Odczynniki. dzieląc zmierzoną absorbancję przez współczynnik absorbancji dla 1µg p-nitrofenolu

Transkrypt

1 Wyznaczanie stałej Michaelisa (Km), Vmax oraz określanie typu inhibicji aktywności fosfatazy kwaśnej (EC fosfohydrolaza monoestrów ortofosforanowych kwaśne optimum). Cel ćwiczenia Celem ćwiczenia jest poznanie kinetyki enzymów (v 0, stałej Km i Vmax) a także określenie typu inhibicji fosfatazy kwaśnej przy zastosowaniu molibdenianu amonu. Wprowadzenie Głównym zadaniem enzymów jest zwiększanie szybkości katalizowanych reakcji, tak aby mogły sprostać potrzebom metabolizmu. W 1913 roku, na podstawie badań przebiegu reakcji enzymatycznych, Leonor Michaelis i Maud Menten sformułowali teorię działania enzymów i ich kinetyki (Michaelis i Menten 1913). Zgodnie z tą teorią enzym (E) tworzy z substratem (S) kompleks enzym-substrat (ES), który następnie może dysocjować w reakcji odwrotnej do enzymu i substratu lub przekształcać się w produkt i wolny enzym. k 1 k 2 E + S S E + P k -1 k 1, k -1, k 2 stałe szybkości odpowiednich reakcji. Przy niewielkim stężeniu substratu, tylko niektóre cząsteczki enzymu tworzą kompleks z substratem, reakcja przebiega z szybkością v 0. Przy wysokich stężeniach substratu wszystkie cząsteczki enzymu połączone są z substratem i reakcja biegnie z szybkością maksymalną (Vmax). Tę zależność ujmuje równanie Michaelisa-Menten, a obrazuje ją hiperbola (Rys.1). gdzie: Vmax szybkość maksymalna reakcji osiągana w warunkach całkowitego wysycenia enzymu substratem, [S] stężenie substratu, v 0 szybkość początkowa reakcji mierzona zanim więcej niż 10% substratu ulegnie przekształceniu w produkt. Rys.1. Wykres Michaelisa-Menten. Zależność szybkości początkowej reakcji od stężenia substratu. Km stała Michaelisa- Menten, Vmax szybkość maksymalna reakcji. Pomiar szybkości reakcji enzymatycznej w czasie zerowym (v 0) ogranicza wpływ na przebieg badanej reakcji takich zjawisk jak reakcja odwrotna, hamowanie enzymu przez produkt, stopniowa inaktywacja enzymu. Szybkość reakcji enzymatycznej zależy od stężenia kompleksu ES oraz szybkości jego powstawania i rozpadu. Miarą stabilności kompleksu ES jest stała Michaelisa (Km). 1

2 Km jest stałą, której wartość odpowiada takiemu stężeniu substratu, przy którym początkowa szybkość reakcji (v 0 ) stanowi połowę szybkości maksymalnej (Vmax). Km wyraża się w jednostkach stężenia substratu, a jej wartość, dla większości enzymów, zawiera się w granicach M i nie zależy od stężenia enzymu. Dane kinetyczne reakcji takie jak Vmax i Km charakteryzują aktywność metaboliczną enzymów. Wartość Km oznacza takie stężenie substratu, w którym połowa miejsc aktywnych w cząsteczkach enzymu jest zajęta, czyli stanowi informację, jakie stężenie substratu jest konieczne do osiągnięcia znaczącego przyspieszenia reakcji. Ponadto, jeśli stała szybkości rozpadu kompleksu ES do substratu i wolnego enzymu (k -1 ) jest znacznie wyższa od stałej rozpadu tego kompleksu do produktu i enzymu (k 2 ), to wówczas wartość Km jest miarą siły wiązania substratu przez enzym. Wysoka wartość Km wskazuje na słabe powinowactwo enzymu do substratu, natomiast niska wartość Km świadczy o silnym wiązaniu substratu przez enzym. Wyniki doświadczeń wskazują, że dla wielu enzymów wartość Km odpowiada stężeniu substratu in vivo. Aby dokładnie wyznaczyć wartość Km oraz Vmax, należy oprzeć się na równaniu Lineweavera-Burka, które jest odwrotnością równania Michaelisa-Menten, a jego wykresem jest linia prosta (rys. 2). Rys.2. Wykres Lineweavera Burka. Zależność odwrotności szybkości reakcji enzymatycznej (1/v 0 ) od odwrotności stężenia substratu (1/[S]). 1/Vmax odwrotność szybkości maksymalnej, -1/Km odwrotność stałej Michaelisa-Menten. Km można wyznaczyć doświadczalnie wykonując serię reakcji, w których początkową szybkość reakcji wyznacza się przy zastosowaniu różnych stężeń substratu, ale przy stałym stężeniu enzymu. Aktywność katalityczna enzymów może zostać zmniejszona poprzez przyłączenie swoiście działających cząsteczek inhibitora. Typ inhibicji można określić przeprowadzając reakcje enzymatyczne przy różnych stężeniach substratu oraz inhibitora i wyznaczając wartość Km i Vmax, a następnie przedstawiając graficznie wyniki analiz. W tym celu na ćwiczeniach studenci przeprowadzą dwie serie reakcji. Jedną bez udziału inhibitora przy wzrastającym stężeniu substratu i stałym stężeniu enzymu oraz drugą stosując identyczne jak w serii pierwszej stężenia substratu i enzymu oraz stałe stężenie inhibitora. Następnie, na podstawie uzyskanych wyników dokonają obliczeń, sporządzą wykresy i określą rodzaj inhibicji. 2

