(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (13) (1) T3 Int.Cl. A61K 38/18 (06.01) A61P 3/00 (06.01) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 12/3 EP B1 (4) Tytuł wynalazku: KOMPOZYCJE FARMACEUTYCZNE ZAWIERAJĄCE ANTAGONISTÓW AKTYWINY-ActRIIA I ICH ZASTOSOWANIE W ZAPOBIEGANIU LUB LECZENIU SZPICZAKA MNOGIEGO () Pierwszeństwo: US P US P US P US 2807 P (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 09/48 (4) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 13/01 (73) Uprawniony z patentu: Acceleron Pharma, Inc., Cambridge, US (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 JOHN KNOPF, Carlisle, US JASBIR SEEHRA, Lexington, US RAVINDRA KUMAR, Acton, US (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Katarzyna Rudnicka SULIMA GRABOWSKA SIERZPUTOWSKA BIURO PATENTÓW I ZNAKÓW TOWAROWYCH SP.J. Skr. poczt Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 SGS-2989/VAL EP B1 Opis 1 2 TŁO WYNALAZKU [0001] Zaburzenia kości, począwszy od osteoporozy do złamań, reprezentują zestaw stanów patologicznych, przeciwko którym opracowano niewiele skutecznych środków farmaceutycznych. Leczenie zamiast tego koncentruje się na interwencjach fizycznych i behawioralnych, w tym unieruchomieniu, ćwiczeniach i zmianie diety. Korzystnym byłoby dysponowanie środkami terapeutycznymi, które stymulują wzrost kości i zwiększają gęstość kości, dla celów leczenia szeregu zaburzeń kości. [0002] Wzrost kości i mineralizacja zależą od aktywności dwóch rodzajów komórek, osteoklastów i osteoblastów, chociaż chondrocyty i komórki układu naczyniowego również uczestniczą w krytycznych aspektach tych procesów. W kwestiach rozwoju, tworzenie się kości zachodzi na pośrednictwem dwóch mechanizmów, śródchrzęstne kostnienie i śródbłonowe kostnienie, przy czym to pierwsze odpowiada za tworzenie się kości wzdłużnych, a to ostatnie odpowiada za tworzenie się topologicznie płaskich kości, takich jak kości czaszki. Śródchrzęstne kostnienie wymaga kolejnego tworzenia się i degradacji struktur chrzęstnych w płytkach wzrostu, które służą jako macierze do tworzenia się osteoblastów, osteoklastów, układu naczyniowego i późniejszej mineralizacji. Podczas śródbłonowego kostnienia, kość tworzy się bezpośrednio w tkankach łącznych. Oba procesy wymagają infiltracji osteoblastów i późniejszej depozycji macierzy. [0003] Złamania i inne zaburzenia strukturalne kości podlegają gojeniu za pośrednictwem procesu, który, co najmniej powierzchniowo, przypomina sekwencję zdarzeń rozwojowych osteogenezy, w tym tworzenie się tkanki chrzęstnej i późniejszą mineralizację. Proces gojenia złamania może zachodzić na dwa sposoby. Bezpośrednie lub pierwotne gojenie kości zachodzi bez tworzenia kostniny. Pośrednie lub wtórne gojenie kości zachodzi z etapem prekursorowym kostniny. Pierwotne gojenie złamań wymaga ponownego utworzenia ciągłości mechanicznej nad blisko ustawionym zakłóceniem. W odpowiednich warunkach, resorbujące kość komórki otaczające zakłócenie wykazują odpowiedź resorpcyjną, pod postacią budowy tunelu w kości, i ustanawiają szlaki do penetracji przez naczynia krwionośne oraz późniejsze gojenie. Wtórne gojenie kości następuje po procesie zapalnym, tworzeniu miękkiej kostniny, mineralizacji kostniny i przemodelowania kostniny. W stadium zapalnym, powstawanie krwiaków i krwawień wynika z rozerwania okostnowych i śródkostnych naczyń krwionośnych w miejscu zranienia. Do obszaru tego wkraczają komórki

3 zapalne. W stadium tworzenia miękkiej kostniny, komórki tworzą nowe naczynia, fibroblasty, materiał wewątrzkomórkowy i komórki podtrzymujące, tworząc ziarninę w przestrzeniach pomiędzy fragmentami złamania. Kliniczny zrost miejsca zakłócenia jest ustanawiany poprzez tkankę włóknistą lub chrzęstną (miękka kostnina). Tworzą się osteoblasty i pośredniczą w mineralizacji miękkiej kostniny, która jest następnie zastępowana przez kość blaszkowatą i poddawana normalnym procesom przebudowy. [0004] Oprócz złamań i innych fizycznych zakłóceń struktury kości, utrata minerałów z kości i masy kostnej mogą być spowodowane przez różnorodne stany i mogą skutkować istotnymi problemami natury medycznej. Zmiany w masie kostnej występują, we względnie przewidywalny sposób, w ciągu całego życia osobnika. Do wieku około lat, kości zarówno mężczyzn, jak i kobiet dorastają do maksymalnej masy poprzez liniowy wzrost śródchrzęstnych płytek wzrostowych oraz wzrost promieniowy. Po przekroczeniu wieku około lat (w przypadku kości beleczkowych, np. kości płaskich, takich jak kręgi i miednica) i wieku 40 lat (w przypadku istoty korowej kości, np. długich kości znajdywanych w kończynach), do powolnej utraty masy kostnej dochodzi zarówno u mężczyzn, jak i kobiet. U kobiet występuje również końcowa faza istotnej utraty masy kostnej, powodowana prawdopodobnie postmenopauzalnymi niedoborami estrogenu. Podczas tej fazy, kobiety mogą tracić dodatkowe % masy kostnej z istoty korowej kości i 2% z przedziału beleczkowatego. To, czy progresywna utrata masy kostnej skutkuje stanem patologicznym, takim jak osteoporoza zależy głównie od wyjściowej masy kostnej danego osobnika i tego, czy istnieją stany nasilające. [000] Utrata masy kostnej jest niekiedy charakteryzowana jako nierównowaga w normalnych procesach przebudowy kości. Zdrowe kości ciągle podlegają przebudowie. Przebudowa rozpoczyna się od resorpcji kości przez osteoklasty. Zresorbowana kość jest nastepnie zastępowana przez nową tkankę kostną, która jest charakteryzowana przez tworzenie kolagenu przez osteoblasty, i późniejsze wapnienie. U osób zdrowych, szybkość resorpcji i tworzenia pozostają w równowadze. Osteoporoza to przewlekły, progresywny stan, zaznaczony przesunięciem ku resorpcji, skutkującym ogólnym zmniejszeniem masy kostnej i mineralizacji kości. Osteoporoza u ludzi jest poprzedzana kliniczną osteopeniąa (gęstość mineralna kości, która jest wieksza, niż jedno odchylenie standardowe, ale mniejsza niż 2, odchyleń standardowych poniżej średniej wartości dla kości młodego dorosłego). Na świecie, około 7 milionów ludzi jest narażonych na osteoporozę. [0006] Zatem, kontrolowanie równowagi pomiędzy aktywnością osteoklastów i osteoblastów może być użyteczne do stymulowania gojenia złamań i innych uszkodzeń kości, jak również leczenia zaburzeń, takich jak osteoporoza, powiązanych z utratą masy kostnej i

4 mineralizacji kości. [0007] Odnośnie osteoporozy, wszystkie spośród estrogenu, kalcytoniny, osteokalcyny z witaminą K, lub wysokich dawek wapnia w diecie są stosowane jako interwencje terapeutyczne. Inne podejścia tereapeutyczne do osteoporozy obejmują bisfosfoniany, hormon przytarczyc, kalcymimetyki, statyny, steroidy anaboliczne, sole lantanu i strontu, i fluorek sodu. Takie terapeutyki są, jednakże, często powiązane z niepożądanymi działaniami ubocznymi. [0008] Zatem, celem ujawnienia jest dostarczanie kompozycji do zapobiegania i leczenia szpiczaka mnogiego, jak wskazano w zastrzeżeniach patentowych KRÓTKI OPIS WYNALAZKU [0009] W pierwszym aspekcie, wynalazek zapewnia kompozycję farmaceutyczną zawierającą białko fuzyjne ActRIIa-Fc, ulegające ekspresji w komórkach CHO, przy czym białko fuzyjne ActRIIa-Fc oznacza dimer utworzony z dwóch polipeptydów, z których każdy ma sekwencję aminokwasową, która jest co najmniej w 90% lub 9% identyczna z sekwencją aminokwasową SEQ ID NO:7 połączone przez wiązanie dwusiarczkowe, przy czym dimer ma od 3 do ugrupowań kwasu sjalowego. [00] Białko fuzyjne ActRIIa-Fc może oznaczać dimer utworzony z dwóch polipeptydów SEQ ID NO:7, i jeden lub oba polipeptydy opcjonalnie mogą mieć o jeden aminokwas mniej na końcach aminowym- lub karboksylowym, niż pokazano w SEQ ID NO:7. Białko fuzyjne ActRIIa-Fc może rekombinacyjnie ulegać ekspresji w komórkach CHO, przy użyciu sekwencji liderowej TPA z SEQ ID NO: 9. Dimer może mieć 4 ugrupowania kwasu sjalowego. [0011] W niektórych przykładach wykonania, białko fuzyjne ActRIIa-Fc ma okres półtrwania w surowicy średnio od 2 do 32 dni, u normalnych, zdrowych ludzi, i równorzędną biodostępność po podaniu dożylnie lub podskórnie. Kompozycja farmaceutyczna według pierwszego aspektu może być odpowiednia do podawania podskórnego. Korzystnie, białko fuzyjne ActRIIa-Fc jest w co najmniej 90% czyste, względem innych składników białkowych. Białko fuzyjne ActRIIa-Fc może zawierać jedną lub więcej modyfikowanych reszt aminokwasowych, wybranych spośród: glikozylowanego aminokwasu, PEG-ylowanego aminokwasu, farnezylowanego aminokwasu, acetylowanego aminokwasu, biotynylowanego aminokwasu, aminokwasu sprzęganego z ugrupowaniem lipidowym i aminokwasu sprzęganego z organicznym środkiem derywatyzującym. Kompozycja farmaceutyczna według pierwszego aspektu może dodatkowo zawierać środek bisfosfonianowy, który może zostać wybrany spośród alendronianu, ibandronianu i rizedronianu. [0012] W drugim aspekcie, wynalazek zapewnia kompozycję farmaceutyczną zawierającą

5 białko fuzyjne ActRIIa-Fc do stosowania w leczeniu lub zapobieganiu szpiczaka mnogiego u pacjenta człowieka, przy czym kompozycja farmaceutyczna oznacza kompozycję farmaceutyczną według pierwszego aspektu wynalazku. [0013] W trzecim aspekcie, wynalazek zapewnia zastosowanie białka fuzyjnego ActRIIa- Fc do wytwarzania leku do leczenia lub zapobiegania szpiczaka mnogiego u pacjenta człowieka, przy czym białko fuzyjne ActRIIa-Fc oznacza białko fuzyjne ActRIIa-Fc, jak zdefiniowano w pierwszym aspekcie wynalazku. [0014] Po części, w opisie przedstawiono, że cząsteczki o aktywności antagonisty aktywiny lub ActRIIa ( antagoniści aktywiny i antagoniści ActRIIa, zbiorczo antagoniści aktywiny-actriia ) można stosować w celu zwiększania gęstości kości, stymulowania wzrostu kości i/lub zwiększania wytrzymałości kości. W szczególności, w opisie przedstawiono, że rozpuszczalna postać ActRIIa działa jako inhibitor sygnalizacji aktywina-actriia i stymuluje zwiększoną gęstość kości, wzrost kości i wytrzymałość kości in vivo. Podczas gdy większość środków farmaceutycznych, które stymulują wzrost kości lub inhibują utratę masy kostnej działają jako środki anty-kataboliczne (określane również powszechnie jako środki kataboliczne ) (np. bisfosfoniany) lub środki anaboliczne (np. hormon przytarczyc, PTH, przy odpowiednim dawkowaniu), rozpuszczalne białko ActRIIa wykazuje podwójną aktywność, mając skutki oddziaływania anty-kataboliczne, jak i anaboliczne. Zatem, w opisie przedstawiono, że antagonistów szlaku sygnalizacji aktywina-actriia można stosować w celu zwiększania gęstości kości i stymulowania wzrostu kości. Podczas gdy rozpuszczalny ActRIIa może oddziaływać na kość poprzez mechanizm inny niż antagonizowanie aktywiny, może być pożądanym, żeby środki terapeutyczne wybierano na podstawie aktywności antagonisty aktywiny-actriia. Jak ujawniono w opisie, antagoniści aktywina-actriia są skuteczni w zapobieganiu i/lub naprawie uszkodzeń kości spowodowanych przez liczne nowotwory szpiczaka mnogiego i nowotwory piersi, oraz, dodatkowo, że antagoniści aktywiny-actriia zmniejszają obciążenie nowotworem w szpiczaku mnogim. Rozpuszczalny polipeptyd ActRIIa stymuluje wzrost kości bez powodowania konsekwentnie mierzalnego wzrostu w masie mięśniowej. [001] W opisie ujawniono sposoby do stosowania antagonistów aktywiny-actriia, w tym, na przykład, polipeptydów ActRIIa wiążących aktywinę, przeciwciał anty-aktywina, przeciwciał anty-actriia, nakierowanych na aktywinę- lub ActRIIa małych cząsteczek i aptamerów, oraz kwasów nukleinowych, które zmniejszają ekspresję aktywiny i ActRIIa, do leczenia zaburzeń powiązanych z małą gęstością kości lub małą wytrzymałością kości, takich jak osteoporoza, lub do stymulowania wzrostu kości u wymagających tego pacjentów, tak jak u pacjentów ze złamaniem kości. W opisie ujawniono polipeptydy zawierające

6 1 2 3 rozpuszczalny polipeptyd ActRIIa wiążący aktywinę, który wiąże się z aktywiną. Polipeptydy ActRIIa można formułować jako preparat farmaceutyczny zawierający polipeptyd ActRIIa wiążący aktywinę i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. Korzystnie, polipeptyd ActRIIa wiążący aktywinę wiąże się z aktywiną, z K D mniejszą niż 1 mikromolarna lub mniejszą niż 0, lub 1 nanomolarna. Opcjonalnie, polipeptyd ActRIIa wiążący aktywinę selektywnie wiąże aktywinę versus GDF11 i/lub GDF8, korzystnie z K D, która jest co najmniej -krotnie, -krotnie lub 0-krotnie niższa względem aktywiny, niż względem GDF11 i/lub GDF8. Bez chęci wiązania się z określonym mechanizmem działania, oczekuje się, że ten stopień selektywności dla inhibicji aktywiny ponad inhibicję GDF11/GDF8 odpowiada za selektywne oddziaływanie na kość, bez konsekwentnie mierzalnego oddziaływania na mięśnie. Polipeptyd ActRIIa można dobrać w celu powodowania mniej niż 1%, mniej niż % lub mniej niż % wzrostu w mięśniach, w dawkach, które osiągają pożądany wpływ na kość. Korzystnie kompozycja jest co najmniej w 9% czysta, względem innych składników polipeptydowych, jak oszacowano przy pomocy chromatografii wykluczania ze względu na rozmiar, i korzystniej, kompozycja jest co najmniej w 98% czysta. Polipeptyd ActRIIa wiążący aktywinę, do stosowania według wynalazku, może mieć sekwencję aminokwasową z SEQ ID NO: 7 lub sekwencję aminokwasową, która jest co najmniej w 90%, 9%, 97% lub 99% identyczna z sekwencją aminokwasową SEQ ID NO: 7. Polipeptydy ActRIIa wiążące aktywinę mogą zawierać funkcjonalny fragment naturalnego polipeptydu ActRIIa, taki jak zawierający co najmniej, lub aminokwasów sekwencji wybranej spośród SEQ ID NOs: 1-3 lub sekwencji SEQ ID NO: 2, pozbawionej do 1 C-końcowych aminokwasów ( ogon ). [0016] Rozpuszczalny polipeptyd ActRIIa wiążący aktywinę może zawierać jedną lub więcej zmian w sekwencji aminokwasowej (np. w domenie wiążącej ligand) względem naturalnie występującego polipeptydu ActRIIa. Przykłady zmienianych polipeptydów ActRIIa zapewniono w WO 06/012627, str Zmiana w sekwencji aminokwasowej może, na przykład, zmieniać glikozylację polipeptydu, gdy jest on produkowany w ssaczej, owadziej lub innej eukariotycznej komórce lub zmieniać cięcie proteolityczne polipeptydu względem naturalnie występującego polipeptydu ActRIIa. [0017] Polipeptyd ActRIIa wiążący aktywinę może oznaczać białko fuzyjne, które ma, jako jedną domenę, polipeptydy ActRIIa. (np. wiążącą ligand część ActRIIa) i jedną lub więcej dodatkowych domen, która zapewnia pożądaną właściwość, taką jak ulepszona farmakokinetyka, łatwiejsze oczyszczanie, nakierowywanie do określonych tkanek, itp. Na przykład, domena białka fuzyjnego może wzmagać jedno lub więcej spośród trwałości in vivo, okresu półtrwania in vivo, podejmowanie/podawanie, lokalizacja lub rozkład w tkan-

7 ce, lub tworzenie się kompleksów białkowych, multimeryzacja białka fuzyjnego i/lub oczyszczanie. Dimeryzacja lub multimeryzacja mogą zapewnić zwiększone powinowactwo wiązania ligandu. Wiążące aktywinę białko fuzyjne ActRIIa może zawierać domenę immunoglobuliny Fc (typu dzikiego lub mutant) lub albuminę surowicy lub inną część polipeptydu, która zapewnia pożądane właściwości, takie jak ulepszona farmakokinetyka, ulepszona rozpuszczalność lub ulepszona trwałość. Typowo, białko fuzyjne ActRIIa-Fc według wynalazku będzie produkowane jako homodimeryczny kompleks. Opcjonalnie, fuzja ActRIIa-Fc zawiera względnie nieustrukturyzowany łącznik, umieszczony pomiędzy domeną Fc i pozakomórkową domeną ActRIIa. Ten nieustrukturyzowany łącznik może odpowiadać z grubsza 1-aminokwasowemu nieustrukturyzowanemu regionowi na C- końcu domeny pozakomórkowej ActRIIa ( ogon ), lub może to być sztuczna sekwencja 1, 2, 3, 4 lub aminokwasów lub o długości od do 1,,, 0 lub więcej aminokwasów, które są względnie wolne od struktur drugorzędowych, lub mieszanina obydwu. Łącznik może być bogaty w reszty glicyny i proliny, i może, na przykład, zawierać pojedynczą sekwencję treoniny/seryny i glicyny lub powtarzające się sekwencje treoniny/seryny i glicyny (np. TG 4 lub SG 4 singlety lub powtórzenia). Białko fuzyjne może zawierać subsekwencję do oczyszczania, taką jak znacznik epitopu, znacznik FLAG, sekwencja polihistydynowa i fuzja GST. Opcjonalnie, rozpuszczalny polipeptyd ActRIIa obejmuje jedną lub więcej modyfikowanych reszt aminokwasowych, wybranych spośród: glikozylowanego aminokwasu, PEG-ylowanego aminokwasu, farnezylowanego aminokwasu, acetylowanego aminokwasu, biotynylowanego aminokwasu, aminokwasu sprzęganego z ugrupowaniem lipidowym i aminokwasu sprzęganego z organicznym środkiem derywatyzującym. Preparat farmaceutyczny może również zawierać jeden lub więcej dodatkowych związków, takich jak związek, który jest stosowany do leczenia zaburzeń kości. Korzystnie, preparat farmaceutyczny jest zasadniczo wolny od pirogenów. Na ogół, jest korzystnym, żeby białko ActRIIa było ekspresjonowane w ssaczej linii komórkowej, która odpowiednio pośredniczy w naturalnej glikozylacji białka ActRIIa, tak, żeby zmniejszyć prawdopodobieństwo niekorzystnej odpowiedzi immunologicznej u pacjenta człowieka, a linie komórkowe CHO stosowano z powodzeniem, i oczekuje się, że inne powszechne ssacze układy ekspresyjne będą użyteczne. [0018] Według opisu, białka ActRIIa oznaczone ActRIIa-Fc mają pożądany właściwości, w tym selektywne wiązanie do aktywiny versus GDF8 i/lub GDF11, wiązanie ligandu z dużym powinowactwem i okres półtwania w surowicy dłuższy niż dwa tygodnie w modelach zwierzęcych. W opisie ujawniono polipeptydy ActRIIa-Fc oraz preparaty farmaceutyczne zawierające takie polipeptydy i farmaceutycznie dopuszczalny rozczynnik. W opi-

8 sie ujawniono kwasy nukleinowe kodujące rozpuszczalny polipeptyd ActRIIa wiążący aktywinę. Izolowany polinukleotyd może zawierać sekwencję kodującą rozpuszczalny polipeptyd ActRIIa wiążący aktywinę, taki jak opisany powyżej. Na przykład, izolowany kwas nukleinowy może zawierać sekwencję kodującą domenę pozakomórkową (np. domena wiążąca ligand) ActRIIa i sekwencję, która będzie kodować część lub całość domeny przezbłonowej i/lub domeny cytoplazmatycznej ActRIIa, ale poza kodonem stop, umieszczonym w obrębie domeny przezbłonowej lub domenie cytoplazmatycznej, lub umieszczonym pomiędzy domeną pozakomórkową i domeną przezbłonową lub domeną cytoplazmatyczną. Na przykład, izolowany polinukleotyd może zawierać pełnej długości sekwencję polinukleotydu ActRIIa, taką jak SEQ ID NO: 4 lub, lub częściowo skróconą wersję, izolowany polinukleotyd dodatkowo zawierający kodon terminacji transkrypcji co najmniej sześćset nukleotydów przed końcem 3' lub umieszczony w inny sposób, taki, że translacja polinukleotydu doprowadzi do powstania domeny pozakomórkowej, opcjonalnie sprzężonej ze skróconą częścią ActRIIa pełnej długości. Jedna sekwencja kwasu nukleinowego oznacza SEQ ID NO: 14. Kwasy nukleinowe ujawnione w opisie mogą być funkcjonalnie związane z promotorem do ekspresji, a ujawnienie zapewnia komórki transformowane takimi rekombinowanymi polinukleotydami. Korzystnie komórka oznacza ssaczą komórkę, taką jak komórka CHO. [0019] Również, w opisie ujawniono sposoby do wytwarzania rozpuszczalnego polipeptydu ActRIIa wiążącego aktywinę. Taki sposób może obejmować ekspresjonowanie dowolnych kwasów nukleinowych (np. SEQ ID NO: 4, lub 14) ujawnionych w opisie w odpowiedniej komórce, takiej jak komórka jajnika chomika chińskiego (CHO). Taki sposób może obejmować: a) hodowanie komórek w warunkach odpowiednich do ekspresji rozpuszczalnego polipeptydu ActRIIa, w którym komórka jest transformowana rozpuszczalnym konstrukt do ekspresji ActRIIa; i b) odzyskiwanie ekspresjonowanego w ten sposób rozpuszczalnego polipeptydu ActRIIa. Rozpuszczalne polipeptydy ActRIIa można odzyskiwać jako surową, częściowo oczyszczoną lub silnie oczyszczoną frakcję. Oczyszczanie można osiągnąć za pomocą serii etapów oczyszczania, w tym, na przykład, jeden, dwa lub trzy lub więcej z poniższych, w dowolnej kolejności: chromatografia białka A, chromatografia anionowymienna (np. Q sefaroza), chromatografia oddziaływań hydrofobowych (np. fenylosefaroza), chromatografia wykluczania ze względu na rozmiar i chromatografia kationowymienna. [00] Antagonistę aktywiny-actriia ujawnionego w opisie, takiego jak rozpuszczalny polipeptyd ActRIIa wiążący aktywinę, można stosować w sposobie do stymulowania wzrostu kości lub podwyższania gęstości kości u danego osobnika. Leczenie zaburzenia

