(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (13) (1) T3 Int.Cl. A61K 38/17 (06.01) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 12/40 EP B1 (4) Tytuł wynalazku: ANTAGONIŚCI AKTYWINY-ACTRII I ZASTOSOWANIA DO LECZENIA NIEDOKRWISTOŚCI () Pierwszeństwo: US P (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 09/49 (4) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 13/03 (73) Uprawniony z patentu: Acceleron Pharma, Inc., Cambridge, US (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 MATTHEW L. SHERMAN, Newton, US (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Katarzyna Rudnicka SULIMA-GRABOWSKA-SIERZPUTOWSKA BIURO PATENTÓW I ZNAKÓW TOWAROWYCH SP.J. skr. poczt Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 SGS-36/VAL EP B1 Opis 1 2 TŁO WYNALAZKU [0001] Dojrzała czerwona krwinka, lub erytrocyt, odpowiada za przenoszenie tlenu w układach krążenia kręgowców. Czerwone krwinki przenoszą wysokie stężenia hemoglobiny, białka, które wiąże tlen w płucach przy stosunkowo wysokim ciśnieniu cząstkowym tlenu (po 2 ) i dostarcza tlen do obszarów organizmu o stosunkowo niskim po 2. [0002] Dojrzałe czerwone krwinki są wytwarzane z pluripotencjalnych krwiotwórczych komórek macierzystych w procesie zwanym erytropoezą. U osób w okresie poporodowym, erytropoeza zachodzi głównie w szpiku kostnym i w miazdze czerwonej śledziony. Skoordynowane działanie różnych szlaków sygnalizacji kontroluje równowagę proliferacji, różnicowania, przeżycia i śmierci komórek. W normalnych warunkach, czerwone krwinki są produkowane z szybkością, która utrzymuje stałą masę krwinek czerwonych w organizmie, a produkcja może wzrastać lub obniżać się w odpowiedzi na różne bodźce, w tym podwyższone lub obniżone ciśnienie tlenu lub zapotrzebowanie tkanek. Proces erytropoezy rozpoczyna się od utworzenia linii zdeterminowanych komórek prekursorowych i postępuje poprzez szereg odrębnych typów komórek prekursorowych. Końcowe stadia erytropoezy zachodzą w miarę jak retikulocyty są uwalniane do krwioobiegu i tracą swoje mitochondria i rybosomy, przyjmując jednocześnie morfologię dojrzałej czerwonej krwinki. Podwyższony poziom retikulocytów, lub podwyższony stosunek retikulocytów: erytrocytów we krwi świadczy o podwyższonym tempie produkcji krwinek czerwonych. [0003] Erytropoetyna (Epo) jest powszechnie uznawana za najistotniejszy dodatni regulator erytropoezy u poporodowych kręgowców. Epo reguluje wyrównawczą odpowiedź erytropoetyczną na zredukowane ciśnienie tlenu w tkankach (hipoksja) i niskie poziomy krwinek czerwonych lub niskie poziomy hemoglobiny. U ludzi, podwyższone poziomy Epo stymulują tworzenie czerwonych krwinek poprzez stymulowanie generowania progenitorów erytroidalnych w szpiku kostnym i śledzionie. U myszy, Epo wzmaga erytropoezę, głównie w śledzionie. [0004] Różne postaci rekombinowanych Epo są stosowane przez lekarzy do podwyższania poziomów krwinek czerwonych w licznych układach klinicznych, a szczególnie do leczenia niedokrwistości. Niedokrwistość to szeroko definiowany stan, charakteryzowany przez niższe niż normalnie poziomy hemoglobiny lub czerwonych krwinek we krwi. W niektórych przypadkach, niedokrwistość jest powodowana przez pierwotne zaburzenie w pro-

3 dukcji lub przeżyciu czerwonych krwinek. Częściej, niedokrwistość jest wtórna w odniesieniu do chorób innych układów (Weatherall & Provan (00) Lancet 3, ). Niedokrwistość może być skutkiem zredukowanego tempa produkcji lub podwyższonego tempa niszczenia czerwonych krwinek lub utraty czerwonych krwinek na skutek krwawienia. Niedokrwistość może powstawać w związku z szeregiem zaburzeń, które obejmują, na przykład, przewlekłą niewydolność nerek, zespół mielodysplastyczny, reumatoidalne zapalenie stawów i przeszczepienie szpiku kostnego. [000] Leczenie za pomocą Epo typowo powoduje wzrost stężenia hemoglobin o około 1-3 g/dl u zdrowych ludzi przez okres tygodni. Przy podawaniu pacjentom z niedokrwistością, ten schemat leczenia często zapewnia znaczące podwyższenie stężenia hemoglobiny i poziomu krwinek czerwonych i prowadzi do polepszenia jakości życia i wydłużonego przeżycia. Epo nie jest jednolicie skuteczne, a wielu osobników jest opornych na działanie nawet wysokich dawek (Horl et al. (00) Nephrol Dial Transplant 1, 43-0). Ponad 0% pacjentów z rakiem ma niedostateczną odpowiedź na Epo, w przybliżeniu % z końcowym stadium choroby nerek jest hiporeaktywnych (Glaspy et al. (1997) J Clin Oncol 1, ; Demetri et al. (1998) J Clin Oncol 16, ), i mniej niż % z zespołem mielodysplastycznym reaguje pozytywnie (Estey (03) Curr Opin Hematol, 60-67). Niektóre czynniki, w tym stan zapalny, niedobór żelaza i witamin, niedostateczna dializa, toksyczność glinu, i nadczynność przytarczyc mogą prognozować słabą odpowiedź terapeutyczną, mechanizmy molekularne oporności na Epo są jak na razie nieznane. [0006] Tym sposobem, celem ujawnienia jest zapewnienie alternatywnych kompozycji i sposobów podwyższania poziomów krwinek czerwonych u pacjentów. KRÓTKI OPIS WYNALAZKU [0007] W pierwszym aspekcie, wynalazek zapewnia antagonistę aktywiny-actrii do stosowania w leczeniu lub zapobieganiu niedokrwistości u pacjenta człowieka, który tego wymaga, w którym antagonista aktywiny-actrii oznacza polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową wybraną z grupy, w której skład wchodzą: a) sekwencja aminokwasowa z SEQ ID NO:2 lub sekwencja aminokwasowa w co najmniej 90% lub 9% identyczna z SEQ ID NO:2; b) sekwencja aminokwasowa z SEQ ID NO: 3 lub sekwencja aminokwasowa w co najmniej 90% lub 9% identyczna z SEQ ID NO: 3; c) polipeptyd zawierający co najmniej 0 kolejnych aminokwasów wybranych z SEQ ID NO: 2; d) sekwencja aminokwasowa z SEQ ID NO: 16 lub sekwencja aminokwasowa w co najmniej 90% lub 9% identyczna z SEQ ID NO: 16;

4 e) sekwencja aminokwasowa z SEQ ID NO: 17 lub sekwencja aminokwasowa w co najmniej 90% lub 9% identyczna z SEQ ID NO: 17; f) polipeptyd zawierający co najmniej 0 kolejnych aminokwasów wybranych z SEQ ID NO: 16; g) sekwencja aminokwasowa z SEQ ID NO: 7 lub sekwencja aminokwasowa w co najmniej 9% identyczna z SEQ ID NO: 7; h) sekwencja aminokwasowa z SEQ ID NO: 12 lub sekwencja aminokwasowa w co najmniej 9% identyczna z SEQ ID NO: 12; i) sekwencja aminokwasowa z SEQ ID NO: lub sekwencja aminokwasowa w co najmniej 9% identyczna z SEQ ID NO: ; oraz j) sekwencja aminokwasowa z SEQ ID NO: 21 lub sekwencja aminokwasowa w co najmniej 9% identyczna z SEQ ID NO: 21. [0008] Antagonista może oznaczać białko fuzyjne w tym, poza polipeptydem antagonisty aktywiny-actrii, jedną lub więcej części polipeptydu, które wzmacniają jedną lub więcej spośród: stabilności in vivo, okresu półtrwania in vivo, podejmowania/podawania, lokalizacji lub dystrybucji w tkance, tworzenia kompleksów białkowych i/lub oczyszczania. Dokładniej, białko fuzyjne może obejmować część polipeptydu wybraną z grupy, w której skład wchodzą: domena Fc immunoglobuliny i albumina surowicy. [0009] Polipeptyd antagonisty aktywiny lub ActRII do stosowania według wynalazku może obejmować jedną lub więcej modyfikowanych reszt aminokwasowych, wybranych z: glikozylowanego aminokwasu, PEG-ylowanego aminokwasu, farnezylowanego aminokwasu, acetylowanego aminokwasu, biotynylowanego aminokwasu, aminokwasu sprzęganego z ugrupowaniem lipidowym i aminokwasu sprzęganego z organicznym środkiem derywatyzującym. [00] Niedokrwistość oznacza niedokrwistość, która może być powiązana z szpiczakiem mnogim, z przewlekłą chorobą nerek u pacjenta, z chemoterapeutycznym leczeniem pacjenta, z zespołem mielodysplastycznym lub z talasemią. [0011] W drugim aspekcie, wynalazek zapewnia sposób identyfikowania środka, który podwyższa poziomy krwinek czerwonych, sposób obejmujący: a) kontaktowanie przedmiotowego środka z izolowanym polipeptydem ActRII, który jest typowo zdolny do wiązania do aktywiny; b) dodawanie kompozycji zawierającej aktywinę; c) określanie ilościowe skuteczności środka w inhibowaniu tworzenia kompleksu pomiędzy polipeptydem ActRII i aktywiną; oraz d) ocenianie oddziaływania środka na poziomy krwinek czerwonych w zwierzęciu.

