI) Nr 4/2010 (63) Scientific Review in Pharmacy Proleki w terapii nowotworów. Część I. Proleki, a celowany transport aktywny Czy istnieje możliwość wskazania modelu zwierzęcego dla porównania jego aktywności metabolicznej z aktywnością ludzkiego cytochromu P450 w badaniach in vivo lub in vitro? Część I oczekiwania Wyciąg z dziurawca w leczeniu depresji mechanizmy działania przeciwdepresyjnego, działania niepożądane i interakcje Polimorfizm IL-2 T-330G u pacjentów ze schizofrenią paranoidalną0 Zastosowanie techniki RFLP w diagnostyce molekularnej 21 Przemiany galaktozoaminoglikanów w przebiegu leczonej tiamazolem choroby Gravesa-Basedowa ISSN lat Znaczenie netropsyny i distamycyny w poszukiwaniu nowych związków przeciwnowotworowych 1

2

3 Redaktor Naczelny / Editor-in-Chief: Prof. dr hab. Krystyna Olczyk Adres redakcji / Editorial Adress: ul. Jedności 8, Sosnowiec, Polska / Poland Tel , Fax kolegium.redakcyjne@kwiecinski.pl Konsultacyjna Rada Naukowa / Scientific Board Przewodniczący / Head: Prof. dr hab. Krystyna Olczyk - Sosnowiec Członkowie / Members: Prof. dr hab. Edward Bańkowski - Białystok Prof. dr Karmela Barišić - Zagreb, Chorwacja Prof. dr hab. Jerzy Brandys - Kraków Prof. dr Vitalis Briedis - Kaunas, Litwa Prof. dr hab. Elżbieta Brzezińska - Łódź Prof. dr Benito Del Castillo Garcia - Madrid, Hiszpania Prof. dr. Lionel Buéno - Toulouse, Francja Prof. dr hab. Kazimierz Głowniak - Lublin Prof. dr hab. Edmund Grześkowiak - Poznań Prof. dr Filiz Hincal - Ankara, Turcja Prof. dr. Michael Horowitz - Adelaide, Australia Prof. dr med. Kinga Howorka - AKH, UW, Wien, Austria Sekretarz Naukowy / Scientific Board Secretary: Dr n. med. Robert D. Wojtyczka fpn@kwiecinski.pl Prof. dr hab. Renata Jachowicz - Kraków Prof. dr hab. Ewa Jagiełło-Wójtowicz - Lublin Prof. dr hab. Krzysztof Jonderko - Sosnowiec Prof. dr hab. Marcin Kamiński - Katowice Prof. dr Vesna Kuntić - Belgrade, Serbia Prof. dr hab. Jan Pachecka - Warszawa Prof. dr hab. Jerzy Pałka - Białystok Prof. dr hab. Janusz Pluta - Wrocław Prof. dr hab. Janusz Solski - Lublin Prof. dr Hiroshi Suzuki - Tokyo, Japonia Prof. dr hab. Yanusz Wegrowski - Reims, Francja Prof. dr hab. Marek Wesołowski - Gdańsk Prof. dr Mira Zečević - Belgrade, Serbia Członkowie Kolegium Redakcyjnego / Members of Editorial Board: Dr n. farm. Paweł Olczyk Dr n. biol. Małgorzata Kępa Mgr Anna Szeremeta Mgr Agnieszka Jura Półtorak Dr n. hum. Anna Kierczak Wydawca / Publisher: Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego 21 lat Adres Wydawcy / Publisher Adress: Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ul. Wiśniowa 25/2, Bielsko-Biała, Polska / Poland tel , fax Prezes / President: dr n. med. Adam Kwieciński (Ph.D. M.D.) Marketing Manager: Opracowanie graficzne / Graphics: Skład / Technical Editor: Agnieszka Romańska Robert Cyganik Jerzy Partyka agnieszka.romanska@kwiecinski.pl Nakład: do egz. / Print run: up to 7000 copies Farmaceutyczny Przegląd Naukowy jest współfinansowany przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego. Scientific Review in Pharmacy is financially supported by Ministry of Science and Higher Education. Wszystkie materiały opublikowane w piśmie objęte są ochroną Prawa autorskiego. Projekty chronione są Ustawą o Prawie autorskim i pokrewnych prawach z 1994 r. (Dz. U. Nr 24, poz. 83). Redakcja zastrzega sobie prawo dostosowania nadesłanych materiałów do potrzeb pisma. Przedruki możliwe jedynie za zgodą wydawcy. Za treść materiałów reklamowych oraz listów od czytelników redakcja nie odpowiada. All published papers in Scientific Review in Pharmacy are protected by copyright laws (according to Law Gazette NO 24, item. 83). Board of Editors reserves the rights to harmonize the papers obtained to journal rules and requirements. Reprints are allowed only after Publisher agreement. Board of Editors are not responsible for advertisements and reader letters.

4 Zdj. Zygmunt Wieczorek Szanowni Państwo, Koleżanki i Koledzy, Drodzy Czytelnicy Trochę z opóźnieniem, ale nie mniej serdecznie, witam Państwa w kolejnym, już czwartym tego roku numerze Farmaceutycznego Przeglądu Naukowego. Od razu anonsuję nadchodzące, ważne dla nas konferencyjne wydarzenie, jakim jest coroczny Kongres Europejskiego Stowarzyszenia Wydziałów Farmaceutycznych (EAFP European Association of Faculties of Pharmacy). Tym razem, miejscem Kongresu, odbywającego się zawsze w gościnnych murach co roku innego Wydziału Farmaceutycznego, będzie Katania. To jedno z największych miast Sycylii, niedaleko Taorminy, z widokiem na Etnę, gościć będzie nauczycieli akademickich i studentów europejskich Wydziałów Farmaceutycznych, praktyków szacownego zawodu farmaceuty czy przedstawicieli różnych instytucji, związanych z szeroko rozumianą farmacją. Obrady tegorocznego Kongresu dotyczyć będą jak zawsze zagadnień edukacyjnych, obejmując szkolenie przeddyplomowe, jak i podyplomowe ciągłe, specjalizacyjne czy doktoranckie. Jednak, przesłaniem Kongresu będą aspekty wielodyscyplinarnego i interdyscyplinarnego kształcenia na kierunku farmacja, promującego nowe treści programowe z zakresu chemii klinicznej, biologii klinicznej czy chemii medycznej. Poruszana będzie także problematyka farmacji szpitalnej i klinicznej, oraz rola i miejsce farmaceuty w zespole specjalistów sprawujących szeroko rozumianą opiekę medyczną nad pacjentem. Nasz nowy numer Farmaceutycznego Przeglądu Naukowego zawiera jednak przede wszystkim liczne artykuły z różnych dziedzin nauk farmaceutycznych i pokrewnych. Serdecznie polecam je Państwa uwadze. Serce rośnie, kiedy docierają do nas opinie o interesującym, szerokim profilu naukowym prac, czytanych z zainteresowaniem przez naszych adresatów. Czytamy je przede wszystkim sami i nawzajem zdobywamy cenną wiedzę. Szanowni Państwo. Proszę być z nami, pisać do Farmaceutycznego Przeglądu Naukowego i czytać to, co w Farmaceutycznym Przeglądzie Naukowym zamieszczamy. Życząc miłej i owocnej lektury, a także natchnienia w przelewaniu na klawiaturę komputera Państwa osiągnięć, po czym kierowania ich do FPN, jak zawsze serdecznie pozdrawiam Redaktor Naczelny Prof. dr hab. Krystyna Olczyk