9 powiązanego z mała gęstością kości, lub stymulowanie wzrostu kości, u wymagających tego pacjentów może obejmować podawanie wymagającemu tego osobnikowi skutecznej ilości antagonisty aktywiny-actriia. Również, ujawnione są zastosowania antagonisty aktywiny-actriia do wytwarzania leku do leczenia zaburzenia lub stanu według opisu. [0021] Sposób do identyfikowania środka, który stymuluje wzrost lub zwiększoną mineralizację kości, może obejmować: a) identyfikowanie środka testowego, który wiąże się z aktywiną lub domeną wiążącą ligand polipeptydu ActRIIa; i b) ocenianie oddziaływania środka na wzrost lub mineralizację kości (nie stanowi części wynalazku). KRÓTKI OPIS RYSUNKÓW [0022] Figura 1 pokazuje oczyszczanie ActRIIa-hFc ekspresjonowanego w komórkach CHO. Białko jest oczyszczane do postaci pojedynczego, dobrze zdefiniowanego piku. [0023] Figura 2 pokazuje wiązanie ActRIIa-hFc do aktywiny i GDF-11, co zmierzono za pomocą oznaczenia Biacore. [0024] Figura 3 pokazuje plan oznaczenia genu reporterowego A-4. Figura pokazuje wektor reporterowy: pgl3 (CAGA)12 (opisany w Dennler et al, 1998, EMBO 17: 91 -.) Motyw CAGA 12 jest obecny w genach reagujących na TGF-beta (PAI-1 gen), tak więc, wektor ten nadaje się do ogólnego użytku z czynnikami sygnalizacyjnymi Smad 2 i 3. [002] Figura 4 pokazuje skutki oddziaływania ActRIIa-hFc (romby) i ActRIIa-mFc (kwadraty) na sygnalizację GDF-8 w oznaczeniu genu reporterowego A-4. Oba białka wykazywały znaczącą inhibicję sygnalizacji regulowanej przez GDF-8 w stężeniach pikomolarnych. [0026] Figura pokazuje skutki oddziaływania trzech różnych preparatów ActRIIa-hFc na sygnalizację GDF-11 w oznaczeniu genu reporterowego A-4. [0027] Figura 6 pokazuje przykłady obrazów DEXA kontroli- i traktowanych ActRIIamFc-myszy BALB/c, przed (panele górne) i po (panele dolne) 12-tygodniowym okresie leczenia. Bledsze cieniowanie wskazuje zwiększoną gęstość kości. [0028] Figura 7 pokazuje kwantyfikację wpływu ActRIIa-mFc na gęstość mineralną kości u myszy BALB/c po okresie 12-tygodni. Leczenie to kontrola (romby), dawkowanie 2 mg/kg ActRIIa-mFc (kwadraty), dawkowanie 6 mg/kg ActRIIa-mFc (trójkąty) i dawkowanie mg/kg ActRIIa-mFc (koła). [0029] Figura 8 pokazuje kwantyfikację wpływu ActRIIa-mFc na skład mineralny kości u myszy BALB/c po okresie 12-tygodni. Leczenie to kontrola (romby), dawkowanie 2 mg/kg ActRIIa-mFc (kwadraty), dawkowanie 6 mg/kg ActRIIa-mFc (trójkąty) i dawkowanie mg/kg ActRIIa-mFc (koła).

10 [00] Figura 9 pokazuje kwantyfikację wpływu ActRIIa-mFc na gęstość mineralną kości beleczkowej u myszy C7BL6 poddanych usunięciu jajników (OVX) lub poddanych pozorowanej operacji (SHAM), po okresie 6-tygodni. Leczenie to kontrola (PBS) lub dawkowanie mg/kg ActRIIa-mFc (ActRIIa). [0031] Figura pokazuje kwantyfikację wpływu ActRIIa-mFc na kość beleczkową u myszy C7BL6 poddanych usunięciu jajników (OVX) po okresie 12-tygodni. Leczenie to kontrola (PBS; jasne słupki) lub dawkowanie mg/kg ActRIIa-mFc (ActRIIa; ciemne słupki). [0032] Figura 11 pokazuje kwantyfikację wpływu ActRIIa-mFc na kość beleczkową u myszy C7BL6 poddanych operacji pozorowanej po okresie leczenia 6- lub 12-tygodni. Leczenie to kontrola (PBS; jasne słupki) lub dawkowanie mg/kg ActRIIa-mFc (ActRIIa; ciemne słupki). [0033] Figura 12 pokazuje wyniki analizy pqct gęstości kości u myszy poddanych usunięciu jajników po 12 tygodniach leczenia. Leczenie to kontrola (PBS; jasne słupki) lub ActRIIa-mFc (ciemne słupki), oś y: mg/ccm. [0034] Figura 13 pokazuje wyniki analizy pqct gęstości kości u myszy poddanych pozorowanej operacji po 12 tygodniach leczenia. Leczenie to kontrola (PBS; jasne słupki) lub ActRIIa-mFc (ciemne słupki), oś y: mg/ccm. [003] Figury 14A i 14B pokazują analizę DEXA całego ciała po 12 tygodniach leczenia (A) i analizie ex vivo kości udowych (B). Jasne obszary wskazują regiony o dużej gęstości kości. [0036] Figura 1 pokazuje ex vivo analizę pqct trzonu kości udowej po dwunastu tygodniach leczenia. Leczenie to kontrola zaróbka (PBS; ciemne słupki) i ActRIIa-mFc (jasne słupki). Cztery słupki po lewej pokazują całkowitą gęstość kości, podczas gdy cztery słupki po prawej pokazują gęstość kości istoty korowej. Pierwsza para słupków w każdym zestawie czterech słupków przedstawia dane od myszy poddanych usunięciu jajników, podczas gdy druga para słupków przedstawia dane od myszy poddanych pozorowanej operacji. [0037] Figura 16 pokazuje analizę pqct ex vivo zawartości trzonu kości długiej trzonu kości udowej po dwunastu tygodniach leczenia. Leczenie to kontrola zaróbka (PBS; ciemne słupki) lub ActRIIa-mFc (jasne słupki). Cztery słupki po lewej pokazują całkowitą zawartość kości, podczas gdy cztery słupki po prawej pokazują zawartość istoty korowej kości. Pierwsza para słupków w każdym zestawie czterech słupków przedstawia dane od myszy poddanych usunięciu jajników, podczas gdy druga para słupków przedstawia dane od myszy poddanych pozorowanej operacji.

11 1 2 3 [0038] Figura 17 pokazuje ex vivo analizę pqct trzonu kości udowej i grubość istoty korowej kości udowej. Leczenie to kontrola (PBS; ciemne słupki) i ActRIIa-mFc (jasne słupki). Cztery słupki po lewej pokazują obwód śródkostny, podczas gdy cztery słupki po prawej pokazują obwód okostnowy. Pierwsza para słupków w każdym zestawie czterech słupków przedstawia dane od myszy poddanych usunięciu jajników, podczas gdy druga para słupków przedstawia dane od myszy poddanych pozorowanej operacji. [0039] Figura 18 przedstawia wyniki badań mechanicznych kości udowych po dwunastu tygodniach leczenia. Leczenie to kontrola (PBS; ciemne słupki) i ActRIIa-mFc (jasne słupki). Dwa słupki po lewej przedstawiają dane od myszy poddanych usunięciu jajników, podczas gdy dwa ostatnie słupki przedstawiają dane od myszy poddanych pozorowanej operacji. [0040] Figura 19 pokazuje skutki oddziaływania ActRIIa-mFc na objętość kości beleczkowej. [0041] Figura pokazuje skutki oddziaływania ActRIIa-mFc na architekturę beleczkowatą w dystalnej części kości udowej. [0042] Figura 21 pokazuje skutki oddziaływania ActRIIa-mFc na istotę korową kości. [0043] Figura 22 pokazuje skutki oddziaływania ActRIIa-mFc na wytrzymałość mechaniczną kości. 0044] Figura 23 pokazuje skutki oddziaływania różnych dawek ActRIIa-mFc na parametry kości, dla trzech różnych dawkowań. [004] Figura 24 pokazuje badanie histomorfometryczne kości, wskazujące, że ActRIIamFc ma podwójną aktywność, anaboliczną i przeciwresorpcyjną. [0046] Figura 2 pokazuje dodatkowe dane histomorfometryczne. [0047] Figura 26 pokazuje obrazy mysich kości udowych z myszy zdrowych i obarczonych nowotworem, oraz skutki oddziaływania leczenia ActRIIa-mFc na morfologię kości w modelu szpiczaka mnogiego. Myszy obarczone nowotworami szpiczaka mnogiego (T2) pokazują wyraźne nadżerki i degradację tkanki kostnej względem normalnych myszy (naive). Leczenie ActRIIa-mFc eliminuje ten efekt. [0048] Figura 27 pokazuje wyniki z badania klinicznego na ludziach, opisanego w Przykładzie, gdzie pole pod krzywą (AUC) i podawana dawka ActRIIa-hFc mają korelację liniową, niezależnie od tego, czy ActRIIa-hFc podawano dożylnie (IV) czy podskórnie (SC). [0049] Figura 28 pokazuje porównanie poziomów ActRIIa-hFc w surowicy, u pacjentów po podaniu IV lub SC. [000] Figura 29 pokazuje poziomy fosfatazy alkalicznej w kościach (BAP) w odpowiedzi

12 11 na różne poziomy dawki ActRIIa-hFc. BAP to marker anabolicznego wzrostu kości. [001] Figura pokazuje łączne skutki oddziaływania ActRIIa-mFc (RAP-011) i środka bisfosfonianowego (zoledronian) u myszy SZCZEGÓŁOWY OPIS WYNALAZKU 1. Streszczenie [002] Nadrodzina transformującego czynnika wzrostu beta (TGF-beta) zawiera szereg czynników wzrostu, które współdzielą powszechnie występujące elementy sekwencji i motywy strukturalne. Białka te są znane z wywierania efektów biologicznych na wiele różnych rodzajów komórek, zarówno u kręgowców, jak i bezkręgowców. Członkowie nadrodziny pełnią ważne funkcje podczas rozwoju zarodkowego, w tworzeniu wzorców i specyfikacji tkanek, i mogą wpływać na szereg procesów różnicowania, w tym odkładanie się tłuszczu, tworzenie się mięśni, powstawanie chrząstek, rozwój serca, tworzenie się krwinek, tworzenie się nerwów, i różnicowanie komórek nabłonkowych. Rodzina dzieli się na dwa główne odgałęzienia: odgałęzienia BMP/GDF i TGF-beta/Aktywina/BMP, których członkowie mają zróżnicowane, często uzupełniające działanie. Przez manipulowanie aktywnością członka rodziny TGF-beta, często możliwe jest wywołanie znaczących zmian fizjologicznych w organizmie. Na przykład, bydło ras Piedmontese oraz Belgian Blue niesie mutację typu utrata funkcji w genie GDF8 (zwanym również miostatyną), która powoduje wyraźny wzrost masy mięśniowej. Grobet et al., Nat Genet. 1997, 17(1):71-4. Ponadto, u ludzi, nieaktywne allele GDF8 są powiązane ze zwiększoną masą mięśniową oraz, podobno, wyjątkową siłą. Schuelke et al., N Engl J Med 04,: [003] Aktywiny to dimeryczne, polipeptydowe czynniki wzrostu, które należą do nadrodziny TGF-beta. Występują trzy główne postaci aktywiny (A, B i AB), które są homo/heterodimerami dwóch blisko spokrewnionych podjednostek β (β A β A, β B β B i β A β B ). Ludzki genom koduje również aktywinę C i aktywinę E, które są głównie ekspresjonowane w wątrobie. W nadrodzinie TGF-beta, aktywiny to unikalne i wielofunkcyjne czynniki, które mogą stymulować produkcję hormonu w komórkach jajników i łożyska, wspierać przeżycie komórek neuronów, oddziaływać na postęp cyklu komórkowego, dodatnio lub ujemnie, zależnie od rodzaju komórki, i indukować różnicowanie mezodermalne, co najmniej w zarodkach płazów (DePaolo et al., 1991, Proc Soc Ep Biol Med. 198: 00-12; Dyson et al., 1997, Curr Biol. 7:81-84; Woodruff, 1998, Biochem Pharmacol. :93-963). Ponadto, stwierdzono, że erytroidalny czynnik różnicowania (EDF) izolowany ze stymulowanych ludzkich monocytowych komórek białaczkowych okazał się być identyczny z aktywiną A (Murata et al., 1988, PNAS, 8:2434). Sugerowano, że aktywina A działa jako

13 naturalny, dodatni regulator powstawania erytrocytów w szpiku kostnym. W kilku tkankach, na sygnalizację aktywiny działa antagonistycznie jej powiązany heterodimer, inhibina. Na przykład, podczas uwalniania hormonu folikulotropowego (FSH) z przysadki, aktywina stymuluje wydzielanie i syntezę FSH, podczas gdy inhibina zapobiega wydzielaniu i syntezie FSH. Do innych białek, które mogą regulować bioaktywność aktywiny i/lub wiązać się do aktywiny zalicza się folistatynę (FS), białko powiązane z folistatyną (FSRP), i α 2 -makroglobulinę. [004] W przekazywaniu sygnałów TGF-β pośredniczą heteromeryczne kompleksy receptorów kinaz serynowych/treoninowych typu I i typu II, które fosforylują i aktywują znajdujące się poniżej w szlaku białka Smad, po stymulacji ligandem (Massague, 00, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1: ). Te receptory typu I i typu II to białka przezbłonowe, złożone z wiążącej ligand domeny pozakomórkowej, z regionem bogatym w cysteinę, domeny przezbłonowej i domeny cytoplazmatycznej, z prognozowaną swoistością serynową/treoninową. Receptory typu I są niezbędne do sygnalizacji; a receptory typu II są wymagane do wiązania ligandów i do ekspresji receptorów typu I. Receptory aktywiny typu I i II tworzą stabilny kompleks po związaniu ligandu, co skutkuje fosforylacją receptorów typu I przez receptory typu II. [00] Zidentyfikowano dwa powiązane receptory typu II, ActRIIa i ActRIIb, jako receptory typu II dla aktywin (Mathews i Vale, 1991, Cell 6: ; Attisanoet al., 1992, Cell 68:97-8). Poza aktywinami, ActRIIa i ActRIIb mogą biochemicznie oddziaływać z kilkoma innymi białkami rodziny TGF-β, w tym BMP7, Nodal, GDF8 i GDF1 1 (Yamashita et al., 199, J. Cell Biol. 1: ; Lee i McPherron, 01, Proc. Natl. Acad. Sci. 98: ; Yeo i Whitman, 01, Mol. Cell 7: ; Oh et al., 02, Genes Dev. 16:2749-4). ALK4 to pierwotny receptor typu I dla aktywin, szczególnie dla aktywiny A, a ALK-7 może równie dobrze służyć jako receptor dla aktywin, szczególnie dla aktywiny B. [006] Jak zademonstrowano w opisie, rozpuszczalny polipeptyd ActRIIa (sactriia), który pokazuje znaczącą preferencję w wiązaniu do aktywiny A, w przeciwieństwie do innych członków rodziny TGF-beta, takich jak GDF8 lub GDF11, jest skuteczny w stymulowaniu wzrostu kości i zwiększaniu gęstości kości in vivo. Nie chcąc wiązać się z jakimkolwiek określonym mechanizmem, oczekuje się, że efekt sactriia jest wywoływany głównie poprzez efekt antagonistyczny względem aktywiny, przy uwzględnieniu bardzo silnego wiązania aktywiny (pikomolarna stała dysocjacji) wykazywanego przez określony konstrukt sactriia użyty w tych badaniach. Niezależnie od mechanizmu, jak wynika z danych przedstawionych w opisie, antagoniści ActRIIa-aktywina zwiększają gęstość kości u nor-

14 malnych myszy, w mysich modelach osteoporozy i w mysich modelach szpiczaka mnogiego. Należy odnotować, że kość to tkanka dynamiczna, z wzrostem lub kurczeniem, i zwiększoną lub zmniejszoną gęstością, w zależności od równowagi czynników, które tworzą kość i stymulują mineralizację (głównie osteoblasty) i czynników, które niszczą i demineralizują kość (głównie osteoklasty). Wzrost kości i mineralizację można zwiększać, przez podwyższanie ilości produktywnych czynników, przez obniżanie ilości destruktywnych czynników, lub jedno i drugie. Pojęcia stymulować wzrost kości i zwiększać mineralizację kości. dotyczą dostrzegalnych, fizycznych zmian w kości i zamierzone są, jako neutralne względem mechanizmu, za pomocą którego zachodzą zmiany w kości. [007] Mysie modele osteoporozy i wzrostu kości/gęstości, które stosowano w badaniach w opisie są uważane za wysoce predykcyjne pod kątem skuteczności u ludzi, i tym samym, polipeptydy ActRIIa i innych antagonistów aktywiny-actriia można stosować do stymulowania wzrostu kości i zwiększania gęstości kości u ludzi. Antagoniści aktywiny-actriia obejmują, na przykład, wiążące aktywinę rozpuszczalne polipeptydy ActRIIa, przeciwciała, które wiążą się do aktywiny (szczególnie podjednostki aktywiny A lub B, określane również jako βa lub βb) i zakłócają wiązanie ActRIIa, przeciwciała, które wiążą się do ActRIIa i zakłócają wiązanie aktywiny, nie będące przeciwciałami białka wybrane do wiązania aktywiny lub ActRIIa (patrz np. WO/02/088171, WO/ 06/0689, i WO/02/03292 co do przykładów takich białek i sposobów projektowania i selekcji takich reagentów o powinowactwie wiązania, nie będących przeciwciałami), i randomizowane peptydy wybierane do wiązania aktywiny lub ActRIIa, często dołączone do domeny Fc. Dwa różne białka (lub inne ugrupowania) z aktywnością wiązania aktywiny lub ActRIIa, szczególnie substancje wiążące aktywinę typu I (np. rozpuszczalny receptor aktywiny typu I) i typu II (np. rozpuszczalny receptor aktywiny typu II) miejsca wiązania, odpowiednio, można łączyć ze sobą, w celu utworzenia bifunkcjonalnej cząsteczki wiążącej. Aptamery kwasu nukleinowego, drobne cząsteczki i inne środki, które inhibują oś sygnalizacji aktywina-actriia. Różne białka mają aktywność antagonisty aktywiny-actriia, w tym inhibina (tj. podjednostka inhibiny alfa), chociaż inhibina nie antagonizuje aktywiny w sposób uniwersalny, we wszystkich tkankach, folistatyna (np. folistatyna-288 i folistatyna- 31), FSRP, aktywina C, alfa(2)-makroglobulina i M8A (zmiana metioniny na alaninę w pozycji 8) mutant aktywiny-a. Na ogół, alternatywne postaci aktywiny, szczególnie te ze zmianami w domenie wiążącej receptora typu I mogą wiązać się do receptorów typu II i nie prowadzą do utworzenia aktywnych kompleksów potrójnych, zatem działają jako antagoniści. Dodatkowo, kwasy nukleinowe, takie jak cząsteczki antysensowe, sirnas lub rybozymy, które inhibują aktywinę A, B, C lub E, lub, szczególnie, ekspresję ActRIIa można

15 stosować jako antagonistów aktywiny-actriia. Korzystnie, antagonista aktywiny-actriia do zastosowania, będzie wykazywać swoistość w inhibowaniu sygnalizacji, w której pośredniczy aktywina, versus inni członkowie rodziny TGF-beta, a szczególnie względem GDF8 i GDFII. Rozpuszczalne białka ActRIIb wiążą się do aktywiny, jednakże, białko typu dzikiego nie wykazuje znaczącej swoistości w wiązaniu do aktywiny versus GDF8/11, a wstępne eksperymenty sugerują, że to białko nie zapewnia pożądanego oddziaływania na kość, podczas gdy powoduje również znaczący wzrost masy mięśniowej. Jednakże, zidentyfikowano zmienione postaci ActRIIb, o różnych właściwościach wiązania (patrz, np. WO 06/012627, str. -9 i te białka mogą osiągać pożądany wpływ na kość. Natywnemu lub zmienionemu ActRIIb można nadać dodatkową swoistość względem aktywiny, przez sprzęganie z drugim, selektywnym dla aktywiny środkiem wiążącym. [008] Pojęcia stosowane w tej specyfikacji na ogół mają swoje zwyczajowe znaczenia w danej dziedzinie, w ramach kontekstu wynalazku, oraz w określonym kontekście, w którym stosowane jest każde pojęcie. Niektóre pojęcia omówiono poniżej lub w innym miejscu specyfikacji, dla zapewnienia dodatkowych wytycznych praktykowi, poprzez opisanie kompozycji i sposobów według wynalazku i ich sporządzania oraz stosowania. [009] Około i w przybliżeniu mają na ogół oznaczać dopuszczalny poziom błędu co do mierzonej ilości, przy uwzględnieniu natury lub precyzji pomiarów. Typowo, przykładowe stopnie błędu mieszczą się w granicach procent (%), korzystnie w granicach %, i korzystniej w granicach % danej wartości lub zakresu wartości. [0060] Alternatywnie, i szczególnie w układach biologicznych, pojęcia około i w przybliżeniu mogą oznaczać wartości, które są w ramach rzędu wielkości, korzystnie w ramach -krotności i korzystniej w ramach 2-krotności danej wartości. Ilości numeryczne, podane w opisie są przybliżeniami, o ile nie podano inaczej, co oznacza, że pojęcie około lub w przybliżeniu można wywnioskować, gdy nie jest wyraźnie zaznaczone. [0061] Sekwencje można porównywać ze sobą, w tym sekwencję typu dzikiego do jednego lub większej liczby mutantów (warianty sekwencji). Takie porównania typowo obejmują nałożenia sekwencji polimeru, np. przy użyciu programów do nakładania sekwencji i/lub algorytmów, które są dobrze znane ze stanu techniki (na przykład, BLAST, FASTA i MEGALIGN, aby wymienić tylko kilka). Znawca może łatwo zrozumieć, że, w takich nałożeniach, gdzie mutacja zawiera insercję lub delecję reszty, nałożenie sekwencji wprowadzi przerwę (typowo zaznaczaną jako myślnik lub A ) w sekwencji polimeru nie zawierającej wprowadzonej lub brakującej reszty. [0062] Homoliczny we wszystkich swoich postaciach gramatycznych i odmianach pisowni, dotyczy związku pomiędzy dwoma białkami, które posiadają wspólne pochodze-