5 [0012] W trzecim aspekcie, wynalazek zapewnia białko fuzyjne ActRII-Fc do stosowania w leczeniu lub zapobieganiu niedokrwistość u pacjenta człowieka, który tego wymaga, w którym białko fuzyjne ActRII-Fc zawiera sekwencję aminokwasową wybraną z grupy, w której skład wchodzą: a) sekwencja aminokwasowa z SEQ ID NO: 3 lub sekwencja, która jest w co najmniej 90% lub 9% identyczna z SEQ ID NO: 3, b) sekwencja aminokwasowa z SEQ ID NO:2 lub sekwencja, która jest w co najmniej 90% lub 9% identyczna z SEQ ID NO: 2, c) sekwencja aminokwasowa z SEQ ID NO:7 lub sekwencja, która jest w co najmniej 90% lub 9% identyczna z SEQ ID NO: 7, d) sekwencja aminokwasowa z SEQ ID NO: 12 lub sekwencja aminokwasowa w co najmniej 9% identyczna z SEQ ID NO: 12, e) sekwencja aminokwasowa z SEQ ID NO: 17 lub sekwencja, która jest w co najmniej 90% lub 9% identyczna z SEQ ID NO: 17, e) sekwencja aminokwasowa z SEQ ID NO: 16 lub sekwencja, która jest w co najmniej 90% lub 9% identyczna z SEQ ID NO: 16, f) sekwencja aminokwasowa z SEQ ID NO: lub sekwencja aminokwasowa co najmniej w 90% lub 9% identyczna z SEQ ID NO:, oraz g) sekwencja aminokwasowa z SEQ ID NO:21 lub sekwencja aminokwasowa co najmniej w 9% identyczna z SEQ ID NO: 21. [0013] Białko może powodować mniej niż 1% podwyższenia masy mięśni szkieletowych pacjenta. W jednym przykładzie wykonania, białko jest podawane tak, żeby osiągnęło stężenie w surowicy pacjenta co najmniej 0 ng/ml przez okres około do dni. Białko może być podawane tak, żeby osiągnęło stężenie w surowicy u pacjenta w zakresie 0 ng/ml do 00 ng/ml. Białko może mieć okres półtrwania w surowicy pomiędzy 1 a dni. W niektórych przykładach wykonania, białko ma być podawanie pacjentowi nie częściej niż raz na tydzień, korzystnie nie częściej niż raz na miesiąc. [0014] Po części, ujawnienie demonstruje, że antagonistów aktywiny, jak również antagonistów ActRIIa i ActRIIb, można stosować do podwyższania poziomów czerwonych krwinek i hemoglobiny. W szczególności, ujawnienie demonstruje, że rozpuszczalna postać ActRIIa działa jako inhibitor aktywiny oraz, przy podawaniu in vivo, podwyższa poziomy krwinek czerwonych we krwi. Łagodniejszy efekt obserwowano w przypadku rozpuszczalnej postaci ActRIIb, która wiąże aktywinę A z mniejszym powinowactwem, niż rozpuszczalna ActRIIa. Podczas gdy rozpuszczalne ActRIIa i ActRIIb mogą oddziaływać na poziomy krwinek czerwonych poprzez mechanizm inny niż antagonizowanie aktywiny,

6 1 2 3 niemniej ujawnienie demonstruje, że pożądane środki terapeutyczne można wybierać na podstawie aktywności antagonisty aktywiny lub antagonisty ActRIIa lub obydwu. Takie środki określa się łącznie jako antagonistów aktywiny-actrii. W następstwie czego, w niektórych przykładach wykonania, wynalazek zapewnia antagonistów aktywiny-actrii, w tym, na przykład, wiążące aktywinę polipeptydy ActRIIa, i wiążące aktywinę polipeptydy ActRIIb, do stosowania w podwyższaniu poziomów czerwonych krwinek i poziomów hemoglobiny u pacjentów i do leczenia zaburzeń powiązanych z niskimi poziomami czerwonych krwinek lub poziomów hemoglobiny u pacjentów, którzy tego wymagają. Jak opisano in amerykańskim zgłoszeniu patentowym A1, antagonistów aktywiny- ActRIIa można stosować do stymulowania wzrostu kości i wzrostu gęstości kości. Według opisu, skutki działania takich antagonistów na poziomy krwinek czerwonych są szybsze i zachodzą przy niższych dawkach, niż skutki działania takich antagonistów na kość. Tym sposobem, w niektórych przykładach wykonania, antagonistów aktywiny-actriia można stosować do podwyższania poziomów czerwonych krwinek lub hemoglobiny bez powodowania znaczącego wzrostu w gęstości kości, na przykład, mniej niż 3%, %, % lub 1% wzrostu w gęstości kości. To selektywne działanie można osiągnąć przez stosowanie, na przykład, niższych dawek antagonisty aktywiny-actriia, rzadszego podawania dawek lub przez stosowanie antagonisty aktywina-actriia o krótszym okresie półtrwania w surowicy, w dawkach i częstotliwościach podawania wyliczonych do dostarczenia niższych stężeń w surowicy. [001] Polipeptydy użyteczne w wynalazku mogą obejmować rozpuszczalny, wiążący aktywinę polipeptyd ActRII, który wiąże się do aktywiny. Wiążący aktywinę polipeptyd może oznaczać polipeptyd ActRIIa lub polipeptyd ActRIIb. Polipeptydy ActRII można formułować jako preparat farmaceutyczny zawierający polipeptyd ActRII wiążący aktywinę i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. Polipeptyd ActRII wiążący aktywinę może wiązać się z aktywiną, z K D mniejszą niż 1 mikromolarna lub mniejszą niż 0, lub 1 nanomolarna. Opcjonalnie, polipeptyd ActRII wiążący aktywinę selektywnie wiąże aktywinę versus GDF11 i/lub GDF8, opcjonalnie z K D, która jest co najmniej -krotnie, -krotnie lub 0-krotnie niższa względem aktywiny, niż względem GDF11 i/lub GDF8. Bez chęci wiązania się z określonym mechanizmem działania, oczekuje się, że ten stopień selektywności dla inhibicji aktywiny ponad inhibicję GDF11/GDF8 odpowiada za oddziaływanie na kość lub erytropoezę, bez konsekwentnie mierzalnego oddziaływania na mięśnie. W wielu przykładach wykonania polipeptyd ActRII można dobrać pod kątem powodowania mniej niż 1%, mniej niż % lub mniej niż % wzrostu w mięśniach, w dawkach, które osiągają pożądany wpływ na poziomy krwinek czerwonych. Kompozycja może być w co najmniej

7 w 9% czysta, względem innych składników polipeptydowych, jak oszacowano przy pomocy chromatografii wykluczania ze względu na rozmiar, i korzystniej, kompozycja jest co najmniej w 98% czysta. Wiążący aktywinę polipeptyd ActRIIa do stosowania w wynalazku może oznaczać dowolny z ujawnionych powyżej, taki jak polipeptyd o sekwencji aminokwasowej wybranej z SEQ ID NOs: 2, 3, 7 lub 12, albo o sekwencji aminokwasowej, która jest co najmniej w 90%, 9%, 97% lub 99% identyczna z sekwencją aminokwasową wybraną spośród SEQ ID NO: 2, 3, 7, 12 lub 13. Polipeptyd ActRIIa wiążący aktywinę może zawierać funkcjonalny fragment naturalnego polipeptydu ActRIIa, taki jak zawierający co najmniej, lub aminokwasów sekwencji wybranej spośród SEQ ID NOs: 1-3 lub sekwencji SEQ ID NO: 2, pozbawionej do 1 C-końcowych aminokwasów ( ogon ). Wiążący aktywinę polipeptyd ActRIIb do stosowania w wynalazku może oznaczać dowolny z ujawnionych powyżej, taki jak polipeptyd o sekwencji aminokwasowej wybranej z SEQ ID NOs: 16, 17, lub 21, albo o sekwencji aminokwasowej, która jest co najmniej w 90%, 9%, 97% lub 99% identyczna z sekwencją aminokwasową wybraną spośród SEQ ID NO: 16, 17, lub 21. Polipeptyd ActRIIb wiążący aktywinę może zawierać funkcjonalny fragment naturalnego polipeptydu ActRIIb, taki jak zawierający co najmniej, lub aminokwasów sekwencji wybranej spośród SEQ ID NOs: 1-12, lub sekwencji pozbawionej do 1 C-końcowych aminokwasów ( ogon ), takiej jak SEQ ID NO: 17. [0016] Rozpuszczalny, wiążący aktywinę polipeptyd ActRII może zawierać jedną lub więcej zmian w sekwencji aminokwasowej (np. w domenie wiążącej ligand) względem naturalnie występującego polipeptydu ActRII. Przykłady zmienianych polipeptydów ActRIIa i ActRIIb zapewniono w WO 06/012627, str i str. -8, odpowiednio. Zmiana w sekwencji aminokwasowej może, na przykład, zmieniać glikozylację polipeptydu, gdy jest on produkowany w ssaczej, owadziej lub innej eukariotycznej komórce lub zmieniać cięcie proteolityczne polipeptydu względem naturalnie występującego polipeptydu ActRII. Wiążący aktywinę polipeptyd ActRII użyteczny w wynalazku może oznaczać białko fuzyjne, które ma, jako jedną domenę, polipeptyd ActRII (np. wiążącą ligand część ActRIIa lub ActRIIb) i jedną lub więcej dodatkowych domen, które zapewniają pożądaną właściwość, taką jak ulepszona farmakokinetyka, łatwiejsze oczyszczanie, nakierowywanie do określonych tkanek, itp. Na przykład, domena białka fuzyjnego może wzmagać jedną lub więcej spośród: stabilność in vivo, okres półtrwania in vivo, podejmowanie/podawanie, lokalizacja lub dystrybucja tkankowa, tworzenie kompleksów białkowych, multimeryzacja białka fuzyjnego, i/lub oczyszczanie. Wiążące aktywinę białko fuzyjne ActRII może zawierać domenę immunoglobuliny Fc (typu dzikiego lub mutant) lub albuminę surowicy lub inną