3 Rys. 3. Wykres Lineweavera Burka dla reakcji enzymatycznej zachodzącej w obecności inhibitora kom petycyjnego. Szczegółowe informacje dotyczące stosowanej na ćwiczeniach metody oznaczania aktywności fosfatazy kwaśnej oraz wiadomości dotyczące typów inhibicji zostały zawarte opisie ćwiczenia: Czynniki warunkujące aktywność enzymów na przykładzie fosfatazy kwaśnej (EC fosfohydrolaza monoestrów ortofosforanowych kwaśne optimum). Odczynniki 1. Wyciąg enzymu z siewek pszenżyta 2. 0,0075 M 4-nitrofenylofosforan disodowy (substrat) 3. 0,1 M bufor octanowy ph 5,5 4. 0,1 M NaOH M molibdenian amonu Wykonanie (zajęcia 3 - godzinne) Studenci wykonują oznaczenia w zespołach 2-osobowych. Studenci przynoszą na ćwiczenia papier milimetrowy, linijkę i ołówek. 1. Wyznaczanie wartości stałej Km dla fosfatazy kwaśnej i oznaczanie aktywności enzymu. Wykonanie Do 6 ponumerowanych probówek (próby właściwe) odmierzyć kolejno po 0,05; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 i 0,5 ml p-nitrofenylofosforanu (2), dodać po 0,75 ml buforu octanowego ph 5,5 (3) i uzupełnić wodą do objętości 2,0 ml, a do siódmej probówki (próba kontrolna) odmierzyć 0,75 ml buforu octanowego ph 5,5 (3) i 1,25 ml wody destylowanej. Wszystkie probówki wstawić do łaźni wodnej o temp. 30 C i po ok. 5 min. (preinkubacja), nie wyjmując prób z łaźni, dodać kolejno do każdej probówki po 0,5 ml wyciągu enzymu, wymieszać, zanotować czas i prowadzić reakcję jeszcze przez 15 min. Po 15 min przerwać działanie enzymu, dodając kolejno do probówek po 2,5 ml 0,1 M NaOH (4), wymieszać i zmierzyć absorbancję prób właściwych przy długości fali 420 nm w fotometrze ustawionym na zero wobec próby kontrolnej. Obliczenia 1. Obliczyć szybkość reakcji katalizowanej przez fosfatazę kwaśną (v o ) zgodnie z równaniem: dzieląc zmierzoną absorbancję przez współczynnik absorbancji dla 1µg p-nitrofenolu 3