16 1 1 2 nie ewolucyjne, w tym białka z nadrodzin w tym samym gatunku organizmu, jak również homologicznych białek z różnych gatunków organizmów. Takie białka (i kodujące je kwasy nukleinowe) mają homologię sekwencji, co jest odzwierciedlone w ich podobieństwie sekwencji, czy to w pojęciach procentowej identyczności, lub obecności określonych reszt lub motywów i konserwatywnych pozycji. [0063] Pojęcie podobieństwo sekwencji, we wszystkich swoich postaciach gramatycznych, dotyczy stopnia identyczności lub zgodności pomiędzy sekwencjami kwasu nukleinowego lub sekwencjami aminokwasowymi, które mogą, lub nie, mieć wspólne pochodzenie ewolucyjne. [0064] Jednakże, w powszechnym użyciu i tymże zgłoszeniu, pojęcie homologiczny, gdy modyfikowane jest takim przysłówkiem jak wysoce może dotyczyć podobieństwa sekwencji i może, lub nie, dotyczyć wspólnego pochodzenia ewolucyjnego. 2. Polipeptydy ActRIIa [006] Według opisu, pojęcie ActRIIa dotyczy białek rodziny receptorów aktywiny typu IIa (ActRIIa) z dowolnego gatunku i wariantów pochodzących z takich białek ActRIIa poprzez mutagenezę lub inną modyfikację. Odniesienie do ActRIIa w opisie jest rozumiane jako odniesienie do dowolnej z obecnie zidentyfikowanych postaci. Członkowie rodziny ActRIIa to na ogół białka przezbłonowe, złożone z wiążącej ligand domeny pozakomórkowej, z regionem bogatym w cysteinę, domeny przezbłonowej i domeny cytoplazmatycznej, z prognozowaną aktywnością kinazy serynowej/treoninowej. [0066] Pojęcie polipeptyd ActRIIa obejmuje polipeptydy zawierające dowolny naturalnie występujący polipeptyd członek rodziny ActRIIa, jak również dowolne jego warianty (w tym mutanty, fragmenty, fuzje i postaci peptydomimetyczne), które zachowują użyteczną aktywność. Na przykład, polipeptydy ActRIIa obejmują polipeptydy pochodzące z sekwencji dowolnego znanego ActRIIa, mającego sekwencję co najmniej w około 80% identyczną z sekwencją polipeptydu ActRIIa, i korzystnie co najmniej 8%, 90%, 9%, 97%, 99% lub większą identyczność. Na przykład, polipeptyd ActRIIa według wynalazku może wiązać się do i inhibować funkcję białka ActRIIa i/lub aktywiny. Polipeptyd ActRIIa może stymulować wzrost kości i mineralizację kości. Przykłady polipeptydów ActRIIa obejmują ludzki ActRIIa prekursor polipeptydowy (SEQ ID NO: 1) i rozpuszczalne ludzkie polipeptydy ActRIIa (np. SEQ ID NOs: 2, 3, 7 i 12). [0067] Sekwencja ludzkiego białka prekursorowego ActRIIa jest jak następuje:

17 16 [0068] Peptyd sygnałowy podkreślono jednokrotnie; domenę pozakomórkową podano wytłuszczoną czcionką, a potencjalne połączone wiązaniem N-glikozydowym miejsca glikozylacji zaznaczono podwójnym podkreśleniem. [0069] Sekwencja ludzkiego, poddanego obróbce, rozpuszczalnego (pozakomórkowo) polipeptydu ActRIIa jest jak następuje: ILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFATWKNISG SIEIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNMCNEKFSYFP EMEVTQPTSNPVTPKPP (SEQ ID NO: 2) [0070] C-końcowy ogon domeny pozakomórkowej podkreślono. Sekwencja z usuniętym ogonem (sekwencja 1) jest jak następuje: [0071] Sekwencja kwasu nukleinowego, kodującego ludzkie białko prekursorowe ActRIIa jest jak następuje (nukleotydy wpisu Genbank NM_001616): 1

18 17 [0072] Sekwencja kwasu nukleinowego kodującego ludzki rozpuszczalny (pozakomórkowy) polipeptyd ActRIIa jest jak następuje: [0073] Według opisu, pojęcie rozpuszczalny polipeptyd ActRIIa na ogół dotyczy poli-

19 peptydów zawierających domenę pozakomórkową białka ActRIIa. Pojęcie rozpuszczalny polipeptyd ActRIIa według opisu, obejmuje dowolną naturalnie występującą domenę pozakomórkową białka ActRIIa, jak również dowolne jej warianty (w tym mutanty, fragmenty i postaci peptydomimetyczne). Polipeptyd ActRIIa wiążący aktywinę oznacza taki, który zachowuje zdolność wiązania się do aktywiny, szczególnie aktywiny AA, AB lub BB. Korzystnie, wiążący aktywinę polipeptyd ActRIIa będzie wiązać się do aktywiny AA ze stałą dysocjacji 1 nm lub mniejszą. Sekwencje aminokwasowe ludzkiego białka prekursorowego ActRIIa zapewniono poniżej. Domena pozakomórkowa białka ActRIIa wiąże się do aktywiny i jest na ogół rozpuszczalna, a zatem można ją nazwać rozpuszczalnym, wiążącym aktywinę polipeptydem ActRIIa. Przykłady rozpuszczalnych, wiążących aktywinę polipeptydów ActRIIa obejmują rozpuszczalny polipeptyd zilustrowany na SEQ ID NOs: 2, 3, 7, 12 i 13. SEQ ID NO:7 jest określana jako ActRIIa-hFc, i jest dalej opisywana w przykładach. Inne przykłady rozpuszczalnych, wiążących aktywinę polipeptydów ActRIIa zawierają sekwencję sygnałową, oprócz domeny pozakomórkowej białka ActRIIa, na przykład, sekwencję liderową melityny miodu pszczelego (SEQ ID NO: 8), lider aktywatora tkankowego plazminogenu (TPA) (SEQ ID NO: 9) lub natywny lider ActRIIa (SEQ ID NO: ). Polipeptyd ActRIIa-hFc, zilustrowany na SEQ ID NO:13 wykorzystuje lider TPA. [0074] Funkcjonalnie aktywne fragmenty polipeptydów ActRIIa można otrzymać poprzez badania przesiewowe polipeptydów produkowanych rekombinacyjnie z odpowiadających fragmentów kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd ActRIIa. Dodatkowo, fragmenty można syntetyzować chemicznie, przy użyciu technik znanych ze stanu techniki, takich jak konwencjonalna chemia Merrifielda w fazie stałej, f-moc lub t-boc. Fragmenty można produkować (rekombinacyjnie lub poprzez syntazę chemiczną) i testować, w celu zidentyfikowania tych fragmentów peptydylowych, które mogą działać jako antagoniści (inhibitory) białka ActRIIa lub sygnalizacji, w której pośredniczy aktywina. [007] Funkcjonalnie aktywne warianty polipeptydów ActRIIa można otrzymać poprzez badania przesiewowe bibliotek modyfikowanych polipeptydów, produkowanych rekombinacyjnie z odpowiadających mutagenizowanych kwasów nukleinowych kodujących polipeptyd ActRIIa. Warianty można produkować i testować, w celu zidentyfikowania tych, które mogą działać jako antagoniści (inhibitory) białka ActRIIa lub sygnalizacji, w której pośredniczy aktywina. Funkcjonalny wariant polipeptydów ActRIIa może zawierać sekwencję aminokwasową, która jest w co najmniej 7% identyczna z sekwencją aminokwasową wybraną spośród SEQ ID NOs: 2 lub 3. W niektórych przypadkach, funkcjonalny wariant ma sekwencję aminokwasową co najmniej w 80%, 8%, 90%, 9%, 97%, 98%,

20 % lub 0% identyczną z sekwencją aminokwasową wybraną spośród SEQ ID NOs: 2 lub 3. [0076] Funkcjonalny warianty można generować poprzez modyfikowanie struktury polipeptydu ActRIIa do takich celów, jak wzmacnianie skuteczności terapeutycznej lub stabilności (np. dozwolony okres przechowywania ex vivo i odporność na degradację proteolityczną in vivo). Takie modyfikowany polipeptydy ActRIIa, po doborze z zachowaniem wiązania aktywiny, są uważane za funkcjonalnie równorzędne wobec naturalnie występujących polipeptydów ActRIIa. Modyfikowane polipeptydy ActRIIa można również produkować, przykładowo, poprzez substytucję, delecję lub addycję aminokwasu. Przykładowo, racjonalnym jest oczekiwanie, że izolowana zamiana leucyny na izoleucynę lub walinę, asparaginianu na glutaminian, treoniny na serynę lub podobna zamiana aminokwasu na powiązany strukturalnie aminokwas (np. mutacje konserwatywne) nie będzie mieć dużego wpływu na aktywność biologiczną powstałej cząsteczki. Konserwatywnymi zamianami są te, które zachodzą w obrębie rodziny aminokwasów, które są powiązane pod względem swoich łańcuchów bocznych. To, czy zmiana w sekwencji aminokwasowej danego polipeptydu ActRIIa doprowadzi do powstania funkcjonalnego homologu, można łatwo określić, poprzez ocenę zdolności wariantu polipeptydu ActRIIa do wytworzenia odpowiedzi w komórkach, w sposób podobny do polipeptydu ActRIIa typu dzikiego. [0077] Można zawrzeć specyficzne mutacje w polipeptydach ActRIIa, tak, żeby zmienić glikozylację polipeptydu. Takie mutacje można dobierać w celu wprowadzenia lub wyeliminowania jednego lub więcej miejsc glikozylacji, takich jak miejsca glikozylacji połączone wiązaniem O- lub N-glikozydowym. Powiązane za pomocą asparaginy miejsca rozpoznawane glikozylacji na ogół zawierają sekwencję tripeptydową, asparagina-xtreonina (lub asparaginy-x-seryna) (gdzie X oznacza dowolny aminokwas), która jest swoiście rozpoznawana przez odpowiednie komórkowe enzymy glikozylacyjne. Zmian można również dokonać poprzez addycję lub substytucję, jednej lub więcej reszt seryny lub treoniny do sekwencji polipeptydu ActRIIa typu dzikiego (do miejsc glikozylacji z wiązaniem O-glikozydowym). Szereg aminokwasowych substytucji lub delecji w jednej z lub obu pozycji pierwszego lub trzeciego aminokwasu miejsca rozpoznawania glikozylacji (i/lub delecja aminokwasu w drugiej pozycji) skutkuje brakiem glikozylacji w modyfikowanej tripeptydowej sekwencji. Kolejnym sposobem zwiększania liczby ugrupowań węglowodanowych na polipeptydzie ActRIIa jest chemiczne lub enzymatyczne sprzęganie glikozydów do polipeptydu ActRIIa. Zależnie od użytego modelu sprzęgania, cukier(-ry) mogą być dołączone do (a) argininy i histydyny; (b) wolnych grup karboksylowych; (c) wolnych grup tiolowych, takich jak te cysteiny; (d) wolnych grup hydroksylowych, takich

21 1 2 3 jak te seryny, treoniny lub hydroksyproliny; (e) reszt aromatycznych, takich jak te fenyloalaniny, tyrozyny lub tryptofanu; lub (f) grupy amidowej glutaminy. Sposoby te opisano w WO 87/03 opublikowanym 11 września 1987 r., i w Aplin i Wriston (1981) CRC Crit. Rev. Biochem., str Usunięcie jednego lub więcej ugrupowań węglowodanowych obecnych na polipeptydzie ActRIIa można dokonać chemicznie i/lub enzymatycznie. Chemiczna deglikozylacja może wymagać, na przykład, ekspozycji polipeptydu ActRIIa na związek kwasu trifluorometanosulfonowego lub równorzędny związek. To traktowanie skutkuje odcięciem większości lub wszystkich cukrów, za wyjątkiem cukru wiążącego (Nacetyloglukozamina lub N-acetylogalaktozamina), podczas gdy pozostawiająca sekwencję aminokwasową w stanie nienaruszonym chemiczna deglikozylacja jest dokładniej opisywana przez Hakimuddin et al. (1987) Arch. Biochem. Biophys. 29: 2 i przez Edge et al. (1981) Anal. Biochem. 118:131. Odcinanie enzymatyczne ugrupowań węglowodanowych na polipeptydach ActRIIa można osiągnąć poprzez użycie szeregu endo- i egzoglikozydaz, jak opisano w Thotakura et al. (1987) Meth. Enzymol. 138:. Sekwencję polipeptydu ActRIIa można dostosowywać, na miarę potrzeb, w zależności od rodzaju użytego układu ekspresji, jako że ssacze, drożdżowe, owadzie i roślinne komórki mogą wszystkie wprowadzać różniące się wzory glikozylacji, na które może oddziaływać sekwencja aminokwasowa peptydu. Na ogół, białka ActRIIa do stosowania u ludzi będą ekspresjonowane w ssaczej linii komórkowej, która zapewnia właściwą glikozylację, takiej jak linie komórkowe HEK293 lub CHO, chociaż oczekuje się, że inne przeznaczone do ekspresji ssacze linie komórkowe, drożdżowe linie komórkowe, z inżynierowanymi enzymami glikozylującymi i komórki owadzie będą równie użyteczne. [0078] W opisie przedstawiono sposób generowania mutantów, szczególnie zestawów kombinatorycznych mutantów polipeptydu ActRIIa, jak również mutantów skróconych; pule kombinatorycznych mutantów są szczególnie użyteczne do identyfikowania sekwencji funkcjonalnych wariantów. Celem badań przesiewowych takich kombinatorycznych bibliotek może być generowanie, na przykład, wariantów polipeptydu ActRIIa, które mogą działać albo jako agoniści lub antagoniści, lub alternatywnie, którzy posiadają całkiem nowe właściwości. Poniżej zapewniono szereg oznaczeń badań przesiewowych, i takie oznaczenia można stosować do oceny wariantów. Na przykład, wariant polipeptydu ActRIIa można badać przesiewowo pod kątem zdolności do wiązania ligandu ActRIIa, zapobiegania wiązaniu ligandu ActRIIa do polipeptydu ActRIIa lub zakłócania sygnalizacji wywołanej ligandem ActRIIa. [0079] Aktywność polipeptydu ActRIIa lub jego wariantów można również testować w oznaczeniu komórkowym lub in vivo. Na przykład, można oceniać oddziaływanie warian-

22 tu polipeptydu ActRIIa na ekspresję genów zaangażowanych w produkcję kości lub destrukcję kości. Można to, na miarę potrzeb, wykonywać w obecności jednego lub więcej rekombinowanych ligandów białek ActRIIa (np. aktywina), a komórki można transfekować, w celu wyprodukowania polipeptydu ActRIIa i/lub jego wariantów, i opcjonalnie, ligandu ActRIIa. Podobnie, polipeptyd ActRIIa można podawać myszom lub innemu zwierzęciu, i można oceniać jedną lub więcej właściwości kości, taką jak gęstość lub objętość kości. Można również oceniać tempo gojenia złamań kości. Absorpcjometria podwójnej energii promieniowania rentgenowskiego (DEXA) jest dobrze udokumentowaną, nieinwazyjną, ilościową techniką do oceny gęstości kości u zwierzęcia. U ludzi, można stosować ośrodkowe systemy DEXA do oceny gęstości kości w kręgosłupie i miednicy. Są to najlepsze predyktory ogólnej gęstości kości. Obwodowe systemy DEXA można stosować do oceny gęstości kości w kościach obwodowych, w tym, na przykład, kości ręki, nadgarstka, kostki i stopy. Tradycyjne systemy obrazowania rentgenowskiego, w tym skany CAT, można stosować do oceny wzrostu kości i gojenia złamań. Można również oceniać wytrzymałość mechaniczną kości. [0080] Można generować otrzymywanie kombinatorycznych wariantów, które mają selektywną lub na ogół zwiększoną moc względem naturalnie występującego polipeptydu ActRIIa. Podobnie, mutageneza może prowadzić do powstawania wariantów, które mają wewnątrzkomórkowe okresy półtrwania dramatycznie różne od odpowiadającego polipeptydu ActRIIa typu dzikiego. Na przykład, zmienione białko można uczynić bardziej stabilnym lub mniej stabilnym względem degradacji proteolitycznej lub innych procesów komórkowych, które prowadzą do degradacji, lub inaktywacji innego rodzaju natywnego polipeptydu ActRIIa. Takie warianty, i kodujące je geny, można wykorzystywać do zmieniania poziomów polipeptydu ActRIIa przez modulowanie okresu półtrwania polipeptydów ActRIIa. Przykładowo, krótki okres półtrwania może prowadzić do uzyskania bardziej przejściowych skutków biologicznych i umożliwić ściślejszą kontrolę poziomów rekombinowanego polipeptydu ActRIIa u pacjenta. W białku fuzyjnym Fc mutacje można wprowadzać w łączniku (o ile w ogóle) i/lub części Fc, w celu zmiany okresu półtrwania białka. [0081] Bibliotekę kombinatoryczną można utworzyć poprzez bibliotekę zdegenerowaną genów kodujących bibliotekę polipeptydów, z których każdy zawiera co najmniej część potencjalnych sekwencji polipeptydu ActRIIa. Przykładowo, mieszaninę syntetycznych oligonukleotydów można enzymatycznie ligować do sekwencji genu, tak, że zdegenerowany zestaw potencjalnych sekwencji polipeptydu ActRIIa ulega ekspresji jako poszczególne polipeptydy, lub alternatywnie, jako zestaw większych białek fuzyjnych (np. do prezentacji fagowej).

23 [0082] Istnieje wiele sposobów generowania biblioteki potencjalnych homologów ze zdegenerowanej sekwencji oligonukleotydowej. Chemiczną syntezę zdegenerowanej sekwencji genu można wykonać w zautomatyzowanym syntetyzerze DNA, a syntetyczne geny następnie ligować do odpowiednich wektorów do ekspresji. Synteza zdegenerowanych oligonukleotydów jest dobrze znana ze stanu techniki (patrz na przykład, Narang, SA (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al., (1981) Recombinant DNA, Proc. 3rd Cleveland Sympos. Macromolecules, ed. AG Walton, Amsterdam: Elsevier str ; Itakura et al., (1984) Annu. Rev. Biochem. 3:323; Itakura et al., (1984) Science 198:6; Ike et al., (1983) Nucleic Acid Res. 11:477). Takie techniki stosowano w ukierunkowanej ewolucji innych białek (patrz, na przykład, Scott et al., (1990) Science 249: ; Roberts et al., (1992) PNAS USA 89: ; Devlin et al., (1990) Science 249: ; Cwirla et al., (1990) PNAS USA 87: ; jak również patenty amerykańskie nr:,223,409,,198,346 i,096,81). [0083] Alternatywnie, można wykorzystywać inne rodzaje mutagenezy do generowania biblioteki kombinatorycznej. Na przykład, warianty polipeptydów ActRIIa można generować i izolować z biblioteki poprzez badania przesiewowe przy użyciu, na przykład, mutagenezy skanowania alaninami i podobnych (Ruf et al., (1994) Biochemistry 33:16-172; Wang et al., (1994) J. Biol. Chem. 269:9-99; Balint et al., (1993) Gene 137:9-118; Grodberg et al., (1993) Eur. J. Biochem. 218:97-601; Nagashima et al., (1993) J. Biol. Chem. 268: ; Lowman et al., (1991) Biochemistry : ; i Cunningham et al., (1989) Science 244:81-8), poprzez mutagenezę skanowania łącznikiem (Gustin et al., (1993) Virology 193:63-660; Brown et al., (1992) Mol. Cell Biol. 12: ; McKnight et al., (1982) Science 232:316); przez mutagenezę nasyceniową (Meyers et al., (1986) Science 232:613); przez mutagenezę PCR (Leung et al., (1989) Method Cell Mol Biol 1:11-19); lub mutagenezę losową, w tym chemiczną mutagenezę, itp. (Miller et al., (1992) A Short Course in Bacterial Genetics, CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY; i Greener et al., (1994) Strategies in Mol Biol 7:32-34). Mutageneza skanowania łącznikiem, szczególnie w układzie kombinatorycznym, to atrakcyjny sposób do identyfikowania skróconych (bioaktywnych) postaci polipeptydów ActRIIa. [0084] Szeroki zakres technik jest znanych ze stanu techniki, do badań przesiewowych produktów genów z kombinatorycznych bibliotek, uzyskanych za pomocą mutacji punktowych i skróceń, oraz, o czym mowa, do badań przesiewowych bibliotek cdna dla produktów genów mających określoną właściwość. Takie techniki będzie na ogół można dostosowywać do szybkich badań przesiewowych bibliotek genów, generowanych przy pomocy kombinatorycznej mutagenezy polipeptydów ActRIIa. Najpowszechniej stosowane

24 techniki do badań przesiewowych dużych bibliotek genów typowo obejmują klonowanie biblioteki genów do zdolnych do replikacji wektorów ekspresyjnych, transformowanie odpowiednich komórek powstałą biblioteką wektorów i ekspresjonowane kombinatorycznych genów w warunkach, w których wykrywanie pożądanej aktywności ułatwia względnie prosta izolacja wektora kodującego gen, którego produkt wykryto. Korzystne oznaczenia obejmują oznaczenia wiązania aktywina i oznaczenie sygnalizacji komórkowej, w której uczestniczy aktywina. [008] Polipeptydy ActRIIa według wynalazku mogą dodatkowo zawierać potranslacyjne modyfikacje, oprócz jakichkolwiek, które są naturalnie obecne w polipeptydach ActRIIa. Takie modyfikacje obejmują, w sposób nieograniczający, acetylowanie, karboksylowanie, glikozylację, fosforylację, lipidacja i acylowanie. Jako wynik, modyfikowane polipeptydy ActRIIa mogą zawierać nie-aminokwasowe elementy, takie jak glikole polietylenowe, lipidy, poli- lub mono-sacharydy i fosforany. Skutki oddziaływania takich pozaaminokwasowych elementów na funkcjonalność polipeptydu ActRIIa można badać według opisu, dla innych wariantów polipeptydów ActRIIa. Gdy polipeptyd ActRIIa jest produkowany w komórkach poprzez cięcie natywnej postaci polipeptydu ActRIIa, obróbka potranslacyjna może również być ważna dla prawidłowego fałdowania i/lub działania białka. Różne komórki (takie jak CHO, HeLa, MDCK, 293, WI38, NIH-3T3 lub HEK293) mają specyficzną maszynerię komórkową i charakterystyczne mechanizmy takich aktywności potranslacyjnych, i można je wybrać w celu zapewnienia prawidłowej modyfikacji i obróbki polipeptydów ActRIIa. [0086] Funkcjonalne warianty lub modyfikowane postaci polipeptydów ActRIIa mogą zawierać białka fuzyjne, mające co najmniej część polipeptydów ActRIIa i jedną lub więcej domen fuzyjnych. Dobrze znane przykłady takich domen fuzyjnych obejmują, w sposób nieograniczający, polihistydynę, Glu-Glu, glutationo-s-transferazę (GST), tioredoksynę, białko A, białko G, region stały łańcucha ciężkiego immunoglobuliny (Fc), białko wiążące maltozę (MBP), lub ludzką albuminę surowicy. Domenę fuzyjną można dobrać tak, aby nadać pożądaną właściwość. Na przykład, niektóre domeny fuzyjne są szczególnie użyteczne do izolacji białek fuzyjnych poprzez chromatografię powinowactwa. Dla celów oczyszczania w oparciu o powinowactwo, stosuje się odpowiednie matryce do chromatografii powinowactwa, takie jak żywice sprzęgane z glutationem, amylazą, i niklem lub kobaltem. Wiele takich matryc jest dostępnych w postaci zestawu, takich jak system oczyszczania Pharmacia GST i system QIAexpress (Qiagen) użyteczne z partnerami fuzji (HlS 6 ). Jako inny przykład, domenę fuzyjną można dobierać tak, aby ułatwić wykrywanie polipeptydów ActRIIa. Przykłady takich domen do wykrywania obejmują różne fluore-