8 część polipeptydu, która zapewnia pożądane właściwości, takie jak ulepszona farmakokinetyka, ulepszona rozpuszczalność lub ulepszona trwałość. W korzystnym przykładzie wykonania, fuzja ActRIIa-Fc zawiera względnie nieustrukturyzowany łącznik, umieszczony pomiędzy domeną Fc i pozakomórkową domeną ActRII. Ten nieustrukturyzowany łącznik może odpowiadać z grubsza 1-aminokwasowemu nieustrukturyzowanemu regionowi na końcu C domeny pozakomórkowej ActRII ( ogon ), lub może to być sztuczna sekwencja 1, 2, 3, 4 lub aminokwasów lub o długości od do 1,,, 0 lub więcej aminokwasów, które są względnie wolne od struktur drugorzędowych, lub mieszanina obydwu. Łącznik może być bogaty w reszty glicyny i proliny, i może, na przykład, zawierać pojedynczą sekwencję treoniny/seryny i glicyn lub powtarzające się sekwencje treoniny/seryny i glicyn (np. TG 4 (SEQ ID NO:22), lub SG 4 (SEQ ID NO:23) singlety lub powtórzenia). Białko fuzyjne może zawierać subsekwencję do oczyszczania, taką jak znacznik epitopu, znacznik FLAG, sekwencja polihistydynowa i fuzja GST. Opcjonalnie, rozpuszczalny polipeptyd ActRII obejmuje jedną lub więcej modyfikowanych reszt aminokwasowych, wybranych spośród: glikozylowanego aminokwasu, PEG-ylowanego aminokwasu, farnezylowanego aminokwasu, acetylowanego aminokwasu, biotynylowanego aminokwasu, aminokwasu sprzęganego z ugrupowaniem lipidowym i aminokwasu sprzęganego z organicznym środkiem derywatyzującym. Preparat farmaceutyczny może również zawierać jeden lub więcej dodatkowych związków, takich jak związek, który jest stosowany do leczenia zaburzeń kości. Korzystnie, preparat farmaceutyczny jest zasadniczo wolny od pirogenów. Na ogół, korzystnym jest, żeby białko ActRII było eksprymowane w ssaczej linii komórkowej, która reguluje w odpowiedni sposób naturalną glikozylację białka ActRII, tak, żeby zmniejszyć prawdopodobieństwo niekorzystnej odpowiedzi immunologicznej u pacjenta. Stosowano z powodzeniem linie komórkowe ludzkie i CHO, oczekuje się, że użyteczne będą inne popularne ssacze układy ekspresyjne. [0017] Według opisu, białka ActRIIa oznaczone ActRIIa-Fc (postać z minimalnym łącznikiem pomiędzy częścią ActRIIa i częścią Fc) mają pożądany właściwości, w tym selektywne wiązanie do aktywiny vs. GDF8 i/lub GDF11, wiązanie ligandu z dużym powinowactwem i okres półtrwania w surowicy dłuższy niż dwa tygodnie w modelach zwierzęcych. W opisie ujawniono preparaty farmaceutyczne zawierające polipeptydy ActRIIa-Fc i farmaceutycznie dopuszczalny rozczynnik. [0018] Również, ujawniono w opisie kwasy nukleinowe kodujące rozpuszczalny, wiążący aktywinę ActRII polipeptyd, taki jak polipeptyd ActRIIa lub ActRIIb. Izolowany polinukleotyd może zawierać sekwencję kodującą rozpuszczalny polipeptyd ActRII wiążący aktywinę, taki jak opisany powyżej. Na przykład, izolowany kwas nukleinowy może zawie-

9 rać sekwencję kodującą domenę pozakomórkową (np. domena wiążąca ligand) ActRII i sekwencję, która będzie kodować część lub całość domeny przezbłonowej i/lub domeny cytoplazmatycznej ActRII, ale poza kodonem stop, umieszczonym w obrębie domeny przezbłonowej lub domeny cytoplazmatycznej, lub umieszczonym pomiędzy domeną pozakomórkową i domeną przezbłonową lub domeną cytoplazmatyczną. Na przykład, izolowany polinukleotyd może zawierać pełnej długości sekwencję polinukleotydu ActRII, taką jak SEQ ID NO: 4 lub lub pełnej długości sekwencję polinukleotydu ActRIIb, taką jak SEQ ID NO: 18, lub częściowo skróconą wersję ActRIIa lub ActRIIb, izolowany polinukleotyd dodatkowo zawierający kodon terminacji transkrypcji co najmniej sześćset nukleotydów przed końcem 3' lub umieszczony w inny sposób, taki, że translacja polinukleotydu doprowadzi do powstania domeny pozakomórkowej, opcjonalnie sprzężonej ze skróconą częścią ActRII pełnej długości. Sekwencja kwasu nukleinowego dla ActRIIa oznacza SEQ ID NO: 14. Kwasy nukleinowe ujawnione w opisie mogą być funkcjonalnie związane z promotorem do ekspresji, a ujawnienie zapewnia komórki transformowane takimi rekombinowanymi polinukleotydami. Korzystnie komórka oznacza ssaczą komórkę, taką jak komórka CHO. [0019] Sposoby wytwarzania rozpuszczalnego, wiążącego aktywinę polipeptydu ActRII mogą obejmować eksprymowanie dowolnych kwasów nukleinowych (np. SEQ ID NO: 4,, 14, 18 lub 19) ujawnionych w opisie w odpowiedniej komórce, takiej jak komórka jajnika chomika chińskiego (CHO). Taki sposób może obejmować: a) hodowanie komórek w warunkach odpowiednich do ekspresji rozpuszczalnego polipeptydu ActRII, w którym komórka jest transformowana rozpuszczalnym konstruktem do ekspresji ActRII; i b) odzyskiwanie eksprymowanego w ten sposób rozpuszczalnego polipeptydu ActRII. Rozpuszczalne polipeptydy ActRII można odzyskiwać jako surowe, częściowo oczyszczone lub silnie oczyszczone frakcje. Oczyszczanie można osiągnąć za pomocą serii etapów oczyszczania, w tym, na przykład, jeden, dwa lub trzy lub więcej z poniższych, w dowolnej kolejności: chromatografia białka A, chromatografia anionowymienna (np. Q sefaroza), chromatografia oddziaływań hydrofobowych (np. fenylosefaroza), chromatografia wykluczania ze względu na rozmiar i chromatografia kationowymienna. [00] Antagonistę aktywiny-actrii ujawnionego w opisie, takiego jak rozpuszczalny polipeptyd ActRIIa wiążący aktywinę, lub rozpuszczalny polipeptyd ActRIIb wiążący aktywinę można stosować w sposobie do stymulowania produkcji krwinek czerwonych lub podwyższania poziomów krwinek czerwonych u danego osobnika. Ujawnia się sposoby leczenia zaburzenia powiązanego z małą liczbą czerwonych krwinek lub niskimi poziomami hemoglobiny (np. niedokrwistość), lub do stymulowania produkcji krwinek czerwo-

