Farmaceutyczny. Scientific Review in Pharmacy. Cena 24,50 zł ISSN ISSN Miesięcznik. ROK VI (X) Nr 4/2009 (51)

Transkrypt

1 copyright 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN Farmaceutyczny Cena 24,50 zł PISMO POD PATRONATEM Przegląd WYDZIAŁU FARMACEUTYCZNEGO ŚLĄSKIEGO UNIWERSYTETU Naukowy MEDYCZNEGO W KATOWICACH IC Value - Current 3.66 MNiSW 4 ROK VI (X) Nr 4/2009 (51) Miesięcznik Scientific Review in Pharmacy Wpływ wybranych induktorów na aktywność N-demetylazy 4-aminopiryny w wątrobie szczura w różnych fazach życia pozapłodowego Wpływ wybranych induktorów na aktywność hydroksylazy aniliny w wątrobie szczura w różnych fazach życia pozapłodowego Leczenie zespołu stopy cukrzycowej w warunkach praktyki lekarza rodzinnego Badanie zależności pomiędzy strukturą i działaniem pochodnych benzodiazepiny. Część II. Pochodne benzodiazepiny o działaniu przeciwarytmicznym Bezpieczeństwo stosowania fluorochinolonów w aspekcie niepożądanych reakcji fotouczulających Zmiany w aktywności kinazy kompleksu dehydrogenazy pirogronianowej (PDH) w wątrobach szczurów pod wpływem wysokiej i niskiej dawki kwasu kawowego (cz. II)0 Profil i koszt antybiotykoterapii u dzieci 0 na podstawie ordynacji lekarskiej w wybranym zakładzie opieki zdrowotnej województwa śląskiego0 ISSN ISSN MIGRENA DIAGNOSTYKA I WSPÓŁCZESNA FARMAKOTERAPIA0 1

2

3 Farmaceutyczny PISMO POD PATRONATEM WYDZIAŁU FARMACEUTYCZNEGO ŚLĄSKIEGO UNIWERSYTETU MEDYCZNEGO W KATOWICACH Miesięcznik Przegląd Naukowy Scientific Review in Pharmacy Index Copernicus 3,66 MNiSW 4 Redaktor Naczelny: Prof. dr hab. Krystyna Olczyk Adres redakcji: Sosnowiec, ul. Jedności 8 Tel Fax. 032/ Mail: fpn@kwiecinski.pl Konsultacyjna Rada Naukowa Przewodniczący: Prof. dr hab. Krystyna Olczyk - Sosnowiec Członkowie: Prof. dr hab. Edward Bańkowski - Białystok Prof. dr hab. Jerzy Brandys - Kraków Prof. dr hab. Elżbieta Brzezińska - Łódź Prof. dr. Lionel Buéno - Toulouse, Francja Prof. dr hab. Kazimierz Głowniak - Lublin Prof. dr hab. Edmund Grześkowiak - Poznań Prof. dr. Michael Horowitz - Adelaide, Australia Prof. dr med. Kinga Howorka - AKH, UW, Wien, Austria Prof. dr hab. Renata Jachowicz - Kraków Prof. dr hab. Ewa Jagiełło-Wójtowicz - Lublin Prof. dr hab. Krzysztof Jonderko - Sosnowiec Prof. dr hab. Marcin Kamiński - Katowice Prof. dr hab. Jan Pachecka - Warszawa Prof. dr hab. Jerzy Pałka - Białystok Prof. dr hab. Janusz Pluta - Wrocław Prof. dr hab. Janusz Solski - Lublin Prof. dr hab. Yanusz Wegrowski - Reims, Francja Prof. dr hab. Marek Wesołowski - Gdańsk Sekretarz Naukowy: Dr n. med. Robert D. Wojtyczka Członkowie Kolegium Redakcyjnego: Dr n. farm. Paweł Olczyk Dr n. biol. Małgorzata Kępa Mgr Anna Szeremeta Mgr Agnieszka Jura Półtorak Wydawca: Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego Adres Wydawcy: Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ul. Wiśniowa 25/2, Bielsko-Biała tel. (0-33) fax (0-33) Prezes: dr n. med. Adam Kwieciński Marketing Manager: Agnieszka Romańska agnieszka.romanska@kwiecinski.pl Opracowanie graficzne: Robert Cyganik Skład: Jerzy Partyka Nakład: do egz. Wszystkie materiały opublikowane w piśmie objęte są ochroną Prawa autorskiego. Projekty chronione są Ustawą o Prawie autorskim i pokrewnych prawach z 1994 r. (Dz. U. Nr 24, poz. 83). Redakcja zastrzega sobie prawo dostosowania nadesłanych materiałów do potrzeb pisma. Przedruki możliwe jedynie za zgodą wydawcy. Za treść materiałów reklamowych oraz listów od czytelników redakcja nie odpowiada. Spis treści Wpływ wybranych induktorów na aktywność N-demetylazy 4-aminopiryny w wątrobie szczura w różnych fazach życia pozapłodowego 5 Wpływ wybranych induktorów na aktywność hydroksylazy aniliny w wątrobie szczura w różnych fazach życia pozapłodowego 12 Leczenie zespołu stopy cukrzycowej w warunkach praktyki lekarza rodzinnego 18 Badanie zależności pomiędzy strukturą i działaniem pochodnych benzodiazepiny. Część II. Pochodne benzodiazepiny o działaniu przeciwarytmicznym0 22 Bezpieczeństwo stosowania fluorochinolonów w aspekcie niepożądanych reakcji fotouczulających0 33 Zmiany w aktywności kinazy kompleksu dehydrogenazy pirogronianowej (PDH) w wątrobach szczurów pod wpływem wysokiej i niskiej dawki kwasu kawowego (cz. II)0 39 Profil i koszt antybiotykoterapii u dzieci 0 na podstawie ordynacji lekarskiej w wybranym zakładzie opieki zdrowotnej województwa śląskiego0 45 MIGRENA DIAGNOSTYKA I WSPÓŁCZESNA FARMAKOTERAPIA0 51