25 scencyjne białka (np. GFP) jak również znaczniki epitopów, którymi są zazwyczaj krótkie sekwencje peptydowe, dla których dostępne jest swoiste przeciwciało. Dobrze znane znaczniki epitopów, dla których są łatwo dostępne swoiste przeciwciała monoklonalne obejmują znaczniki FLAG, hemaglutyninę wirusa grypy (HA) i znaczniki c-myc. W niektórych przypadkach, domeny fuzyjne mają miejsce cięcia preoteazy, takiej jak dla czynnika Xa lub trombiny, co umożliwia odnośnej proteazie częściowo trawić białka fuzyjne i w ten sposób uwalniać z nich rekombinowane białka. Uwolnione białka można następnie izolować z domeny fuzyjnej przez późniejszy rozdział chromatograficzny. Polipeptyd ActRIIa można sprzęgać z domeną, która stabilizuje polipeptyd ActRIIa in vivo (domena stabilizatora ). Przez stabilizowanie rozumie się dowolne działanie, które wydłuża okres półtrwania w surowicy, niezależnie od tego, czy jest to spowodowane zmniejszonym niszczeniem, zmniejszonym klirensem nerkowym, czy innym efektem farmakokinetycznym. Fuzje z częścią Fc immunoglobuliny są znane z nadawania pożądanych właściwości farmakokinetycznych szerokiemu zakresowi białek. Podobnie, fuzje z ludzką albuminą surowicy mogą nadać pożądane właściwości. Inne rodzaje domen fuzyjnych, które można wybrać obejmują multimeryzację (np. dimeryzację, tetrameryzację) domen i funkcjonalnych domen (które nadają dodatkową funkcję biologiczną, taką jak dalsza stymulacja wzrostu kości lub wzrostu masy mięśniowej, jako pożądane). [0087] W charakterze specyficznego przykładu, białko fuzyjne może zawierać rozpuszczalną domenę pozakomórkową ActRIIa sprzężoną z domeną Fc (np. SEQ ID NO: 6). THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMI- SRTPEVTCWVD(A)VSHEDPEVKENWYVDGnVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCK(A)VSNKALPVP IEKTISKAKnGQPREPQVYTLPPSRE- EMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGnPFFLY- SKLTVDKSRWQQGMVFSCSVMHEALHN(A)HYTQKSL SLSPGK* [0088] Opcjonalnie, domena Fc ma jedną lub więcej mutacji w resztach takich jak Asp- 26, lizyna 322 i Asn-434. W niektórych przypadkach, mutant domeny Fc, mający jedną lub więcej tych mutacji (np. mutacja Asp-26) ma zredukowaną zdolność wiązania do receptorów Fc względem domeny Fc typu dzikiego. W innych przypadkach, mutant domeny Fc mający jedną lub więcej tych mutacji (np. mutacja Asn-434) ma zwiększoną zdolność wiązania do receptora Fc, powiązanego z MHC klasy I (FcRN) względem domeny Fc typu dzikiego. [0089] Jest zrozumiałym, że różne elementy białek fuzyjnych można aranżować w dowolny sposób, który jest zgodny z pożądaną funkcjonalnością. Na przykład, polipeptyd ActRIIa można umieszczać C-końcowo wobec heterologicznej domeny, lub, alternatywnie,

26 heterologiczną domenę można umieszczać C-końcowo wobec polipeptydu ActRIIa. Domena polipeptydu ActRIIa i heterologiczna domena nie muszą sąsiadować w białku fuzyjnym, i mogą być obecne dodatkowe domeny lub sekwencje aminokwasowe, C- lub N- końcowo względem dowolnej z domen, lub pomiędzy domenami. [0090] W niektórych przykładach wykonania, polipeptydy ActRIIa według wynalazku zawierają jedną lub więcej modyfikacji, które są zdolne do stabilizowania polipeptydów ActRIIa. Na przykład, takie modyfikacje wydłużają okres półtrwania in vitro polipeptydów ActRIIa, wydłużają okres półtrwania w krążeniu polipeptydów ActRIIa lub redukują degradację proteolityczną polipeptydów ActRIIa. Takie stabilizujące modyfikacje obejmują, w sposób nieograniczający; białka fuzyjne (w tym, na przykład, białka fuzyjne zawierające polipeptyd ActRIIa i domenę stabilizatora), modyfikacje miejsca glikozylacji (w tym, na przykład, addycja miejsca glikozylacji do polipeptydu ActRIIa) i modyfikacje ugrupowania węglowodanowego (w tym na przykład, usunięcie ugrupowania węglowodanowego z polipeptydu ActRIIa). W przypadku białek fuzyjnych, polipeptyd ActRIIa jest sprzężony z domeną stabilizatora, taką jak cząsteczka IgG (np. domena Fc). Jak zastosowano w opisie, pojęcie domena stabilizatora nie dotyczy wyłącznie domeny fuzyjnej (np. Fc) jak w przypadku białek fuzyjnych, ale również obejmuje niebiałkowe modyfikacje, takie jak ugrupowanie węglowodanowe, lub niebiałkowy polimer, taki jak glikol polietylenowy. [0091] Izolowane i/lub oczyszczone postaci polipeptydów ActRIIa, można izolować z, lub w inny sposób zasadniczo wolnych od innych białek. Polipeptydy ActRIIa będą na ogół produkowane na drodze ekspresji z rekombinowanych kwasów nukleinowych. 3. Kwasy nukleinowe kodujące polipeptydy ActRIIa (nie stanowi części wynalazku) [0092] W opisie ujawniono izolowane i/lub rekombinowane kwasy nukleinowe kodujące dowolne polipeptydy ActRIIa (np. rozpuszczalne polipeptydy ActRIIa), w tym fragmenty, funkcjonalne warianty i białka fuzyjne ujawnione w opisie. Na przykład, SEQ ID NO: 4 koduje naturalnie występujący ludzki prekursor polipeptydu ActRIIa, podczas gdy SEQ ID NO: koduje domenę pozakomórkową ActRIIa po obróbce. Przedmiotowe kwasy nukleinowe mogą być pojedynczo-niciowe lub podwójnoniciowe. Takie kwasy nukleinowe mogą być cząsteczkami DNA lub RNA. Te kwasy nukleinowe można stosować, na przykład, w sposobach do wytwarzania polipeptydów ActRIIa lub jako bezpośrednie środki terapeutyczne (np. w podejściu typu terapia genowa). [0093] W niektórych aspektach, przedmiotowe kwasy nukleinowe kodujące polipeptydy ActRIIa są dodatkowo rozumiane jako obejmujące kwasy nukleinowe, które są wariantami SEQ ID NO: 4 lub. Wariantowe sekwencje nukleotydowe obejmują sekwencje, które różnią się jedną lub więcej substytucjami, addycjami lub delecjami nukleotydów, takie jak

27 warianty alleliczne. [0094] Również, ujawnione w opisie są sekwencje izolowanego lub rekombinowanego kwasu nukleinowego, które są w co najmniej 80%, 8%, 90%, 9%, 97%, 98%, 99% lub 0% identyczne z SEQ ID NO: 4 lub. Znawca dostrzeże, że można zapewnić sekwencje kwasu nukleinowego komplementarne do SEQ ID NO: 4 lub, i warianty SEQ ID NO: 4 lub. Sekwencje kwasu nukleinowego ujawnione w opisie mogą oznaczać izolowaną, rekombinowaną i/lub sprzężoną z heterologiczną sekwencją nukleotydową, lub w bibliotece DNA. [009] Kwasy nukleinowe mogą również obejmować sekwencje nukleotydowe, które hybrydyzują w wysoce rygorystycznych warunkach do sekwencji nukleotydowej oznaczonej w SEQ ID NO: 4 lub, komplementarnej sekwencji SEQ ID NO: 4 lub, lub ich fragmentów. Jak omówiono powyżej, znawca łatwo zrozumie, że odpowiednie pod względem rygorystyczności warunki, które promują hybrydyzację DNA mogą być zróżnicowane. Znawca łatwo zrozumie, że odpowiednie pod względem rygorystyczności warunki, które promują hybrydyzację DNA mogą być zróżnicowane. Na przykład, można prowadzić hybrydyzację w 6,0 x chlorku sodu/cytrynianie sodu (SSC) w około 4 C, z następczym odmywaniem 2,0 x SSC w 0 C. Na przykład, stężenie soli na etapie odmywania można wybrać spośród niskiej rygorystyczności około 2,0 x SSC w 0 C do wysokiej rygorystyczności około 0,2 x SSC w 0 C. Dodatkowo, temperaturę na etapie odmywania można zwiększać od warunków niskiej rygorystyczności w temperaturze pokojowej, około 22 C, do warunków wysokiej rygorystyczności w około 6 C. Zarówno temperatura, jak i sól mogą być zróżnicowane, lub temperaturę lub stężenie soli można utrzymywać na stałym poziomie, podczas gdy zmienia się inną zmienną. W opisie zaprezentowano kwasy nukleinowe, które hybrydyzują w warunkach niskiej rygorystyczności, 6 x SSC w temperaturze pokojowej, z następczym odmywaniem 2 x SSC w temperaturze pokojowej. [0096] Izolowane kwasy nukleinowe, które różnią się od kwasów nukleinowych jak podano e SEQ ID NOs: 4 lub ze względu na degenerację kodu genetycznego są również ujawnione w opisie. Na przykład, szereg aminokwasów jest kodowanych przez więcej niż jeden triplet. Kodony, które określają ten sam aminokwas, lub synonimy (na przykład, CAU i CAC są synonimami histydyny) mogą prowadzić do powstania cichych mutacji, które nie wpływają na sekwencję aminokwasową białka. Jednakże, oczekuje się, że polimorfizmy sekwencji DNA, które prowadzą do zmian w sekwencjach aminokwasowych przedmiotowych białek będą występować pomiędzy ssaczymi komórkami. Znawca dostrzeże, że te wariacje w jednym lub więcej nukleotydów (aż do około 3-% nukleotydów) kwasów nukleinowych kodujących określone białko mogą występować u poszczególnych

28 osobników danego gatunku, w związku z naturalną zmiennością alleliczną. [0097] Rekombinowane kwasy nukleinowe ujawnione w opisie mogą być funkcjonalnie związane z jedną lub więcej regulatorowymi sekwencjami nukleotydowymi w konstrukcie do ekspresji. Regulatorowe sekwencje nukleotydowe będą na ogół be odpowiednie dla komórki gospodarza użytego do ekspresji. Liczne rodzaje odpowiednich wektorów ekspresyjnych i odpowiednich sekwencji regulatorowych są znane ze stanu techniki dla komórek szeregu gospodarzy. Typowo, jedna lub więcej nukleotydowych sekwencji regulatorowych może zawierać, w sposób nieograniczający, sekwencje promotorowe, sekwencje liderowe lub sygnałowe, miejsca wiązania rybosomu, sekwencje startu i terminacji transkrypcji, sekwencje startu i terminacji translacji i sekwencje enhancerowe lub aktywatorowe. Rozważa się konstytutywne lub indukowalne promotory znane ze stanu techniki. Promotory mogą oznaczać albo naturalnie występujące promotory, lub hybrydowe promotory, które łączą elementy więcej niż jednego promotora. Konstrukt do ekspresji może być obecny w komórce na episomie, takim jak plazmid, lub konstrukt do ekspresji może zostać wprowadzony do chromosomu. Wektor ekspresyjny może zawierać geny markera selekcyjnego, dla umożliwienia selekcji transformowanych komórek gospodarza. Geny markera selekcyjnego są dobrze znane ze stanu techniki i będą się różnić, w zależności od użytych komórek gospodarza. [0098] Kwas nukleinowy można zapewniać w wektorze ekspresyjnym, zawierającym sekwencje nukleotydową kodującą polipeptyd ActRIIa i funkcjonalnie połączoną z co najmniej jedną regulatorową sekwencją. Sekwencje regulatorowe są znane ze stanu techniki, i dobierane dla kierowania ekspresji polipeptydu ActRIIa. Stosownie do tego, pojęcie sekwencja regulatorowa obejmuje promotory, enhancery i inne elementy kontrolujące ekspresję. Przykładowe sekwencje regulatorowe opisano w Goeddel ; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, CA (1990). Przykładowo, dowolną z szerokiej gamy sekwencji kontrolujących ekspresję, które kontrolują ekspresję sekwencji DNA, gdy są funkcjonalnie z nią połączone, można stosować w tych wektorach, w celu ekspresjonowania sekwencji DNA kodującej polipeptyd ActRIIa. Takie użyteczne sekwencje kontrolujące ekspresję, obejmują, na przykład, wczesne i późne promotory SV40, promotor tet, bezpośredni wczesny promotor adenowirusa lub cytomegalowirusa, promotory RSV, system lac, system trp, system TAC lub TRC, promotor T7, którego ekspresją kieruje polimeraza T7 RNA, główne regiony operatorowe i promotorowe faga lambda, region kontrolne białka płaszcza fd, promotor dla kinazy 3-fosfoglicerynianu lub innych enzymów glikolitycznych, promotory kwaśnej fosfatazy, np. Pho, promotory czynników koniugacyjnych α drożdży, polihedronowy promotor z systemu bakulowiruso-

29 wego i inne sekwencje znane z kontrolowania ekspresji genów prokariotycznych lub eukariotycznych komórek lub ich wirusów, i różne ich kombinacje. Należy rozumieć, że projekt wektora ekspresyjnego może zależeć od takich czynników, jak wybór komórki gospodarza do transformacji i/lub rodzaj białka, którego ekspresja jest pożądana. Co więcej, należy także rozważyć liczbę kopii wektora, zdolność do kontrolowania tej liczby kopii i ekspresję dowolnego innego białka kodowanego przez wektor, takiego jak markery antybiotykowe. [0099] Rekombinowany kwas nukleinowy można produkować poprzez ligowanie sklonowanego genu lub jego części, do wektora odpowiedniego do ekspresji w prokariotycznych komórkach, eukariotycznych komórkach (drożdżowe, ptasie, owadzie lub ssacze), lub obydwu. Nośniki do ekspresji do produkcji rekombinowanego polipeptydu ActRIIa obejmują plazmidy i inne wektory. Przykładowo, odpowiednie wektory obejmują plazmidy typu: plazmidy pochodzące od pbr322, plazmidy pochodzące od pembl, plazmidy pochodzące od pex, plazmidy pochodzące od pbtac i plazmidy pochodzące od puc do ekspresji w komórkach prokariotycznych, takich jak E. coli. [00] Niektóre ssacze wektory ekspresyjne zawierają zarówno sekwencje prokariotyczne, dla ułatwienia namnażania wektora w bakteriach, jak i jedną lub więcej eukariotycznych jednostek transkrypcyjnych, które są ekspresjonowane w eukariotycznych komórkach. Wektory pochodzące od pcdnai/amp, pcdnai/neo, prc/cmv, psv2gpt, psv2neo, psv2-dhfr, ptk2, prsvneo, pmsg, psvt7, pko-neo i phyg to przykłady ssaczych wektorów ekspresyjnych, odpowiednich do transfekowania eukariotycznych komórek. Niektóre z tych wektorów są modyfikowane sekwencjami z bakteryjnych plazmidów, takich jak pbr322, dla ułatwienia replikacji i selekcji opartej na oporności na lek zarówno w prokariotycznych, jak i eukariotycznych komórkach. Alternatywnie, można stosować pochodne wirusów, takich jak bydlęcy wirus brodawczaka (BPV-1), lub wirus Epsteina-Barra (phe- Bo, pochodzący od prep i p) do przejściowej ekspresji białek w eukariotycznych komórkach. Przykłady innych wirusowych (w tym retrowirusowych) systemów ekspresji można znaleźć w opisie systemów dostarczania terapii genowej. Różne sposoby wykorzystywane w przygotowywaniu plazmidów i transformacji organizmów gospodarza są dobrze znane ze stanu techniki. Inne odpowiednie systemy ekspresji dla zarówno prokariotycznych i eukariotycznych komórkek, jak również ogólne procedury rekombinacji, patrz Molecular Cloning A Laboratory Manual, wydanie trzecie, ed. by Sambrook, Fritsch i Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 01). W niektórych przypadkach, pożądane może być ekspresjonowanie rekombinowanych polipeptydów przy użyciu bakulowirusowego systemu ekspresji. Przykłady takich bakulowirusowych systemów ekspresji obejmu-

30 ją wektory pochodzące od pvl (takie jak pvl1392, pvl1393 i pvl941), wektory pochodzące od pacuw (takie jak pacuw1), i wektory pochodzące od pbluebac (takie jak zawierający β-gal pbluebac III). [01] Wektor można zaprojektować do produkcji przedmiotowych polipeptydów ActRIIa w komórkach CHO, taki jak wektor Pcmv-Script (Stratagene, La Jolla, Calif.), wektory pcdna4 (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) i wektory pcl-neo (Promega, Madison, Wisc.). Jak będzie oczywistym, przedmiotowe konstrukty genowe można stosować do wywołania ekspresji przedmiotowych polipeptydów ActRIIa w komórkach namnażanych w kulturze, np. do produkcji białek, w tym białek fuzyjnych lub wariantów białek, do oczyszczania. [02] Również ujawniona jest komórka gospodarza transfekowana rekombinowanym genem, w tym sekwencją kodującą (np. SEQ ID NO: 4 lub ) dla jednego lub więcej przedmiotowych polipeptydów ActRIIa. Komórka gospodarza może oznaczać dowolną prokariotyczną lub eukariotyczną komórkę. Na przykład, polipeptyd ActRIIa można ekspresjonować w bakteryjnych komórkach, takich jak E. coli, owadzich komórkach (np. przy użyciu bakulowiruowego systemu ekspresji), drożdżach lub komórkach ssaczych. Inne odpowiednie komórki gospodarza są znane znawcom. [03] W opisie ujawnione są sposoby produkowania przedmiotowych polipeptydów ActRIIa. Na przykład, komórkę gospodarza transfekowaną wektorem ekspresyjnym kodującym polipeptyd ActRIIa można hodować w odpowiednich warunkach, w celu umożliwienia zajścia ekspresji polipeptydu ActRIIa. Polipeptyd ActRIIa może być wydzielany i izolowany z mieszaniny komórek i pożywki zawierającej polipeptyd ActRIIa. Alternatywnie, polipeptyd ActRIIa można zachowywać w cytoplazmie lub we frakcji błon i zbierać komórki, poddawać lizie i izolować białko. Kultura komórkowa obejmuje komórki gospodarza, pożywki i inne produkty uboczne. Odpowiednie pożywki do kultur komórkowych są dobrze znane ze stanu techniki. Przedmiotowe polipeptydy ActRIIa można izolować z pożywki kultury komórkowej, komórek gospodarza, lub obydwu, przy użyciu technik znanych ze stanu techniki do oczyszczania białek, w tym chromatografia jonowymienna, chromatografia z filtracją żelową, ultrafiltracja, elektroforeza, oczyszczanie typu immunopowinowactwa, z przeciwciałami swoistymi dla określonych epitopów polipeptydów ActRIIa i oczyszczanie typu powinowactwa, ze środkiem, który wiąże się z domeną sprzęgniętą do polipeptydu ActRIIa (np. można stosować kolumnę z białkiem A do oczyszczania fuzji ActRIIa-Fc). Polipeptyd ActRIIa może oznaczać białko fuzyjne zawierające domenę, która ułatwia jego oczyszczanie. Oczyszczanie można osiągnąć za pomocą serii etapów chromatografii na kolumnie, w tym, na przykład, trzy lub więcej z poniższych, w dowolnej kolejności: chromatografia białka A, chromatografia Q sefarozy, chromatografia

31 1 2 3 fenylosefarozy, chromatografia wykluczania ze względu na rozmiar i chromatografia kationowymienna. Oczyszczanie można zakończyć poprzez filtrację wirusa i wymianę buforu. Jak zademonstrowano w opisie, białko ActRIIa-hFc oczyszczono do czystości rzędu >98%, jak ustalono za pomocą chromatografii wykluczania ze względu na rozmiar i >9%, jak ustalono za pomocą SDS PAGE. Ten stopień czystości był wystarczający do osiągnięcia pożądanych oddziaływań na kość u myszy i dopuszczalnego profilu bezpieczeństwa u myszy, szczurów i różnych od człowieka naczelnych. [04] Gen fuzyjny kodujący oczyszczaną sekwencję liderową, taki jak sekwencja miejsca cięcia poli-(his)/enterokinazy na końcu N pożądanej części rekombinowanego polipeptydu ActRIIa, może umożliwić oczyszczanie ekspresjonowanego białka fuzyjnego przez chromatografię powinowactwa przy użyciu żywicy z metalem Ni 2+. Oczyszczaną sekwencję liderową można następnie usunąć, poprzez potraktowanie enterokinazą, dla dostarczenia oczyszczonego polipeptydu ActRIIa (np. patrz Hochuli et al., (1987) J. Chromatography 411 :177; i Janknecht et al., PNAS USA 88:8972). [0] Techniki do wytwarzania genów fuzyjnych są dobrze znane. Zasadniczo, łączenie różnych fragmentów DNA, kodujących sekwencje różnych polipeptydów prowadzi się zgodnie z konwencjonalnymi technikami, wykorzystując tępe lub odstające końce do ligacji, trawienie enzymem restrykcyjnym dla zapewnienia odpowiednich końców, wypełnianie lepkich końców, jak jest to odpowiednie, traktowanie fosfatazą alkaliczną, dla uniknięcia niepożądanego połączenia i ligację enzymatyczną. Gen fuzyjny można syntetyzować konwencjonalnymi technikami, w tym na zautomatyzowanych syntetyzerach DNA. Alternatywnie, można prowadzić amplifikację PCR fragmentów genów, przy użyciu kotwiczących starterów, które prowadzą do uzyskania komplementarnych wystających końców pomiędzy dwoma kolejnymi fragmentami genów, które można później hybrydyzować, w celu wygenerowania chimerycznej sekwencji genu (patrz, na przykład, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons: 1992). 4. Alternatywni antagoniści aktywiny i ActRIIa (nie stanowi części wynalazku) [06] Dane zaprezentowane w opisie wykazują, że antagoniści sygnalizacji aktywina- ActRIIa można stosować do stymulowania wzrostu kości i mineralizacji kości. Chociaż w opisie opisane są niektóre rozpuszczalne polipeptydy ActRIIa, i szczególnie ActRIIa-Fc, i chociaż tacy antagoniści mogą oddziaływać na kość poprzez mechanizm inny niż antagonizowanie aktywiny (np. inhibicja aktywiny może świadczyć o tendencji środka do inhibowania aktywności szeregu cząsteczek, w tym, być może, innych członków nadrodziny TGF-beta, a taka łączna inhibicja może prowadzić do pożądanych oddziaływań na kość), oczekuje się, że inne rodzaje antagonistów aktywina-actriia będą użyteczne, w tym prze-

32 ciwciała anty-aktywina (np. A, B, C lub E), przeciwciała anty-actriia, antysens, RNAi lub rybozymowe kwasy nukleinowe, które inhibują produkcję ActRIIa i inne inhibitory aktywiny lub ActRIIa, szczególnie te, które zakłócają wiązanie aktywina-actriia. [07] Przeciwciało, które swoiście reaguje z polipeptydem ActRIIa (np. rozpuszczalny polipeptyd ActRIIa) i które wiąże się kompetycyjnie z ligandem dla polipeptydu ActRIIa lub w inny sposób inhibuje regulowaną przez ActRIIa sygnalizację, można stosować jako antagonistę aktywności polipeptydu ActRIIa. Podobnie, przeciwciało, które swoiście reaguje z polipeptydem aktywiny A i które zakłóca wiązanie ActRIIa można stosować jako antagonistę. [08] Poprzez użycie immunogenów pochodzących z polipeptydu ActRIIa lub polipeptydu aktywiny, można otrzymać surowice odpornościowe anty-białko/anty-peptyd lub monoklonalne przeciwciała, za pomocą standardowych protokołów (patrz, na przykład, Antibodies: A Laboratory Manual ed. by Harlow i Lane (Cold Spring Harbor Press: 1988)). Ssaka, takiego jak mysz, chomik lub królik można immunizować immunogenną postacią polipeptydu ActRIIa, antygenowym fragmentem, który jest zdolny do wywołania odpowiedzi przeciwciała, lub białka fuzyjnego. Techniki nadawania immunogenności białku lub peptydowi obejmują koniugację do nośników lub inne techniki dobrze znane ze stanu techniki. Immunogenną część ActRIIa lub polipeptydu aktywiny można podawać w obecności adjuwantu. Postęp immunizacji można monitorować poprzez wykrywanie miana przeciwciała w osoczu lub surowicy. Standardowo ELISA lub inne immunooznaczenia można stosować z immunogenem, jako antygenem do oceny poziomów przeciwciał. [09] Po immunizacji zwierzęcia antygennym preparatem polipeptydu ActRIIa, można otrzymać surowice odpornościowe oraz, o ile jest to pożądane, izolować poliklonalne przeciwciała z surowicy. W celu wyprodukowania monoklonalnych przeciwciał, komórki produkujące przeciwciało (limfocyty) można zbierać z immunizowanego zwierzęcia i sprzęgać za pomocą standardowych procedur fuzji komórek somatycznych, z unieśmiertelnieniem komórek takich jak komórki szpiczaka, dla otrzymania komórek typu hybrydoma. Takie techniki są dobrze znane ze stanu techniki, i obejmują, na przykład, technikę hybrydoma (opracowaną po raz pierwszy przez Kohler i Milstein, (197) Nature, 26: ), technikę hybrydoma ludzkich komórek B (Kozbar et al., (1983) Immunology Today, 4: 72), i technikę EBV-hybrydoma, do produkcji ludzkich monoklonalnych przeciwciał (Cole et al., (198) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. str ). Komórki hybrydoma można badać przesiewowo immunochemicznie, do produkcji przeciwciał swoiście reagujących z polipeptydem ActRIIa i monoklonalnych przeciwciał izolowanych z kultury zawierającej takie komórki hybrydoma.