4 (p-np) równy 0,002 oraz masę cząsteczkową p-nitrofenolu równą 139 oraz czas reakcji wynoszący 15 min.. 2. Dla poszczególnych prób obliczyć 1/[S] w mol/l, pamiętając, że substrat wyjściowy został rozcieńczony w mieszaninie inkubacyjnej do 2,5 ml, tj. oraz odwrotność szybkości początkowej1/v 0 (w μmolach produktu). 3. Sporządzić wykres zależności początkowej szybkości reakcji od stężenia substratu, odkładając na osi rzędnych 1/v 0 (μmole p-nitrofenolu), a na osi odciętych 1/[S] (mole/l 4-nitrofenylofosforanu). Obliczyć wartość Km oraz Vmax. 4. Uwzględniając wynik absorbancji dla najwyższego stężenia substratu oraz rozcieńczenie enzymu obliczyć aktywność fosfatazy kwaśnej wyrażając ją w µmolach p-nitrofenolu na 1 g liści pszenżyta na 1 min. czasu reakcji. Do zaliczenia studenci podają prowadzącemu ćwiczenia wartość absorbancji dla reakcji przy najwyższym stężeniu substratu oraz wartość Km. Przykładowe obliczenia ml substratu Substrat [S] (mol/l) 1/[S] Szybkość reakcji = ilość wytworzonego produktu A 420 μg produktu = A 420 / /v 0 v 0 = μg prod./139/15 min (μmole produktu/min) 0,1 0, , ,049 20,4 Zajęcia 4-godzinne Studenci wyznaczają stałą Km oraz określają typ inhibicji fosfatazy kwaśnej, a oznaczenia wykonują w zespołach 2-osobowych. Studenci przynoszą na ćwiczenia papier milimetrowy, linijkę i ołówek. 5. Wyznaczanie Km, Vmax oraz określanie typu inhibicji fosfatazy kwaśnej przez molibdenian amonu. Wykonanie A. Wyznaczanie stałej Km w reakcji bez inhibitora. Do 6 ponumerowanych probówek (próby właściwe) odmierzyć kolejno 0,05; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 i 0,5 ml p-nitrofenylofosforanu (2), dodać do każdej po 0,75 ml buforu octanowego ph 5,5 (3) i uzupełnić wodą do objętości 2,0 ml, a do siódmej probówki (próba kontrolna) odmierzyć 0,75 ml buforu octanowego ph 5,5 (3) i 1,25 ml wody destylowanej. Wszystkie probówki wstawić do łaźni wodnej o temp. 30 C i po ok. 5 min (preinkubacja) nie wyjmując prób z łaźni, dodać kolejno do każdej probówki po 0,5 ml wyciągu enzymu, wymieszać, zanotować czas, i prowadzić reakcję jeszcze przez 15 min. Po 15 min przerwać działanie enzymu, dodając kolejno do probówek po 2,5 ml 0,1M NaOH (4), wymieszać i oznaczyć absorbancję przy długości fali 420 nm w fotometrze ustawionym na zero wobec próby kontrolnej. B. Wyznaczanie stałej Km dla fosfatazy kwaśnej katalizującej reakcję w obecności inhibitora. Do sześciu ponumerowanych probówek (próby właściwe) odmierzyć po 0,5 ml ekstraktu enzymatycznego (1), po 0,05 ml molibdenianu amonu (5) oraz po 0,75 ml buforu octanowego o ph 5,5 (3). Do siódmej probówki (próba kontrolna) odmierzyć 0,5 ml ekstraktu enzymatycznego, 0,05 ml molibdenianu (5), 0,75 ml buforu octanowego o ph 5,5 (3) oraz 1,2 ml wody destylowanej. Wszystkie probówki wstawić do łaźni wodnej o temperaturze 30 o C na okres 10 min. Po dziesięciu minutach preinkubacji enzymu z inhibitorem, nie 4