4 Szanowni Państwo, Koleżanki i Koledzy, Drodzy Czytelnicy Witam serdecznie na łamach czwartego w tym roku zeszytu Farmaceutycznego Przeglądu Naukowego i niezwłocznie zapraszam do jego lektury. Nie ustaję także w zachętach do nadsyłania prac, by czasopismo nasze stało się najbardziej aktualną platformą wymiany wiedzy na temat postępów nauk farmaceutycznych i pokrewnych nauk biomedycznych. Wprawdzie, jak zwykle brakuje nam wszystkim czasu, ale i tak dbać musimy o stałe dokumentowanie naszych naukowych osiągnięć, a Farmaceutyczny Przegląd Naukowy stwarza doskonałą ku temu sposobność. Z drugiej strony, powoli dobiega końca okres realizowania planowych, tak absorbujących, semestralnych zajęć dydaktycznych, choć w dalszym ciągu pracy na naszych Wydziałach nie brakuje, bo to bowiem czas obron prac magisterskich, lecz także i tych prac doktorskich, które należy uwieńczyć obroną przed końcem roku akademickiego. Miejsce zajęć dydaktycznych powoli zastępować zaczynają konferencje i zjazdy naukowe, których kulminacja przypadnie jak zawsze we wrześniu. A tuż przed nami, zapowiedziana w poprzednim numerze, Konferencja Europejskiego Stowarzyszenia Wydziałów Farmaceutycznych (EAFP European Association of Faculties of Pharmacy), która odbywać się będzie w Oslo, w dniach czerwca. Tegoroczna Konferencja, pod nazwą New issues in postgraduate / postregistration pharmacy education, dotyczyć będzie wszystkich aspektów szkolenia podyplomowego, obejmującego szkolenia ciągłe, specjalizacyjne i studia doktoranckie. Polskę reprezentować będą przedstawiciele trzech Wydziałów Farmaceutycznych, tj. Wydziału Farmaceutycznego Collegium Medium Uniwersytetu Jagiellońskiego w Krakowie, Wydziału Farmaceutycznego Uniwersytetu Medycznego w Lublinie oraz Wydziału Farmaceutycznego Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach. Będę także uczestniczyć w tej Konferencji, a w ramach pamiątkowego upominku z Polski, wręczę Pani Profesor Karen Marie Ulshagen, Przewodniczącej Komitetu Organizacyjnego i Członkowi Komitetu Naukowego tegorocznej Konferencji, poprzedni numer naszego czasopisma, zawierający oryginalny Komunikat na temat nadchodzącego spotkania EAFP. W następnym numerze Farmaceutycznego Przeglądu Naukowego przedstawię krótką relację z Konferencji. Mam zaszczyt zawiadomić Państwa, iż skład Konsultacyjnej Rady Naukowej FPN uległ wzbogaceniu o znaczących w światowej nauce Profesorów. Do naszej Rady Naukowej zechcieli dołączyć Pani Profesor Renata Jachowicz z CMUJ w Krakowie i Pani Profesor Kinga Howorka z Wiednia (Austria), oraz Panowie Profesor Yanusz Wegrowski z Reims (Francja), Profesor Michael Horowitz z Adelajdy (Australia) oraz Profesor Lionel Buéno z Tuluzy (Francja). Szanowni Państwo, Drodzy Czytelnicy. Zapraszam serdecznie do lektury naszego bieżącego numeru Farmaceutycznego Przeglądu Naukowego. Niebawem pojawi się numer kolejny, nad zawartością którego już pracujemy. Życząc udanej, także i dla nas nauczycieli akademickich, sesji zaliczeniowo egzaminacyjnej, łączę moc serdecznych pozdrowień, Redaktor Naczelny Prof. dr hab. n. med. Krystyna Olczyk

5 Farm Przegl Nauk, 2009,4, 5-11 copyright 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN Wpływ wybranych induktorów na aktywność N-demetylazy 4-aminopiryny w wątrobie szczura w różnych fazach życia pozapłodowego Age and inductors effect on rat hepatic 4-aminopyrine N-demethylase activity Andrzej Plewka, Danuta Plewka*, Beata Jakubiec-Bartnik Zakład Proteomiki, Śląski Uniwersytet Medyczny Kierownik: Andrzej Plewka * Katedra Morfologii, Zakład Histologii, Śląski Uniwersytet Medyczny Streszczenie W dalszym ciągu powszechne zainteresowanie budzi nie tylko rozwój poszczególnych enzymów związanych z metabolizmem substancji endo- i egzogennych w okresie płodowym i początkowej fazie życia pozapłodowego, ale także ich ewolucja w zaawansowanym wieku. Celem prezentowanych badań było wykazanie, jak zmienia się profil wątrobowej aktywności N-demetylazy 4-aminopiryny w różnych fazach życia szczura i po indukcji fenobarbitalowej, β-naftoflawonowej i deksametazonowej. Badania przeprowadzono na samcach szczurzych rasy Wistar. Doświadczenie obejmowało 8 grup wiekowych, tj. szczury: 0.5-, 1-, 2-, 4-, 8-, 12-, 20- i 28 miesięczne. Aktywność właściwa N-demetylazy 4-aminopiryny rosła do 4 miesiąca życia szczurów, po czym delikatnie opadała, osiągając u zwierząt najstarszych poziom najniższy w całym badanym zakresie wieku. Fenobarbital okazał się induktorem N-demetylazy 4-aminopiryny we wszystkich grupach wiekowych, szczególnie silnym u zwierząt starych. Do 12 miesiąca życia indukcyjność omawianej demetylazy wynosiła %, ale w dwóch ostatnich grupach wiekowych osiągała 350% kontroli. β-naftoflawon był słabszym induktorem N-demetylazy 4-aminopiryny niż fenobarbital. Tym razem w początkowej fazie życia indukcyjność sięgała % kontroli, a w fazie starzenia zwierząt obserwowano wzrost indukcji do około 200% kontroli. Deksametazon również indukował aktywność N-demetylazy 4-aminopiryny w całym badanym przedziale wieku. W pierwszej fazie życia indukcja była nieco wyższa niż w serii fenobarbitalowej, ale w grupach zwierząt starszych lekko malała, osiągając wartości podobne do serii β-naftoflawonowej. Słowa kluczowe: N-demetylaza 4-aminopiryny, szczur, wątroba, wiek, indukcja Abstract Not only the development of the individual enzymes connected with the metabolism of endo- and exogenous substances during the foetal period and in the first phase of life after birth still arouse general interest but also their evolution in advanced age. The aim of the presented researches was to demonstrate how the profile of the hepatic activity of the 4-aminopyrine N-demethylase is changing in the different phases of the rat life and after phenobarbital, β-naphthoflavone and dexamethasone induction. The researches were done on male rats (breed of Wistar). The experiment concerned 8 age groups of the rats: 0.5-, 1-, 2-, 4-8-, 12-, 20- and 28 months-old. N-Demethylase 4-aminopyrine activity was increasing till fourth month of rats life, and the next successively decreas with age. The lowest level was observed at the eldest population of rats. Phenobarbital was the strong inhibitor of N-demethylase 4-aminopyrine to all groups of age, particulary to the oldest. Activity of N-demethylase 4-aminopyrine till twelfth month of life achived % comparing to control group, but in two last groups of age achived 350% comparing to control group. β-naphthoflavone was weaker inhibitor of N-demethylase 4-aminopyrine comparing to fenobarbitale. In that case activity of N-demethylase 4-aminopyrine in first fase incraes to % comparing to control group, but in older rats was observed incrase of its activity to 200% comparing to control group. Dexamethasone also inducted activity of N-demethylase 4-aminopyrine in all studied age groups. In first fase of life induction was sligthly higer comparing to fenobarbitale study, but in elder groups af rats slitghly decreased achiving valiues similar to β-naphthoflavone study. Key words: 4-aminopyrine N-demethylase, rat, liver, ageing, induction 5