5 Nr 4 / 2010 Spis treści Proleki w terapii nowotworów. Część I. Proleki, a celowany transport aktywny 8 Prodrugs in cancer therapy. Part I. Prodrugs, active targeting Czy istnieje możliwość wskazania modelu zwierzęcego dla porównania jego aktywności metabolicznej z aktywnością ludzkiego cytochromu P450 w badaniach in vivo lub in vitro? Część I oczekiwania 12 Is there an animal model for a human cytochrome P450 activity in in vivo and in vitro investigations? Part I hopes Wyciąg z dziurawca w leczeniu depresji mechanizmy działania przeciwdepresyjnego, działania niepożądane i interakcje0 17 St. John s Wort extract in the treatment of depression mechanisms of action, adverse effects and drug interactions Polimorfizm IL-2 T-330G u pacjentów ze schizofrenią paranoidalną0 23 T-330G IL-2 Polymorphism in patients with paranoid schizophrenia0 Zastosowanie techniki RFLP w diagnostyce molekularnej0 28 Restriction fragments length polymorphism [RFLP] analysis 0 in molecular diagnostics Przemiany galaktozoaminoglikanów 0 w przebiegu leczonej tiamazolem choroby Gravesa-Basedowa 0 32 The changes of galactosaminoglycans in the course of thiamazol treated Graves disease 0 Znaczenie netropsyny i distamycyny w poszukiwaniu nowych związków przeciwnowotworowych0 40 Importance of netropsin and distamycin in research on new anticancer agent

6

7

8 Farm Przegl Nauk, 2010,4, 8-11 Proleki w terapii nowotworów. Część I. Proleki, a celowany transport aktywny Prodrugs in cancer therapy. Part I. Prodrugs, active targeting Andrzej Stańczak, Marta Szumilak Zakład Farmacji Szpitalnej Wydziału Farmaceutycznego Uniwersytetu Medycznego w Łodzi Streszczenie Leczenie nowotworów stanowi ogromne wyzwanie współczesnej medycyny. Większość stosowanych obecnie leków przeciwnowotworowych charakteryzuje wysoka toksyczność systemowa i brak selektywności względem tkanki nowotworowej. Jednym ze sposobów zwiększania skuteczności terapii i ograniczania jej toksyczności jest projektowanie proleków. Nowoczesne proleki tzw. Tumor Activated Prodrugs projektuje się w oparciu o nieustająco rosnącą wiedzę na temat budowy i funkcji tkanki nowotworowej. Szereg jej cech np. hipoksja, obecność specyficznych antygenów bądź receptorów, czy wadliwy system naczyniowy, stanowi punkt uchwytu umożliwiający wybiórcze dostarczenie i aktywację proleku w obrębie guza. Niniejsza praca przybliża koncepcję aktywnego, celowanego transportu cząsteczek leku, opierającą się na różnicach w ekspresji specyficznych dla komórek nowotworowych antygenów, bądź receptorów nieobecnych na powierzchni komórek zdrowych. Głównym zadaniem tej strategii jest opracowanie koniugatów leku z odpowiednimi nośnikami tj. przeciwciałami monoklonalnymi lub antygenami, które umożliwiają wybiórczy transport leku do tkanki nowotworowej. Abstract Treatment of cancer is a major challenge for the contemporary medicine. Most currently used anticancer drugs are characterized by high systemic toxicity and lack of tumor selectivity. One way to increase effectiveness of treatment and reduce its toxicity is prodrug design. Advanced prodrugs so-called Tumor Activated Prodrugs are designed on the basis of ever-growing knowledge of the structure and function of tumor tissue. Several of its features such as: presence of specific antigens or receptors, vascular system failure or hypoxia can be the targets allowing the selective delivery and activation of prodrugs within the tumor. This work describes active targeting strategy which is based on differences in cell surface antigen or receptor expression between normal and tumor tissue. The aim of this strategy is to develop drug conjugates with monoclonal antibodies or receptor-affine ligands which allow selective drug transport into the tumor tissue. Key words: prodrugs, anticancer drugs, antibody-drug conjugates, ligand-drug conjugates, active targeting Słowa kluczowe: proleki, leki przeciwnowotworowe, koniugaty przeciwciało-lek, koniugaty ligand-lek, celowany transport aktywny Wprowadzenie Leczenie nowotworów stanowi niewątpliwie ogromne wyzwanie współczesnej medycyny. Większość obecnie stosowanych leków przeciwnowotworowych ma zdolność preferencyjnego zabijania szybko dzielących się komórek głównie poprzez uszkadzanie ich materiału genetycznego i zaburzenia procesów zaangażowanych w podział komórkowy. Jednakże ich potencjał terapeutyczny jest ograniczony ze względu na brak selektywności wobec komórek nowotworowych, co powoduje także zabijanie komórek prawidłowych w szybko dzielących się tkankach, takich jak szpik kostny, czy nabłonki oraz ograniczone działanie na komórki guzów litych, które zwykle przestają się intensywnie dzielić. Jednym ze sposobów zwiększania skuteczności leków przeciwnowotworowych i ograniczania ich toksyczności jest projektowanie proleków w oparciu o charakterystykę komórek zmienionych nowotworowo [1]. Termin prodrug po raz pierwszy został wprowadzony w 1958 roku przez Alberta. Określa on farmakologicznie nieaktywną chemiczną pochodną leku przejściowo poprawiającą jej właściwości fizykochemiczne, obniżającą toksyczność i podnoszącą wartość terapeutyczną [2]. Zgodnie z definicją IUPAC z 1998 roku prolekiem może być każdy środek leczniczy zawierający nietoksyczne ugrupowania ochronne, które są wprowadzone przejściowo, aby wyeliminować niepożądane właściwości związku macierzystego [3]. 8