5 wyjmując prób z łaźni, do prób właściwych dodać kolejno 1,15 ml, 1,10 ml, 1,0 ml, 0,9 ml 0,8 ml i 0,7 ml wody destylowanej oraz odmierzyć kolejno 0,05; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 i 0,5 ml p-nitrofenylofosforanu (2), wymieszać i prowadzić reakcję enzymatyczną przez 15min. Po 15 min. inkubacji przerwać działanie enzymu, dodając kolejno do wszystkich probówek po 2,5 ml 0,1M NaOH (4), wymieszać i oznaczyć absorbancję przy długości fali 420 nm w fotometrze ustawionym na zero wobec próby kontrolnej. Opracowanie wyników 1. Obliczyć szybkość reakcji katalizowanej przez fosfatazę kwaśną (v o ) w zależności od ph, zgodnie z równaniem: dzieląc zmierzoną absorbancję przez współczynnik absorbancji dla 1µg p-nitrofenolu (p- NP) równy 0,002 i masę cząsteczkową p-nitrofenolu równą 139 oraz czas reakcji wynoszący 15 min. 2. Dla poszczególnych stężeń substratu obliczyć 1/[S] w mol 1 l 1, pamiętając, że substrat wyjściowy został rozcieńczony w mieszaninie inkubacyjnej do 2,5 ml, tj. oraz odwrotność szybkości 1/v 0 dla reakcji bez inhibitora oraz 1/v 0i dla reakcji z inhibitorem (w μmolach produktu). 3. Sporządzić wykres zależności szybkości reakcji bez inhibitora i z inhibitorem od stężenia substratu, odkładając na osi rzędnych odpowiednio 1/v 0 i 1/v i (μmole p-nitrofenolu), a na osi odciętych 1/[S] (mole p-nitrofenylofosforanu). 4. Przedłużyć linię do przecięcia się z ujemną częścią osi OX, z otrzymanej wartości 1/K m oraz -1/Kmi obliczyć wartość stałej Km dla reakcji niehamowanej i reakcji hamowanej. 5. Obliczyć wartość Vmax dla reakcji niehamowanej i reakcji hamowanej wiedząc, że punkt przecięcia prostej z osią OY wyznacza wartość 1/Vmax. 6. Szybkość maksymalną dla reakcji bez inhibitora można także obliczyć ze wzoru: V max = v 0 (1+ K m /[S]) mając wyznaczoną wartość K m i aktualne stężenie substratu w próbie oraz dla reakcji w obecności inhibitora ze wzoru: V max,i = v i (1+ K m,i /[S]) mając wyznaczoną wartość K mi i aktualne stężenie substratu w próbie. 7. Ustalić typ inhibicji analizując otrzymane wykresy oraz porównując uzyskane wartości Vmax i Km dla reakcji bez inhibitora z wartościami uzyskanymi dla reakcji w obecności inhibitora. 8. Korzystając z wartości absorbancji dla reakcji prowadzonej przy najwyższym stężeniu substratu, a następnie uwzględniając rozcieńczenia enzymu obliczyć aktywność fosfatazy kwaśnej wyrażając ją w µmolach p-nitrofenolu na 1 g liści pszenżyta na 1 min. czasu reakcji. Do zaliczenia studenci podają prowadzącemu ćwiczenia wartość absorbancji dla najwyższego stężenia substratu oraz wartości Km i Vmax. Przykładowe obliczenia Reakcja bez inhibitora Substrat (ml) [S] (mol/l) 1/[S] Szybkość reakcji = ilość wytworzonego produktu A 420 A 420 /0.002 = µg produktu Szybkość reakcji bez inhibitora (v 0)= μg prod./139/15 (µmole produktu/min) 0,1 0, , ,049 20,4 Reakcja w obecności inhibitora 1/v 0 5

6 Substrat [S] 1/[S] Szybkość reakcji z inhibitorem = ilość produktu wytworzonego (ml) (mol/l) w obecności inhibitora A 420 A 420 /0.002 = Szybkość reakcji z 1/v 0i μg produktu inhibitorem v 0i = μg prod./139/15 (µmole produktu/min) 0,1 0, , ,015 66,6 Pytania 1. Co to jest stała Michaelisa-Menten i o czym świadczy jej wartość? 2. Podaj równanie Lineweavera-Burka i omów wyznaczanie stałej K m dla fosfatazy kwaśnej w oparciu o postępowanie Lineweavera-Burka. 3. Omów krótko działanie inhibitora kompetycyjnego oraz metodę określania typu inhibicji aktywności fosfatazy kwaśnej. 4. Oblicz wartość V max wiedząc, że: Km=1,19 x 10-3 M; v 0 = 0,85 µmola [S] = 7,5 x 10-3 M 5. Po przeprowadzeniu reakcji enzymatycznej bez inhibitora oraz z inhibitorem uzyskano następujące wyniki: Km= 2,6 x 10-4 M, Vmax = 1,25 x 10-5 M, a dla reakcji z inhibitorem Kmi = 4,2 x 10-3 M oraz Vmax = 1,25 x 10-5 M. Na jaki typ inhibicji wskazują dane doświadczalne. 6. Sporządzono 500 ml 0,4 % roztworu p-nitorofenylofosforanu disodowego. Oblicz stężenie molowe tego roztworu. Literatura 1. Berg, J.M., Tymoczko J.L., Stryer L. Biochemia. Wydawnictwo Naukowe PWN Witwicki J. Ardelt W. Elementy enzymologii PWN Michaelis L., Menten L. M Die kinetic der invertinwirkung. Biochemistry Zeitung 49, Lineweaver H., Burk D.J The determination of enzyme disotiation constans. J. Am. Chem. Soc. 56, Senna R., Simonin V., Silva-Neto M.A.C., Fialho E Induction of acid phosphatase activity during germination of maize (Zea mays) seeds. Plant Phys. Bioch. 44, Van Etten R.L., Waymack D.M., Rehkop D.M Transition metal ion inhibition of enzyme-catalyzed phosphate ester displacement reactions. J.Am. Chem. Soc. 96,