6 Farm Przegl Nauk, 2009,4 Wstęp Cytochrom P450 jest główną składową układu enzymatycznego odpowiedzialnego za przemiany ksenobiotyków [1-5]. Enzymy biotransformujące podlegają ewolucji ilościowej i jakościowej w trakcie ontogenezy [6-8]. Wynika to między innymi z ewolucji genów, zmian składu frakcji lipidowej błon, a tym samym spadku jej płynności [9, 10]. Mikrosomalny transport elektronów ulega modyfikacji, a konsekwencją tego jest zmiana aktywności monooksygenaz zależnych od cytochromu P450 [11-13]. Literaturowe rozważania dotyczące roli wieku w wątrobowym metabolizmie ksenobiotyków ograniczają się zasadniczo do dwóch okresów, tj. od urodzenia do osiągnięcia dojrzałości narządowej i płciowej oraz okresu zaawansowanego starzenia się organizmu. W tym drugim przypadku początkowo zgodnie przyjęto, że zmiany w masie wątroby i przepływie krwi są głównymi powodami odpowiedzialnymi za wiekowo zależny spadek wątrobowego metabolizmu leków. Nadal jednak pozostaje niejasny związek pomiędzy wspomnianymi parametrami a wątrobowym metabolizmem leków u osobników starych, o ile taki związek istnieje [14]. Już wiele lat temu zwrócono uwagę na mechanizmy, odpowiedzialne za zależne od wieku zmiany aktywności enzymatycznych. Do czynników, mogących uzasadniać spadek zawartości i aktywności monooksygenaz zależnych od cytochromu P450 można zaliczyć: - zmniejszenie w hepatocytach powierzchni gładkiej siateczki śródplazmatycznej, - ewolucję składu lipidów lub właściwości fizykochemicznych błon, które bezpośrednio wpływają na obecne w niej enzymy, - modyfikacje potranslacyjne ograniczające tempo metabolizmu, np. reduktazy NADPH-cytochrom P450, co wyraża się zależnym od wieku gromadzeniem się uszkodzonych i katalitycznie nieaktywnych białek. Pomimo wielu badań, nadal trudno jednoznacznie zidentyfikować przemiany, jakim podlegają składniki monooksygenaz zależnych od cytochromu P450 w okresie starzenia się szczurów. Część badaczy podkreślała spadek zawartości cytochromu P450 i aktywności reduktazy współpracującej z nim, inni sugerują, że wraz z wiekiem nie występuje istotny spadek całkowitej zawartości cytochromu P450, cytochromu b 5 ani aktywności obu reduktaz współpracujących z nimi. Wykazano między innymi w tym okresie spadek hydroksylacji aniliny, ale równoczesne pewne podwyższenie O-deetylacji p-nitroanizolu. Przyczyn takich zmian specyficzności substratowej autorzy upatrują w ewolucji w proporcjach różnych izoform cytochromu P450 [11, 15, 16]. Celem pracy było zbadanie jak zmienia się konstytucyjna i indukowalna aktywność N-demetylazy 4-aminopiryny w wątrobie szczura w funkcji wieku i pod wpływem wybranych induktorów układu monooksygenaz zależnych od cytochromu P450. Szczególnie ważne było stwierdzenie czy istnieje korelacja między tą aktywnością a składem izoform cytochromu P450 w różnych fazach życia szczura po indukcji fenobarbitalowej, β-naftoflawonowej i deksametazonowej. Materiały i metody Zwierzęta Badania przeprowadzono na samcach szczurzych rasy Wistar. Zwierzęta pochodziły z hodowli Centralnej Zwierzętarni Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach-Ligocie. Serie badawcze obejmowały 8 grup wiekowych, tj. szczury: 0.5-, 1-, 2-, 4-, 8-, 12-, 20- i 28 miesięczne. Zwierzęta grupy najmłodszej przebywały cały czas z matkami. Po usamodzielnieniu się, każde zwierzę przebywało osobno w klatkach plastikowych, a hodowla była prowadzona w tym samym pomieszczeniu o ustalonej wilgotności powietrza (około 60%), temperaturze ( C) i rytmie 12-godzinowego oświetlenia (dzień-noc: ). Szczury karmiono paszą standardową (LSM), którą usuwano na 12 godzin przed zabiciem, pozostawiając wolny dostęp do wody. Szczury zabijano przez dekapitację. Natychmiast pobierano wątroby i umieszczano je w lodowatym roztworze soli fizjologicznej. Traktowanie Szczurom pierwszej serii eksperymentalnej podawano dootrzewnowo dwukrotnie fenobarbital w dawkach po 75 mg/kg masy ciała na 3- i 2 dni przed dekapitacją. Zastosowano dawkę nieco niższą od zalecanej w literaturze, bowiem wyższa dawka powodowała wzrost śmiertelności zwierząt w grupach zwierząt młodych. Wszystkie iniekcje wykonano w każdej serii doświadczalnej o godzinie Zwierzęta drugiej serii doświadczalnej otrzymywały trzykrotnie dootrzewnowo β-naftoflawon. Podawano go na 3-, 2- i 1 dzień przed zabiciem w dawkach po 40 mg/kg masy ciała zawsze o godzinie Wreszcie, zwierzęta trzeciej serii doświadczalnej otrzymywały dootrzewnowo deksametazon. Podawano go o godzinie 9 00 w postaci zawiesiny w oleju kukurydzianym również trzykrotnie na 3-, 2- i 1 dzień przed zabiciem w dawce po 20 mg/kg masy ciała. Stała godzina podawania induktora podyktowana była podatnością układu monooksygenaz zależnych od cytochromu P450 na zmiany pod wpływem rytmu okołodobowego [17, 18] Izolacja frakcji mikrosomalnej Wątrobową frakcję mikrosomalną izolowano według metody Dallnera [19]. Po kilkukrotnym przepłukaniu w roztworze soli fizjologicznej, wątroby cięto na niewielkie skrawki i rozdrabniano w homogenizatorze Pottera-Elvehjema z tłokiem teflonowym, przy 400 obrotach na minutę i czterech pełnych ruchach tłoka. Środowiskiem homogenizacyjnym był 0,25 molowy roztwór sacharozy w 10 milimolowym buforze Tris-HCl o ph=7,4. Na 1 gram tkanki dodawano 5 cm 3 tego roztworu. Ten i kolejne etapy obróbki wątroby prowadzano w temperaturze C. 6

7 copyright 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN Rycina 1. Aktywność wątrobowej N-demetylazy 4-aminopiryny wyrażonej w [nanomolach/min/mg białka] u szczurów w różnym wieku w serii kontrolnej i po indukcji Rycina 2. Aktywność wątrobowej N-demetylazy 4-aminopiryny w seriach doświadczalnych wyrażona jako procent kontroli u szczurów w różnym wieku Czyste frakcje mikrosomalne zawieszano w zbuforowanym 20% o/o roztworze glicerolu, tak aby stężenie białka było nie mniejsze niż 5 mg/cm 3. Próby te natychmiast zamrażano w temperaturze C. Oznaczanie aktywności N-demetylazy 4-aminopiryny Enzym ten z małymi modyfikacjami oznaczano według metody Orreniusa i wsp. [20]. W końcowej objętości 2 cm 3 40 milimolowego buforu Tris-HCl o ph 7.4 znajdowało się: 8 milimoli 4-aminopiryny, 1 milimol NADPH, 2.5 milimola chlorku magnezowego oraz badana zawiesina mikrosomalna. Całość inkubowano w temperaturze 37 0 C przez 20 minut, po czym reakcję zatrzymywano przez dodanie 1 cm 3 20% TCA. Po odwirowaniu wytrąconego białka pobierano 2 cm 3 supernatantu i dodawano 1 cm 3 odczynnika Nasha [21]. Całość inkubowano w temperaturze 60 0 C przez 10 minut, schładzano do temperatury pokojowej i mierzono absorpcję przy 412 nm. Ilość uwolnionego formaldehydu obliczano wykorzystując współczynnik absorpcji molowej wynoszący 8000 M -1 cm -1 [22]. Aktywność enzymu wyrażano w nanomolach uwolnionego formaldehydu na 1 minutę na 1 mg białka. Analiza statystyczna Wyniki oznaczeń biochemicznych, które przedstawiono w tym opracowaniu są średnią z pięciu niezależnych pomiarów. Istotność różnic w poszczególnych seriach, a także pomiędzy grupami wiekowymi oceniano na podstawie testu ANOVA dla p=0.05. Wyniki Aktywność demetylazy 4-amino-piryny rosła od 0,39 do 0,69 nanomoli/min/mg białka (różnica znamienna statystycznie), praktycznie liniowo do 4 miesiąca (Ryc. 1), co przekładało się na wzrost o 175%. Po tym okresie następował stosunkowo szybki spadek aktywności enzymu tak, że 7