33 [01] Pojęcie przeciwciało według opisu ma z założenia obejmować jego fragmenty, które także swoiście reagują z przedmiotowym polipeptydem. Przeciwciała można fragmentować przy użyciu konwencjonalnych technik, a fragmenty badać przesiewowo pod kątem użyteczności, w ten sam sposób, jak opisano powyżej dla pełnych przeciwciał. Na przykład, można generować fragmenty F(ab) 2 poprzez traktowanie przeciwciała pepsyną. Powstały fragment F(ab) 2 można traktować w celu redukcji mostków dwusiarczkowych, dla otrzymania fragmentu Fab. Przeciwciała ujawnione w opisie dodatkowo obejmują z założenia dwuswoiste, pojedynczołańcuchowe, chimeryczne, humanizowane i w pełni ludzkie cząsteczki, mające powinowactwo do ActRIIa lub polipeptydu aktywiny, nadawane przez co najmniej jeden region CDR przeciwciała. Przeciwciało może dodatkowo zawierać dołączony do niego znacznik i być zdolne do zostania wykrytym (np. znacznik może oznaczać izotop promieniotwórczy, związek fluorescencyjny, enzym lub kofaktor enzymu). [0111] Przeciwciało może oznaczać rekombinowane przeciwciało, które to pojęcie obejmuje dowolne przeciwciało generowane po części technikami biologii molekularnej, w tym przeciwciała z przeszczepianym CDR lub chimeryczne, ludzkie lub inne przeciwciała pochodzące z wybieranych z biblioteki domen przeciwciała, przeciwciał pojedynczołańcuchowych i przeciwciał pojedynczodomenowych (np. ludzkie białka V H lub wielbłądzie białka V HH ). Przeciwciało może oznaczać monoklonalne przeciwciało, i w opisie ujawniono sposoby generowania nowych przeciwciał. Na przykład, sposób generowania monoklonalnego przeciwciała, które wiąże się swoiście z polipeptydem ActRIIa lub polipeptydem aktywiny może obejmować podawanie myszy ilości immunogennej kompozycji zawierającej polipeptyd antygenu, skuteczny do stymulowania wykrywalnej odpowiedzi immunologicznej, otrzymywanie produkujących przeciwciała komórek (np. komórki ze śledziony) od myszy i sprzęganie produkujących przeciwciało komórek z komórkami szpiczaka, w celu otrzymania produkujących przeciwciało hybrydom, i testowanie produkujących przeciwciało hybrydom, w celu identyfikacji hybrydomy, która wytwarza monoklonalne przeciwciało, które wiąże się swoiście z antygenem. Po otrzymaniu, hybrydomę można namnażać w kulturze komórkowej, opcjonalnie w warunkach hodowli, gdzie pochodzące od hybrydomy komórki produkują monoklonalne przeciwciało, które wiąże się swoiście z antygenem. Monoklonalne przeciwciało można oczyszczać z kultury komórkowej. [0112] Przymiotnik swoiście reaguje z, jak zastosowano w odniesieniu do przeciwciała ma z założenia oznaczać, jak na ogół rozumianym jest w danej dziedzinie, że przeciwciało jest wystarczająco selektywne wobec przedmiotowego antygenu (np. polipeptyd ActRIIa) w porównaniu do innych antygenów, które nie są przedmiotem zainteresowania, względem których przeciwciało jest użyteczne, co najmniej z wykrywaniem obecności przedmioto-

34 wego antygenu w określonym rodzaju próbek biologicznych. W niektórych sposobach, takich jak zastosowania terapeutyczne, pożądane może być stosowanie przeciwciała o wyższym stopniu swoistości wiązania. Monoklonalne przeciwciała na ogół mają większą tendencję (w porównaniu do poliklonalnych przeciwciał) do skutecznego rozróżniania pomiędzy pożądanymi antygenami, a reagującymi krzyżowo polipeptydami. Jedną z cech, które wpływają na swoistość oddziaływania przeciwciało:antygen jest powinowactwo przeciwciała dla antygenu. Chociaż pożądaną swoistość można osiągnąć przy szeregu różnych powinowactw, na ogół korzystne przeciwciała będą mieć powinowactwo (stałą dysocjacji) około -6, -7, -8, -9 lub mniejsze. Zważywszy na wyjątkowo ścisłe wiązanie pomiędzy aktywiną i ActRIIa, oczekuje się, że neutralizowanie przeciwciała anty-aktywina lub anty-actriia będzie na ogół mieć stałą dysocjacji - lub mniej. [0113] Dodatkowo, techniki stosowane do badań przesiewowych przeciwciał, w celu identyfikacji pożądanego przeciwciała mogą oddziaływać na właściwości otrzymanego przeciwciała. Na przykład, jeśli przeciwciało ma by stosowane do wiązania antygenu w roztworze, pożądanym może być testowanie wiązania w roztworze. Szereg różnych technik jest dostępnych do testowania oddziaływań pomiędzy przeciwciałami i antygenami, w celu identyfikacji szczególnie pożądanych przeciwciał. Takie techniki obejmują oznaczenia wiązania typu ELISA, rezonans plazmonów powierzchniowych (np. oznaczenie wiązania Biacore, Biacore AB, Uppsala, Szwecja), oznaczenia kanapkowe (np. system paramagnetycznych kulek z IGEN International, Inc., Gaithersburg, Maryland), hybrydyzacje typu Western, oznaczenia immunoprecypitacji i immunohistochemię. [0114] Przykłady kategorii związków kwasów nukleinowych, które są antagonistami aktywiny lub ActRIIa obejmują antysensowne kwasy nukleinowe, konstrukty RNAi i konstrukty katalitycznych kwasów nukleinowych. Związek kwasu nukleinowego może być pojedynczoniciowy lub podwójnoniciowy. Podwójnoniciowy związek mogą również obejmować regiony wystających końców lub niekomplementarne, gdzie jedna lub druga z nici są pojedynczoniciowe. Pojedynczoniciowy związek może zawierać regiony samokomplementarne, co oznacza, że związek tworzy tzw. spinkę do włosów lub strukturę region sparowany-pętla, z regionem podwójnej struktury helikalnej. Związek kwasu nukleinowego może zawierać sekwencję nukleotydową, która jest komplementarna do a regionu składającego się z nie więcej niż 00, nie więcej niż 00, nie więcej niż, nie więcej niż 0 lub nie więcej niż 0, 3,, 2, 22, lub 18 nukleotydów pełnej długości sekwencji kwasu nukleinowego ActRIIa lub sekwencji kwasu nukleinowego aktywiny βa lub aktywiny βb. Region komplementarności będzie korzystnie mieć co najmniej 8 nukleotydów, i opcjonalnie co najmniej lub co najmniej 1 nukleotydów, i opcjonalnie

35 pomiędzy 1 i 2 nukleotydów. Region komplementarności może wypadać w obrębie intronu, sekwencji kodującej lub sekwencji niekodującej docelowego transkryptu, takiej jak część sekwencji kodującej. Na ogół, związek kwasu nukleinowego związek będzie mieć długość około 8 do około 00 nukleotydów lub par zasad długości, i opcjonalnie długość będzie wynosić około 14 do około 0 nukleotydów. Kwas nukleinowy może oznaczać DNA (szczególnie do stosowania jako antysens), RNA lub hybrydę RNA:DNA. Dowolna z nici może zawierać mieszaninę DNA i RNA, jak również modyfikowane postaci, których nie można łatwo zaklasyfikować jako DNA lub RNA. Podobnie, podwójnoniciowy związek może oznaczać DNA:DNA, DNA:RNA lub RNA:RNA, i dowolna z nici może również obejmować mieszaninę DNA i RNA, jak również modyfikowane postaci, których nie można łatwo zaklasyfikować jako DNA lub RNA. Związek kwasu nukleinowego może zawierać dowolny szereg modyfikacji, w tym jedną lub więcej modyfikacji szkieletu (część cukrowo-fosforanowa w naturalnym kwasie nukleinowym, w tym wiązania wewnątrznukleotydowe) lub części zasady (purynowa lub pirymidynowa część naturalnego kwasu nukleinowego). Antysensowny związek kwasu nukleinowego będzie korzystnie mieć długość około 1 do około nukleotydów i będzie często zawierać jedną lub więcej modyfikacji do poprawy parametrów, takich jak stabilność w surowicy, w komórce lub w miejscu, w którym prawdopodobne jest dostarczenie związku, takie jak żołądek w przypadku dostarczanych doustnie związków i płuca dla związków wziewnych. W przypadku konstruktu RNAi nicią komplementarną do transkryptu docelowego będzie na ogół RNA lub jego modyfikacje. Inną nicią może być RNA, DNA lub dowolna inna wariacja. Dupleksowa część podwójnoniciowej lub pojedynczoniciowej spinki do włosów konstruktu RNAi będzie korzystnie mieć długość 18 do 40 nukleotydów długości i opcjonalnie około 21 do 23 nukleotydów długości, o ile tylko służy jako substrat dla enzymu Dicer. Katalitycznymi lub enzymatycznymi kwasami nukleinowymi mogą być rybozymy lub enzymy DNA, i mogą również zawierać modyfikowane postaci. Związki kwasów nukleinowych mogą inhibować ekspresję obiektu docelowego o około 0%, 7%, 90% lub więcej, po skontaktowaniu z komórkami w fizjologicznych warunkach i w stężeniu, w którym kontrola nonsensowna lub sensowna nie wywołałaby niemal żadnego, lub żadnego efektu. Korzystne stężenia do testowania efektu związków kwasów nukleinowych wynoszą 1, i mikromolarne. Związki kwasów nukleinowych można również testować pod kątem oddziaływań, na przykład, na wzrost kości i mineralizację.. Oznaczenia badań przesiewowych (nie stanowi części wynalazku) [011] Polipeptydy ActRIIa (np. rozpuszczalne polipeptydy ActRIIa) i polipeptydy aktywiny można stosować w celu identyfikacji związków (środków), które są agonistami lub

36 antagonistami szlaku sygnalizacji aktywina-actriia. Związki zidentyfikowane poprzez te badania przesiewowe można testować dla dokonania oceny ich zdolności do modulowania wzrostu kości lub mineralizacji in vitro. Opcjonalnie, związki te można dalej testować w różnych od człowieka modelach zwierzęcych, dla dokonania oceny ich zdolności do modulowania wzrostu tkanki in vivo. [0116] Istnieją liczne podejścia do badań przesiewowych dla środków terapeutycznych do modulowania wzrostu tkanki przez nakierowywanie na aktywinę i polipeptydy ActRIIa. Wysokowydajne badania przesiewowe związków można prowadzić w celu identyfikacji środków, które zakłócają wywoływane przez aktywinę lub ActRIIa oddziaływania na kość. W niektórych przypadkach, oznaczenie wykonuje się w celu przeprowadzenia badań przesiewowych i identyfikacji związków, które swoiście inhibują lub redukują wiązanie polipeptydu ActRIIa do aktywiny. Alternatywnie, oznaczenie można stosować w celu identyfikacji związków, które wzmagają wiązanie polipeptydu ActRIIa do aktywiny. Związki można identyfikować poprzez ich zdolność do oddziaływania z aktywiną lub polipeptydem ActRIIa. [0117] Szereg formatów oznaczeń będzie wystarczająca, a, w świetle ujawnienia, te nieopisane w sposób wyraźny w opisie nadal będą zrozumiałe dla znawcy. Według opisu, testowe związki (środki) można tworzyć w dowolny kombinatoryczny chemiczny sposób. Alternatywnie, przedmiotowe związki mogą oznaczać naturalnie występujące biocząsteczki syntetyzowane in vivo lub in vitro. Można produkować związki (środki) do testowania pod kątem ich zdolności do działania jako modulatory wzrostu tkanki, na przykład, w bakteriach, drożdżach, roślinach lub innych organizmach (np. naturalne produkty), produkować chemicznie (np. drobne cząsteczki, w tym peptydomimetyki), lub produkować rekombinacyjnie. Testowane związki obejmują nie-peptydylowe organiczne cząsteczki, peptydy, polipeptydy, peptydomimetyki, cukry, hormony i cząsteczki kwasu nukleinowego. W określonym przypadku, testowany środek oznacza małą organiczną cząsteczkę, mającą masę cząsteczkową mniej niż około 2,000 daltonów. [0118] Testowane związki może dostarczać jako pojedyncze, odrębne jednostki, lub dostarczać w bibliotekach o większej złożoności, takich jak uzyskane metodami chemii kombinatorycznej. Te biblioteki mogą zawierać, na przykład, alkohole, halogenki alkilu, aminy, amidy, estry, aldehydy, etery i inne klasy organicznych związków. Prezentowanie testowanych związków w systemie testowania może zachodzić albo w izolowanej postaci, albo jako mieszaniny związków, szczególnie na początkowych etapach badań przesiewowych. Opcjonalnie, związki mogą być opcjonalnie derywatyzowane innymi związkami i mieć derywatyzujące grupy, które ułatwiają izolację związków. Nieograniczające przykła-

37 dy grup derywatyzujących obejmują biotynę, fluoresceinę, digoksygeninę, białko zielonej fluorescencji, izotopy, polihistydynę, kulki magnetyczne, glutationo-s-transferazę (GST), zdolne do fotoaktywacji łączniki sieciujące lub dowolne ich kombinacje. [0119] W wielu programach badań przesiewowych leków, które testują biblioteki związków i ekstraktów urodzeniowych, pożądane są wysokowydajne oznaczenia, do maksymalizacji liczby związków analizowanych w danym okresie czasu. Oznaczenia wykonywane w systemach pozakomórkowych, tak jako pierwotne badania przesiewowe, pod tym względem, że mogą one być generowane dla umożliwienia szybkiego opracowywania i względnie prostego wykrywania zmiany celu molekularnego, w czym pośredniczy testowany związek. Co więcej, skutki oddziaływania komórkowej toksyczności lub biodostępności testowanego związku można na ogół pominąć w systemie in vitro, oznaczenie zamiast tego koncentruje się głównie na oddziaływaniu na cel molekularny, co może przejawiać się w zmianie powinowactwa wiązania pomiędzy polipeptydem ActRIIa i aktywiną. [01] W celu zilustrowania, w przykładowych oznaczeniach badań przesiewowych, przedmiotowy związek jest kontaktowany z izolowanym i oczyszczonym polipeptydem ActRIIa, który jest zwyczajowo zdolny do wiązania do aktywiny. Do mieszaniny związku i polipeptydu ActRIIa jest następnie dodawana kompozycja zawierająca ligand ActRIIa. Wykrywanie i kwantyfikacja kompleksów ActRIIa/aktywina zapewnia sposób wyznaczania skuteczności związku w inhibowaniu (lub wzmacnianiu) tworzenia kompleksów pomiędzy polipeptydem ActRIIa i aktywiną. Skuteczność związku można oceniać przez generowanie krzywych odpowiedzi na dawkę z danych uzyskanych przy użyciu różnych stężeń testowanych związków. Co więcej, można również wykonać kontrolne oznaczenie, dla zapewnienia poziomu wyjściowego do porównań. Na przykład, w kontrolnym oznaczeniu, izolowaną i oczyszczoną aktywinę dodaje się do kompozycji zawierającej polipeptyd ActRIIa, i tworzenie się kompleksu ActRIIa/aktywina ocenia się ilościowo pod nieobecność testowanego związku. Będzie zrozumiałym, że, na ogół, kolejność mieszania reagentów może być zróżnicowana, i mogą one być mieszane równocześnie. Co więcej, zamiast oczyszczonego białka, można stosować ekstrakty komórkowe i lizaty, do otrzymania odpowiedniego pozakomórkowego systemu oznaczeń. [0121] Tworzenie się kompleksu pomiędzy polipeptydem ActRIIa i aktywiną można wykrywać za pomocą szeregu technik. Przykładowo, modulację tworzenia się kompleksów można oznaczać ilościowo przy użyciu, na przykład, wykrywalnych znakowanych białek, takich jak znakowany izotopem promieniotwórczym (np. 32 P, 3 S, 14 C lub 3 H), znakowany fluorescencyjnie (np. FITC), lub znakowany enzymatycznie polipeptyd ActRIIa lub aktywina, za pomocą wykrywania w immunooznaczeniu, lub chromatograficznie.

38 [0122] Można stosować oznaczenia polaryzacji fluorescencji i oznaczenia transferu energii rezonansu fluorescencji (FRET) a pomiarach, bezpośrednich lub pośrednich, stopnia oddziaływania pomiędzy polipeptydem ActRIIa i jego białkiem, partnerem wiązania. Ponadto, można stosować inne tryby wykrywania, takie jak te oparte na światłowodach optycznych (publikacja PCT WO 96/26432 i patent amerykański nr,677,196), rezonans plazmonów powierzchniowych (SPR), czujniki ładunków powierzchniowych, i czujniki sił powierzchniowych [0123] Można stosować oznaczenie oddziaływania typu pułapka, znane również jako oznaczenie dwuhybrydowe do identyfikowania środków, które zakłócają lub nasilają oddziaływanie pomiędzy polipeptydem ActRIIa i jego białkiem partnerem wiązania. Patrz na przykład, patent amerykański nr,283,317; Zervos et al. (1993) Cell 72: ; Madura et al. (1993) J Biol Chem 268:146-14; Bartel et al. (1993) Biotechniques 14:9-924; i Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8: ). Odwrócenie systemów dwuhybrydowych można stosować w celu identyfikacji związków (np. małych cząsteczek lub peptydów) które usuwają oddziaływania pomiędzy polipeptydem ActRIIa i jego białkiem partnerem wiązania. Patrz na przykład, Vidal i Legrain, (1999) Nucleic Acids Res 27:919-29; Vidal i Legrain, (1999) Trends Biotechnol 17:374-81; i patenty amerykańskie nr,2,490;,9,280; i,96,368. [0124] Przedmiotowe związki można identyfikować przez ich zdolność oddziaływania z ActRIIa lub polipeptydem aktywiny ujawnionym w opisie. Oddziaływanie pomiędzy związkiem i ActRIIa lub polipeptydem aktywiny mogą być kowalencyjne lub niekowalencyjne. Na przykład, takie oddziaływanie można identyfikować na poziomie białka przy użyciu sposobów biochemicznych in vitro, w tym foto-sieciowania, wiązania ligandu znakowanego izotopem promieniotwórczym i chromatografii powinowactwa (Jakoby WB et al., 1974, Methods in Enzymology 46: 1). W niektórych przypadkach, związki mogą być testowane przesiewowo przy pomocy oznaczenia opartego na mechanizmie, takim jak oznaczenie do wykrywania związków, które wiążą się do aktywiny lub polipeptydu ActRIIa. Może to obejmować zdarzenie wiązania w fazie stałej lub fazie ciekłej. Alternatywnie, gen kodujący aktywinę lub polipeptyd ActRIIa można transfekować w reporterowym systemie (np. β-galaktozydaza, lucyferaza, lub białko zielonej fluorescencji) do komórki i badać przesiewowo względem biblioteki, korzystnie za pomocą wysokowydajnych badań przesiewowych lub poszczególnych członków biblioteki. Można stosować inne oznaczenia oparte na mechanizmie wiązania, na przykład, oznaczenia wiązania, które wykrywają zmiany w energii swobodnej. Oznaczenia wiązania można prowadzić z obiektem docelowym związanym do studzienki, kulki lub chipu, lub wychwyconym przez immobilizowane

39 przeciwciało lub rozdzielanym w elektroforezie kapilarnej. Związane związki można wykrywać zazwyczaj przy użyciu kolorymetrii lub fluorescencji lub rezonansu plazmonów powierzchniowych. [012] W opisie ujawnione są sposoby i środki do modulowania (stymulowania lub inhibowania) tworzenia się kości i zwiększania masy kostnej. Tym samym, dowolny zidentyfikowany związek można testować w całych komórkach lub tkankach, in vitro lub in vivo, dla potwierdzenia jego zdolności do modulowania wzrostu kości lub mineralizacji. Do tego celu można zastosować różne sposoby znane ze stanu techniki. [0126] Na przykład, oddziaływanie ActRIIa lub polipeptydów aktywiny lub testowanych związków na wzrost kości lub chrząstki można wyznaczyć przez pomiar indukcji Msx2 lub różnicowania osteoprogenitorowych komórek w osteoblasty w komórkowych oznaczeniach (patrz, np. Daluiski et al., Nat Genet. 01, 27(1):84-8; Hino et al., Front Biosci. 04, 9:1-9). Kolejny przykład komórkowego oznaczenia obejmuje analizę osteogennej aktywności przedmiotowych ActRIIa lub polipeptydów aktywiny i testowanych związków w mezenchymalnych komórkach progenitorowych i osteoblastycznych. Dla ilustracji, można skonstruować rekombinowaną, ekspresjonowaną w adenowirusach aktywinę lub polipeptyd ActRIIa, do infekowania pluripotentnych mezenchymalnych komórek progenitorowych C3H 1 0Y1/2, preosteoblastycznych komórek C2C12 i osteoblastycznych komórek TE-8. Osteogenną aktywność wyznacza się następnie przez pomiar indukcji fosfatazy alkalicznej, osteokalcyny, i mineralizacji macierzy (patrz, np. Cheng et al., J bone Joint Surg Am. 03, 8-A(8):1 44-2). [0127] Można stosować oznaczenia in vivo do pomiaru wzrostu kości lub chrząstki. Na przykład, Namkung-Matthai et al., Bone, 28:80-86 (01) ujawnia szczurzy model osteoporotyczny, w którym bada się naprawę kości we wczesnym okresie po złamaniu. Kubo et al., Steroid Biochemistry & Molecular Biology, 68:197-2 (1999) również ujawnia szczurzy model osteoporotyczny, w którym bada się naprawę kości w późnym okresie po złamaniu. Andersson et al., J. Endocrinol. 170:29-37 opisują mysi model osteoporozy, w którym myszy są pozbawiane jajników, co powoduje, że myszy tracą znacząco zawartość mineralną kości i gęstość mineralna kości, przy czym kość beleczkowa traci z grubsza 0% gęstości mineralnej kości. Gęstość kości można zwiększać u myszy poddanych usunięciu jajników przez podawanie czynników takich jak hormon przytarczyc. Można stosować oznaczenia gojenia złamań, które są znane ze stanu techniki. Te oznaczenia obejmują technikę złamania, histologiczną analizę i biochemiczną analizę, które opisano w, na przykład, patencie amerykańskim nr 6,21,70, który ujawnia protokoły eksperymentalne do powodowania, jak również mierzenia efektu złamań i procesu naprawy.