10 nych, u pacjentów, którzy tego wymagają. Sposób może obejmować podawanie osobnikowi, który tego wymaga skutecznej ilości antagonisty aktywiny-actrii. W niektórych aspektach, ujawnione są zastosowania antagonistów aktywiny-actrii do wytwarzania leku do leczenia zaburzenia lub stanu według opisu. [0021] W niektórych aspektach, ujawnienie zapewnia sposób do identyfikacji środka, który stymuluje produkcję czerwonych krwinek. Sposób obejmuje: a) identyfikowanie środka testowego, który wiąże się z aktywiną lub domeną wiążącą ligand polipeptydu ActRII; i b) ocenianie oddziaływania środka na poziomy czerwonych krwinek, hemoglobiny i/lub poziomy prekursorów czerwonych krwinek (np. poziomy retikulocytów). KRÓTKI OPIS RYSUNKÓW [0022] Figura 1 pokazuje oczyszczanie ActRIIa-hFc eksprymowanego w komórkach CHO. Białko oczyszczane jest jako pojedynczy, dobrze zdefiniowany pik, jak zwizualizowano na kolumnie do rozdzielania pod względem rozmiaru (lewy panel) i SDS-PAGE wybarwianym Coomassie (prawy panel) (lewa ścieżka: standardy mas cząsteczkowych; prawa ścieżka: ActRIIa-hFc). Figura 2 pokazuje wiązanie ActRIIa-hFc do aktywiny i GDF-11, co zmierzono za pomocą oznaczenia Biacore. Figura 3 pokazuje oddziaływanie ActRIIa-hFc na liczbę czerwonych krwinek u samic naczelnych różnych od człowieka. Samice małp cynomolgus (cztery grupy, po pięć małp każda) traktowano placebo lub 1 mg/kg, mg/kg lub mg/kg ActRIIa-hFc w dniu 0, dniu 7, dniu 14 i dniu 21. Figura 3A pokazuje liczbę czerwonych krwinek (RBC). Figura 3B pokazuje poziomy hemoglobiny. Istotność statystyczną pokazano względem wartości wyjściowych dla każdej grupy leczenia. W dniu 7, w każdej grupie pozostały dwie małpy. Figura 4 pokazuje oddziaływanie ActRIIa-hFc na liczbę czerwonych krwinek u samic naczelnych różnych od człowieka. Samce małp cynomolgus (cztery grupy, po pięć małp każda) traktowano placebo lub 1mg/kg, mg/kg lub mg/kg ActRIIahFc w dniu 0, dniu 7, dniu 14 i dniu 21. Figura 4A pokazuje liczbę czerwonych krwinek (RBC). Figura 4B pokazuje poziomy hemoglobiny. Istotność statystyczną pokazano względem wartości wyjściowych dla każdej grupy leczenia. W dniu 7, w każdej grupie pozostały dwie małpy. Figura pokazuje oddziaływanie ActRIIa-hFc na liczbę retikulocytów u samic naczelnych różnych od człowieka. Małpy cynomolgus (cztery grupy, po pięć małp każda) traktowano placebo lub 1 mg/kg, mg/kg lub mg/kg ActRIIa-hFc w

11 1 2 dniu 0, dniu 7, dniu 14 i dniu 21. Figura A pokazuje liczbę bezwzględną retikulocytów. Figura B pokazuje odsetek retikulocytów względem RBC. Istotność statystyczną pokazano względem wartości wyjściowych dla każdej grupy. W dniu 7, w każdej grupie pozostały dwie małpy. Figura 6 pokazuje oddziaływanie ActRIIa-hFc na liczbę retikulocytów u samic naczelnych różnych od człowieka. Małpy cynomolgus (cztery grupy, po pięć małp każda) traktowano placebo lub 1 mg/kg, mg/kg lub mg/kg ActRIIa-hFc w dniu 0, dniu 7, dniu 14 i dniu 21. Figura 6A pokazuje liczbę bezwzględną retikulocytów. Figura 6B pokazuje odsetek retikulocytów względem RBC. Istotność statystyczną pokazano względem wartości wyjściowych dla każdej grupy. W dniu 7, w każdej grupie pozostały dwie małpy. Figura 7 pokazuje wyniki z badania klinicznego na ludziach, opisanego w Przykładzie, gdzie pole pod krzywą (AUC) i podawana dawka ActRIIa-hFc mają korelację liniową, niezależnie od tego, czy ActRIIa-hFc podawano dożylnie (IV) czy podskórnie (SC). Figura 8 pokazuje porównanie poziomów ActRIIa-hFc w surowicy u pacjentów, po podaniu IV lub SC. Figura 9 pokazuje poziomy fosfatazy alkalicznej w kościach (BAP) w odpowiedzi na różne poziomy dawki ActRIIa-hFc. BAP to marker anabolicznego wzrostu kości. Figura przedstawia medianę zmiany z punktu wyjściowego poziomów hematokrytu z badania klinicznego na ludziach, opisanego w Przykładzie. ActRIIa-hFc podawano dożylnie (IV) we wskazanych dawkach. Figura 11 przedstawia medianę zmiany z punktu wyjściowego poziomów hemoglobiny z badania klinicznego na ludziach, opisanego w Przykładzie. ActRIIa-hFc podawano dożylnie (IV) we wskazanych dawkach. Figura 12 przedstawia medianę zmiany z punktu wyjściowego liczby RBC (czerwonych krwinek) z badania klinicznego na ludziach, opisanego w Przykładzie. ActRIIa-hFc podawano dożylnie (IV) we wskazanych dawkach. Figura 13 przedstawia medianę zmiany z punktu wyjściowego liczby retikulocytów z badania klinicznego na ludziach, opisanego w Przykładzie. ActRIIa-hFc podawano dożylnie (IV) we wskazanych dawkach. SZCZEGÓŁOWY OPIS WYNALAZKU 1. Streszczenie

12 [0023] Nadrodzina transformującego czynnika wzrostu beta (TGF-beta) zawiera szereg czynników wzrostu, które współdzielą powszechnie występujące elementy sekwencji i motywy strukturalne. Białka te są znane z wywierania efektów biologicznych na wiele różnych rodzajów komórek, zarówno u kręgowców, jak i bezkręgowców. Członkowie nadrodziny pełnią ważne funkcje podczas rozwoju zarodkowego, w tworzeniu wzorców i specyfikacji tkanek, i mogą wpływać na szereg procesów różnicowania, w tym odkładanie się tłuszczu, tworzenie się mięśni, powstawanie chrząstek, rozwój serca, tworzenie się krwinek, tworzenie się nerwów i różnicowanie komórek nabłonkowych. Rodzina dzieli się na dwa główne odgałęzienia: odgałęzienia BMP/GDF i TGF-beta/Aktywina/BMP, których członkowie mają zróżnicowane, często uzupełniające działanie. Przez manipulowanie aktywnością członka rodziny TGF-beta, często możliwe jest wywołanie znaczących zmian fizjologicznych w organizmie. Na przykład, bydło ras Piedmontese oraz Belgian Blue niesie mutację typu utrata funkcji w genie GDF8 (zwanym również miostatyną), która powoduje wyraźny wzrost masy mięśniowej. Grobet et al., Nat Genet. 1997, 17(1):71-4. Ponadto, u ludzi, nieaktywne allele GDF8 są powiązane ze zwiększoną masą mięśniową oraz, podobno, wyjątkową siłą. Schuelke et al., N Engl J Med 04, : [0024] Aktywiny to dimeryczne, polipeptydowe czynniki wzrostu, które należą do nadrodziny TGF-beta. Występują trzy główne postaci aktywiny (A, B i AB), które są homo/heterodimerami dwóch blisko spokrewnionych podjednostek β (odpowiednio β A β A, β B β B i β A β B ). Ludzki genom koduje również aktywinę C i aktywinę E, które są głównie eksprymowane w wątrobie, znane są również postaci heterodimeryczne β C lub β E. W nadrodzinie TGF-beta, aktywiny to unikalne i wielofunkcjonalne czynniki, które mogą stymulować produkcję hormonu w komórkach jajników i łożyska, wspierać przeżycie komórek neuronów, oddziaływać na postęp cyklu komórkowego, dodatnio lub ujemnie, zależnie od rodzaju komórki, i indukować różnicowanie mezodermalne, co najmniej w zarodkach płazów (DePaolo et al., 1991, Proc Soc Ep Biol Med. 198:00-12; Dyson et al., 1997, Curr Biol. 7:81-84; Woodruff, 1998, Biochem Pharmacol. :93-963). Ponadto, stwierdzono, że erytroidalny czynnik różnicowania (EDF) izolowany ze stymulowanych ludzkich monocytowych komórek białaczkowych okazał się być identyczny z aktywiną A (Murata et al., 1988, PNAS, 8:2434). Sugerowano, że aktywina A stymuluje erytropoezę in szpiku kostnym. W kilku tkankach, na sygnalizację aktywiny działa antagonistycznie jej powiązany heterodimer, inhibina. Na przykład, podczas uwalniania hormonu folikulotropowego (FSH) z przysadki, aktywina stymuluje wydzielanie i syntezę FSH, podczas gdy inhibina zapobiega wydzielaniu i syntezie FSH. Do innych białek, które mogą regulować bioak-