8 Farm Przegl Nauk, 2009,4 Rycina 3. Aktywność wątrobowej N-demetylazy 4-aminopiryny wyrażonej w [nanomolach/min/nanomol P450] u szczurów w różnym wieku w serii kontrolnej i po indukcji 400 Rycina 4. Aktywność wątrobowej N-demetylazy 4-aminopiryny przeliczonej na 1 nanomol cytochromu P450 w seriach doświadczalnych wyrażonej jako procent kontroli u szczurów w różnym wieku w grupie zwierząt najstarszych była ona poniżej poziomu obserwowanego w grupie najmłodszej. Fenobarbital znacząco indukował aktywność demetylazy we wszystkich grupach wiekowych (Ryc. 1, 2). W dwóch pierwszych grupach obserwowano indukcję rzędu 150%, która w grupie 2 miesięcznej jeszcze wzrosła i stabilizowała się na wysokości około 180%, aż do 12 miesiąca życia. Pomimo ustabilizowanej indukcji, aktywność enzymu w tej serii doświadczalnej rosła od 0,88 do 1,17 nanomoli/min/mg białka. W fazie starzenia się zwierząt, indukcyjność omawianego enzymu osiągała poziom 260% i 370% odpowiednio w 20- i w 28 miesiącu życia, z czym wiązał się wzrost aktywności enzymu do 1,18 nanomola/min/mg białka. Podawanie β-naftoflawonu również indukowało omawianą demetylazę (Ryc. 1, 2). Jednak do 12 miesiąca stopień indukcji był zazwyczaj znacznie niższy niż w serii fenobarbitalowej i do 12 miesiąca nie przekraczał 140% kontroli (znamienne statystycznie zmiany w 2-, 8- i 12 miesiącu życia). Dopiero zwierzęta dwóch ostatnich grup wiekowych charakteryzowały się 200% i 270% podatnością na indukcję β-naftoflawonem z równoczesnym wzrostem aktywności do poziomu 0,86 nanomoli/min/mg białka. Również deksametazon indukował aktywność N-demetylazy 4-aminopiryny do 2 miesiąca, jednak w stopniu wyższym niż oba powyżej omawiane induktory (Ryc. 2). Rosła ona od 165% w grupie 0,5 miesięcznej do 200% w grupie 2 miesięcznej. Szczury 4 miesięczne cechowały się obniżeniem poziomu indukcji omawianego enzymu do 150%, jednak w kolejnych grupach rosła ona dalej aż do 260% w grupie najstarszej. N-Demetylaza 4-aminopiryny jest enzymem ściśle współpracującym z cytochromem P450, stąd też jej aktywność przedstawiono również w przeliczeniu na zawartość cytochromu P450 (Ryc. 3). Po przejściowym, niewielkim obniżeniu aktywności, rosła ona szybko do 4 miesiąca (wzrost od 0,41 do 1,28 nanomola/min/nanomol P450, znamienny statystycznie). Od tej chwili obserwowano obniżanie aktywności tego enzymu 8

9 copyright 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN do grupy 28 miesięcznej włącznie (spadek do wartości 0,34 nanomola/min/nanomol P450, znamienny statystycznie). Podobnie jak w przypadku aktywności właściwej, fenobarbital również indukował omawianą demetylazę przeliczoną na stężenie cytochromu P450 (Ryc. 3, 4). Wysoka indukcyjność w grupie 15 dniowej (150% kontroli, wzrost do 0,84 nanomola/min/nanomol P450, znamienny statystycznie), malała wraz z wiekiem i w trzech kolejnych grupach wiekowych były one nieznamienne statystycznie. W kolejnych trzech grupach indukcja była niewielka, chociaż znamiennie statystyczna i dopiero w grupie najstarszej osiągała poziom, przekraczający 270% kontroli. Z wyjątkiem zwierząt najmłodszych (0,5-1 miesiąc), gdzie β-naftoflawon hamował nieznamiennie statystycznie aktywność demetylazy, w pozostałych grupach zachowywał się jak induktor (Ryc. 3, 4). Indukcja N-demetylazy 4-aminopiryny wyrażona na 1 nanomol cytochromu P450 była niewielka i mieściła się w przedziale %, ale nie wszystkie wahania miały cechy znamienności statystycznej. U zwierząt najstarszych indukcja sięgała poziomu 300%. Najsilniejszym induktorem tak ujętej aktywności demetylazy 4-aminopiryny okazał się deksametazon (Ryc. 3, 4). Praktycznie we wszystkich grupach wiekowych związek ten co najmniej ją podwajał. Bardzo wysoką, % indukcję obserwowano wśród zwierząt trzech pierwszych grup wiekowych. Od 4 miesiąca życia indukcyjność obniżała się i oscylowała w granicach 200%, ale obserwowana w tej fazie życia aktywność w tej serii doświadczalnej była bardzo wysoka i wynosiła nawet 2,3 nanomola/min/nanomol P450. Ponownie ponad czterokrotną indukcję odnotowano w wątrobach zwierząt 28 miesięcznych. Dyskusja W niniejszej pracy aktywność N-demetylazy 4-aminopiryny rosła wyraźnie aż do 4 miesiąca, po czym liniowo malała, aż do późnej starości, osiągając wartości najniższe w badanym przedziale wieku. Kamataki i wsp. [23] wykazali, że wzrost omawianej aktywności trwał aż do 12 miesiąca i dopiero po tym okresie następował ponad 100% spadek. Z kolei Fujita i wsp. [24] stwierdzili, że począwszy od 3 miesiąca aż do 1. roku życia u samców nie następowała żadna istotna zmiana tej aktywności, po czym aktywność enzymu wyraźnie spadała. Podobne wyniki prezentowali Kitani [25] oraz Abraham i wsp. [26]. Premedykacja fenobarbitalowa nie zmieniała profilu zmian jakościowych aktywności N-demetylacji 4-aminopiryny do 12. miesiąca życia. Uzyskane w tej pracy wyniki dotyczące aktywności N-demetylazy nie zostały potwierdzone w kilku laboratoriach [27]. Na przykład Shapiro i wsp. [28, 29] wykazali, że fenobarbital conajmniej dwukrotnie zwiększał aktywność N-demetylazy 4-aminopiryny już u 4 miesięcznych samców szczurzych, a podobne wyniki uzyskali Kamataki i wsp. [23] dla zwierząt jeszcze młodszych. Rozbieżności takich nie stwierdza się w fazie starzenia się zwierząt. Cytowani już Abraham i wsp. [26] wykazali wyraźny wzrost omawianej aktywności po podaniu fenobarbitalu szczurom miesięcznym. Wiek zwierząt jest czynnikiem mającym bezpośredni wpływ na jakościowy i ilościowy udział poszczególnych form tej hemoproteiny w układzie oksydaz o funkcji mieszanej w błonach siateczki śródplazmatycznej. Wiadomo także, że izoformy te cechuje różna, ale nakładająca się specyficzność substratowa oraz zmienna reaktywność na fenobarbital. Zróżnicowany poziom indukcji aktywności demetylazy wynikał zapewne z różnorodności izoform cytochromu P450 [27, 30]. Wykazaliśmy w naszej pracy, że rosnąca aktywność demetylazy w tej serii badawczej pokrywała się ze wzrostem stężenia CYP2B1/2 i CYP2A1, głównych izoform biorących udział w procesach demetylacyjnych. Porównując wyniki serii β-naftoflawonowej z serią kontrolną zauważyliśmy, że β-naftoflawon był induktorem omawianej demetylazy we wszystkich badanych grupach wiekowych. Efekt indukcyjny początkowo był niewielki i dopiero u zwierząt w okresie starzenia stawał się wyraźny, co nie w pełni potwierdzają dane literaturowe. Rosenberg i wsp. [31] oraz Kamataki i wsp. [23] nie stwierdzili żadnych zmian tej aktywności po β-naftoflawonie, ale Tanaka i wsp. [32] wykazali indukcję aktywności N-demetylacji 4-aminopiryny. Z kolei Cresteil i wsp. [33] dowiedli, że ten sam induktor w grupie zwierząt 5 dniowych stymulował aktywność demetylazy, w niecałe dwa tygodnie później był inhibitorem, aby z chwilą osiągnięcia dojrzałości płciowej ponownie zamarkować lekki charakter induktorowy. Zatem nasze wyniki rozszerzają listę prac na omawiany temat, jednak nie dają przesłanek do ostatecznego rozwiązania problemu, chociaż Sun i wsp. [34] również stwierdzili, że β-naftoflawon jest słabszym induktorem niż fenobarbital. W interpretacji wyników badań nad czynnikami wywołującymi indukcję należy zachować pewną ostrożność, bowiem stymulują one często syntezę nie jednej a kilku izoform cytochromu. Na przykład podanie 3-metylocholantrenu lub β-naftoflawonu przede wszystkim wywołuje wzrost poziomu CYP1A1, ale obok tego ma miejsce indukcja CYP2A1 i 1A2. Izoformy P450 2A1 i 1A2 nie są jednak zdolne do przeprowadzenia metabolizmu substratów typowych dla CYP1A1, np. dealkilacji 7-etoksyrezorufiny czy 7-etoksykumaryny [35]. Nie należy wykluczać i takiej możliwości, że po podaniu omawianego induktora powstają pewne, niewielkie ilości jeszcze innych izoform cytochromu P450. Oceniając wpływ deksametazonu na aktywność N-demetylacyjną zauważyliśmy, że w pierwszym roku życia była ona wyższa niż w pozostałych seriach induktorowych. Dopiero w fazie starzenia indukcja deksametazonowa ustępowała pozostałym. Uzyskanych w tej pracy wyników nie można skonfrontować z żadnymi doniesieniami literaturowymi. Niepełne informacje na ten temat pochodzą z lat 80-tych [36]. Wnioski 1. Aktywność właściwa N-demetylazy 4-aminopiryny rośnie do czasu osiągnięcia dojrzałości płciowej i fizycznej szczura, po czym delikatnie opada aż do końca życia zwierzęcia. 2. Spośród badanych ksenobiotyków tylko fenobarbital i deksametazon indukowały aktywność właściwą N- demetylazy 4-aminopiryny. 9