9 copyright 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN Wiele leków przeciwnowotworowych wpisuje się w definicje proleku np. leki alkilujące, antymetabolity, kompleksy platyny i in. Klasyczny przykład stanowią kapecytabina (Xeloda), aktywowana w trzystopniowym procesie do 5-fluorouracylu [4], stosowana w monoterapii pierwszego rzutu rozsianego raka jelita grubego [5], czy furflucil (Tegafur), cytostatyk z grupy fluoropirymidyn wykorzystywany w chemioterapii nowotworów złośliwych układu pokarmowego zwłaszcza raka jelita grubego i wątroby oraz raka sutka [5]. Jednak proleki te zostały zsyntetyzowane po to, aby poprawić właściwości farmakokinetyczne macierzystych substancji czynnych poprzez zmianę ich cech fizykochemicznych np. lipofilowości i ze względu na niespecyficzną aktywację w organizmie wykazują nadal toksyczność systemową [1]. Nowoczesne proleki tzw. Tumor Activated Prodrugs są projektowane w oparciu o stale rosnącą wiedzę na temat budowy i funkcji tkanki nowotworowej. Wadliwie zbudowane naczynia krwionośne, znaczne niedotlenienie, obecność specyficznych enzymów, nadekspresja charakterstycznych antygenów, bądź receptorów na powierzchni komórek, to szereg cech tkanki nowotworowej wykorzystywanych, jako tzw. target w terapii celowanej, umożliwiający selektywne dostarczanie i aktywację leku w obrębie tkanki nowotworowej. Nowoczesny prolek to nie tylko mała cząsteczka substancji leczniczej o zmodyfikowanych właściwościach farmakokinetycznych, lecz niejednokrotnie specjalny system zapewniający jej selektywny transport do tkanki nowotworowej oraz chroniący ją przed aktywacją w obrębie układu krwionośnego [1, 4]. Koncepcja aktywnego, celowanego transportu cząsteczki leku opiera się na różnicach w budowie powierzchni komórki zdrowej i zmienionej nowotworowo. Wykorzystuje różnice ekspresji specyficznych dla komórki nowotworowej receptorów bądź antygenów nieobecnych na powierzchni komórek zdrowych [4]. Głównym zadaniem terapii celowanej jest opracowanie koniugatów aktywnego leku z odpowiednimi nośnikami, którymi mogą być zarówno przeciwciała monoklonalne rozpoznające selektywnie wybrane antygeny obecne na powierzchni komórki nowotworowej, jak i ligandy, które mają wysokie powinowactwo do receptorów komórek guza [4, 6]. Historycznie, przeciwciała były pierwszym intensywnie badanym nośnikiem w terapii celowanej nowotworów, głównie ze względu na ich wysokie powinowactwo do odpowiednich antygenów na powierzchni komórek nowotworowych. Dodatkowym czynnikiem przyspieszającym badania w tej materii było opracowanie mysich przeciwciał monoklonalnych w 1975 roku przez Milsteina i Kohlera [4]. Przeciwciała monoklonalne należą do immunoglobulin klasy IgG i są używane w lecznictwie, jako leki same w sobie [7] oraz jako nośniki substancji cytotoksycznych (koniugaty przeciwciało monoklonalne-lek) lub enzymów (ADEPT) [4, 8]. Koniugaty przeciwciało monoklonalne - lek Pierwsza generacja koniugatów przeciwciał monoklonalnych z lekami przeciwnowotworowymi okazała się nieaktywna w badaniach klinicznych mimo obiecujących wyników badań przedklinicznych [9, 10]. Wykazano, że użyte do konstruowania koniugatów leki (metotreksat, mitomycyna C, alkaloidy Vinca) charakteryzowały się zbyt niską toksycznością. W konsekwencji zarówno liczba molekuł związanych z przeciwciałem, jak i ilość antygenów na powierzchni komórki nowotworowej wiążących przeciwciała, były zbyt małe, aby leki te mogły wykazać swoją aktywność cytotoksyczną. Nie bez znaczenia była również ograniczona penetracja koniugatów do tkanki nowotworowej wynikająca ze słabego jej unaczynienia, nieefektywny proces ich internalizacji, niepełne lub przedwczesne uwolnienie leku z połączeń z przeciwciałem, które prowadziło do obniżenia wybiórczości i zwiększenia toksyczności systemowej, oraz ujawnienia się silnej odpowiedzi immunologicznej na mysie przeciwciała (human anti-mouse antibody HAMA) użyte do konstruowania tych koniugatów [6, 9, 10]. Nowoczesne koniugaty zostały opracowane na bazie związków o wyższej cytotoksyczności (kalicheamicyna, maytansinoidy, auristatyny), toksyn, radionuklidów, związanych z przeciwciałem za pośrednictwem stabilnych wiązań uwalniających substancję cytotoksyczną preferencyjnie wewnątrz komórki docelowej, co czyniło je znacznie mniej toksycznymi wobec zdrowych tkanek. Użycie humanizowanych lub chimeryzowanych przeciwciał monoklonalnych umożliwiło znaczne obniżenie odpowiedzi immunologicznej [4, 10]. Badania kliniczne prowadzono z udziałem m. in: hun901-dm1 - koniugatu DM1 (pochodna maytansinoidu) z przeciwciałem anty-cd56 w leczeniu drobnokomórkowego raka płuc [11], MLN-2704-DM1 - koniugatu DM1 z humanizowanym przeciwciałem anty-psa w leczeniu raka prostaty [9], Cantuzumab mertansine (huc242-dm1) - koniugatu DM1 z przeciwciałem huc242 anty-canag) stosowanym w leczeniu zaawansowanych guzów litych [12, 13], CMC-544 (Inotuzumab ozogamicynu) zawierającego cząsteczkę kalicheamicyny, wybiórczo wiążącego się z antygenem CD22 na powierzchni limfocytów B (białaczkowych), wykorzystywanego w leczeniu chłoniaków nieziarniczych [14], SGN-35 zbudowanego z auristatyny-e i przeciwciała anty-cd30, wykorzystywanego w leczeniu choroby Hodgkina i innych CD30 pozytywnych nowotworów hematologicznych [15], BR96-DOX będącego koniugatem doksorubicyny i chimeryzowanego przeciwciała monoklonalnego skierowanego przeciwko antygenowi Lewis-Y, znajdującemu się m. in. na powierzchni komórek raka piersi [16, 17]. Na szczególną uwagę zasługują koniugaty zaaprobowane do leczenia nowotworów ludzkich: Mylotarg, Zevalin, Bexxar [18, 19]. Mylotarg - gemtuzumab ozogamicynu składa się z rekombinowanego, humanizowanego przeciwciała monoklonalnego (gemtuzumabu) przeciwko CD33 (antygen występujący na powierzchni komórek ostrej białaczki szpikowej u 80% pacjentów) oraz ozogamicynu, antybiotyku enodiy- 9