13 tywność aktywiny i/lub wiązać się do aktywiny zalicza się folistatynę (FS), białko powiązane z folistatyną (FSRP), i α 2 -makroglobulinę. [002] W przekazywaniu sygnałów TGF-β pośredniczą heteromeryczne kompleksy receptorów kinaz serynowych/treoninowych typu I i typu II, które fosforylują i aktywują znajdujące się poniżej w szlaku białka Smad, po stymulacji ligandem (Massague, 00, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1: ). Te receptory typu I i typu II to białka przezbłonowe, złożone z wiążącej ligand domeny pozakomórkowej, z regionem bogatym w cysteinę, domeny przezbłonowej i domeny cytoplazmatycznej, z prognozowaną swoistością serynową/treoninową. Receptory typu I są niezbędne do sygnalizacji; a receptory typu II są wymagane do wiązania ligandów i do ekspresji receptorów typu I. Receptory aktywiny typu I i II tworzą stabilny kompleks po związaniu ligandu, co skutkuje fosforylacją receptorów typu I przez receptory typu II. [0026] Zidentyfikowano dwa powiązane receptory typu II (ActRII), ActRIIa i ActRIIb, jako receptory typu II dla aktywin (Mathews i Vale, 1991, Cell 6: ; Attisanoet al., 1992, Cell 68: 97-8). Poza aktywinami, ActRIIa i ActRIIb mogą biochemicznie oddziaływać z kilkoma innymi białkami rodziny TGF-β, w tym BMP7, Nodal, GDF8 i GDF11 (Yamashita et al., 199, J. Cell Biol. 1: ; Lee i McPherron, 01, Proc. Natl. Acad. Sci. 98: ; Yeo i Whitman, 01, Mol. Cell 7: ; Oh et al., 02, Genes Dev. 16:2749-4). ALK4 to pierwotny receptor typu I dla aktywin, szczególnie dla aktywiny A, a ALK-7 może równie dobrze służyć jako receptor dla aktywiny, szczególnie dla aktywiny B. [0027] Jak zademonstrowano w opisie, rozpuszczalny polipeptyd ActRIIa (sactriia), który pokazuje znaczącą preferencję w wiązaniu do aktywiny A, w przeciwieństwie do innych członków rodziny TGF-beta, takich jak GDF8 lub GDF11, jest skuteczny w stymulowaniu wzrostu poziomów krwinek czerwonych in vivo. Nie chcąc wiązać się z jakimkolwiek określonym mechanizmem, oczekuje się, że efekt sactriia jest wywoływany głównie poprzez efekt antagonistyczny względem aktywiny, przy uwzględnieniu bardzo silnego wiązania aktywiny (pikomolarna stała dysocjacji) wykazywanego przez określony konstrukt sactriia użyty w tych badaniach. Niezależnie od mechanizmu, jest oczywistym z ujawnienia, że antagoniści ActRIIa-aktywiny podwyższają poziomy krwinek czerwonych u gryzoni, małp i ludzi. Należy odnotować, że hematopoeza to złożony proces, regulowany przez szereg czynników, w tym erytropoetynę, G-CSF i homeostazę żelaza. Pojęcia wzrost poziomu krwinek czerwonych i stymulowanie tworzenia czerwonych krwinek dotyczą wartości mierzalnych klinicznie, takich jak pomiary hematokrytu, liczby czerwo-

14 nych krwinek i hemoglobiny, i mają z założenia być obojętne w odniesieniu do mechanizmu, za pomocą którego zachodzą takie zmiany. [0028] Jak również zademonstrowano w opisie, rozpuszczalny polipeptyd ActRIIb (sactriib) jest skuteczny w podwyższaniu poziomów retikulocytów in vivo, który to efekt, w dłuższym okresie czasowym ma, jak się oczekuje, podwyższać poziom hematokrytu. [0029] Dane przytoczone w opisie, w odniesieniu do naczelnych różnych od człowieka są odtwarzalne u myszy, szczurów, jak również ludzi a zatem, polipeptydy ActRII i innych antagonistów aktywiny-actrii można stosować do stymulowania produkcji krwinek czerwonych i wzrostu poziomów krwinek czerwonych u ssaków, począwszy od gryzoni do ludzi. Antagoniści aktywiny-actrii obejmują, na przykład, wiążące aktywinę rozpuszczalne polipeptydy ActRIIa, wiążące aktywinę rozpuszczalne polipeptydy ActRIIb, przeciwciała, które wiążą się do aktywiny (szczególnie podjednostki aktywiny A lub B, określane również jako βa lub βb) i zakłócają wiązanie ActRIIa i/lub ActRIIb, przeciwciała, które wiążą się do ActRIIa i zakłócają wiązanie aktywiny, przeciwciała, które wiążą się do ActRIIb i zakłócają wiązanie aktywiny, nie będące przeciwciałami białka wybrane do wiązania aktywiny, ActRIIa lub ActRIIb (patrz np. WO/02/088171, WO/ 06/0689 i WO/02/03292, co do przykładów takich białek i sposobów projektowania i selekcji tychże), randomizowane peptydy wybierane do wiązania aktywiny ActRIIa lub ActRIIb, często dołączone do domeny Fc. Dwa różne białka (lub inne ugrupowania) z aktywnością wiązania aktywiny, ActRIIa lub ActRIIb, szczególnie substancje wiążące aktywinę, blokujące miejsca wiązania typu I (np. rozpuszczalny receptor aktywiny typu I) i typu II (np. rozpuszczalny receptor aktywiny typu II), odpowiednio, można łączyć ze sobą, w celu utworzenia bifunkcjonalnej cząsteczki wiążącej. Aptamery kwasu nukleinowego, drobne cząsteczki i inne środki, które inhibują oś sygnalizacji aktywina-actriia, są ujęte jako antagoniści aktywiny-actrii. Różne białka mają aktywność antagonisty aktywiny-actrii, w tym inhibina (tj. podjednostka inhibiny alfa), chociaż inhibina nie antagonizuje aktywiny w sposób uniwersalny, we wszystkich tkankach, folistatyna (np. folistatyna-288 i folistatyna- 31), FSRP, aktywina C, afa(2)-makroglobulina i M8A (zmiana metioniny na alaninę w pozycji 8) mutant aktywiny A. Na ogół, alternatywne postaci aktywiny, szczególnie te ze zmianami w domenie wiążącej receptora typu I mogą wiązać się do receptorów typu II i nie są zdolne do utworzenia aktywnego kompleksu trzeciorzędowego, działając w ten sposób jak antagoniści. Dodatkowo, kwasy nukleinowe, takie jak cząsteczki antysensowne, sirnas lub rybozymy, które inhibują aktywinę A, B, C lub E, lub, szczególnie, ekspresję ActRIIa lub ActRIIb można stosować jako antagonistów aktywiny-actrii. Antagonista aktywiny-actriia do zastosowania, może wykazywać swoistość w inhibowaniu sygnalizacji,

15 w której pośredniczy aktywina, vs. inni członkowie rodziny TGF-beta, a szczególnie względem GDF8 i GDF11. [00] Pojęcia stosowane w tej specyfikacji na ogół mają swoje zwyczajowe znaczenia w danej dziedzinie, w ramach wynalazku, oraz w określonym kontekście, w którym stosowane jest każde pojęcie. Niektóre pojęcia omówiono poniżej lub w innym miejscu specyfikacji, dla zapewnienia dodatkowych wytycznych praktykowi, poprzez opisanie kompozycji i sposobów według wynalazku i ich sporządzania oraz stosowania. Zakres lub znaczenie jakiegokolwiek użycia pojęcia będzie oczywiste z określonego kontekstu, w którym zastosowano dane pojęcie. [0031] Około i w przybliżeniu mają na ogół oznaczać dopuszczalny poziom błędu co do mierzonej ilości, przy uwzględnieniu natury lub precyzji pomiarów. Typowo, przykładowe stopnie błędu mieszczą się w granicach procent (%), korzystnie w granicach %, i korzystniej w granicach % danej wartości lub zakresu wartości. [0032] Alternatywnie, i szczególnie w układach biologicznych, pojęcia około i w przybliżeniu mogą oznaczać wartości, które są w ramach rzędu wielkości, korzystnie w ramach -krotności i korzystniej w ramach 2-krotności danej wartości. Ilości numeryczne, podane w opisie są przybliżeniami, o ile nie podano inaczej, co oznacza, że pojęcie około lub w przybliżeniu można wywnioskować, gdy nie jest wyraźnie oznaczone. [0033] Sekwencje można porównywać ze sobą, w tym sekwencję typu dzikiego do jednego lub większej liczby mutantów (warianty sekwencji). Takie porównania typowo obejmują nałożenia sekwencji polimeru, np. przy użyciu programów do nakładania sekwencji i/lub algorytmów, które są dobrze znane ze stanu techniki (na przykład, BLAST, FASTA i MEGALIGN, aby wymienić tylko kilka). Znawca może łatwo zrozumieć, że, w takich nałożeniach, gdzie mutacja zawiera insercję lub delecję reszty, nałożenie sekwencji wprowadzi przerwę (typowo zaznaczaną jako myślnik lub A ) w sekwencji polimeru nie zawierającej wprowadzonej lub brakującej reszty. [0034] Homologiczny we wszystkich swoich postaciach gramatycznych i odmianach pisowni, dotyczy związku pomiędzy dwoma białkami, które posiadają wspólne pochodzenie ewolucyjne, w tym białkami z nadrodzin w tym samym gatunku organizmu, jak również homologicznych białek z różnych gatunków organizmów. Takie białka (i kodujące je kwasy nukleinowe) mają homologię sekwencji, co jest odzwierciedlone w ich podobieństwie sekwencji, czy to w pojęciach procentowej identyczności, lub obecności określonych reszt lub motywów i konserwatywnych pozycji. [003] Pojęcie podobieństwo sekwencji, we wszystkich swoich postaciach gramatycznych, dotyczy stopnia identyczności lub zgodności pomiędzy sekwencjami kwasu nuklei-