10 Farm Przegl Nauk, 2009,4 3. Jeżeli aktywność N-demetylazy 4-aminopiryny wyrażano w nanomolach/min/nanomol P450, to efekt indukcyjny ujawniał się tylko po traktowaniu deksametazonem. Piśmiennictwo 1. Aviram M., Kent U.M., Hollenberg P.F.: Microsomal cytochromes P450 catalyze the oxidation of low density lipoprotein. Atherosclerosis 1999; 143: Brandes L.J., Queen G.M., LaBella F.S.: Potent interaction of histamine and polyamines ta microsomal cytochrome P450, nuclei, and chromatin from rat hepatocytes. J. Cell. Biochem. 1998; 69: Coutts R.T., Urichuk L.J.: Polymorphic cytochrome P450 and drugs used in psychiatry. Cell. Molec. Neurobiol. 1999; 19: Mansuy D.: Cytochromes P450 and drug toxicity. Clin. Rev. Allergy Immunol. 1995; 13: Spatzengger M., Jaeger W.: Clinical importance of hepatic cytochrome P450 in drug metabolism. Drug Metab. Rev. 1995; 27: Klinger W., Muller D., Kleeberg U., Kretzschmar M., Splinter F.-K.: The influence of essential phospholipids (EPL) on phase-i- and phase-ii-reactions and on the glutathione status in the liver of aging rats. Exp. Pathol. 1991; 41: Schmucker D.L.: Liver function and phase I drug metabolism in the elderly: a paradox. Drugs Aging 2001; 18: Vermeulen A.M., Belpaire F.M., Smet F.De, Vercruysse I., Bogaert M.G.: Aging and the pharmacokinetics and metabolism of metoprolol enantiomers in the rat. J. Gerontol. 1993; 48: B108-B Saito M., Kubota-Shirao M., Kobatake Y., Yamaguchi M.: Influence of different types and levels of dietary lipids on liver microsomal mixed function oxidase system in rats. Ann. Nutr. Metab. 1990; 34: Witkowski J.M.: Zmiany w błonie komórkowej jako składnik procesu starzenia się. Post. Biol. Kom. 1993; 20: Kitani K.: Aging and the liver: functional aspects. Archiv. Gerontol. Geriatr. 1994; 19: Sanz N., Diez-Fernandez C., Andres D., Cascales M.: Hepatotoxicity and aging: endogenous antioxidant systems in hepatocytes from 2-, 6-, 12-, 18- and 30-monthold rats following a necrogenic dose of thioacetamide. Biochim. Biophys. Acta 2002; 1587: Sanz N., Diez-Fernandez C., Alvarez A.M., Fernandez- Simon L., Cascales M.: Age-related changes on parameters of experimentally-induced liver injury and regeneration. Toxicol. Appl. Pharmacol. 1999;154: Blumsohn A., Eastell R.: Age-related factors. Osteoporosis: Etiology, Diagnosis, and Management, 2nd Edition, eds. B.L. Riggs and J. Melton III, Publ. Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1995; s Kamataki T., Maeda K., Shimada M., Kitani K., Nagai T., Kato R.: Age-related alteration in the activities of drug-metabolizing enzymes and contents of sex-specific forms of cytochrome P-450 in liver microsomes from male and female rats. J.Pharmacol. Exp. Ther. 1985; 233: Schmucker D.L., Wang R.K., Vessey D., James J., Maloney J.: Age-dependent alterations in the physicochemical properties of rat liver microsomes. Mech Ageing Dev. 1984; 27: Plewka A., Czekaj P., Kamiński M., Plewka D.: Circadian changes of cytochrome P-450-dependent monooxygenase system in the rat liver. Pol. J. Pharmacol. Pharm. 1992; 44: Czekaj P., Plewka A., Kamiński M., Nowaczyk G., Pawlicki K., Wielgus-Serafińska E.: Daily and circadian rhythms in the activity of mixed function oxidases system in rats of different age. Biol. Rhythm Res. 1994; 25: Dallner G.: Isolation of rough and smooth microsomes - general. Methods Enzymol. 1974; 32: Orrenius S., Erricsson J.L., Ernster L.: Phenobarbitalinduced synthesis of the microsomal drug-metabolizing enzyme system and its relationship to the proliferation of endoplasmic membranes. J. Cell Biol., 1965; 25: Nash T.: The colorimetric estimation of formaldehyde by means of the Hantzsh reaction. Biochem. J. 1953; 55: Werringloer J.: Assay of formaldehyde generated during microsomal oxidation reactions. Methods Enzymol. 1978; 52: Kamataki T., Yamazoe Y., Kato R.: Alteration in the population of sex-specific P-450 species in rat liver microsomes during aging. w: Liver and Aging, K. Kitani ed., Elsevier Science Publishing, 1986; s Fujita S., Kitagawa H., Chiba M., Suzuki T., Ohta M., Kitani K.: Age and sex associated differences in the relative abundance of multiple species of cytochrome P-450 in rat liver microsomes. A separation by HPLC of hepatic microsomal cytochrome P-450 species. Biochem. Pharmacol. 1985; 34: Kitani K.: Neurohumoral control of liver functions during aging. Gerontology 1988; 34: Abraham N.G., Levere R.D, Freedman M.: Effect of age on rat liver heme and drug metabolism. Exp. Gerontol. 1985; 20: Boyle S.P., Craft J.A.: The effect of gender, sexual maturation and xenobiotic treatment on the formation of hydroxymethyl metabolites from 7, 12-dimethylbenz[a] anthracene in rat liver microsomes. Toxicol. Lett. 2000;117: Shapiro B.H.: Sexually dimorphic response of rat hepatic monooxygenases to low-dose phenobarbital. Biochem. Pharmacol. 1986; 35: Shapiro B.H., Pampori N.A., Lapenson D.P., Waxman D.J.: Growth hormone -dependent and -independent sexually dimorphic regulation of phenobarbital-induced hepatic cytochromes P450 2B1 and 2B2. Archiv. Biochem. Biophys. 1994; 312: Monostory K., Verczkey L.: The effect of phenobarbital and dexamethasone coadministration on the activity of rat liver P450 system. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1994; 203:

11 copyright 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN Rosenberg D.W., Sardana M.K., Kappas A.: Altered induction response of hepatic cytochrome P-450 to phenobarbital, 3-methylcholanthrene, and β-naphthoflavone in organtin-treated animals. Biochem. Pharmacol. 1985; 34: Tanaka E., Kurata N., Kahno M., Yoshida T., Kuroiwa Y.: Induction of cytochrome P-450 and related drug-oxidizing activities in muscone (3-methylcyclopenta-decanone)-treated rats. Biochem. Pharmacol. 1987; 36: Cresteil T., Beaune P., Celier C., Leroux J.P., Guengerich F.P.: Cytochrome P-450 isozyme content and monooxygenase activities in rat liver: Effect of ontogenesis and pretreatment by phenobarbital and 3-methylcholanthrene. J. Pharm. Exp. Ther. 1986; 236: Sun J., Lau P.P., Strobel H.V.: Aging modifiers the expression of hepatic microsomal cytochromes P-450 after pretreatment of rats with β-naphthoflavone or phenobarbital. Exp. Gerontol. 1986; 21: Ronis M.J., Rowlands J.C., Hakkak R., Badger T.M.: Inducibility of hepatic CYP1A enzymes by 3-methylcholanthrene and isosafrole differs in male rats fed diets containing casein, soy protein isolate or whey from conception to adulthood. J. Nutr. 2001; 131: Plewka A.: Wpływ wieku i deksametazonu na aktywność wątrobowego układu oksydaz o funkcji mieszanej u szczurów. Ann. Acad. Med. Siles. (supl. 14) 1992; Adres do korespondencji Dr hab. Andrzej Plewka Zakład Proteomiki, Śląski Uniwersytet Medyczny, Sosnowiec, ul. Ostrogórska 30 telefon:

12 Farm Przegl Nauk, 2009,4, Wpływ wybranych induktorów na aktywność hydroksylazy aniliny w wątrobie szczura w różnych fazach życia pozapłodowego Age and inductors effect on rat hepatic aniline hydroxylase activity Andrzej Plewka, Dr Danuta Plewka*, Jacek Marczyński, Józef Waloszek Zakład Proteomiki, Śląski Uniwersytet Medyczny Kierownik: Andrzej Plewka * Katedra Morfologii, Zakład Histologii, Śląski Uniwersytet Medyczny Streszczenie W dalszym ciągu powszechne zainteresowanie budzi nie tylko rozwój poszczególnych enzymów związanych z metabolizmem substancji endo- i egzogennych w okresie płodowym i początkowej fazie życia pozapłodowego, ale także ich ewolucja w zaawansowanym wieku. Celem prezentowanych badań było wykazanie jak zmienia się profil wątrobowej aktywności hydroksylazy aniliny w różnych fazach życia szczura i po indukcji fenobarbitalowej, β-naftoflawonowej i deksametazonowej. Badania przeprowadzono na samcach szczurzych rasy Wistar. Doświadczenie obejmowało 8 grup wiekowych: 0.5-, 1-, 2-, 4-, 8-, 12-, 20- i 28 miesięczne. Aktywność właściwa hydroksylazy aniliny w funkcji wieku nie podlegała istotnym zmianom. Fenobarbital okazał się silnym induktorem hydroksylazy aniliny we wszystkich grupach wiekowych. Do 2 miesiąca życia indukcyjność omawianej hydroksylazy rosła do 285% kontroli. Utrzymywała się ona przez kilka kolejnych miesięcy i dopiero u zwierząt po 1. roku życia obniżała się do około 200% kontroli. β-naftoflawon był słabszym induktorem hydroksylazy aniliny niż fenobarbital. Tym razem w początkowej fazie życia indukcyjność sięgała 230% kontroli, a w fazie starzenia zwierząt obserwowano spadek indukcji do około 150% kontroli. Deksametazon również indukował aktywność hydroksylazy aniliny w całym badanym przedziale wieku. Ponad 300% indukcję obserwowano w grupie 0,5 miesięcznej. Następnie malała ona do niecałych 140% kontroli w 4 miesiącu życia szczura i utrzymywała się na nieco wyższym poziomie w kolejnych fazach życia. Słowa kluczowe: hydroksylacja aniliny, szczur, wątroba, wiek, indukcja Wstęp W komórkach wątrobowych cytochrom P450 może stanowić do 25% puli białek siateczki śródplazmatycznej. Cytochrom ten aktywuje cząsteczki tlenu w kierunku jej rozpadu, przy czym jeden z powstałych atomów tlenu włączany jest do substratu. W zależności od substratów oksygenacja manifestuje się pojawianiem różnorodnych typów reakcji Abstract Not only the development of the individual enzymes connected with the metabolism of endo- and exogenous substances during the foetal period and in the first phase of life after birth still arouse general interest but also their evolution in advanced age. The aim of the presented researches was to demonstrate how the profile of the hepatic activity of the aniline hydroxylase is changing in the different phases of the rat life and after phenobarbital, β-naphthoflavone and dexamethasone induction. The researches were done on male rats (breed of Wistar). The experiment concerned 8 age groups of the rats: 0.5-, 1-, 2-, 4-8-, 12-, 20- and 28 months-old. The real activity of the aniline hydroxylase was not changing significantly in the function of the age. Phenobarbital turned out to be strong initiator in all age groups. Until the second month of the life the induction of the mentioned hydroxylase was increasing to 285 per cent of the control. It was remaining over the few next months and just decreasing to about 200 per cent in the over one-year-old animals. β-naphthoflavone was weaker initiator aniline hydroxylase than phenobarbital. This time in the first phase of the life induction was reaching 230 per cent of the control and in the ageing phase of the animals the decrease of the induction to about 150 per cent was observed. Dexamethasone was also inducing the activity of the aniline hydroxylase in the whole researched age bracket. Over 300 per cent induction was observed in the 0.5 month age group. Next it was decreasing to not quite 140 per cent of the control at the age of 4 months of the rat and it was remaining at a little higher level in the following phases of the life. Key words: aniline hydroxylase, rat, liver, ageing, induction [1]. Obejmują one hydroksylację węgla, epoksydację, oksygenację heteroatomów czy też przeniesienie chemicznych grup funkcyjnych. W zależności od substratu, a także typu reakcji, której substrat ten podlega, mówimy o hydroksylazie benzo(a)pirenu, hydroksylazie aniliny i innych [2]. Literaturowe rozważania dotyczące roli wieku w wątrobowym metabolizmie ksenobiotyków ograniczają się zasadniczo do dwóch okresów, tj. od urodzenia do osiągnięcia 12