10 Farm Przegl Nauk, 2010, 4 nowego izolowanego z Micromonospora echinospora subs. calichensis. Po przyłączeniu do CD33, gemtuzumab ozogamicynu ulega endocytozie, następnie dochodzi do uwolnienia ozogamicynu wewnątrz lizosomu i jego dyfuzja do jądra komórkowego, prowadząca do letalnych uszkodzeń DNA [19]. Wskazaniem do zastosowania Mylotargu jest pierwszy nawrót ostrej białaczki szpikowej z ekspresją CD33 u pacjentów powyżej 60 r.ż. niekwalifikujących się do konwencjonalnej chemioterapii cytotoksycznej [4, 9, 19, 20]. Zevalin i Bexxar są przykładem przeciwciał znakowanych radioizotopami. Stosuje się je w radioimmunoterapii, która wykorzystuje zdolność przeciwciał monoklonalnych do selektywnego wiązania się z antygenami na powierzchni komórek nowotworowych i w konsekwencji ich niszczenia za pomocą radioizotopu związanego z przeciwciałem. Promieniowanie emitowane przez izotop nie jest ograniczone tylko do komórki z ekspresją danego antygenu, ale obejmuje także komórki sąsiadujące, do których nie przyłączyło się przeciwciało monoklonalne. Zjawisko to nazywane jest efektem ognia krzyżowego (ang. cross-fire effect) [7, 21]. Ibritumomab tiuxetan znakowany radioizotopem [ 90 Y] (Zevalin) wiąże się specyficznie z komórkami B, w tym z komórkami nowotworowymi posiadającymi ekspresję antygenu CD20. Ibritumomab tiuxetan jest rekombinowanym mysim przeciwciałem monoklonalnym IgG1 typu kappa. Izotop itru-90 emituje cząstki beta (elektrony), zaś jego średni zakres oddziaływania wynosi około 5 mm. W rezultacie posiada on zdolność niszczenia zarówno komórek docelowych, jak i komórek z nimi sąsiadujących. Zevalin jest wskazany w leczeniu dorosłych pacjentów z oporną na leczenie CD20+ postacią grudkowego B-komórkowego chłoniaka nieziarniczego lub pacjentów z nawrotem choroby po leczeniu rituksymabem [18, 22, 23]. Preparat Zevalin został dopuszczony do obrotu na terenie Unii Europejskiej w 2004 roku [23]. Tositumomab znakowany radioizotopem [ 131 I] (Bexxar) jest mysim przeciwciałem monoklonalnym IgG 2a typu lambda swoistym dla antygenu CD20 komórek B. Jod 131 I emituje promieniowanie gamma, które może być wykorzystane zarówno do obrazowania jak i terapii nowotworów [19]. Bexxar został zaaprobowany przez FDA w 2003 roku do leczenia pacjentów z grudkowym nieziarniczym chłoniakiem CD20+ opornym na rituksymab [9, 24]. Koniugaty ligand-lek Specyficzne antygeny występujące na powierzchni komórek nowotworowych, będące podstawą terapii celowanej z użyciem przeciwciał monoklonalnych nie są jedynymi elementami struktury, które mogą być wykorzystane, jako tzw. target dla koniugatów nośnik-lek. Podobną funkcję pełnią receptory występujące na błonach komórkowych komórek nowotworowych. W literaturze opisano wiele z nich m.in. receptory selektynowe, integrynowe, receptor transferynowy, asjaloglikoproteinowy (ASGPR), GLUTs, receptor dla kwasu hialuronowego oraz receptor folianowy [4]. Transport aktywny danego leku do komórek nowotworowych opiera się na zaprojektowaniu koniugatu, w którym lek jest połączony wiązaniem kowalencyjnym z częścią transportującą-ligandem mającym wysokie powinowactwo do danego receptora na powierzchni komórki nowotworowej. Koniugat wiąże się specyficznie za pośrednictwem ligandu z receptorem, w wyniku, czego następuje endocytoza i wewnątrzkomórkowe uwolnienie właściwego leku cytotoksycznego. Ligandami mogą być zarówno związki nisko jak i wysokocząsteczkowe, np. witaminy, cukry, peptydy [4]. Kwas foliowy jest przykładem niezwykle użytecznego ligandu, często używanego w projektowaniu systemów aktywnie dostarczających chemioterapeutyki do komórek nowotworowych. Wiąże się bowiem z receptorem folianowym (FR), który ulega nadekspresji w komórkach wielu nowotworów (jajnika, mózgu, nerek, piersi, płuc itd.), przy czym proces ten wydaje się postępować wraz z progresją nowotworu. Kwas foliowy wykazuje wiele korzystnych cech takich, jak wysokie powinowactwo do receptora, niska immunogenność, niewielki rozmiar, stabilność, podatność na modyfikacje i kompatybilność z wieloma rozpuszczalnikami. Typowy koniugat zbudowany jest z kwasu pterynowego połączonego kowalencyjnie z ligandem za pośrednictwem łącznika, który pozwala uniknąć zawady przestrzennej obniżającej powinowactwo rdzenia pterynowego do receptora folianowego. Łącznikiem jest zazwyczaj peptyd zawierający kwas glutaminowy połączony z lekiem wiązaniem disiarczkowym. Niekiedy bywają nim także węglowodany, czy polimery [8, 25]. Początkowe badania nad koniugatami kwasu foliowego obejmowały łączenie go ze znakowanymi lub fluorescencyjnymi proteinami, a następnie poszerzono badania o koniugaty kwasu foliowego z radiofarmaceutykami, środkami kontrastowymi używanymi w magnetycznym rezonansie jądrowym, chemioterapeutykami niskocząsteczkowymi, oligonukleotydami, rybozymami itd. [4, 8, 25]. Ciekawym przykładem koniugatu kwasu foliowego jest niskocząsteczkowy prolek EC145 zbudowany z monohydrazydu dezacetylowinblastyny (DAVLBH) połączonego z kwasem foliowym mostkiem disiarczkowym, warunkującym uwolnienie leku z koniugatu w endosomie. Odpowiednią rozpuszczalność koniugatu w wodzie zapewniło wprowadzenie do łącznika cząsteczek argininy i kwasu asparaginowego. Obecnie prowadzone są badania kliniczne II fazy z udziałem EC145 w leczeniu pacjentów z zaawansowanymi nowotworami jajników, macicy i płuc [4, 26, 27]. Nie mniej interesujący wydaje się koniugat EC0225 zawierający dwa leki o różnym mechanizmie działania cytotoksycznego (alkaloid Vinca - hamujący mitozę w stadium metafazy, oraz mitomycynę C - lek alkilujący) połączone z jedną cząsteczką kwasu foliowego za pośrednictwem hydrofilowego łącznika peptydowego i dwóch wiązań disiarczkowych. Obiecujące wyniki badań przedklinicznych [28] doprowadziły do wprowadzenia EC0225 do badań klinicznych. Obecnie lek podlega badaniom klinicznym I fazy w grupie pacjentów z przerzutowymi i nawracającymi nowotworami FR-pozytywnymi [29]. Teoretycznie zarówno receptor jak i antygen występujące na powierzchni komórek nowotworowych stanowią idealną podstawę dla projektowania systemów wybiórczo dostarczających aktywny lek w obręb tkanki nowotworowej. W praktyce istnieje wiele ograniczeń, które znacznie upośledzają efektywny, wybiórczy transport proleków do miejsca działania. Należy pamiętać, że zarówno ligandy jak i przeciwciała nie są całkowicie specyficzne wobec komórek nowotworowych, co niesie ze sobą ryzyko oddzia- 10

11 copyright 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN ływania koniugatów także na zdrowe tkanki i możliwość pojawienia się toksyczności systemowej. Nie mniej istotny jest fakt, że ekspresja zarówno receptorów jak i antygenów na powierzchni komórek nowotworowych zachodzi w różnym stopniu. Przyczynia się to do obniżenia liczby komórek wrażliwych na dany typ terapii celowanej. Ponadto w pewnym zakresie receptory i antygeny są wydzielane do krwi i są w stanie zneutralizować proleki już w obrębie układu krążenia, przyczyniając się do znacznego obniżenia jego ilości dostarczanej do tkanki nowotworowej. Nie bez znaczenia jest także przedkliniczna ocena terapii, którą zazwyczaj prowadzi się na mysich modelach ludzkich ksenoprzeszczepów, bowiem biodystrybucja zarówno przeciwciał, jak i ligandów u myszy może znacznie odbiegać od tej jak zachodzi w organizmie ludzkim [4]. Próba pokonania tych ograniczeń wiąże się z powstaniem bardziej złożonego systemu dostarczania leków w obręb tkanki nowotworowej nosząca nazwę ADEPT, który zostanie opisany w części II. Praca finansowana przez Uniwersytet Medyczny w Łodzi w ramach prac własnych nr Piśmiennictwo 1. Denny WA. Prodrugs strategies in cancer therapy. Eur J Med Chem 2001; 36: Albert A. Chemical aspects of selective toxicity. Nature 1958; 182: IUPAC Pure & Appl. Chem., 1998; 70: Kratz F i wsp. Prodrugs strategies in anticancer chemotherapy. Chem Med Chem 2007; 3: Podlewski JK, Chwalibogowska-Podlewska A. Leki współczesnej terapii, wyd. XVII. Warszawa Jaracz S i wsp. Recent advances in tumor-targeting anticancer conjugates. Bioorg Med Chem 2005; 13: Sosińska-Mielczarek K, Jassem J. Przeciwciała monoklonalne w leczeniu nowotworów litych. Onkologia w Praktyce Klinicznej 2005; 1: Avendano C, Menendez CJ. Medicinal Chemistry of Anticancer Drugs. Elsevier B.V. Oxford Schrama D, Reisfeld RA, Becker JC. Antibody targeted drugs as cancer therapeutics. Nat Rev Drug Discov 2006; 5: Chari RVJ. Targeted delivery of chemotherapeutics: tumor-activated prodrug therapy. Adv Drug Deliv Rev 1998; 31: Fossella F i wsp. Phase II Trial of BB (hun901- DM1) given weekly for consecutive weeks every 6 weeks in patients with relapsed SCLC and CD56-positive small cell carcinoma. J Clin Oncol ASCO Annual Meeting Proceedings 2005; 23(suppl): abstract Helft PR i wsp. A Phase I Study of Cantuzumab Mertansine Administered as a Single Intravenous Infusion Once Weekly in Patients with Advanced Solid Tumors. Clin Cancer Res 2004; 10: Tolcher AW i wsp. Cantuzumab Mertansine, a Maytansinoid Immunoconjugate Directed to the CanAg Antigen: A Phase I, Pharmacokinetic, and Biologic correlative Study. J Clin Oncol 2003; 21: DiJoseph JF i wsp. CMC-544 (inotuzumab ozogamicin): A CD22-targeted immunoconjugate of calicheamicin. Hematology Meeting Reports 2008; 5: Oflazoglu E i wsp. Combination of the anti-cd33- auristatin-e antibody-drug conjugate (SGN-35) with chemotherapy improves antitumor activity in Hodgkin lymphoma. Br J Haematol 2008; 142: Saleh MN i wsp. Phase I Trial of the Anti-Lewis Y Drug Immunoconjugate BR96-Doxorubicin In Patients With Lewis Y-Expressing Epithelial Tumors. J Clin Oncol 2000; 18: Tolcher WA i wsp. Randomized Phase II Study of BR96 -Doxorubicin Conjugate in Patients With Metastatic Breast Cancer. J Clin Oncol 1999; 17: Sharkey RM, Goldenberg DM. Use of antibodies and immunoconjugates for the therapy of more accessible cancers. Adv Drug Deliv Rev 2008; 60: Brunton LL, Lazo JS, Parker KL. Goodman&Gilman s The Pharmacological Basis of Therapeutics. Mc Graw- Hill. USA Van der Velden VHJ, Van Dongen JJM. Effectivenes of gemtuzumab ozogamicin (Mylotarg) treatment: cellular and systemic determinants. EJHP Science 2006; 6: Mazur G i wsp. Nowe kierunki leczenia chłoniaków nieziarniczych. Postępy Hig Med Dosw 2006; 60: Europejskie Publiczne Sprawozdanie Oceniające (EPAR) Zevalin. EMEA/H/C/ Vose JM. Bexxar : Novel Radioimmunotherapy for the Treatment of Low-Grade and transformed Low-Grade Non-Hodgkin s Lymphoma. The Oncologist 2004; 9: Leamon ChP, Reddy JA. Folate targeted chemotherapy. Adv Drug Deliv Rev 2004; 56: Reddy JA i wsp. Preclinical Evaluation of EC145, a Folate-Vinca Alkaloid Conjugate. Cancer Res 2007; 67: (stan na ) 28. Leamon CP i wsp. Preclinical antitumor activity of a novel folate-targeted dual drug conjugate. Mol Pharm 2007; 4: (stan na ) data otrzymania pracy: r. data akceptacji do druku: r. Adres do korespondencji: Andrzej Stańczak Zakład Farmacji Szpitalnej Wydziału Farmaceutycznego UM w Łodzi, ul. Muszyńskiego 1, Łódź; tel ; andrzej.stanczak@umed.lodz.pl 11