16 1 1 2 nowego lub sekwencjami aminokwasowymi, które mogą, lub nie, mieć wspólne pochodzenie ewolucyjne. [0036] Jednakże, w powszechnym użyciu i tymże zgłoszeniu, pojęcie homologiczny, gdy modyfikowane jest takim przysłówkiem jak wysoce może dotyczyć podobieństwa sekwencji i może, lub nie, dotyczyć wspólnego pochodzenia ewolucyjnego. 2. Polipeptydy ActRII [0037] W niektórych aspektach, wynalazek dotyczy pewnych polipeptydów ActRII do stosowania w leczeniu lub zapobieganiu niedokrwistości. Według opisu, pojęcie ActRII dotyczy rodziny receptorów aktywiny typu II. Rodzina ta obejmuje zarówno receptor aktywiny typu IIa, jak i receptor aktywiny typu IIb. [0038] Według opisu, pojęcie ActRIIa dotyczy białek rodziny receptorów aktywiny typu IIa (ActRIIa) z dowolnego gatunku i wariantów pochodzących z takich białek ActRIIa poprzez mutagenezę lub inną modyfikację. Odniesienie do ActRIIa w opisie jest rozumiane jako odniesienie do dowolnej z obecnie zidentyfikowanych postaci. Członkowie rodziny ActRIIa to na ogół białka przezbłonowe, złożone z wiążącej ligand domeny pozakomórkowej, z regionem bogatym w cysteinę, domeny przezbłonowej i domeny cytoplazmatycznej, z prognozowaną aktywnością kinazy serynowej/treoninowej. [0039] Pojęcie polipeptyd ActRIIa obejmuje polipeptydy zawierające dowolny naturalnie występujący polipeptyd członek rodziny ActRIIa, jak również dowolne jego warianty (w tym mutanty, fragmenty, fuzje i postaci peptydomimetyczne) które zachowują użyteczną aktywność. Patrz, na przykład, WO/06/ Na przykład, polipeptydy ActRIIa obejmują polipeptydy pochodzące z sekwencji dowolnego znanego ActRIIa, mającego sekwencję co najmniej w około 80% identyczną z sekwencją polipeptydu ActRIIa, i korzystnie co najmniej 8%, 90%, 9%, 97%, 99% lub większą identyczność. Na przykład, polipeptyd ActRIIa według wynalazku może wiązać się do i inhibować funkcję białka ActRIIa i/lub aktywiny. Polipeptyd ActRIIa można dobierać pod kątem aktywności w stymulowaniu tworzenia czerwonych krwinek in vivo. Przykłady polipeptydów ActRIIa obejmują ludzki prekursor polipeptydu ActRIIa (SEQ ID NO: 1) i rozpuszczalne ludzkie polipeptydy ActRIIa (np. SEQ ID NOs: 2, 3, 7 i 12). [0040] Sekwencja ludzkiego białka prekursorowego ActRIIa jest jak następuje:

17 16 [0041] Peptyd sygnałowy podkreślono jednokrotnie; domenę pozakomórkową podano wytłuszczoną czcionką, a potencjalne połączone wiązaniem N-glikozydowym miejsca glikozylacji zaznaczono podwójnym podkreśleniem. [0042] Sekwencja ludzkiego, poddanego obróbce, rozpuszczalnego (pozakomórkowo) polipeptydu ActRIIa jest jak następuje: [0043] C-końcowy ogon domeny pozakomórkowej podkreślono. Sekwencja z usuniętym ogonem (sekwencja 1) jest jak następuje: [0044] Sekwencja kwasu nukleinowego, kodującego ludzkie białko prekursorowe ActRIIa jest jak następuje (nukleotydy wpisu Genbank NM_001616):

18 17 [004] Sekwencja kwasu nukleinowego kodującego ludzki rozpuszczalny (pozakomórkowy) polipeptyd ActRIIa jest jak następuje:

19 18 1 [0046] Według opisu, pojęcie ActRIIb dotyczy białek rodziny receptorów aktywiny typu IIb (ActRIIb) z dowolnego gatunku i wariantów pochodzących z takich białek ActRIIb poprzez mutagenezę lub inną modyfikację. Odniesienie do ActRIIb w opisie jest rozumiane jako odniesienie do dowolnej z obecnie zidentyfikowanych postaci. Członkowie rodziny ActRIIb to na ogół białka przezbłonowe, złożone z wiążącej ligand domeny pozakomórkowej, z regionem bogatym w cysteinę, domeny przezbłonowej i domeny cytoplazmatycznej, z prognozowaną aktywnością kinazy serynowej/treoninowej. [0047] Pojęcie polipeptyd ActRIIb obejmuje polipeptydy zawierające dowolny naturalnie występujący polipeptyd członek rodziny ActRIIb, jak również dowolne jego warianty (w tym mutanty, fragmenty, fuzje i postaci peptydomimetyczne) które zachowują użyteczną aktywność. Patrz, na przykład, WO/06/ Na przykład, polipeptydy ActRIIb obejmują polipeptydy pochodzące z sekwencji dowolnego znanego *ActRIIb, mającego sekwencję co najmniej w około 80% identyczną z sekwencją polipeptydu ActRIIb, i korzystnie co najmniej 8%, 90%, 9%, 97%, 99% lub większą identyczność. Na przykład, polipeptyd ActRIIb według wynalazku może wiązać się do i inhibować funkcję białka ActRIIb i/lub aktywiny. Polipeptyd ActRIIb można dobierać pod kątem aktywności w stymulowaniu tworzenia czerwonych krwinek in vivo. Przykłady polipeptydów ActRIIb obejmują ludzki prekursor polipeptydu ActRIIb (SEQ ID NO: 1) i rozpuszczalne ludzkie polipeptydy ActRIIb (np. SEQ ID NO: 16, 17, i 21). [0048] Sekwencja ludzkiego białka prekursorowego ActRIIb jest jak następuje:

20 19 [0049] Peptyd sygnałowy podkreślono jednokrotnie; domenę pozakomórkową podano wytłuszczoną czcionką, a potencjalne połączone wiązaniem N-glikozydowym miejsca glikozylacji zaznaczono ramkami. [000] Sekwencja ludzkiego, poddanego obróbce, rozpuszczalnego (pozakomórkowo) polipeptydu ActRIIb jest jak następuje: [001] C-końcowy ogon domeny pozakomórkowej podkreślono. Sekwencja z usuniętym ogonem (sekwencja 1) jest jak następuje: [002] Sekwencja kwasu nukleinowego kodującego ludzkie rozpuszczalne białko prekursorowe ActRIIb jest jak następuje: (nukleotydy -143 wpisu Genbank NM_0016)

21 [003] Sekwencja kwasu nukleinowego kodującego ludzki rozpuszczalny (pozakomórkowy) polipeptyd ActRIIa jest jak następuje:

22 [004] W określonym przykładzie wykonania, wynalazek dotyczy zastosowań niektórych rozpuszczalnych polipeptydów ActRII. Według opisu, pojęcie rozpuszczalny polipeptyd ActRII na ogół dotyczy polipeptydów zawierających domenę pozakomórkową białka ActRIIa lub ActRIIb. Pojęcie rozpuszczalny polipeptyd ActRII według opisu, obejmuje dowolną naturalnie występującą domenę pozakomórkową białka ActRIIa lub ActRIIb, jak również dowolne jej warianty (w tym mutanty, fragmenty i postaci peptydomimetyczne). Polipeptyd ActRII wiążący aktywinę oznacza taki, który zachowuje zdolność wiązania się do aktywiny, w tym, na przykład aktywiny AA, AB lub BB lub postaci, które zawierają podjednostkę C lub E. Opcjonalnie, wiążący aktywinę polipeptyd ActRII będzie wiązać się do aktywiny AA ze stałą dysocjacji 1 nm lub mniejszą. Domena pozakomórkowa białka ActRII wiąże się do aktywiny i jest na ogół rozpuszczalna, a zatem można ją nazwać rozpuszczalnym, wiążącym aktywinę polipeptydem ActRII. Przykłady rozpuszczalnych, wiążących aktywinę polipeptydów ActRII obejmują rozpuszczalne polipeptydy zilustrowane na SEQ ID NOs: 2, 3, 7, 12 i 13. SEQ ID NO:7 jest określana jako ActRIIa-hFc, i jest dalej opisywana w przykładach. Inne przykłady rozpuszczalnych, wiążących aktywinę polipeptydów ActRIIa zawierają sekwencję sygnałową, oprócz domeny pozakomórkowej białka ActRIIa, na przykład, sekwencję liderową melityny miodu pszczelego (SEQ ID NO: 8), lider aktywatora tkankowego plazminogenu (TPA) (SEQ ID NO: 9) lub natywny lider ActRIIa (SEQ ID NO: ). Polipeptyd ActRIIa-hFc, zilustrowany na SEQ ID NO:13 wykorzystuje lider TPA. Przykłady rozpuszczalnych, wiążących aktywinę polipeptydów ActRIIb obejmują rozpuszczalne polipeptydy zilustrowane na SEQ ID NOs: 16, 17,. Wiążące aktywinę polipeptydy ActRIIb mogą także zawierać sekwencję sygnałową, oprócz domeny pozakomórkowej białka ActRIIb, na przykład, sekwencję liderową melityny miodu pszczelego (SEQ ID NO: 8), lub lider aktywatora tkankowego plazminogenu (TPA) (SEQ ID NO: 9). [00] Funkcjonalnie aktywne fragmenty polipeptydów ActRII można otrzymać poprzez badania przesiewowe polipeptydów produkowanych rekombinacyjnie z odpowiadających fragmentów kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd ActRII. Dodatkowo, fragmenty