13 copyright 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN dojrzałości narządowej i płciowej oraz okresu zaawansowanego starzenia się organizmu. W tym drugim przypadku początkowo zgodnie przyjęto, że zmiany w masie wątroby i przepływie krwi są głównie odpowiedzialnie za wiekowo zależny spadek wątrobowego metabolizmu leków. Jednakże wyniki szeregu prac nie potwierdziły tego [3-6]. Stąd też nadal pozostaje niejasny związek pomiędzy wieloma parametrami fizjologicznymi, a wątrobowym metabolizmem leków u osobników starych, o ile taki związek istnieje [7, 8]. Ogólne zainteresowanie budzi nie tylko rozwój poszczególnych enzymów związanych z metabolizmem substancji endo- i egzogennych w okresie płodowym i początkowej fazie życia pozapłodowego, ale także ich ewolucja u osobników w zaawansowanym wieku. Wyniki nielicznych prac eksponują istnienie zależności między wiekiem zwierząt, a aktywnością poszczególnych ogniw mikrosomalnego układu metabolizującego ksenobiotyki [9-12]. Wydaje się, że poszczególne izoformy mają szeroką, ale nakładającą się specyficzność substratową. W oparciu o wczesne doniesienia literaturowe [13, 14, 15] można zaproponować kilka spostrzeżeń: 1. Rzeczywiście, specyficzność substratowa jest faktem. Np. izoforma CYP2B1 jest bardziej efektywna w katalizie N-demetylacji benzofetaminy niż w metabolizmie innych substratów, a izoenzym 1A1 preferuje oksydację wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych. 2. Nie jest ona absolutna, bowiem określony izoenzym może metabolizować różne typy substratów: jedne szybciej inne wolniej. Z kolei, jeden substrat może być metabolizowany przez różne izoenzymy P450 z różnymi wartościami stałej Michaelisa. 3. Te same substraty mogą być odmiennie metabolizowane przez poszczególne izoformy cytochromu P450. Przykładowo, testosteron wykazuje preferencyjną hydroksylację w pozycji 6β, 7α i 16α odpowiednio przez izoenzymy 1A1 i 1A2, 2A1 oraz 2B1 i 2B2. Celem naszych badań było wykazanie jak zmienia się konstytucyjna i indukowana aktywność hydroksylazy aniliny w wątrobie szczura w zależności od wieku i pod wpływem wybranych induktorów układu monooksygenaz zależnych od cytochromu P450. Szczególnie ważne było stwierdzenie czy istnieje korelacja między tą aktywnością, a składem izoform cytochromu P450 w różnych fazach życia szczura po indukcji fenobarbitalowej, β-naftoflawonowej i deksametazonowej. Materiały i metody Zwierzęta Badania przeprowadzono na samcach szczurzych rasy Wistar. Zwierzęta pochodziły z hodowli Centralnej Zwierzętarni Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach-Ligocie. Serie badawcze obejmowały 8 grup wiekowych, tj. szczury: 0.5-, 1-, 2-, 4-, 8-, 12-, 20- i 28 miesięczne. Zwierzęta grupy najmłodszej przebywały cały czas z matkami. Po usamodzielnieniu się, każde zwierzę przebywało osobno w klatkach plastikowych, a hodowla była prowadzona w tym samym pomieszczeniu o ustalonej wilgotności powietrza (około 60%), temperaturze ( C) i rytmie 12-godzinowego oświetlenia (dzień-noc: ). Szczury karmiono paszą standardową (LSM), którą usuwano na 12 godzin przed zabiciem, pozostawiając wolny dostęp do wody. Szczury zabijano przez dekapitację. Natychmiast pobierano wątroby i umieszczano je w lodowatym roztworze soli fizjologicznej. Traktowanie Szczurom pierwszej serii eksperymentalnej podawano dootrzewnowo dwukrotnie fenobarbital w dawkach po 75 mg/kg masy ciała na 3- i 2 dni przed dekapitacją. Zastosowano dawkę nieco niższą od zalecanej w literaturze, bowiem wyższa dawka powodowała wzrost śmiertelności zwierząt w grupach zwierząt młodych. Wszystkie iniekcje wykonano w każdej serii doświadczalnej o godzinie Zwierzęta drugiej serii doświadczalnej otrzymywały trzykrotnie dootrzewnowo β-naftoflawon. Podawano go na 3-, 2- i 1 dzień przed zabiciem w dawkach po 40 mg/kg masy ciała zawsze o godzinie Wreszcie, zwierzęta trzeciej serii doświadczalnej otrzymywały dootrzewnowo deksametazon. Podawano go o godzinie 9 00 w postaci zawiesiny w oleju kukurydzianym również trzykrotnie na 3-, 2- i 1 dzień przed zabiciem w dawce po 20 mg/kg masy ciała. Stała godzina podawania induktora podyktowana była podatnością układu monooksygenaz zależnych od cytochromu P450 na zmiany pod wpływem rytmu okołodobowego [16, 17]. Izolacja frakcji mikrosomalnej Wątrobową frakcję mikrosomalną izolowano według metody Dallnera [18]. Po kilkukrotnym przepłukaniu w roztworze soli fizjologicznej, wątroby cięto na niewielkie skrawki i rozdrabniano w homogenizatorze Pottera-Elvehjema z tłokiem teflonowym, przy 400 obrotach na minutę. Środowiskiem homogenizacyjnym był 0,25 molowy roztwór sacharozy w 10 milimolowym buforze Tris-HCl o ph=7,4. Na 1 gram tkanki dodawano 5 cm 3 tego roztworu. Ten i kolejne etapy obróbki wątroby prowadzano w temperaturze C. Czyste frakcje mikrosomalne zawieszano w zbuforowanym 20% o/o roztworze glicerolu, tak aby stężenie białka było nie mniejsze niż 5 mg/cm 3. Próby te natychmiast zamrażano w temperaturze C. Oznaczanie cytochromu P450 Zawartość cytochromu P450 z małymi modyfikacjami określano według metody Estabrooka i Werringloera [19]. Pomiary wykonywano zapisując tzw. widmo różnicowe w przedziale nm. Zawartość cytochromu P450 wyliczano, korzystając z milimolowego współczynnika absorpcji, równego 91 mm -1 cm -1. Zawartość tego cytochromu wyrażano w nanomolach cytochromu na 1 mg białka. Oznaczanie aktywności hydroksylazy aniliny Aktywność tę oznaczano kolorymetrycznie zgodnie ze zmodyfikowaną procedurą Imai i wsp. [20]. Mieszanina reakcyjna w końcowej objętości 1 cm 3 80 mikromolowego buforu Tris-HCl o ph 7,4 zawierała: 8 mikromoli chlorowodorku aniliny, 2,5 mikromola chlorku magnezowego, 1,0 mikromol NADPH i białko mikrosomalne. Reakcję prowadzono przez 20 minut w temperaturze 37 0 C w warunkach 13