12 Farm Przegl Nauk, 2010,4, Czy istnieje możliwość wskazania modelu zwierzęcego dla porównania jego aktywności metabolicznej z aktywnością ludzkiego cytochromu P450 w badaniach in vivo lub in vitro? Część I oczekiwania Is there an animal model for a human cytochrome P450 activity in in vivo and in vitro investigations? Part I hopes Andrzej Plewka Zakład Proteomiki, Śląski Uniwersytet Medyczny Streszczenie Cytochromy P450 to hemoproteiny grające kluczową rolę w bioaktywacji i biotransformacji szerokiej gamy substancji ksenobiotycznych. Cytochromy te zostały opisanie w bardzo wielu organizmach, wliczając w to bakterie, grzyby, rośliny i kręgowce, w tym ssaki. Porównanie międzygatunkowe, które jak się wydaje jest niezbędne, musi zostać przeprowadzone ze względu na dwa powody. Po pierwsze, w organizmie ludzkim między osobnikami występują różnice indywidualne pomiędzy izoformami CYP, jako fenotypowa konsekwencja polimorfizmu genetycznego. Po drugie, jeśli nawet podział CYP na podrodziny opiera się na sekwencji aminokwasowej, to wysokie podobieństwo w tej sekwencji nie pociąga za sobą podobnej aktywności enzymatycznej izoform cytochromu P450. Ponadto, różne CYP mogą katalizować takie same reakcje. Określono aktywności enzymów różnych zwierząt, wykorzystując w tym celu takie substraty jak, 7-etoksyrezorufina, kumaryna, diklofenak, S-mefenytoina, bufuralol, chlorzoksazon, testosteron czy kwas laurynowego. Wymienione substraty są dobrze poznanymi markerami substratowymi dla ludzkiego CYP450. Wykorzystywano do tego wątrobowe mikrosomy szczura, myszy, królika, psa, świnki morskiej, małpy, kota, konia i człowieka. Abstract Cytochromes P450 represent haemoproteins of key importance for bioactivation and biotransformation of a broad range xenobiotic substances. The cytochromes were described in very many species, including bacteria, fungi, plants and vertebrates, including mammals. The interspecific comparison seems indispensable for two reasons. First, human individuals differ between each other in CYP isoforms, as a phenotypic consequence of the genetic polymorphism. Second, even if division of CYP into subfamilies reflects amino acid sequences, a high similarity of the sequence is not equivalent to similar enzymatic activity of the cytochrome P450 isoforms. Moreover, various CYP may catalyze the same reactions. Activities of the enzymes were defined in various animals, using substrates such as 7-ethoxyresorufin, coumarin, diclophenac, S-mephenytoin, bufuralol, chlorzoxazone, testosterone or lauric acid. The substrates represent well recognized substrate markers of human CYP450. For the tests hepatic microsomes of rat, mouse, rabbit, dog, guinea pig, monkey, cat, horse and humans were used. Key words: animals species, human, enzyme activities, kinetic parameters, inhibition, cytochrome P450, CYP Słowa kluczowe: gatunek zwierząt, człowiek, aktywność enzymatyczna, parametry kinetyczne, inhibicja, cytochrom P450, CYP Metabolizm ksenobiotyków u zwierząt i człowieka Cytochromy P450 to hemoproteiny odgrywające kluczową rolę w bioaktywacji i biotransformacji szerokiej gamy substancji ksenobiotycznych. Białka te są kodowane przez dużą nadrodzinę genów. Określenie cytochrom P450 jest konsekwencją obserwacji, w której zredukowana forma tych białek tworzy związki kompleksowe z tlenkiem węgla, i które w tzw. widmie różnicowym wykazują maksimum absorbancji przy 450 nm. Białka P450 należą do grupy białek hemo-siarkowych i zostały opisanie w bardzo wielu organizmach, wliczając w to bakterie, grzyby, rośliny i kręgowce, w tym ssaki [1, 2]. W tkankach i narządach ssaków, cytochromy P450 są zlokalizowane głównie w siateczce śródplazmatycznej gładkiej komórek i są całkowicie odmienne 12