23 można syntetyzować chemicznie, przy użyciu technik znanych ze stanu techniki, takich jak konwencjonalna chemia Merrifielda w fazie stałej, f-moc lub t-boc. Fragmenty można produkować (rekombinacyjnie lub poprzez syntezę chemiczną) i testować, w celu zidentyfikowania tych fragmentów peptydylowych, które mogą działać jako antagoniści (inhibitory) białka ActRII lub sygnalizacji, w której pośredniczy aktywina. [006] Funkcjonalnie aktywne fragmenty polipeptydów ActRII można otrzymać poprzez badania przesiewowe bibliotek zmodyfikowanych polipeptydów, produkowanych rekombinacyjnie z odpowiadających mutagenizowanych kwasów nukleinowych kodujących polipeptyd ActRII. Warianty można produkować i testować, w celu zidentyfikowania tych, które mogą działać jako antagoniści (inhibitory) białka ActRII lub sygnalizacji, w której pośredniczy aktywina. Funkcjonalny wariant polipeptydów ActRIIa może zawierać sekwencję aminokwasową, która jest w co najmniej 7% identyczna z sekwencją aminokwasową wybraną spośród SEQ ID NOs: 2 lub 3. W niektórych przypadkach, funkcjonalny wariant ma sekwencję aminokwasową co najmniej w 80%, 8%, 90%, 9%, 97%, 98%, 99% lub 0% identyczną z sekwencją aminokwasową wybraną spośród SEQ ID NOs: 2 lub 3. Funkcjonalny wariant polipeptydów ActRIIb może zawierać sekwencję aminokwasową, która jest w co najmniej 7% identyczna z sekwencją aminokwasową wybraną spośród SEQ ID NOs: 16 lub 17. W niektórych przypadkach, funkcjonalny wariant ma sekwencję aminokwasową co najmniej w 80%, 8%, 90%, 9%, 97%, 98%, 99% lub 0% identyczną z sekwencją aminokwasową wybraną spośród SEQ ID NOs: 17 lub 18. [007] Funkcjonalne warianty można generować poprzez modyfikowanie struktury polipeptydu ActRII do takich celów, jak wzmacnianie skuteczności terapeutycznej lub stabilności (np. dozwolony okres przechowywania ex vivo i odporność na degradację proteolityczną in vivo). Takie modyfikowane polipeptydy ActRII, po doborze z zachowaniem wiązania aktywiny, są uważane za funkcjonalnie równorzędne wobec naturalnie występujących polipeptydów ActRII. Modyfikowane polipeptydy ActRII można również produkować, przykładowo, poprzez substytucję, delecję lub addycję aminokwasu. Przykładowo, racjonalnym jest oczekiwanie, że izolowana zamiana leucyny na izoleucynę lub walinę, asparaginianu na glutaminian, treoniny na serynę lub podobna zamiana aminokwasu na powiązany strukturalnie aminokwas (np. mutacje konserwatywne) nie będzie mieć dużego wpływu na aktywność biologiczną powstałej cząsteczki. Konserwatywnymi zamianami są te, które zachodzą w obrębie rodziny aminokwasów, które są powiązane pod względem swoich łańcuchów bocznych. To, czy zmiana w sekwencji aminokwasowej danego polipeptydu ActRII doprowadzi do powstania funkcjonalnego homologu, można łatwo okre-

24 ślić, poprzez ocenę zdolności wariantu polipeptydu ActRII do wytworzenia odpowiedzi w komórkach, w sposób podobny do polipeptydu ActRII typu dzikiego. [008] W niektórych przykładach wykonania, ujawnienie rozważa określone mutacje polipeptydów ActRII, prowadzące do zmiany glikozylacji polipeptydu. Takie mutacje można dobierać w celu wprowadzenia lub wyeliminowania jednego lub więcej miejsc glikozylacji, takich jak miejsca glikozylacji połączone wiązaniem O- lub N-glikozydowym. Powiązane za pomocą asparaginy miejsca rozpoznawane glikozylacji na ogół zawierają sekwencję tripeptydową, asparagina-x-treonina lub asparagina-x-seryna (gdzie X oznacza dowolny aminokwas), która jest swoiście rozpoznawana przez odpowiednie komórkowe enzymy glikozylacyjne. Zmian można również dokonać poprzez addycję lub substytucję, jednej lub więcej reszt seryny lub treoniny do sekwencji polipeptydu ActRII typu dzikiego (do miejsc glikozylacji z wiązaniem O-glikozydowym). Szereg aminokwasowych substytucji lub delecji w jednej z lub obu pozycji pierwszego lub trzeciego aminokwasu miejsca rozpoznawania glikozylacji (i/lub delecja aminokwasu w drugiej pozycji) skutkuje brakiem glikozylacji w modyfikowanej tripeptydowej sekwencji. Kolejnym sposobem zwiększania liczby ugrupowań węglowodanowych na polipeptydzie ActRII jest chemiczne lub enzymatyczne sprzęganie glikozydów do polipeptydu ActRII. Zależnie od użytego modelu sprzęgania, cukier(-ry) mogą byc dołączone do (a) argininy i histydyny; (b) wolnych grup karboksylowych; (c) wolnych grup tiolowych, takich jak te cysteiny; (d) wolnych grup hydroksylowych, takich jak te seryny, treoniny lub hydroksyproliny; (e) reszt aromatycznych, takich jak te fenyloalaniny, tyrozyny lub tryptofanu; lub (f) grupy amidowej glutaminy. Usuwanie jednego lub więcej ugrupowań węglowodanowych obecnych na polipeptydzie ActRII można prowadzić chemicznie i/lub enzymatycznie. Chemiczna deglikozylacja może wymagać, na przykład, ekspozycji polipeptydu ActRII na związek kwasu trójfluorometanosulfonowego lub równorzędny związek. To traktowanie skutkuje odcięciem większości lub wszystkich cukrów, za wyjątkiem cukru wiążącego (N-acetyloglukozamina lub N- acetylogalaktozamina), podczas gdy sekwencja aminokwasowa jest pozostawiana w stanie nienaruszonym. Odcinanie enzymatyczne ugrupowań węglowodanowych na polipeptydach ActRII można osiągnąć poprzez użycie szeregu endo- i egzo-glikozydaz, jak opisano w Thotakura et al. (1987) Meth. Enzymol. 138:. Sekwencję polipeptydu ActRII można dostosowywać, na miarę potrzeb, w zależności od rodzaju użytego układu ekspresji, jako że ssacze, drożdżowe, owadzie i roślinne komórki mogą wszystkie wprowadzać różniące się wzory glikozylacji, na które może oddziaływać sekwencja aminokwasowa peptydu. Na ogół, białka ActRII do stosowania u ludzi będą eksprymowane w ssaczej linii komórkowej, która zapewnia właściwą glikozylację, takiej jak linie komórkowe HEK293 lub CHO, cho-

25 ciaż oczekuje się, że inne przeznaczone do ekspresji ssacze linie komórkowe, będą równie użyteczne. [009] W opisie dodatkowo rozważa się sposób generowania mutantów, szczególnie zestawów kombinatorycznych mutantów polipeptydu ActRII, jak również mutantów skróconych; pule kombinatorycznych mutantów są szczególnie użyteczne do identyfikowania sekwencji funkcjonalnych wariantów. Celem wykonywania takich badań przesiewowych bibliotek kombinatorycznych może być generowanie, na przykład, wariantów polipeptydu ActRII, które wiążą się z aktywiną lub innymi ligandami. Poniżej zapewniono szereg oznaczeń do badań przesiewowych, a takie oznaczenia można stosować do oceny wariantów. Na przykład, wariant polipeptydu ActRII można badać przesiewowo pod kątem zdolności do wiązania ligandu ActRII, zapobiegania wiązaniu ligandu ActRII do polipeptydu ActRII lub zakłócania sygnalizacji wywołanej ligandem ActRII. [0060] Aktywność polipeptydu ActRII lub jego wariantów można również testować w oznaczeniu komórkowym lub in vivo. Na przykład, można oceniać oddziaływanie wariantu polipeptydu ActRII na ekspresję genów zaangażowanych w hematopoezę. Można to, na miarę potrzeb, wykonywać w obecności jednego lub więcej rekombinowanych białek ligandów ActRII (np. aktywina), a komórki można transfekować, w celu wyprodukowania polipeptydu ActRII i/lub jego wariantów, i opcjonalnie, ligandu ActRII. Podobnie, polipeptyd ActRII można podawać myszom lub innemu zwierzęciu, i można oceniać jeden lub więcej pomiarów krwi, takich jak liczba RBC, stężenie hemoglobiny lub liczba retikulocytów. [0061] Można generować otrzymywanie kombinatorycznych wariantów, które mają selektywną lub na ogół zwiększoną moc względem naturalnie występującego polipeptydu ActRII. Podobnie, mutageneza może prowadzić do powstawania wariantów, które mają wewnątrzkomórkowe okresy półtrwania dramatycznie różne od odpowiadającego polipeptydu ActRII typu dzikiego. Na przykład, zmienione białko można uczynić bardziej stabilnym lub mniej stabilnym względem degradacji proteolitycznej lub innych procesów komórkowych, które prowadzą do degradacji, lub inaktywacji innego rodzaju natywnego polipeptydu ActRII. Takie warianty, i kodujące je geny, można wykorzystywać do zmieniania poziomów polipeptydu ActRII przez modulowanie okresu półtrwania polipeptydów ActRII. Przykładowo, krótki okres półtrwania może prowadzić do uzyskania bardziej przejściowych skutków biologicznych i umożliwić ściślejszą kontrolę poziomów rekombinowanego polipeptydu ActRII w komórce. W białku fuzyjnym Fc mutacje można wprowadzać w łączniku (o ile w ogóle) i/lub części Fc, w celu zmiany okresu półtrwania białka.