40 Przykładowe zastosowania terapeutyczne [0128] Antagonistów aktywiny-actriia (np. polipeptydy ActRIIa) można stosować do leczenia lub zapobiegania chorobie lub stanowi, które są powiązane z uszkodzeniami kości, czy to, np. poprzez złamanie, utratę lub demineralizację. Jak zademonstrowano w opisie, antagoniści aktywina-actriia, i szczególnie konstrukty ActRIIa-Fc są skuteczne w leczeniu lub zapobieganiu powiązanej z rakiem utracie masy kostnej. W opisie ujawnione są sposoby leczenia lub zapobiegania uszkodzeniom kości u wymagających tego osobników, albo przez podawanie osobnikom terapeutycznie skutecznej ilości antagonisty aktywina- ActRIIa, szczególnie polipeptydu ActRIIa. Również, ujawnione są sposoby stymulowania wzrostu kości lub mineralizacji u wymagających tego osobników, przez podawanie osobnikom terapeutycznie skutecznej ilości antagonisty aktywina-actriia, szczególnie polipeptydu ActRIIa. Te sposoby są korzystnie nakierowane na terapeutyczne i profilaktyczne leczenie zwierząt, a korzystniej, ludzi. Tamże, opisani są antagoniści aktywina-actriia (szczególnie rozpuszczalne polipeptydy ActRIIa i neutralizujące przeciwciała nakierowane na aktywinę lub ActRIIa) do leczenia zaburzeń powiązanych z małą gęstością kości lub zmniejszoną wytrzymałością kości. [0129] Według opisu, terapeutyk, który zapobiega zaburzeniu lub stanowi dotyczy związku, który, w statystycznej próbce, zmniejsza częstość występowania zaburzenia lub stanu w leczonej próbie, względem nietraktowanej próby kontrolnej, lub opóźnia wystąpienie lub zmniejsza nasilenie jednego lub więcej objawów zaburzenia lub stanu, względem nietraktowanej próby kontrolnej. Pojęcie leczenie według opisu obejmuje profilaktykę określonego stanu lub polepszenie lub eliminację stanu, po jego ustabilizowaniu. W każdym z przypadków, zapobieganie lub leczenie może być rozróżnione w diagnozie zapewnionej przez lekarza i zamierzonym wyniku podawania środka terapeutycznego. [01] Ujawnienie opisuje sposoby indukowania tworzenia się kości i/lub chrząstki, zapobieganie utracie masy kostnej, zwiększanie mineralizacji kości lub zapobieganie demineralizacji kości. Na przykład, przedmiotowi antagoniści aktywiny-actriia znajdują zastosowanie w leczeniu osteoporozy i gojenia złamań kości i uszkodzeń chrząstki u ludzi i innych zwierząt. ActRIIa lub polipeptydy aktywiny mogą być użyteczne u pacjentów, u których rozpoznano subkliniczną małą gęstość kości, jako środek ochronny przeciwko rozwojowi osteoporozy. [0131] Przedmiotowe kompozycje mogą znaleźć zastosowanie medyczne w gojeniu złamań kości i uszkodzeń chrząstki u ludzi i innych zwierząt. Przedmiotowe kompozycje mogą również mieć zastosowanie profilaktyczne w redukcji zamkniętych, jak również otwartych złamań, jak również w ulepszonym mocowaniu sztucznych stawów. Tworzenie się

41 kości de novo, indukowane przez osteogenny środek przyczynia się do naprawy wrodzonych, wywołanych urazem, lub onkologiczną resekcją indukowanych ubytków czaszkowotwarzowych, jak również jest użyteczne w kosmetycznej chirurgii plastycznej. W niektórych przypadkach, przedmiotowi antagoniści aktywiny-actriia mogą zapewniać środowisko do przyciągania komórek tworzących kość, stymulowania wzrostu komórek tworzących kość lub indukowania różnicowania progenitorów komórek tworzących kość. Antagoniści aktywiny-actriia mogą również być użyteczni w leczeniu osteoporozy. [0132] Kompozycje według wynalazku można stosować w stanach, charakteryzowanych przez lub obejmujących utratę masy kostnej, takich jak osteoporoza (w tym wtórna osteoporoza), nadczynność przytarczyc, choroba Cushinga, choroba Pageta, tyreotoksykoza, przewlekły stan biegunkowy lub złe wchłanianie, kwasica kanalików nerkowych, lub anorexia nervosa. [0133] Osteoporoza może być powodowana przez, lub powiązana z, różnymi czynnikami. Płeć żeńska, szczególnie w fazie postmenopauzalnej, mała masa ciała, i prowadzenie siedzącego trybu życia to wszystko czynniki ryzyka dla osteoporozy (utrata gęstości mineralnej kości, prowadzące do ryzyka złamań). Osoby o dowolnym z poniższych profilów mogą stanowić kandydatów do leczenia antagonistą ActRIIa: kobieta w wieku pomenopauzalnym, nie przyjmująca terapii zastępczej estrogenem lub innym hormonem; osoba z występowaniem w wywiadzie własnym lub rodzinnym złamania biodra lub nałogiem palenia; wysoka kobieta w wieku pomenopauzalnym (ponad stóp 7 cali) lub chuda (mniej niż 12 funtów); mężczyzna z klinicznymi stanami powiązanymi z utratą masy kostnej; osoba stosująca leki, które są znane z powodowania utraty masy kostnej, w tym kortykosteroidy, taki jak Prednisone, różne leki przeciwdrgawkowe, takie jak Dilantin i niektóre barbiturany, lub wysokie dawki leków terapii zastępczej tarczycy; osoba z cukrzycą typu 1, chorobą wątroby, chorobą nerek lub rodzinną historią osteoporozy; osoba mająca wysoki obrót kostny (np. nadmiar kolagenu w próbkach moczu); osoba z chorobą tarczycy, taką jak nadczynność tarczycy; osoba, która doznała złamania po zaledwie łagodnym urazie; osoba z poświadczonym rentgenowsko złamaniem kręgu lub innymi oznakami osteoporozy. [0134] Jak odnotowano powyżej, osteoporoza może również być skutkiem stanu powiązanego z innym zaburzeniem lub stosowania niektórych leków. Osteoporoza powstała na skutek przyjmowania leków, lub spowodowana innym stanem medycznym jest znana jako wtórna osteoporoza. W stanie znanym jako choroba Cushinga, nadmierna ilość kortyzolu wytwarzana przez organizm prowadzi do osteoporozy i złamań. Najczęściej, lekami powiązanymi z wtórną osteoporozą są kortykosteroidy, klasa leków działających jak kortyzol, hormon produkowany naturalnie przez nadnercza. Chociaż odpowiednie poziomy

42 hormonów tarczycy (które są produkowane przez gruczoł tarczycy) są niezbędne do rozwoju szkieletu, nadmiar hormonu tarczycy może obniżać masę kostną z biegiem czasu. Środki zobojętniające kwasy, które zawierają glin mogą prowadzić do utraty masy kostnej przy przyjmowaniu wysokich dawek przez ludzi mających problemy z nerkami, szczególnie tych poddawanych dializie. Inne leki, które mogą spowodować wtórną osteoporozę obejmują fenytoinę (Dilantin) i barbiturany, które są stosowane do zapobiegania napadom padaczkowym; metotreksat (Rheumatrex, Immunex, Folex PFS), lek na niektóre postaci zapalenia stawów, raka i zaburzenia immunologiczne; cyklosporyna (Sandimmune, Neoral), lek stosowany do leczenia niektórych chorób autoimmunologicznych i do supresji układu immunologicznego u pacjentów po przeszczepie narządów; agoniści hormonu uwalniającego hormon luteinizujący (Lupron, Zoladex), stosowani do leczenia raka stercza i endometriozy; heparyna (Calciparine, Liquaemin), leki przeciwzakrzepowe; i cholestyramina (Questran) i kolestypol (Colestid), stosowane do leczenia wysokiego stężenia cholesterolu. Utrata masy kostnej będąca wynikiem chemioterapii nowotworów jest powszechnie rozpoznawana i określana jako indukowana chemioterapią nowotworów utrata masy kostnej (CTIBL). Przerzuty do kości mogą tworzyć jamy w kości, które mogą być korygowane poprzez leczenie antagonistami aktywiny-actriia. [013] W korzystnych przykładach wykonania, kompozycje według wynalazku można stosować u pacjentów z rakiem. Pacjenci mający określone nowotwory (np. szpiczak mnogi) mogą być leczeni zastrzeganym antagonistą aktywiny-actriia nawet pod nieobecność dowodów utraty masy kostnej lub przerzutów do kości. Pacjentów można również monitorować pod kątem dowodów utraty masy kostnej lub przerzutów do kości, i mogą być leczeni antagonistami aktywiny-actriia w przypadku zdarzeń, gdy indykatory wskazują na zwiększone ryzyko. Na ogół, stosuje się skany DEXA do oceny zmian w gęstości kości, podczas gdy indykatory przebudowy kości można stosować do oceny prawdopodobieństwa wystąpienia przerzutów do kości. Można monitorować markery surowicy. Specyficzna dla kości fosfataza alkaliczna (BSAP) to enzym, który jest obecny w osteoblastach. Poziomy BSAP we krwi są zwiększone u pacjentów z przerzutami do kości i innymi stanami, które powodują zwiększoną przebudowę kości. Osteokalcyna i peptydy prokolagenu są również powiązane z tworzeniem się kości i przerzutów do kości. Wzrost poziomu BSAP wykrywano u pacjentów z przerzutami do kości spowodowanymi rakiem stercza, i w mniejszym stopniu, w przerzutach do kości z raka piersi. Poziomy białka morfogenetycznego kości-7 (BMP-7) są wysokie w raku stercza po przerzucie do kości, ale nie w przerzutach do kości raka pęcherza, skóry, wątroby lub płuca. Telopeptyd typu I na końcu karboksylowym (ICTP) to wiązanie poprzeczne znajdywane w kolagenie, które jest tworzone

43 podczas resorpcji kości. Jako że kość ulega stałej degradacji i przebudowie, ICTP będzie znajdywane w całym organizmie. Jednakże, w miejscu przerzutu do kości, poziom będzie znacznie wyższy, niż w obszarze normalnej kości. ICTP znajdywano na dużym poziomie w przerzucie do kości raka stercza, płuca i piersi. Kolejne wiązanie poprzeczne kolagenu, typu telopeptyd IN-końcowy (NTx), jest wytwarzane wraz z ICTP podczas obrotu kostnego. Ilość NTx zwiększa się w przerzutach do kości wywołanych wieloma różnymi rodzajami raka, w tym płuca, stercza i piersi. Również, poziomy NTx wzrastają wraz z progresją przerzutów do kości. Tym samym, ten marker można stosować zarówno do wykrywania przerzutów, jak również mierzenia zakresu choroby. Inne markery resorpcji obejmują pirydynolinę i deoksypirydynolinę. Dowolny wzrost ilości markerów resorpcji lub markerów przerzutów do kości wskazuje na potrzebę leczenia pacjenta antagonistą aktywiny- ActRIIa. [0136] Antagoniści aktywiny-actriia mogą być podawani wspólnie z innymi środkami farmaceutycznymi. Wspólne podawanie można osiągnąć poprzez podawanie pojedynczej współ-formulacji, przez równoczesne podawanie lub podawanie w innym czasie. Antagoniści aktywiny-actriia mogą być szczególnie korzystni przy podawaniu z innymi aktywnymi wobec kości środkami. Pacjent może skorzystać ze współpodawania antagonisty aktywiny-actriia i przyjmowania suplementów wapnia, witaminy D, odpowiedniego ćwiczenia i/lub, w niektórych przypadkach, innych leków. Przykłady innych leków obejmują, bisfosfoniany (alendronian, ibandronian i rizedronian), kalcytoninę, estrogeny, hormon przytarczyc i raloksyfen. Bisfosfoniany (alendronian, ibandronian i rizedronian), kalcytonina, estrogeny i raloksyfen wpływają na cykl przebudowy kości i są klasfikowane jako leki przeciw-resorpcyjne. Przebudowa kości składa się z dwóch odrębnych stadiów: resorpcja kości i tworzenie się kości. Przeciw-resorpcyjne leki spowalniają lub zahamowują resorbującą kość część cyklu przebudowy kości, ale nie spowalniają tworzącej kość części cyklu. W wyniku, nowe tworzenie zachodzi z większą prędkością niż resorpcja kości, i gęstość kości może się z czasem zwiększać. Teryparatyd, postać hormonu przytarczyc, podwyższa szybkość tworzenia się kości w cyklu przebudowy kości. Alendronian zatwierdzono zarówno do zapobiegania ( mg dziennie lub 3 mg raz w tygodniu) i leczenia ( mg dziennie lub 70 mg raz w tygodniu) postmenopauzalnej osteoporozy. Alendronian redukuje utratę masy kostnej, zwiększa gęstość kości i redukuje ryzyko złamań kręgosłupa, nadgarstka i biodra. Alendronian jest również zatwierdzony do leczenia indukowanej glikokortykoidami osteoporozy u mężczyzn i kobiet, będącej wynikiem długotrwałego stosowania tych leków (np. prednizonu lub kortyzonu) i do leczenia osteoporozy u mężczyzn. Alendronian plus witamina D to zatwierdzone leczenie osteoporozy u postmenopauzalnych

44 kobiet (70 mg raz w tygodniu plus witamina D), i do leczenia w celu poprawy masy kostnej u mężczyzn z osteoporozą. Ibandronian jest zatwierdzony do zapobiegania i leczenia postmenopauzalnej osteoporozy. Przyjmowany jako pigułka raz w miesiącu ( mg), ibandronian należy przyjmować tego samego dnia każdego miesiąca. Ibandronian redukuje utratę masy kostnej, zwiększa gęstość kości i redukuje ryzyko złamań kręgosłupa. Rizedronian jest zatwierdzony do zapobiegania i leczenia postmenopauzalnej osteoporozy. Przyjmowany codziennie (dawka mg) lub cotygodniowo (dawka 3 mg lub dawca 3 mg z wapniem), rizedronian spowalnia utratę masy kostnej, zwiększa gęstość kości i redukuje ryzyko złamań kręgosłupa i innych złamań. Rizedronian jest również zatwierdzony do stosowania u mężczyzn i kobiet, do zapobiegania i/lub leczenia indukowanej glikokortykoidami osteoporozy, będącej wynikiem długotrwałego stosowania tych leków (np. prednizonu lub kortyzonu). Kalcytonina to naturalnie występujący hormon, uczestniczący w regulacji wapnia i metabolizmie kości. U kobiet w wieku ponad lat po menopauzie, kalcytonina spowalnia utratę masy kostnej, zwiększa gęstość kości kręgosłupa, i może łagodzić ból powiązany z złamaniami kości. Kalcytonina redukuje ryzyko złamań kręgosłupa. Kalcytonina jest dostępna jako wstrzyknięcia (0-0 IU dziennie) lub sprej do nosa (0 IU dziennie). Terapia estrogenowa(et)/terapia hormonalna (HT) jest zatwierdzona do zapobiegania osteoporozie. Wykazano, że ET redukuje utratę masy kostnej, zwiększa gęstość kości zarówno w kręgosłupie, jak i biodrze, i redukuje ryzyko złamań kręgosłupa i biodra w kobiet pomenopauzalnych. ET podaje się najczęściej w postaci pigułki lub plastra na skórę, które dostarczają niską dawkę, w przybliżeniu 0.3 mg dziennie lub standardową dawkę, w przybliżeniu 0,62 mg dziennie i jest skuteczna nawet po rozpoczęciu w wieku ponad 70 lat. Kiedy estrogen jest przyjmowany samodzielnie, może podwyższać u kobiet ryzyko rozwinięcia się raka wyściółki macicy (rak endometrium). Dla wyeliminowania tego ryzyka, pracownicy służby zdrowia przepisują hormon progesteron w połączeniu z estrogenem (hormonalna terapia zastępcza lub HT) dla tych kobiet, które mają nienaruszoną macicę. ET/HT łagodzi objawy menopauzy i wykazano, że korzystnie działa na zdrowie kości. Działania niepożądane mogą obejmować krwawienie z pochwy, tkliwość piersi, zaburzenia nastroju i chorobę pęcherzyka żółciowego. Raloksyfen, 60 mg dziennie jest zatwierdzony do zapobiegania i leczenia postmenopauzalnej osteoporozy. Należy do klasy leków nazywanej selektywnymi modulatorami receptora estrogenu (SERMs), które opracowano dla zapewnienia korzystnych skutków oddziaływania estrogenów, bez ich potencjalnych wad. Raloksyfen zwiększa masę kostną i redukuje ryzyko złamań kręgosłupa. Nie są jeszcze dostępne dane, wykazujące, że raloksyfen może redukować ryzyko złamań biodra i innych złamań, niebędących złamaniami kręgosłupa. Teryparatyd, postać hormonu

45 przytarczyc, jest zatwierdzony do leczenia osteoporozy u kobiet pomenopauzalnych i mężczyzn obarczonych wysokim ryzykiem złamania. Ten lek stymuluje nowe tworzenie się kości i znacząco zwiększa gęstość mineralną kości. U kobiet pomenopauzalnych, redukcję złamań odnotowano w kręgosłupie, biodrach, stopie, żebrach i nadgarstku. U mężczyzn, redukcję złamań odnotowano w kręgosłupie, ale nie było wystarczających danych do oceny redukcji złamań w innych miejscach. Teryparatyd podaje się samodzielnie jako codzienne wstrzyknięcie, aż do 24 miesięcy. 7. Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku są zdefiniowane w zastrzeżeniach patentowych 1-11 [0137] W niektórych przykładach wykonania, antagoniści aktywiny-actriia (np. polipeptydy ActRIIa) według wynalazku są formułowani z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem. Na przykład, polipeptyd ActRIIa można podawać samodzielnie lub jako składnik formulacji terapeutycznej (terapeutyczna kompozycja). Przedmiotowe związki można formułować do podawania dowolną dogodną drogą do stosowania w medycynie lub medycynie weterynaryjnej. [0138] Kompozycje można podawać układowo, lub miejscowo, jako implant lub urządzenie. Po podaniu, terapeutyczna kompozycja do stosowania według wynalazku oznacza wolną od pyrogenów, fizjologicznie dopuszczalną postać. Terapeutycznie użyteczne środki, inne niż antagoniści ActRIIa, które można również opcjonalnie podawać dla porównania, jak opisano powyżej, można podawać równocześnie lub sekwencyjnie z przedmiotowymi związkami (np. polipeptydy ActRIIa) w sposobach według wynalazku. [0139] Typowo, antagoniści ActRIIa będą podawani pozajelitowo, a szczególnie dożylnie lub podskórnie. Kompozycje farmaceutyczne odpowiednie do podawania pozajelitowego mogą zawierać jeden lub więcej polipeptydów ActRIIa, w połączeniu z jednym lub więcej farmaceutycznie dopuszczalnymi jałowymi izotonicznymi wodnymi lub niewodnymi roztworami, dyspersjami, zawiesinami lub emulsjami, lub jałowe proszki, które mogą być odtwarzane do jałowych wstrzykiwanych roztworów lub dyspersji tuż przed użyciem, które mogą zawierać przeciwutleniacze, bufory, bakteriostatyny, soluty, które czynią formulację izotoniczną z krwią zamierzonego dawcy lub środki zawieszające lub zagęszczające. Przykłady odpowiednich wodnych i niewodnych nośników, które można stosować w kompozycjach farmaceutyczne według wynalazku obejmują wodę, etanol, poliole (takie jak glicerol, glikol propylenowy, glikol polietylenowy, i podobne), i odpowiednie ich mieszaniny, oleje roślinne, takie jak olej z oliwek i wstrzykiwane estry organiczne, taki jak oleinian etylu. Właściwą płynność można utrzymać, na przykład, przez użycie materiałów powlekających, takich jak lecytyna, utrzymywanie właściwych rozmiarów cząstek, w przypadku

46 dyspersji, i przez stosowanie środków powierzchniowo czynnych. [0140] Ponadto, kompozycję można kapsułkować lub wstrzykiwać, w celu dostarczenia do miejsca tkanki docelowej (np. kość). W niektórych przykładach wykonania, kompozycje według wynalazku mogą zawierać macierz zdolną do dostarczania jednego lub więcej terapeutycznych związków (np. polipeptydy ActRIIa) do miejsca tkanki docelowej (np. kość), zapewniającą strukturę do rozwoju tkanki i opcjonalnie zdolną do wchłonięcia przez organizm. Na przykład, macierz może zapewniać powolne uwalnianie polipeptydów ActRIIa. Takie macierze można tworzyć z materiałów stosowanych w innych aplikacjach implantów medycznych. [0141] Wybór materiału macierzy opiera się na biokompatybilności, biodegradowalności, właściwościach mechanicznych, wyglądzie kosmetycznym i właściwościach międzyfazowych. Określone zastosowanie przedmiotowych kompozycji będzie definiować odpowiednią formulację. Potencjalne macierze dla kompozycji mogą oznaczać biodegradowalny i definiowany chemicznie siarczan wapnia, fosforan trójwapniowy, hydroksyapatyt, kwas polimlekowy i polibezwodniki. Inne potencjalne materiały są biodegradowalne i biologicznie dobrze zdefiniowane, takie jak kość lub kolagen dermatologiczny. Dalsze macierze składają się z czystych białek lub pozakomórkowych składników macierzy. Inne potencjalne macierze są niebiodegradowalne i chemicznie definiowane takie jak spiekany hydroksyapatyt, bioszkło, gliniany lub inne materiały ceramiczne. Macierze mogą składać się z kombinacji dowolnych powyższych rodzajów materiałów, takich jak kwas polimlekowy i hydroksyapatyt lub kolagen i fosforan trójwapniowy. Materiały bioceramiczne mogą być zmienione w kompozycji, tak jak w fosforanie wapniowo-glinowym, i poddane obróbce mającej na celu zmianę rozmiarów porów, rozmiarów cząstek, kształtu cząstek i biodegradowalności. [0142] Kompozycje według wynalazku można podawać doustnie, np. w postaci kapsułek, saszetek, pigułek, tabletek, tabletek do ssania (przy użyciu aromatyzowanej bazy, zazwyczaj sacharozy i gumy akacjowej lub tragakantu), proszków, granulek, lub jako roztwór lub zawiesinę w wodnej lub niewodnej cieczy, lub jako emulsję typu olej w wodzie lub woda w oleju, lub jako eliksir lub syrop, lub jako pastylki (przy użyciu obojętnej bazy, takiej jak żelatyna i gliceryna, lub sacharoza i guma arabska) i/lub jako płukanki do ust i podobne, przy czym każdy zawiera ustaloną z góry ilość środka, jako składnika czynnego. Środek można również podawać jako wstrzyknięcie dożylne, lekarstwo zmieszane z miodem lub syropem lub pastę. [0143] W stałych postaciach dawkowania do podawania doustnego (kapsułki, tabletki, pigułki, drażetki, proszki, granulki i podobne), jeden lub więcej terapeutycznych związków