13 copyright 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN od białek cytochromowych odpowiedzialnych za mitochondrialny transport elektronów. Jest oczywiste, że enzymy cytochromu P450 grają ogromnie ważną rolę w metabolizmie ksenobiotyków. W charakteryzowaniu cytochromów P450 poczyniony został ogromny postęp, z uwzględnieniem ich związku w toksykologii człowieka. Dalszy rozwój wraz z korzystaniem z postępu biochemicznego i klinicznego, powiązanego z analizą molekularno-genetyczną i użyciem modeli transgenicznych, powoduje powiększanie naszej wiedzy na tym polu. Ważnym celem tych badań jest identyfikacja kluczowych czynników ryzyka, które dyktują toksykologiczną odpowiedź na ekspozycję na czynniki chemiczne. Faza I biotransformacji, związana z cytochromem P450, odgrywa znaczącą rolę w metabolizmie związków egzogennych, takich jak leki. Wiedza na temat biotransformacji nowych leków u różnych gatunków zwierząt doświadczalnych cieszy się w dalszym ciągu dużym zainteresowaniem. Obecnie coraz bardziej skupia się ona na rozwoju środków terapeutycznych dla zwierząt domowych takich, jak koń, pies czy kot, co automatycznie wskazuje na potrzebę zrozumienia, jak te zwierzęta metabolizują ksenobiotyki. Jednakże środki niezbędne do badania metabolizmu in vivo u tak dużych zwierząt, jak koń nie są przydatne na wczesnych etapach badań nad lekami. Z tego względu użycie technik in vitro może być użyteczne w celu określenia ważnych szlaków metabolicznych. Ludzkie izoformy cytochromu P450 zostały zbadane i scharakteryzowane w wyniku wieloletnich badań [3-6], a używając metod immunochemicznych [7, 8] wykazano, że CYP 1A2, 2A6, 2C9, 2D6, 3A4 i 2E1 stanowią większość z izoform cytochromu P450 występującego w wątrobie. Ponadto wykazano, że pewne substancje są metabolizowane tylko przez jeden określony izoenzym P450 lub izoformy ściśle z nim powiązane [4, 9-13]. Może to być między innymi przydatne przy fenotypowaniu frakcji mikrosomalnych uzyskanych z ludzkiej wątroby [4]. Na przykład, metody enzymatyczne, w których oceniano aktywności O-deetylazy fenacetyny lub N3-demetylazy kaffeiny wykazały, że są one specyficzne dla CYP 1A1/1A2, aktywność hydroksylazy tolbutamidu dla CYP2C9, aktywność 4 -hydroksylazy S-mefenytoiny dla CYP2C19, aktywność 7-hydroksylazy kumaryny dla CYP2A6, aktywność O-demetylazy dekstrometorfanu dla CYP2D6 a aktywność 6β-hydroksylazy testosteronu dla CYP3A4. Wykazano również, że niektóre substancje chemiczne mogą hamować w ściśle określony sposób w warunkach in vitro aktywność pewnych reakcji enzymatycznych związanych z ludzkim cytochromem P450 [4, 14-19]. Na przykład, furafilina jest selektywnym inhibitorem dla CYP1A2, sulfafenazol dla CYP2C9, tranylcypromina lub S-mefenytoina dla CYP2C19, 8-metoksypsoralen dla CYP2A6, chinidyna dla CYP2D6, dietyloditiokarbaminian dla CYP2E1 a troleandomycyna dla ludzkiego CYP3A4. Biorąc pod uwagę fakt, że wiodące prace na ten temat były wykonane w drugiej połowie lat dziewięćdziesiątych i na przełomie lat dziewięćdziesiątych i dwudziestych ubiegłego wieku, w tym opracowaniu w wielu wypadkach autor będzie powoływał się na te starsze prace, jako wiodące i szczególnie ważne. W założeniu tego artykułu jest bowiem przedstawienie pewnych istotnych faktów w powiązaniu z rysem historycznym, odnoszącym się do gromadzenia danych związanych z problemem zawartym w tytule tego opracowania. Cytochromy P450 Obecnie prawdopodobnie ponad 6500 izoform cytochromu P450 zostało scharakteryzowanych u wielu różnych gatunków, zarówno w świecie eukariota jak i prokariota. Wystandaryzowana nomenklatura, bazująca początkowo na podobieństwach w sekwencji aminokwasowej, została zaadoptowana tak, aby klasyfikować poszczególne cytochromy P450 w osobne rodziny i podrodziny. Białka P450 wykazujące co najmniej 40% podobieństwa w sekwencji aminokwasowej są zaliczane do jednej rodziny, a białka wykazujące ponad 55% podobieństwo w sekwencji aminokwasowej są przypisywane do podrodzin danej rodziny [1, 20]. U człowieka stwierdzono obecność 18 rodzin i co najmniej 43 podrodziny. Dotychczas opisano sekwencję 57 izoform cytochromu P450. Chociaż katalog cytochromów P450 jest na bieżąco aktualizowany, obecna nomenklatura była odnowiona ostatnio w 2007 roku. Ze względu na dynamikę zmian w tym zagadnieniu, najnowsze informację dostępne są na stronach internetowych. Rodziny takie początkowo oznaczano rzymskimi cyframi (CYP I, CYP II; skrót CYP pochodzi od terminu cytochrom P450 ), jednak obecnie preferuje się cyfry arabskie, pisane tuż po rdzeniu CYP. Podrodziny oznacza się dużymi literami A, B, C itd. Specyficzne izoformy molekularne w ramach tej samej podrodziny są numerowane kolejno: 1, 2, 3 itd.; np. P450 1A1, 1A2 (CYP1A1, CYP1A2). Cytochromy P450 metabolizujące ksenobiotyki tworzą cztery rodziny. Białka te są podstawowymi enzymami uwikłanymi w biotransformację leków oraz innych obcych związków chemicznych. Natomiast uważa się, że jedynie trzy główne grupy izoform cytochromu P450, tj. CYP1, CYP2 i CYP3 uważane są obecnie jako odpowiedzialne za metabolizm leków. Około 70% wątrobowego cytochromu P450 u człowieka składa się na izoformy CYP1A2, 2A6, 2B6, 2C, 2D6, 2E1 i 3A. Spośród nich CYP3A (CYP3A4 i 3A5) i CYP2C (CYP2C8, 2C9, 2C18 i 2C19) mają najbardziej liczne podrodziny, stanowiąc odpowiednio 30 i 20% puli cytochromu P450. Rodzina CYP1 Rodzina CYP1 zawiera 3 podrodziny, w tym ważne CYP1A oraz CYP1B [1]. Izoenzymy podrodziny CYP1A, tj. CYP1A l i CYP1A2 zostały dobrze przebadane i scharakteryzowane. Historycznie są one związane z receptorem węglowodorów arylowych (aromatycznych), a geny tych białek są przez nie indukowane [21, 22]. Izoenzymy CY- P1A aktywują kilka prokancerogenów. Zalicza się do nich benzo(a)piren i inne policykliczne węglowodory aromatyczne (dla CYP1A1) oraz aminy aromatyczne, takie jak 2-acetyloaminofluoren, aminy heterocykliczne i aflatoksynę Bl (dla CYP1A2) [23, 24]. CYP1A1 ulega ekspresji w wielu tkankach, ale typowo pojawia tylko po indukcji TCDD lub przez inne ligandy receptora Ah. W przeciwieństwie do niego, CYP1A2 ekspresji ulega głównie w wątrobie na znacząco wysokim poziomie konstytutywnym i jest wyraźnie 13