14 Farm Przegl Nauk, 2009,4 tlenowych. Proces zatrzymywano przez dodanie 0,5 cm 3 20% w/o kwasu trichlorooctowego. Po odwirowaniu wytrąconego białka, pobierano 1 cm 3 supernatantu, dodawano 0,5 cm 3 10% w/o Na 2 CO 3 oraz 1 cm 3 2% fenolu w 0,2 molowym NaOH. Intensywność niebieskiego zabarwienia mierzono po 30 minutach przy 630 nm. Wartość absorbancji przeliczano na ilość uwolnionego p-aminofenolu, korzystając z wcześniej przygotowanej krzywej kalibracyjnej. Aktywność tego enzymu wyrażano w nanomolach na 1 minutę na 1 mg białka mikrosomalnego. Oznaczanie białka mikrosomalnego Zawartość białka mikrosomalnego oznaczano metodą Lowry ego i wsp. [21], stosując jako standard albuminę z surowicy wołowej. Analiza statystyczna Wyniki oznaczeń biochemicznych, które przedstawiono w tym opracowaniu są średnią z pięciu niezależnych pomiarów. Istotność różnic w poszczególnych seriach, a także pomiędzy grupami wiekowymi oceniano na podstawie a Rycina 1. 0Aktywność wątrobowej hydroksylazy aniliny wyrażonej w [nanomolach/min/ mg białka] u szczurów w różnym wieku w serii kontrolnej i po indukcji testu ANOVA dla p=0.05. Wyniki A k t y w n o ś ć właściwa hydroksylazy aniliny w funkcji wieku nie podlegała uderzającym wahaniom (Ryc. 1). Po 12 miesiącu następował spadek aktywności hydroksylazy, który w 28 miesiącu życia był znamienny statystycznie w stosunku do grupy 1 rocznej. F e n o b a r b i t a l okazał się silnym induktorem hydroksylazy aniliny we wszystkich grupach wiekowych (Ryc. 1, 2). Do 2 miesiąca życia indukcyjność omawianej hydroksylazy rosła, osiągając wartość około 285% kontroli (0,82 nanomol/min/mg białka). Utrzymywała się ona przez kilka kolejnych miesięcy i dopiero u zwierząt 12 miesięcznych obniżała się do około 200%, jednak aktywność enzymu wzrastała do 0,89 nanomol/min/mg. 200% indukcję obserwowano również aktywność zwierząt dwóch najstarszych grup wiekowych. β-naftoflawon był słabszym niż fenobarbital, jednak znamiennym statystycznie induktorem hydroksylazy aniliny we wszystkich grupach wiekowych (Ryc. 1, 2). I tym razem również w początkowej fazie życia następował wzrost aktywności od 0,53 do 0,65 nanomol/min/mg oraz wzrost indukcji do 230% kontroli. Od 2 miesiąca życia obserwowano stopniowy spadek indukcyjności do 130% w grupie 12 miesięcznej. W fazie starzenia zwierząt obserwowano około 150% indukcję, jednak aktywność 0,46 nanomol/min/mg u zwierząt 28 miesięcznych była najmniejsza. Deksametazon również indukował znamiennie statystycznie aktywność hydroksylazy aniliny w całym badanym przedziale wieku (Ryc. 1, 2). Ponad 300% indukcję obserwowano w grupie 0,5 miesięcznej (0,92 nanomol/min/ mg). Następnie malała ona do niecałych 140% w 4 miesiącu życia szczura, osiągając poziom aktywności 0,45 nano- Rycina 2. 0Aktywność wątrobowej hydroksylazy aniliny w seriach doświadczalnych wyrażona jako procent kontroli u szczurów w różnym wieku 14

15 mol/min/mg i utrzymywała się na nieco wyższym poziomie w kolejnych fazach życia. Dopiero w grupie najstarszej ponownie wzrastała do 200% kontroli, osiągając aktywność 0,55 nanomol/min/mg. Aktywność hydroksylazy aniliny przeliczona na 1 nanomol cytochromu P450 cechowała się dużą zmiennością w zależności od wieku (Ryc. 3). Po początkowym, znamiennym statystycznie spadku do 1. miesiąca życia, aktywność ta nie zmieniała się przez następny miesiąc. Od 2 do 4 miesiąca podwajała swoją wartość, osiągając aktywność 0,61 nanomol/min/nanomol P450, po czym była ustabilizowana przez 4 kolejne miesiące. Od 8 miesiąca życia aktywność hydroksylazy ponownie szybko rosła do 12 miesiąca życia (różnica znamienna statystycznie), po czym silnie malała aż do grupy 28 miesięcznej, osiągając poziom 0,29 nanomol/ min/nanomol cytochromu P450. W miarę dojrzewania zwierząt indukcja fenobarbitalowa (Ryc. 3, 4) rosła od około 150% w 15 dniu życia (0,66 nanomol/min/nanomol P450) do ponad 230% u zwierząt 2 miesięcznych (0,62 nanomol/min/nanomol P450). W dalszych przedziałach wieku była nadal wysoka i dopiero w 12 copyright 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN miesiącu zmalała i oscylowała w granicach 150% w pozostałych grupach wiekowych, jednak aktywność wyraźnie malała od 1,40 w 12 miesiącu do 0,42 nanomol/min/ nanomol P450 w 28 miesiącu życia. β-naftoflawon (Ryc. 3, 4) powodował narastanie aktywności hydroksylazy aniliny przeliczonej na 1 nanomol cytochromu P450. Stwierdzony 120% wzrost aktywności u zwierząt 15 dniowych był nieznamienny statystycznie, ale u zwierząt 2 miesięcznych indukcja wynosiła prawie 390% (wzrost do 1,04 nanomol/min/nanomol P450). Indukcyjność ta malała w kolejnych fazach życia, a w grupach 12- oraz 20 miesięcznych zanikała (brak znamienności statystycznej). U szczurów najstarszych obserwowano ponownie wyraźną indukcję, wynoszącą 270% kontroli (0,77 nanomol/min/nanomol P450). Najwyższą, ponad 400% indukcję deksametazonową hydroksylazy aniliny (Ryc. 3, 4) stwierdzono w grupie 15 dniowej (aktywność 1,76 nanomol/min/nanomol P450). Malała ona następnie sukcesywnie do 12 miesiąca, gdzie nie obserwowano zmian statystycznie znamiennych. W grupie zwierząt najstarszych obserwowano ponownie ponad 300% indukcję tego enzymu (0,93 nanomol/min/nanomol cytochromu P450). Rycina 3. 0Aktywność wątrobowej hydroksylazy aniliny wyrażonej w [nanomolach/min/ nanomol P450] u szczurów w różnym wieku serii kontrolnej i po indukcji Rycina 4. 0Aktywność wątrobowej hydroksylazy aniliny przeliczonej na 1 nanomol cytochromu P450 w seriach doświadczalnych wyrażona jako procent kontroli u szczurów w różnym wieku Dyskusja Zmiany w wątrobowym metabolizmie leków zależne od wieku były przedmiotem bardzo intensywnych badań w przeszłości. Ten problem ma znaczenie w farmakoterapii ludzi starych. Wynika to z tego, że kiedy zdolność wątroby do metabolizowania leków zmienia się wraz z wiekiem, farmakokinetyczne profile leków również się zmieniają, co prowadzi do zmian w ich farmakodynamice [22, 23, 24]. 15