47 według wynalazku można mieszać z jednym lub więcej farmaceutycznie dopuszczalnymi nośnikami, takimi jak cytrynian sodu lub fosforan dwuwapniowy, i/lub dowolne z poniższych: (1) substancje wypełniające lub domieszki, takie jak skrobie, laktoza, sacharoza, glukoza, mannitol i/lub krzemionka; (2) substancje wiążące, takie jak, na przykład, karboksymetyloceluloza, alginiany, żelatyna, poliwinylopirolidon, sacharoza, i/lub guma arabska; (3) środki utrzymujące wilgotność, takie jak glicerol; (4) środki rozsadzające, takie jak agar-agar, węglan wapnia, skrobia ziemniaczana lub z tapioki, kwas alginowy, niektóre krzemiany, i węglan sodu; () środki spowalniające roztwór, takie jak parafina; (6) środki przyspieszające wchłanianie, takie jak czwartorzędowe związki amonowe; (7) środki zwilżające, takie jak, na przykład, alkohol cetylowy i monostearynian glicerolu; (8) absorbenty, takie jak kaolin i glina bentonitowa; (9) substancje nawilżające, takie jak talk, stearynian wapnia, stearynian magnezu, stałe glikole polietylenowe, laurylosiarczan(vi) sodu i ich mieszaniny i () środki barwiące. W przypadku kapsułek, tabletek i pigułek, kompozycje farmaceutyczne mogą również zawierać środki buforujące. Stałe kompozycje podobnego typu mogą również być stosowane jako wypełniacze w miękkich i twardych kapsułkach żelatynowych, przy użyciu takich rozczynników jak laktoza lub cukry mleka, jak również glikole polietylenowe o dużej masie cząsteczkowej i podobne. [0144] Płynne postaci dawkowania do podawania doustnego obejmują farmaceutycznie dopuszczalne emulsje, mikroemulsje, roztwory, zawiesiny, syropy i eliksiry. Oprócz składnika czynnego, płynne postaci dawkowania mogą zawierać obojętne rozcieńczalniki, powszechnie stosowane w stanie techniki, takie jak woda lub inne rozpuszczalniki, środki solubilizujące i emulgatory, takie jak alkohol etylowy, alkohol izopropylowy, węglan etylu, octan etylu, alkohol benzylowy, benzoesan benzylu, glikol propylenowy, glikol 1,3- butylenowy, oleje (w szczególności, z nasion bawełny, orzeszków ziemnych, kukurydzy, kiełków, oliwy, rącznika i sezamowy), glicerol, alkohol tetrahydrofurylowy, glikole polietylenowe i estry sorbitanowe kwasów tłuszczowych, i ich mieszaniny. Poza obojętnymi rozcieńczalnikami, kompozycje doustne mogą również zawierać adjuwanty, takie jak środki zwilżające, emulgujące i zawieszające, słodzące, aromatyzujące, barwiące, zapachowe i konserwujące. [014] Zawiesiny, oprócz związków aktywnych, mogą zawierać środki zawieszające, takie jak etoksylowane alkohole izostearylowe, sorbitol polioksyetylenu i estry sorbitanu, celuloza mikrokrystaliczna, metawodorotlenek glinu, bentonit, agar-agar i tragakant, i ich mieszaniny. [0146] Kompozycje według wynalazku mogą również zawierać adjuwanty, takie jak konserwanty, środki zwilżające, emulgatory i środki dyspergujące. Zapobieganie działaniu mi-

48 kroorganizmów można gwarantować przez inkluzję różnych środków antybakteryjnych i przeciwgrzybowych, na przykład, parabenu, chlorobutanolu, fenolu, kwasu sorbinowego i podobnych. Może również być pożądane zawarcie środków izotonicznych, takich jak cukry, chlorek sodu, i podobne w kompozycjach. Dodatkowo, przedłużone wchłanianie wstrzykiwanej postaci farmaceutycznej można spowodować poprzez włączenie środków, które opóźniają wchłanianie, takich jak monostearynian glinu i żelatyna. [0147] Jest zrozumiałym, że schemat dawkowania zostanie ustalony przez lekarza prowadzącego, z uwzględnieniem różnych czynników, które modyfikują działanie przedmiotowych związków według wynalazku (np. polipeptydów ActRIIa). Różne czynniki obejmują, w sposób nieograniczający, pożądaną ilość masy kostnej, która ma zostać utworzona, stopień utraty gęstości kości, miejsce uszkodzenia kości, stan uszkodzonej kości, wiek pacjenta, płeć i dieta, nasilenie jakiejkolwiek choroby, która może przyczyniać się do utraty masy kostnej, czas podawania i inne czynniki kliniczne. Opcjonalnie, dawkowanie można różnicować za pomocą rodzaju macierzy użytej do odtworzenia i rodzajów związków w kompozycji. Dodanie innych znanych czynników wzrostu do końcowej kompozycji może również wpływać na dawkowanie. Progres można monitorować poprzez okresową ocenę wzrostu kości i/lub naprawy, na przykład, promieniowaniem rentgenowskim (w tym DEXA), ustaleniami histomorfometrycznymi i znakowaniem tetracykliny. [0148] Eksperymenty z udziałem naczelnych i ludzi wykazały, że skutki oddziaływania ActRIIa-Fc na kość są wykrywalne, gdy związek jest dawkowany z przerwami i w ilości wystarczającej do osiągnięcia stężeń w surowicy około 0 ng/ml, z połową maksymalnego oddziaływania na anaboliczne biomarkery kości zachodzącą przy dawkowaniu 0,3 mg/kg lub równorzędnym, w przeliczeniu na pole pod krzywą. U ludzi, poziomy w surowicy rzędu 0 ng/ml można osiągać za pomocą pojedynczej dawki 0,1 mg/kg lub większej, a poziomy w surowicy rzędu 00 ng/ml można osiągać za pomocą pojedynczej dawki 0,3 mg/kg lub większej. Obserwowany okres półtrwania cząsteczki w surowicy wynosi pomiędzy około 2 i 3 dni, zasadniczo dłużej niż większości białek fuzyjnych Fc, a zatem utrzymujący się, skuteczny poziom w surowicy można osiągnąć, na przykład, przez dawkowanie około 0,0 do 0, mg/kg w schemacie cotygodniowym lub co dwa tygodnie, lub można stosować wyższe dawki z dłuższymi odstępami pomiędzy dawkowaniami. Na przykład, dawki rzędu 0.1, 0.3, 0., 0.7, 1, 2 lub 3 mg/kg, lub wartości pomiędzy nimi, można stosować w schemacie co miesiąc lub co dwa miesiące, a oddziaływanie na kość może być wystarczająco trwałe, że dawkowanie jest konieczne jedynie raz na 3, 4,, 6, 9, 12 lub więcej miesięcy. Dłuższe odstępy pomiędzy dawkami są dodatkowo wspierane utrzymywaniem się efektu farmakodynamicznego, który jest dłuższy, niż czas trwania leku

49 w surowicy. Efekty PD obserwuje się przez co najmniej 1 dni u pacjentów ludzi. [0149] Można stosować terapię genową do produkcji in vivo polipeptydów ActRIIa. Taka terapia osiągnęłaby swój efekt terapeutyczny poprzez wprowadzenie sekwencji polinukleotydowych ActRIIa do komórek lub tkanek mających zaburzenia, jak wyszczególniono powyżej. Dostarczanie sekwencji polinukleotydowych ActRIIa można osiągnąć przy użyciu rekombinowanego wektora ekspresyjnego, takiego jak wirus chimeryczny lub koloidalny system dyspersyjny. Korzystne do terapeutycznego dostarczania sekwencji polinukleotydowych ActRIIa jest zastosowanie nakierowywanych liposomów. [0] Różne wektory wirusowe, które można stosować do terapii genowej, jak przedstawiono w opisie obejmują adenowirusy, wirusa opryszczki, wirusa ospy bydlęcej lub, korzystnie, wirusa RNA, takiego jak retrowirus. Korzystnie, retrowirusowy wektor jest pochodną mysiego lub ptasiego retrowirusa. Przykłady retrowirusowych wektorów, do których można wprowadzić pojedynczy, obcy gen obejmują, w sposób nieograniczający: wirusa białaczki mysiej Moloney a (MoMuLV), wirusa mięsaka mysiego Harvey a (Ha- MuSV), mysiego wirusa raka sutka (MuMTV) i wirusa mięsaka Rousa (RSV). Szereg dodatkowych wektorów retrowirusowych może pomieścić liczne geny. Wszystkie z tych wektorów mogą przenosić lub inkorporować gen markera selekcyjnego, aby można było identyfikować i generować komórki po takiej transdukcji. Wektory retrowirusowe można uczynić swoistymi dla obiektu docelowego poprzez dołączenie, na przykład, cukru, glikolipidu lub białka. Korzystne nakierowywanie osiąga się przy użyciu przeciwciała. Znawcy rozpoznają, że można wprowadzać specyficzne sekwencje polinukleotydowe do genomu retrowirusa lub dołączać do wirusowej otoczki, dla umożliwienia swoistego względem obiektu docelowego dostarczania wektora retrowirusowego, zawierającego polinukleotyd ActRIIa. W korzystnym przykładzie wykonania wektor jest nakierowywany do kości lub chrząstki. [011] Alternatywnie, komórki kultur tkankowych można bezpośrednio transfekować plazmidami kodującymi geny strukturalne retrowirusa gag, pol i env, poprzez konwencjonalną transfekcję fosforanem wapnia. Komórki te są następnie transfekowane wektorem plazmidem zawierającym przedmiotowe geny. Powstałe komórki uwalniają wektor retrowirusowy do pożywki hodowlanej. [012] Kolejnym nakierowywanym systemem dostarczania dla polinukleotydów ActRIIa jest koloidalny system dyspersyjny. Koloidalne systemy dyspersyjne obejmują kompleksy makrocząsteczek, nanokapsułki, mikrosfery, kulki, i systemy oparte na lipidach, w tym emulsje typu olej w wodzie, micele, micele mieszane, i liposomy. Korzystne, system koloidalny oznacza liposom. Liposomy są sztucznymi pęcherzykami błon, które są użyteczne

50 49 1 jako nośniki do dostarczania in vitro i in vivo. RNA, DNA i nienaruszone wiriony można kapsułkować w wodnym wnętrzu i dostarczać do komórek w biologicznie aktywnej postaci (patrz np. Fraley, et al., Trends Biochem. Sci., 6:77, 1981). Sposoby skutecznego przenoszenia genów, przy użyciu nośnika liposomowego, są znane ze stanu techniki, patrz np. Mannino, et al., Biotechniques, 6:682, Kompozycja liposomu to zazwyczaj kombinacja fosfolipidów, zazwyczaj w połączeniu ze steroidami, szczególnie cholesterolem. Można także stosować inne fosfolipidy lub inne lipidy. Charakterystyka fizyczna liposomów zależy od ph, siły jonowej i obecności kationów dwuwartościowych. [013] Przykłady lipidów użytecznych w produkcji liposomów obejmują związki fosfatydylowe, takie jak fosfatydyloglicerol, fosfatydylocholina, fosfatydyloseryna, fosfatydyloetanoloamina, sfingolipidy, cerebrozydy i gangliozydy. Do ilustrujących fosfolipidów zalicza się fosfatydylocholinę z jaja, dipalmitoilofosfatydylocholinę i distearoilofosfatydylocholinę. Możliwe jest również nakierowywanie liposomów, na podstawie, na przykład, swoistości do narządu, swoistości do komórki i swoistości do organelli, i jest znane ze stanu techniki. PRZYKŁADY Przykład 1: Białka fuzyjne ActRIIa-Fc [014] Zgłaszający skonstruowali rozpuszczalne białko fuzyjne ActRIIa, które ma domenę pozakomórkową ludzkiego ActRIIa, sprzężoną z ludzką lub mysią domeną Fc z minimalnym łącznikiem pomiędzy nimi. Konstrukty są określane odpowiednio ActRIIa-hFc i ActRIIa-mFc. [01] ActRIIa-hFc pokazano poniżej, jako oczyszczony z linii komórkowych CHO (SEQ ID NO: 7): 2 [016] Białka ActRIIa-hFc i ActRIIa-mFc ekspresjonowano w liniach komórkowych CHO. Rozważano trzy różne sekwencje liderowe: (i) Melityna miodu pszczelego (HBML): MKFLVNVALVFMVVYISYIYA (SEQ ID NO: 8) 40 (ii) Aktywator plazminogenu tkankowego (TPA): MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP

51 0 (SEQ ID NO: 9) (iii) Natywna: MGAAAKLAFAVFLISCSSGA (SEQ ID NO: ). [017] Wybraną postać wykorzystuje lider TPA i ma poniższą, niepoddawaną obróbce sekwencję aminokwasową: [018] Ten polipeptyd jest kodowany przez poniższą sekwencję kwasu nukleinowego: [019] Zarówno ActRIIa-hFc, jak i ActRIIa-mFc były wyjątkowo podatne na rekombinowaną ekspresję. Jak pokazano na figurze 1, białko oczyszczano jako pojedynczy, dobrze zdefiniowany pik białka. Sekwencjonowanie N-końcowe ujawniło pojedynczą sekwencję

52 ILGRSTQE (SEQ ID NO: 11). Oczyszczanie można osiągnąć za pomocą serii etapów chromatografii na kolumnie, w tym, na przykład, trzy lub więcej z poniższych, w dowolnej kolejności: chromatografia białka A, chromatografia Q sefarozy, chromatografia fenylosefarozy, chromatografia wykluczania ze względu na rozmiar i chromatografia kationowymienna. Oczyszczanie można zakończyć poprzez filtrację wirusa i wymianę buforu. Białko ActRIIa-hFc oczyszczono do czystości rzędu >98%, jak ustalono za pomocą chromatografii wykluczania ze względu na rozmiar i >9%, jak ustalono za pomocą SDS PAGE. [0160] ActRIIa-hFc i ActRIIa-mFc wykazywały wysokie powinowactwo dla ligandów, szczególnie aktywiny A. GDF-11 lub aktywinę A ( ActA ) immobilizowano na czipie Biacore CM przy użyciu standardowej procedury sprzęgania amin. Białka ActRIIa-hFc i ActRIIa-mFc nanoszono na system, i mierzono wiązanie. ActRIIa-hFc ulegało wiązaniu do aktywiny ze stałą dysocjacji (K D ) x -12, i białko wiązało się do GDF11 z K D 9,96 x - 9. Patrz figura 2. ActRIIa-mFc zachowywało się podobnie. [0161] Oznaczenie genu reporterowego A-4 stosowano do oceny skutków oddziaływania białek ActRIIa-hFc na sygnalizację GDF-11 i aktywiny A. Linia komórkowa: Ludzki mięsak mięśni prążkowanych (pochodzący z mięśni). Wektor reporterowy: pgl3(caga) 12 (opisany w Dennler et al, 1998, EMBO 17: 91-.) Patrz Figura 3. Motyw CAGA 12 jest obecny w genach reagujących na TGF-beta (gen PAI-1), tak więc, wektor ten nadaje się do ogólnego użytku z czynnikami sygnalizacyjnymi Smad 2 i 3. [0162] Dzień 1: Rozkładano komórki A-4 na 48-studzienkowej płytce. [0163] Dzień 2: Komórki A-4 komórki transfekowano pg pgl3(caga)12 lub pgl3(caga)12 ( µg)+ prlcmv (1 µg) i Fugene. [0164] Dzień 3: Dodawano czynniki (rozcieńczenie do pożywki + 0,1% BSA). Inhibitory należy poddawać wstępnej inkubacji z czynnikami przez 1 godzinę przed dodaniem do komórek. 6 godzin później, komórki przemywano PBS, i lizowano komórki. [016] Następnie wykonywano oznaczenie lucyferazy. Typowo u tym oznaczeniu, pod nieobecność jakichkolwiek inhibitorów, aktywina A pokazuje z grubsza -krotną stymulację ekspresji genu reporterowego i ED0-2 ng/ml. GDF-11: 16-krotna stymulacja, ED0: ~ 1, ng/ml. GDF-8 pokazuje efekt podobny do GDF-11. [0166] Jak pokazano na figurze 4, ActRIIa-hFc i ActRIIa-mFc inhibują regulowaną GDF-8 sygnalizację, w pikomolarnych stężeniach. Jak pokazano na figurze, trzy różne preparaty ActRIIa-hFc inhibowały sygnalizację GDF-II z IC0 w przybliżeniu 0 pm. [0167] ActRIIa-hFc był bardzo stabilny w badaniach farmakokinetycznych. Szczurom podawano dawkę 1 mg/kg, 3 mg/kg lub mg/kg białka ActRIIa-hFc i mierzono poziomy białka w osoczu po 24, 48, 72, 144 i 168 godzinach. W odrębnym badaniu, szczurom po-

53 dawano dawkę 1 mg/kg, mg/kg lub mg/kg. U szczurów, ActRIIa-hFc miało dniowy okres półtrwania w surowicy, a poziomy leku w obiegu były dość wysokie po dwóch tygodniach (11 µg/ml, 1 µg/ml lub 4 µg/ml przy początkowym podawaniu 1 mg/kg, mg/kg lub mg/kg, odpowiednio). U małp cynomolgus, okres półtrwania w osoczu był zasadniczo dłuższy niż 14 dni i w obiegu poziomy leku wynosiło 2 µg/ml, 4 µg/ml lub 1440 µg/ml przy początkowym podawaniu odpowiednio 1 mg/kg, mg/kg lub mg/kg. Wstępne wyniki u ludzi sugerują, że okres półtrwania w surowicy wynosi pomiędzy około i dni. Przykład 2: ActRIIa-mFc stymuluje wzrost kości in vivo (nie stanowi części wynalazku) [0168] Normalnym samicom myszy (BALB/c) podawano dawkę ActRIIa-mFc na poziomie 1 mg/kg/dawkę, 3 mg/kg/dawkę lub mg/kg/dawkę, z dawkami podawanymi dwa razy w tygodniu. Gęstość mineralna kości i skład mineralny kości wyznaczano za pomocą DEXA, patrz figura 6. [0169] U samic myszy BALB/c, skany DEXA wykazywały znaczący wzrost (>%) gęstości mineralnej kości i zawartości, jako wynik leczenia ActRIIa-mFc. Patrz figury 7 i 8. [0170] Zatem, antagonizm ActRIIa powodował zwiększoną gęstość kości i zawartość u normalnych samic myszy. W kolejnym etapie testowano oddziaływanie ActRIIa-mFc na kość w mysim modelu osteoporozy. [0171] Andersson et al. (01), ustalili, że myszy poddane usunięciu jajników cierpiały na znaczącą utratę masy kostnej (z grubsza 0% utraty kości beleczkowej sześć tygodni po operacji), i że utratę masy kostnej u tych myszy można korygować kandydującymi środkami terapeutycznymi, takimi jak hormon przytarczyc. [0172] Zgłaszający stosowali samice myszy C7BL6, którym usuwano jajniki (OVX) lub które poddawano operacji pozorowanej w wieku 4- tygodni. Osiem tygodni po operacji inicjowano leczenie ActRIIa-mFc ( mg/kg, dwa razy w tygodniu) lub kontrolą (PBS). Gęstość kości mierzono za pomocą skanera CT. [0173] Jak pokazano na figurze 9, nietraktowane, poddane usunięciu jajników myszy wykazywały znaczącą utratę gęstość kości beleczkowej, względem pozorowanych kontroli po sześciu tygodniach. Leczenie ActRIIa-mFc przywróciło gęstość kości do poziomu myszy poddanych pozorowanej operacji. Po 6 i 12 tygodniach leczenia, ActRIIa-mFc spowodowało znaczący wzrost w kości beleczkowej myszy OVX. Patrz Figura. Po 6 tygodniach leczenia, gęstość kości zwiększyła się o 24% względem kontroli PBS. Po 12 tygodniach, wzrost wynosił 27%. [0174] U myszy poddanych pozorowanej operacji, ActRIIa-mFc również spowodował znaczący wzrost w kości beleczkowej. Patrz Figura 11. Po 6 i 12 tygodniach, leczenie

54 spowodowało 3% wzrost względem kontroli. [017] W dodatkowym zestawie eksperymentów, myszy poddane usunięciu jajników (OVX) lub myszy poddane pozorowanej operacji, jak opisano powyżej, traktowano ActRIIa-mFc ( mg/kg, dwa razy w tygodniu) lub kontrolą (PBS) w okresie dwunastu tygodni. Podobnie do wyników opisanych powyżej dla ActRIIa-mFc, myszy OVX otrzymujące ActRIIa-mFc wykazywały wzrost w gęstości kości beleczkowej rzędu 1%, tak wcześnie, jak cztery tygodnie i rzędu 2% po 12 tygodniach leczenia (Figura 12). Myszy poddane pozorowanej operacji, otrzymujące ActRIIa-mFc podobnie wykazywały wzrost w gęstości kości beleczkowej rzędu 22%, tak wcześnie, jak cztery tygodnie i rzędu 32% po 12 tygodniach leczenia (Figura 13). [0176] Po dwunastu tygodniach leczenia ActRIIa-mFc, analizy całego ciała i analiza ex vivo DEXA kości udowej wykazywały, że leczenie indukuje wzrost w gęstości kości, zarówno u myszy poddanych usunięciu jajnika, jak i myszy poddanych pozorowanej operacji (Figury 14A i 14B, odpowiednio). Te wyniki są również wspierane analizą ex vivo pqct trzonu kości udowej, która zaprezentowała znaczący wzrost zarówno w całkowitej, jak i gęstości istoty korowej kości po dwunastu tygodniach leczenia ActRIIa-mFc. Leczone zaróbką myszy kontrolne poddane usunięciu jajników wykazywały gęstości kości, które były porównywalne do leczonych zaróbką myszy kontrolnych poddanych pozorowanej operacji (Figura 1). Oprócz gęstości kości, po leczeniu ActRIIa-mFC zwiększyła się zawartość (trzonów) kości. Analiza ex vivo pqct trzonu kości udowej zademonstrowała znaczący wzrost zarówno w zawartości całkowitej, jak i zawartości istoty korowej kości po dwunastu tygodniach leczenia ActRIIa-mFc, podczas gdy zarówno poddane usunięciu jajników, i jak i poddane pozorowanej operacji, traktowane kontrolną zaróbką myszy wykazywały porównywalną zawartość kości (Figura 16). Również analiza ex vivo pqct trzonu kości udowej wykazywała, że leczone ActRIIa-mFc myszy nie wykazywały zmian w obwodzie okostnowym; jednakże leczenie ActRIIa-mFc skutkowało spadkiem w obwodzie śródkostnym, co świadczy o wzroście grubości istoty korowej, ze względu na wzrost na wewnętrznej powierzchni kości udowej (Figura 17). [0177] Badania mechaniczne kości udowych ustaliło, że ActRIIa-mFc był zdolny do zwiększenia zewnętrznych parametrów kości (maksymalne obciążenie, sztywność i energia do złamania) które przyczyniły się do znaczącego wzrostu właściwości wewnętrznych (wytrzymałość graniczna) kości. Myszy poddane usunięciu jajników leczone ActRIIa-mFc wykazywały zwiększoną wytrzymałość kości względem poziomów pozornie operowanych, leczonych zaróbką kontroli, co wskazuje na całkowite odwrócenie fenotypu osteoporotycznego (Figura 18).