14 Farm Przegl Nauk, 2010, 4 indukowany przez kaskadę receptora Ah [21, 22]. Teofilinia, kaffeina i fenacetyna są przydatnymi substratami w badaniach in vivo do oceny stanu aktywności CYP1A u ludzi [25]. Furafilina jest wysoce specyficznym inhibitorem izoenzymu CYP1A2 [23]. CYP1B1 to nieco później opisane białko rodziny CYP1. Izoenzym CYP1B1 ulega konstytutywnej ekspresji w większości tkanek, ale może być również indukowany przez kaskadę receptora Ah. CYP1B1 jest związany z metabolizmem endogennych estrogenów, w takim samym stopniu jak w czasie biotransformacji amin heterocyklicznych znajdujących się w mięsie grillowanym na węglu drzewnym [26]. Rodzina CYP2 Rodzina CYP2 jest największą i najbardziej zróżnicowaną z rodzin cytochromów P450, zawierającą 13 podrodzin, wliczając w to CYP2A, CYP2B, CYP2C, CYP2D oraz CY- P2E [20]. Krótką charakterystyka poszczególnych podrodzin rodziny CYP2 jest przedstawiona poniżej. CYP2A Podrodzina CYP2A składa się z co najmniej 10 różnych białek, występujących u różnych gatunków zwierząt [27, 28]. Na przykład CYP2A1, CYP2A2 oraz CYP2A3 występują u szczurów a CYP2A6 oraz CYP2A7 ulegają ekspresji u ludzi. CYP2A6 ujawnia swoją aktywność w reakcji z kilkoma substratami kancerogennymi, wliczając w to aflatoksynę Bl, N-nitrodietyloaminę oraz 4-(trietylnitrozoamino)- l-(3-piridylo)-l-butanon (NNK, specyficzną nitrozoaminę występującą w tytoniu) [29]. Białka rodziny CYP2A ekspresji ulegają przede wszystkim w wątrobie. CYP2A6 jest indukowany przez barbiturany. 7-Hydroksylacja kumaryny jest rutynowo wykorzystywaną reakcją dla pomiaru aktywności CYP2A6 [28]. CYP2B Podrodzina CYP2B jest złożona z około 20 odrębnych cytochromów, zidentyfikowanych u kilku różnych gatunków zwierząt. CYP2B1 oraz CYP2B2 są głównymi białkami podrodziny, a występują przede wszystkim u szczurów, podczas gdy CYP2B6 ulega ekspresji na niskim poziomie w wątrobie ludzkiej [30]. U gryzoni izoenzymy z tej podrodziny są zazwyczaj indukowalne przez fenobarbital i inne barbiturany i ulegają inhibicji po traktowaniu metyraponem. Białka z podrodziny CYP2B są związane z metabolizmem różnorodnych ksenobiotyków i farmaceutyków, wliczając w to pochodne amfetaminy i benzodiazepiny [24, 31]. CYP2B6 wydaje się bioaktywować 6-aminochryzen oraz leki przeciwnowotworowe takie jak cyklofosfamid i izofosfamid [32]. Pentoksyrezorufina i benzyloksyrezorufina są często używane jako substraty dla oceny aktywności CYP2B in vitro [39]. CYP2C Ta podrodzina u ludzi składa się z CYP2C8, CYP2C9, CYP2C18 oraz CYP2C19, chociaż aż 40 różnych izoform cytochromu P450 z tej podrodziny zostało zidentyfikowanych u kilku różnych gatunków wliczając w to szczury, króliki, myszy, małpy, kozy, świnie i psy. CYP2C9 obejmuje 17-20% całkowitej zawartości cytochromu P450 w ludzkiej wątrobie. Enzymy podrodziny CYP2C są odpowiedzialne za metabolizm bardzo szerokiego wachlarza substancji, między innymi S-mefenytoiny, fenytoiny, tolbutamidu, S-warfaryny i niesteroidowych leków przeciwzapalnych [33, 34]. Fenytoina, mefenytoina oraz tolbutamid są powszechnie używane jako substraty w badaniach in vitro dla pomiaru aktywności CYP2C. Rifampicyna wydaje się być silnym induktorem izoform podrodziny CYP2C. Żadne z powszechnie znanych substancji toksycznych nie zostały zidentyfikowane jako substraty dla tych cytochromów P450. CYP2D Do tej pory zidentyfikowano ponad 20 różnych cytochromów z podrodziny CYP2D w obrębie wielu gatunków. O ile, aż pięć różnych białek z podrodziny CYP2D ulega ekspresji u szczurów, to u ludzi ekspresji ulega tylko jedna główna izoforma w postaci CYP2D6. Ludzkie geny dla CYP2D7 i CYP2D8 zostały zidentyfikowane w DNA, ale nie wydaje się żeby ulegały ekspresji w postaci białek. CYP2D6 stanowi tylko 2% wszystkich izoform cytochromu P450 w wątrobie ludzkiej. Izoenzym ten nie wydaje się być indukowalny, natomiast ulega ekspresji konstytutywnej i przez cały czas utrzymuje aktywność, metabolizując szereg różnych substancji farmaceutycznych zawierających atomy azotu, między innymi sparteinę, debrisoquinę, dekstrometorfan i kodeinę. Dekstrometorfan jest używany jako substrat dla pomiaru in vitro aktywności CYP2D6 i jako narzędzie do fenotypowania osobników. Do kilku z ważniejszych klinicznie inhibitorów CYP2D6 należą chinidyna, chinina i paroksetyna. NNK wydaje się być ksenobiotykiem będąc równocześnie substratem dla CYP2D6 [29, 35]. CYP2E CYP2E1 jest najważniejszym białkiem podrodziny CYP2E, chociaż CYP2E2 został również zidentyfikowany u królików. CYP2E1 stanowi 7% całkowitej zawartości P450 w ludzkiej wątrobie, jakkolwiek jego ekspresja została również ujawniona w innych tkankach. CYP2E1 jest odpowiedzialny za metabolizm i potencjalną bioaktywację szeregu niskocząsteczkowych farmaceutyków i innych ksenobiotyków, wliczając w to acetaminofen, etanol, izoniazyd, anestetyki halogenowe, aceton czy benzen [36, 53]. Chlorzoksazon i p-nitrofenol są rutynowo używane jako substraty dla pomiaru aktywności CYP2E1, jakkolwiek chlorzoksazon może być również metabolizowany przez CYP1A2. Izoenzym jest indukowany przez etanol, aceton, izoniazyd oraz przez głodzenie zwierząt [37]. Inhibicja CYP2E1 jest obserwowana przy traktowaniu dietyloditiokarbaminianem, izotiocyjankami i 4-metylopirazolem [24, 37]. Rodzina CYP3 Rodzina CYP3 zawiera tylko jedną i odpowiada za metabolizm około 50% obecnie używanych środków farmaceutycznych. Około 25 różnych białek podrodziny CYP3A 14

15 copyright 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN zostało zidentyfikowanych u wielu gatunków zwierząt, wliczając w to ludzi, króliki, makaki, chomiki, szczury, myszy czy psy [20]. CYP3A Podrodzina CYP3A stanowi 30-40% całkowitej zawartości P450 w ludzkiej wątrobie [24]. Do głównych ludzkich cytochromów podrodziny CYP3A należą CYP3A4, CY- P3A5 oraz CYP3A7. CYP3A4 i CYP3A5 ulegają ekspresji w wątrobie i w błonie śluzowej jelit [24]. CYP3A5 jest polimorficznym białkiem i ulega ekspresji w wątrobie u około 30% ludzi oraz u około 70% w jelicie. CYP3A7 jest głównie płodową formą CYP3A, jakkolwiek znane są przypadki, że występuje w wątrobie dorosłych osobników. Enzymy podrodziny CYP3A są indukowane przez rifampicynę i barbiturany a w mniejszym stopniu przez karbamazepinę, fenytoinę i deksametazon [38]. Ta podrodzina enzymów jest odpowiedzialna za metabolizm dużej i różnorodnej grupy substratów. 6β Hydroksylacja nifedypiny, midazolamu i testosteronu są często wykorzystywane do pomiaru aktywności CYP3A [39, 40]. Te enzymy ulegają inhibicji pod wpływem szerokiej gamy substancji, między innymi triacetyloleandomycyny (TAO), antybiotyków makrolidowych, przeciwgrzybiczych leków azolowych i kompetycyjnie przez szereg substratów dla CYP3A [38, 39]. Wśród wielu substratów dla CYP3A, kilka jest ważnych toksykologicznie, w tym aflatoksyna Bl, 1 nitropiren i 6-aminochryzen [24]. Rodzina CYP4 Rodzina CYP4 składa się z 11 podrodzin (CYP4A- CYP4M) [41], gdzie podrodzina CYP4A została zbadana najdokładniej. CYP4A Podrodzina CYP4A nie stanowi istotnego punktu zainteresowania w toksykologii, ponieważ jest indukowana przez różne substancje chemiczne, wliczając w to substancje używane jako utwardzacze, herbicydy i rozpuszczalniki, np. di- (2-etyloheksylo)ftalany, kwas 2,4-dichlorofenoksyacetylowy i trichloroetylen [41]. Chociaż endogenne substancje takie jak kwasy tłuszczowe ulegają oksydacji przez izoenzymy CYP4A, żadne powszechnie znane środowiskowe substancje chemiczne nie wydają się być metabolizowane tą drogą. Podrodzina CYP4A związana jest z metabolizmem kwasu arachidonowego prowadząc do produkcji ważnych fizjologicznie jego pochodnych związanych z mechanizmami takimi, jak przepływ krwi w nerce czy w mózgu [41]. Indukcja CYP4A jest nadzorowana przez PPAR-α (receptory proliferacji peroksysomalnej-α), jądrowy receptor, który należy do nadrodziny receptorów zawierającej również receptory dla estrogenów, hormonów tarczycy, glukokortykoidów, kwasu retinowego i tzw. receptorów sierocych [41, 42]. Te receptory ulegają dimeryzacji z receptorem X kwasu retinowego i aktywują ekspresję genu w odpowiadającym mu loci genowym [43]. Ekspozycja substancji powodujących proliferację peroksysomów wydaje się być związana z rozwojem hepatokancerogenów u gryzoni, jednakże nie u ludzi [43]. Piśmiennictwo 1. Nebert DW, McKinnon RA. Cytochrome P450: evolution and functional diversity. Prog Liver Dis 1994; 12: Guengerich FP. Characterization of human cytochrome P450 enzymes. FASEB J 1992; 6: Nelson DR. Cytochrome P450 nomenclature, Methods Mol Biol 2006; 320: Wrighton SA i wsp. In vitro methods for assessing human hepatic drug metabolism: their use in drug development. Drug Metab Rev 1993; 25: Venkatakrishnan K, Von Moltke LL, Greenblatt DJ. Human drug metabolism and the cytochromes P450: application and relevance of in vitro models. J Clin Pharmacol 2001; 41: Ponsoda X i wsp. Drug metabolism by cultured human hepatocytes: how far are we from the in vivo reality? Altern Lab Anim 2004; 32: Shimada T i wsp. Interindividual variations in human liver cytochrome P-450 enzymes involved in the oxidation of drugs, carcinogens and toxic chemicals: studies with liver microsomes of 30 Japanese and 30 Caucasians. J. Pharmacol Exp Ther 1994; 270: Jeurissen SM i wsp. Human cytochrome p450 enzymes of importance for the bioactivation of methyleugenol to the proximate carcinogen 1 -hydroxymethyleugenol. Chem Res Toxicol 2006; 19: Wrighton SA, VandenBranden M, Ring BJ. The human drug metabolizing cytochromes P450. J Pharmacokinet Biopharm 1996; 24: Tang C, Lin JH, Lu AY. Metabolism-based drug-drug interactions: what determines individual variability in cytochrome P450 induction? Drug Metab Dispos 2005; 33: Wrighton SA i wsp. Isolation and characterization of human liver cytochrome P450 2C19: correlation between 2C19 and S-mephenytoin 4 -hydroxylation. Arch Biochem Biophys 1993; 306: Johnson EF, Stout CD. Structural diversity of human xenobiotic-metabolizing cytochrome P450 monooxygenases. Biochem Biophys Res Commun 2005; 338: Yamazaki H i wsp. Requirements for cytochrome b5 in the oxidation of 7-ethoxycoumarin, chlorzoxazone, aniline, and N-nitrosodimethylamine by recombinant cytochrome P450 2E1 and by human liver microsomes. Biochem Pharmacol 1996; 52: Anzenbacher P, Anzenbacherová E. Cytochromes P450 and metabolism of xenobiotics. J Cell Mol Life Sci 2001; 58: Lewis DF, Lake BG, Dickins M. Substrates of human cytochromes P450 from families CYP1 and CYP2: analysis of enzyme selectivity and metabolism. Drug Metabol Drug Interact 2004; 20: Murray S i wsp. Inhibition of human CYP1A2 activity in vitro by methylxanthines: potent competitive inhibition by 8-phenyltheophylline. Xenobiotica 2001; 31:

16 Farm Przegl Nauk, 2010, Rodrigues AD. Prioritization of clinical drug interaction studies using in vitro cytochrome P450 data: proposed refinement and expansion of the rank order approach. Drug Metab Lett 2007; 1: Wienkers LC i wsp. Formation of (R)-8-hydroxywarfarin in human liver microsomes. A new metabolic marker for the (S)-mephenytoin hydroxylase, P4502C19. Drug Metab Dispos 1996; 24: Lasker JM i wsp. Characterization of CYP2C19 and CYP2C9 from human liver: respective roles in microsomal tolbutamide, S-mephenytoin, and omeprazole hydroxylations. Arch Biochem Biophys 1998; 353: Nelson DR i wsp. P450 superfamily: Update on new sequences, gene mapping, accession numbers, and nomenclature. Phar macogenetics 1996; 6: Dogra SC, Whitelaw ML, May BK. Transcriptional activation of cytochrome P450 genes by different classes of chemical inducers. Clin Exp Pharmacol Physiol 1998; 25: Gonzalez FJ, Liu SY, Yano M. Regulation of cytochrome P450 genes: Molecular mechanisms. Pharmacogenetics 1993; 3: Eaton DL i wsp. Role of cytochrome P4501A2 in chemical carcinogenesis: Implications for hu man variability in expression and enzyme activity. Pharmacogenetics 1995; 5: Rendic S, Di-Carlo FJ. Human cytochrome P450 enzymes: A status report summarizing their reactions, substrates, inducers, and inhibitors. Drug Metab Rev 1997; 29: Buters JT i wsp. Role of CYP1A2 in caffeine pharmacokinetics and metabolism: Studies using mice deficient in CYP1A2. Pharmacogenetics 1996; 6: Crofts FG i wsp. Metabolism of 2-amino-l-methyl- 6-phenylimidazo[4,5-b]pyridine (PhIP) by human cytochrome P4501B1. Carcinogenesis 1997; 18: Fernandez-Salguero P, Gonzalez FJ. The CYP2A gene sub family: Species differences, regulation, catalytic activities, and role in chem ical carcinogenesis. Pharmacogenetics 1995; 5: Lewis DF, Lake BG. Species differences in coumarin metabolism: a molecular modelling evaluation of CYP2A interactions. Xenobiotica 2002; 32: Gonzalez FJ, Gelboin HV. Role of human cytochromes P450 in the metabolic activation of chemical carcinogens and toxins. Drug Metab Rev 1994; 26: Mimura M i wsp. Characterization of cytochrome P-450 2B6 in human liver microsomes. Drug Metab Dispos 1993; 21: Hanna ICH i wsp. Expression of human cytochrome P450 2B6 in Escherichia coli: characterization of catalytic activity and expression levels in human liver. Arch Biochem Biophys 2000; 376: Code EL i wsp. Human cytochrome P4502B6: Interindividual hepatic expression, substrate specificity, and role in procarcinogen activation. Drug Metab Dispos 1997; 25: Cresteil T i wsp. Regioselective metabolism of taxoids by human CYP3A4 and 2C8: structure-activity relationship. Drug Metab Dispos 2002; 30: Redman AR. Implications of cytochrome P450 2C9 polymorphism on warfarin metabolism and dosing. Pharmacotherapy 2001; 21: Zhou SF. Polymorphism of human cytochrome P450 2D6 and its clinical significance: Part I. Clin Pharmacokinet 2009; 48: Zhang J i wsp. Modulation of acetaminophen-induced hepatotoxicity by the xenobiotic receptor CAR. Science 2002; 298: Lieber CS. Cytochrome P-4502E1: Its physiological and pathological role. Physiol. Rev. 1997; 77: Thummel KE, Wilkinson GR. In vitro and in vivo drug interactions involving human CYP3A. Annu Rev Pharmacol Toxicol 1998; 38: Wilkinson GR. Cytochrome P450 3A (CYP3A) metabolism: Prediction of in vivo activity in humans. J Pharmacokinet Biopharm 1996; 24: Kharasch ED i wsp. Role of hepatic and intestinal cytochrome P450 3A and 2B6 in the metabolism, disposition, and miotic effects of methadone. Clin Pharmacol Ther 2004; 76: Simpson AE. The cytochrome P450 4 (CYP4) family. Gen Phar macol 1997; 28: Klaunig JE i wsp. PPARalpha agonist-induced rodent tumors: modes of action and human relevance. Crit Rev Toxicol 2003; 33: Palmer CN i wsp. Peroxisome proliferator activated receptor-alpha expression in hu man liver. Mol. Pharmacol. 1998; 53: data otrzymania pracy: r. data akceptacji do druku: r. Adres do korespondencji: dr hab. Andrzej Plewka Zakład Proteomiki, Śląski Uniwersytet Medyczny, Sosnowiec, ul. Ostrogórska 30 tel.: aplewka@sum.edu.pl 16