55 [0178] Te dane demonstrują, że antagonista aktywiny-actriia może zwiększyć gęstość kości u normalnych samic myszy oraz, ponadto, korygować ubytki w gęstości kości, zawartości kości, i w końcu wytrzymałości kości, w mysim modelu osteoporozy. [0179] W dalszym zestawie eksperymentów, myszy poddawano usunięciu jajników lub pozorowanej operacji w 4 tygodniu, i rozpoczynając od 12 tygodnia otrzymywały albo placebo, albo ActRIIa-mFc (2 razy/tydzień, mg/kg) (również nazywany jako RAP-11 na Figurach 19-24), przez kolejny okres 12 tygodni. oceniano szereg parametrów kości. Jak pokazano na Figurze 19, ActRIIa-mFc zwiększył objętość kości beleczkowej kręgów do stosunków całkowitej objętości (BV/TV) zarówno u myszy OVX, jak i myszy poddanych pozorowanej operacji. ActRIIa-mFc ulepszył również architekturę beleczkowatą (Figura ), zwiększył grubość istoty korowej kości (Figura 21) i ulepszył wytrzymałość kości (Figura 22). Jak pokazano na Figurze 23, ActRIIa-mFc wytworzył pożądane efekty dla szeregu dawek, od 1 mg/kg do mg/kg. [0180] Badanie histomorfometryczne kości przeprowadzano w punkcie czasowym 2 tygodni u myszy poddanych pozorowanej operacji. Te dane, zaprezentowane na Figurze 24, demonstrują, że ActRIIa-mFc wykazuje podwójne działanie, zarówno inhibowanie resorpcji kości, jak i promowanie wzrostu kości. Zatem ActRIIa-mFc stymuluje wzrost kości (efekt anaboliczny) i inhibuje resorpcję kości (efekt anty-kataboliczny). BV = Objętość kości; TV = całkowita objętość tkanki. BV/TV to miara odsetka objętości kości, który jest mineralizowany. ES = powierzchnia z nadżerkami; BS = powierzchnia kości. ES/BS to miara erozji kości, i spadek wywołany przez RAP-011 demonstruje przeciwresorpcyjny lub anty-kataboliczny efekt. Ms/Bs to stosunek powierzchni mineralizacji/powierzchni kości, który jest wskaźnikiem wzrostu kości, lub efektu anabolicznego. Podobnie, szybkość odkładania minerałów (MAR) i szybkość tworzenia się kości na powierzchnię kości dziennie (BFR/BSd) wskazują na wzrost kości. Pomiary osteoblastów (Nob/BPm) i osteoklastów (Noc/BPm) pobierano w celu zgłębienia mechanizmu działania. [0181] Drugi eksperyment badanie histomorfometryczne kości przeprowadzano u samic myszy C7BL/6, rozpoczynając w wieku dwunastu tygodni. Myszom podawano śródotrzewnowo, dwa razy w tygodniu mg/kg ActRIIa-mFc przez dwa tygodnie, cztery tygodnie, osiem tygodni lub dwanaście tygodni. Każdą grupę uśmiercano pięć dni po podaniu ostatniej dawki, a kości pobierano do analizy. Myszy znakowano kalceiną na dziewięć i dwa dni przed eutanazją. Jak pokazano na Figurze 2, dane metryczne pokazują, że ActRIIa-mFc stymuluje wzrost kości i mineralizację i ma działanie zarówno anaboliczne, jak i anty-kataboliczne. Patrz na przykład stosunek BV/TV, stosunek ES/BS i stosunek MS/BS. Działania anaboliczne zdają się utrzymywać przez cały czas podawania schematu

56 1 2 3 dawkowania, podczas gdy działanie przeciwresorpcyjne zdaje się być bardziej krótkotrwałe u myszy. Przykład 3: ActRIIa-mFc polepsza lub zapobiega uszkodzeniu kości w mysim modelu szpiczaka mnogiego [0182] Pacjenci z szpiczakiem mnogim wykazują zaburzenie utratę masy kostnej, charakteryzowane przez zwiększoną aktywność osteoklastów i zmniejszone tworzenie kości przez osteoblasty. Model T2MM szpiczaka u myszy opiera się na zastosowaniu komórek nowotworowych (komórki T2MMi) z typu spontanicznego nowotworu, który rozwija się u starszych myszy i wywołuje efekty u myszy, które są podobne do tych obserwowanych u pacjentów ludzi z szpiczakiem mnogim. Patrz, np. Vanderkerken et al., Methods Mol Med. 0; 113:191-. ActRIIa-mFc testowano pod kątem oddziaływań w tym modelu. [0183] Komórki T2MM, wstrzykiwane myszom C7BI/KaLwRij stymulowały wzrost powierzchni osteoklastów, tworzenie zmian osteolitycznych i powodowały zmniejszenie w obszarze kości. Choroba kości była powiązana ze spadkiem liczby osteoblastów, powierzchni osteoblastów i redukcją mineralizacji. [0184] Myszy niosące komórki T2MM traktowano ActRIIa-mFc (RAP-011) ( mg/kg, i.p. śródotrzewnowo, dwa razy w tygodniu), lub zaróbką, od czasu wstrzyknięcia T2MM, ogółem przez 12 tygodni. Analiza MicroCT proksymalnej kości piszczelowej i kręgów lędźwiowych wykazała 39% i 21% redukcję objętości kości beleczkowej (p<0,001 i p<0,01) i 37% i 1% redukcję w liczbie beleczek (p<0,01 i p<0,0) u myszy niosących T2MM, w porównaniu do myszy typu naive. RAP-011 całkowicie zapobiegało indukowanemu T2MM obniżeniu objętości beleczkowatej i liczby, zarówno w kości piszczelowej (p<0,001 i p<0,0), jak i kręgach (p<0,01 i p<0,0), w porównaniu do myszy traktowanych zaróbką. Objętość kości była o 19% wyższa w kości piszczelowej (p=168) i 12% wyższa w kręgach (p<0,0) myszy traktowanych RAP-011, w porównaniu do myszy typu naïve. RAP-011 zapobiegał rozwojowi osteolitycznych zmian kości (p<0,0). Efekt ten zilustrowano na Figurze 26. Podczas gdy wstępna ocena danych nie doprowadziła do identyfikacji znaczących oddziaływań na paraproteinę surowicy (biomarker komórek nowotworowych szpiczaka mnogiego) lub obciążenie szpiczakiem w tym badaniu, dalsza analiza wskazała, że poziom paraproteiny w surowicy zasadniczo zmniejszył się we wszystkich poza jednym leczonym zwierzęciem, jak również, objętość zdrowego szpiku kostnego zasadniczo zwiększyła się, co wskazuje na spadek obciążenia komórek nowotworem szpiczakiem. [018] Tym samym, ActRIIa-mFc można stosować do zmniejszania skutków oddziaływania choroby kości, wynikłej z szpiczaka mnogiego i do leczenia komórek nowotworowych

57 samych w sobie. Przykład 4: Charakteryzacja białka ActRIIa-hFc [0186] Białko fuzyjne ActRIIa-hFc ekspresjonowano w stabilnie transfekowanych komórkach CHO-DUKX B11 z wektora paid4 (SV40 ori/enhancer, promotor CMV), przy użyciu sekwencji liderowej plazminogenu tkankowego SEQ ID NO:9. Białko, oczyszczone jak opisano powyżej w Przykładzie 1, miało sekwencję SEQ ID NO:7. Część Fc część to sekwencja ludzkiej Fc IgG1, jak pokazano na SEQ ID NO:7. Analiza kwasu sjalowego wykazała, że białko zawierało, średnio, pomiędzy około 1, i 2, mola kwasu sjalowego na cząsteczkę białka fuzyjnego ActRIIa-hFc. [0187] To oczyszczone białko wykazywało nadzwyczaj długi okres półtrwania w surowicy u wszystkich badanych zwierząt, w tym okres półtrwania rzędu 2-32 dni u pacjentów ludzi (patrz Przykład, poniżej). Dodatkowo, materiał ekspresjonowany w komórce CHO miał wyższe powinowactwo do ligandu aktywiny B, niż to zgłaszane dla białka fuzyjnego ActRIIa-hFc, ekspresjonowanego w komórkach ludzkich 293 (del Re et al., J Biol Chem. 04 Dec 17;279(1):3126-3). Dodatkowo, zastosowanie sekwencji liderowej TPA zapewniło większą produkcję, niż inne sekwencje liderowe oraz, w przeciwieństwie do ActRIIa-Fc ekspresjonowanego z natywną sekwencją liderową, zapewniło N-końcową sekwencję o dużej czystości. Zastosowanie natywnej sekwencji liderowej skutkowało powstaniem dwóch głównych rodzajów ActRIIa-Fc, z których każdy miał różną sekwencję N-końcową. Przykład : Badanie kliniczne na ludziach (nie stanowi części wynalazku) [0188] Białko opisane w Przykładzie 4 podawano pacjentom ludziom w randomizowanym, podwójnie zaślepionym, kontrolowanym placebo badaniu, które przeprowadzano w celu oceny, głównie, bezpieczeństwa stosowania białka u zdrowych kobiet pomenopauzalnych. Czterdzieści osiem pacjentek randomizowano w kohorty po 6 osób, do otrzymywania pojedynczej dawki ActRIIa-hFc lub placebo ( aktywny: placebo). Poziomy dawek mieściły się w zakresie 0,01 do 3,0 mg/kg dożylnie (IV) i 0,03 do 0,1 mg/kg podskórnie (SC). Wszystkie pacjentki kontrolowano przez 1 dni. Pacjentki wykluczano z uczestnictwa w badaniu, jeśli przyjmowały leki wpływające na metabolizm kości w okresie 6 miesięcy od przystąpienia do badania. Oceny bezpieczeństwa przeprowadzano kontrolując każdą kohortę, dla wyznaczenia eskalacji dawki. Oprócz analiz farmakokinetycznych (PK), oceniano również aktywność biologiczną ActRIIa-hFc poprzez pomiar biochemicznych markerów tworzenie się kości i resorpcji, i poziomów FSH. [0189] W badaniu nie zgłoszono żadnych poważnych działań niepożądanych. Działania niepożądane (AEs) były na ogół łagodne i przejściowe. Wstępna analiza AEs obejmowała

58 ból głowy, podwyższone wartości w badaniach laboratoryjnych, objawy przeziębienia, torsje lub wymioty, infiltrację dożylną i krwiak w miejscu wstrzyknięcia. [0190] Analiza PK ActRIIa-hFc zaprezentowała profil liniowy względem dawki, i średni okres półtrwania wynoszący w przybliżeniu 2-32 dni. Pole pod krzywą (AUC) dla ActRIIa-hFc było liniowe względem dawki, a wchłanianie po dawkowaniu SC było zasadniczo całkowite (patrz Figury 27 i 28). Te dane wskazują, że SC to pożądane podejście do dawkowania, ponieważ zapewnia ono równorzędną biodostępność i okres półtrwania leku w surowicy, z jednoczesnym unikaniem gwałtownego wzrostu stężeń leku w surowicy, powiązanych z kilkoma pierwszymi dniami dawkowania IV (patrz Figura 28). ActRIIchFc spowodował szybki, zależny od utrzymywania dawki wzrost w poziomach w surowicy swoistej dla kości fosfatazy alkalicznej (BAP), która jest markerem anabolicznego wzrostu kości, i zależny od dawki spadek poziomów C-końcowego telopeptydu kolagenu typu I i winianoopornej kwaśnej fosfatazy b, które są markerami resorpcji kości. Inne markery, takie jak P1NP wykazywały nierozstrzygające wyniki. Poziomy BAP wykazywały efekt niemalże pełnego wysycenia dla najwyższego dawkowania leku, co wskazuje, że połowę działania maksymalnego na ten anaboliczny biomarker kości można by osiągnąć dla dawki 0,3 mg/kg, ze zwiększaniem zakresu do 3 mg/kg. Wyliczony jako związek działania farmakodynamicznego do AUC dla leku, EC0 wynosiło 1,46 (dzień*ng/ml). Patrz Figura 29. Te zmiany biomarkera kości utrzymywały się w przybliżeniu przez 1 dni, w najwyższych testowanych poziomach dawkowania. Występował również zależny od dawki spadek poziomów FSH w surowicy, zgodny z inhibicją aktywiny. [0191] Pojedyncza dawka ActRIIa-hFc podawana zdrowym kobietom pomenopauzalnym była bezpieczna i dobrze tolerowana w zakresie testowanych poziomów dawek. Wydłużone efekty PK i farmakodynamiczne sugerują, że okresowe dawkowanie będzie odpowiednie w dalszych badaniach. Na przykład, dawkowanie oparte na okresie półtrwania w surowicy można wykonywać w schemacie miesięcznym, lub na zlecenie, raz na dwa, trzy, cztery, pięć lub sześć tygodni. Dodatkowo, ponieważ działanie farmakodynamiczne trwa o wiele dłużej niż przebywanie leku w surowicy, dawkowanie można by wykonywać w oparciu o działanie farmakodynamiczne, co oznacza, że dawkowanie co trzy miesiące lub co dwa, trzy, cztery, pięć, sześć lub nawet dwanaście miesięcy może być skuteczne w produkowaniu pożądanego działania u pacjentów. To badanie kliniczne demonstruje, że, u ludzi, ActRIIa-hFc jest środkiem osteoanabolicznym, z dowodami biologicznymi zarówno na wzrost w tworzeniu się kości, jak i spadku w resorpcji kości. Przykład 6: Współpodawanie ActRIIa-mFc i bisfosfonianu [0192] Bisfosfoniany są klasą leków, które są powszechnie stosowane do leczenia zabu-

59 rzeń powiązanych z niską gęstością mineralną kości, w tym osteoporozy i powiązanej z rakiem utraty masy kostnej. Bisfosfoniany mają silną aktywność przeciwresorpcyjną, inhibowanie osteoklastów. Być może, ze względu na to, że osteoklasty są wymagane zarówno do degradacji kości, jak i wzrostu kości, bisfosfoniany zdają się zmniejszać skutki oddziaływania hormonu przytarczyc (PTH), jedne z niewielu znanych środków anabolicznego wzrostu kości (Black et al., N Engl J Med. 03 Sep 2;349(13):17-1; Samadfam et al., Endocrinology. 07 Jun;148(6): ) [0193] W celu przetestowania użyteczności leczenia ActRIIa-Fc u pacjentów, którzy przyjmowali wcześniej, lub otrzymywali równolegle bisfosfonian lub inną terapię przeciwresorpcyjną, testowano myszy za pomocą łącznego podawania ActRIIa-mFc i zoledronianu, związku bisfosfonianu. 12-tygodniowe myszy C7BL/6N traktowano jak następuje: Grupa 1 PBS Grupa 2 ActRIIa-mFc (RAP-011) ( mg/kg) dwa razy na tydzień (z Grupą 3 i 4) Grupa 3 Kwas zoledronowy (ZOL) pojedyncza dawka ( mg/kg) Grupa 4 ZOL (1 dawka), 3 dni później ActRIIa-mFc (RAP-011) (1 mg/kg) dwa razy na tydzień Grupa ZOL (1 dawka), 3 dni później ActRIIa-mfc (RAP-011) ( mg/kg) dwa razy na tydzień Całkowite BMD ustalono za pomocą skanu DEXA (P1XI) przed dawkowaniem i po 3 i 8 tygodniach leczenia. [0194] Jak pokazano na Figurze, całkowite BMD zwiększało się wyraźnie we wszystkich grupach leczonych, przy czym kombinacja ZOL i ActRIIa-mFc dawała największe efekty. Te wyniki wskazują, że można stosować białka ActRIIa-Fc w celu zwiększania gęstości kości, nawet u pacjentów, którzy otrzymywali terapię bisfosfonianem. Przykład 7: ActRIIa-Fc polepsza lub zapobiega utracie masy kostnej spowodowanej przez przerzuty raka piersi (nie stanowi części wynalazku) [019] Szacuje się, że 6 do 7 procent raków piersi daje przerzuty do kości, powodując znaczące uszkodzenia struktury kości, zwiększając ryzyko złamania i wywołując ból i inne działania niepożądane. Testowaliśmy skutki oddziaływania ActRIIa-Fc w mysim modelu raka piersi, który dał przerzut do kości. [0196] Sublinię linii komórkowej ludzkiego raka piersi MDA-MH-231 (klon 2287) hodowano in vitro, a komórki zbierano po osiągnięciu gęstości x 6 komórek/ml. MDA-MB- 231 to linia komórkowa, która jest wysoce właściwa do zaszczepiania w kości i powodowania uszkodzeń kości podobnych do tych wywoływanych przerzutami do kości. ml komórek wstrzykiwano do kości piszczelowej 6-tygodniowych pozbawionych grasicy sa-

60 9 1 mic myszy szczepu nude, w dniu badania 0. W dniu badania myszy otrzymywały ActRIIa-mFc ( mg/kg/dwa razy w tygodniu/podskórnie) (n=8) lub zaróbkę PBS (n=7). Progresję choroby oceniano przez absorpcjometrię podwójnej energii promieniowania rentgenowskiego (PIXIMus) w odstępach cotygodniowych. Myszy traktowano ActRIIamFc przez 4 tygodnie i następnie uśmiercano, a kości piszczelowe (zarówno ze wstrzykiwanym nowotworem lub nie) pobierano od każdego zwierzęcia. Kości piszczelowe następnie poddawano obróbce i przygotowywano do analiz microct i histologicznej. [0197] Wstrzykiwanie do kości piszczelowej komórek MDA-MB-231 do pozbawionych grasicy myszy szczepu nude promowało rozwój osteolitycznych zmian kości w kości piszczelowej, do której podawano wstrzyknięcie, w porównaniu do nogi po stronie przeciwnej. Analiza microct proksymalnej kości piszczelowej wykazała 62% redukcję w objętości kości beleczkowej w kościach piszczelowych niosących MDA-MB-231, w porównaniu do nieobarczonej nowotworem kości piszczelowej u myszy traktowanych zaróbką PBS. Leczenie ActRIIa-mFc prowadziło do zwiększania rzędu 70% lub 147% w zdrowej lub niosącej nowotwór kości piszczelowej, odpowiednio, w porównaniu do zaróbki (P<0,01 dla obydwu). Niosące nowotwór kości piszczelowe myszy leczonych ActRIIa-mFc miały podobną gęstość kości beleczkowej, jak zdrowe kości piszczelowe myszy traktowanych VEH (p=0,39). [0198] Zatem, ActRIIa-mFc jest zdolny do eliminacji uszkodzeń kości powiązanych z obecnością komórek nowotworu piersi w kości. Przykład 8: Alternatywne białka ActRIIa-Fc [0199] Alternatywny konstrukt może mieć delecję ogona c-końcowego (końcowe 1 aminokwasów domeny pozakomórkowej ActRIIa. Sekwencję takiego konstruktu zaprezentowano poniżej (część Fc podkreślono) (SEQ ID NO: 12): 2 Zastrzeżenia patentowe 1. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca białko fuzyjne ActRIIa-Fc, ulegające ekspresji w komórkach CHO, przy czym białko fuzyjne ActRIIa-Fc oznacza dimer utworzony z

61 dwóch polipeptydów, z których każdy ma sekwencję aminokwasową, która jest co najmniej w 90% lub 9% identyczna z sekwencją aminokwasową SEQ ID NO:7, połączonych przez wiązanie dwusiarczkowe, przy czym dimer ma od 3 do ugrupowań kwasu sjalowego. 2. Kompozycja farmaceutyczna według zastrzeżenia 1, w którym białko fuzyjne ActRIIa- Fc oznacza dimer utworzony przez dwa polipeptydy SEQ ID NO:7, i w którym jeden lub oba polipeptydy opcjonalnie mają o jeden aminokwas mniej na końcach aminowym lub karboksylowym, niż pokazano w SEQ ID NO:7. 3. Kompozycja farmaceutyczna według zastrzeżenia 1 lub zastrzeżenia 2, w którym białko fuzyjne ActRIIa-Fc jest rekombinacyjnie ekspresjonowane w komórkach CHO przy użyciu sekwencji liderowej TPA SEQ ID NO: Kompozycja farmaceutyczna według któregokolwiek z poprzednich zastrzeżeń, przy czym dimer ma 4 ugrupowania kwasu sjalowego.. Kompozycja farmaceutyczna według któregokolwiek z poprzednich zastrzeżeń, przy czym białko fuzyjne ActRIIa-Fc ma okres półtrwania w surowicy średnio od 2 do 32 dni, u normalnych, zdrowych ludzi, i równorzędną biodostępność po podaniu dożylnym lub podskórnym. 6. Kompozycja farmaceutyczna według któregokolwiek z poprzednich zastrzeżeń, przy czym kompozycja farmaceutyczna jest odpowiednia do podawania podskórnego. 7. Kompozycja farmaceutyczna według któregokolwiek z poprzednich zastrzeżeń, przy czym białko fuzyjne ActRIIa-Fc jest co najmniej w 90% czyste względem innych składników białkowych. 8. Kompozycja farmaceutyczna według któregokolwiek z poprzednich zastrzeżeń, przy czym białko fuzyjne ActRIIa-Fc zawiera jedną lub więcej modyfikowanych reszt aminokwasowych wybranych spośród: glikozylowanego aminokwasu, PEG-ylowanego aminokwasu, farnezylowanego aminokwasu, acetylowanego aminokwasu, biotynylowanego aminokwasu, aminokwasu sprzęganego z ugrupowaniem lipidowym i aminokwasu sprzęganego z organicznym środkiem derywatyzującym. 9. Kompozycja farmaceutyczna według któregokolwiek z poprzednich zastrzeżeń, dodatkowo zawierająca środek bisfosfonianowy.. Kompozycja farmaceutyczna według zastrzeżenia 9, w którym środek bisfosfonianowy jest wybrany spośród alendronianu, ibandronianu i rizedronianu. 11. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca białko fuzyjne ActRIIa-Fc do stosowania w leczeniu lub zapobieganiu szpiczakowi mnogiemu u pacjenta człowieka, przy czym kompozycja farmaceutyczna oznacza jak zdefiniowano w którymkolwiek z zastrzeżeń 1

62 61 do. 12. Zastosowanie białka fuzyjnego ActRIIa-Fc do wytwarzania leku do leczenia lub zapobiegania szpiczakowi mnogiemu u pacjenta człowieka, w którym białko fuzyjne ActRIIa-Fc oznacza jak zdefiniowano w którymkolwiek z zastrzeżeń 1 do. Uprawniony: Pełnomocnik: Acceleron Pharma, Inc. mgr Katarzyna Rudnicka Rzecznik patentowy

63 62 Figura 1

64 63

65 64

66 6

67 66

68 67

69 68

70 69

71 70 Figura 9

72 71

73 72

74 73

75 74

76 7 Figura 14