26 2 1 2 [0062] Bibliotekę kombinatoryczną można utworzyć poprzez bibliotekę zdegenerowaną genów kodujących bibliotekę polipeptydów, z których każdy zawiera co najmniej część potencjalnych sekwencji polipeptydu ActRII. Przykładowo, mieszaninę syntetycznych oligonukleotydów można enzymatycznie ligować do sekwencji genu, tak, że zdegenerowany zestaw potencjalnych sekwencji polipeptydu ActRII ulega ekspresji jako poszczególne polipeptydy, lub alternatywnie, jako zestaw większych białek fuzyjnych (np. do prezentacji fagowej). [0063] Istnieje wiele sposobów generowania biblioteki potencjalnych homologów ze zdegenerowanej sekwencji oligonukleotydowej. Chemiczną syntezę zdegenerowanej sekwencji genu można wykonać w zautomatyzowanym syntetyzerze DNA, a syntetyczne geny następnie ligować do odpowiedniego wektora do ekspresji. Synteza zdegenerowanych oligonukleotydów jest dobrze znana ze stanu techniki (patrz na przykład, Narang, SA (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al., (1981) Recombinant DNA, Proc. 3rd Cleveland Sympos. Macromolecules, ed. AG Walton, Amsterdam: Elsevier str ; Itakura et al., (1984) Annu. Rev. Biochem. 3:323; Itakura et al., (1984) Science 198:6; Ike et al., (1983) Nucleic Acid Res. 11:477). Takie techniki stosowano w ukierunkowanej ewolucji innych białek (patrz, na przykład, Scott et al., (1990) Science 249: ; Roberts et al., (1992) PNAS USA 89: ; Devlin et al., (1990) Science 249: ; Cwirla et al., (1990) PNAS USA 87: ; jak również patenty amerykańskie nr:,223,409,,198,346 i,096,81). [0064] Alternatywnie, można wykorzystywać inne rodzaje mutagenezy do generowania biblioteki kombinatorycznej. Na przykład, warianty polipeptydów ActRII można generować i izolować z biblioteki poprzez badania przesiewowe przy użyciu, na przykład, mutagenezy skanowania alaninami i podobnych (Ruf et al., (1994) Biochemistry 33:16-172; Wang et al., (1994) J. Biol. Chem. 269:9-99; Balint et al., (1993) Gene 137:9-118; Grodberg et al., (1993) Eur. J. Biochem. 218:97-601; Nagashima et al., (1993) J. Biol. Chem. 268: ; Lowman et al., (1991) Biochemistry : ; i Cunningham et al., (1989) Science 244:81-8), poprzez mutagenezę skanowania łącznikiem (Gustin et al., (1993) Virology 193:63-660; Brown et al., (1992) Mol. Cell Biol. 12: ; McKnight et al., (1982) Science 232:316); przez mutagenezę nasyceniową (Meyers et al., (1986) Science 232:613); przez mutagenezę PCR (Leung et al., (1989) Method Cell Mol Biol 1:11-19); lub mutagenezę losową, w tym chemiczną mutagenezę, itp. (Miller et al., (1992) A Short Course in Bacterial Genetics, CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY; i Greener et al., (1994) Strategies in Mol Biol 7:32-34). Mutageneza skanowania łączni-

27 kiem, szczególnie w układzie kombinatorycznym, to atrakcyjny sposób do identyfikowania skróconych (bioaktywnych) postaci polipeptydów ActRII. [006] Szeroki zakres technik jest znanych ze stanu techniki, do badań przesiewowych produktów genów z kombinatorycznych bibliotek, uzyskanych za pomocą mutacji punktowych i skróceń, oraz, o czym mowa, do badań przesiewowych bibliotek cdna dla produktów genów mających określoną właściwość. Takie techniki będzie na ogół można dostosowywać do szybkich badań przesiewowych bibliotek genów, generowanych przy pomocy kombinatorycznej mutagenezy polipeptydów ActRII. Najpowszechniej stosowane techniki do badań przesiewowych dużych bibliotek genów typowo obejmują klonowanie biblioteki genów do zdolnych do replikacji wektorów ekspresyjnych, transformowanie odpowiednich komórek powstałą biblioteką wektorów i eksprymowanie kombinatorycznych genów w warunkach, w których wykrywanie pożądanej aktywności ułatwia względnie prosta izolacja wektora kodującego gen, którego produkt wykryto. Korzystne oznaczenia obejmują oznaczenia wiązania aktywiny i oznaczenie sygnalizacji komórkowej, w której uczestniczy aktywina. [0066] W niektórych przykładach wykonania, polipeptydy ActRII użyteczne według wynalazku mogą dodatkowo zawierać post-translacyjne modyfikacje, poza tymi, które są naturalnie obecne w polipeptydach ActRII. Takie modyfikacje obejmują, w sposób nieograniczający, acetylowanie, karboksylowanie, glikozylację, fosforylację, lipidację i acylowanie. W wyniku, modyfikowane polipeptydy ActRII mogą zawierać elementy pozaaminokwasowe, takie jak glikole polietylenowe, lipidy, poli- lub mono-sacharydy i fosforany. Skutki oddziaływania takich pozaaminokwasowych elementów na funkcjonalność polipeptydu ActRII można badać według opisu, dla innych wariantów polipeptydów ActRII. Gdy polipeptyd ActRII jest produkowany w komórkach poprzez cięcie natywnej postaci polipeptydu ActRII, obróbka potranslacyjna może również być ważna dla prawidłowego fałdowania i/lub działania białka. Różne komórki (takie jak CHO, HeLa, MDCK, 293, WI38, NIH-3T3 lub HEK293) mają specyficzną maszynerię komórkową i charakterystyczne mechanizmy do takich aktywności potranslacyjnych, i można je wybrać w celu zapewnienia prawidłowej modyfikacji i obróbki polipeptydów ActRII. [0067] Funkcjonalne warianty lub modyfikowane postaci polipeptydów ActRII mogą zawierać białka fuzyjne, mające co najmniej część polipeptydów ActRII i jedną lub więcej domen fuzyjnych. Dobrze znane przykłady takich domen fuzyjnych obejmują, w sposób nieograniczający, polihistydynę, Glu-Glu, glutationo-s-transferazę (GST), tioredoksynę, białko A, białko G, region stały łańcucha ciężkiego immunoglobuliny (Fc), białko wiążące maltozę (MBP) lub ludzką albuminę surowicy. Domenę fuzyjną można dobrać tak, aby

28 nadać pożądaną właściwość. Na przykład, niektóre domeny fuzyjne są szczególnie użyteczne do izolacji białek fuzyjnych poprzez chromatografię powinowactwa. Dla celów oczyszczania w oparciu o powinowactwo, stosuje się odpowiednie matryce do chromatografii powinowactwa, takie jak żywice sprzęgane z glutationem, amylazą i niklem lub kobaltem. Wiele takich matryc jest dostępnych w postaci zestawu, takich jak system oczyszczania Pharmacia GST i system QIAexpress (Qiagen) użyteczne z partnerami fuzji (HIS 6 ). Jako inny przykład, domenę fuzyjną można dobierać tak, aby ułatwić wykrywanie polipeptydów ActRII. Przykłady takich domen do wykrywania obejmują różne fluorescencyjne białka (np. GFP) jak również znaczniki epitopów, którymi są zazwyczaj krótkie sekwencje peptydowe, dla których dostępne jest swoiste przeciwciało. Dobrze znane znaczniki epitopów, dla których są łatwo dostępne swoiste przeciwciała monoklonalne obejmują znaczniki FLAG, hemaglutyninę wirusa grypy (HA) i znaczniki c-myc. W niektórych przypadkach, domeny fuzyjne mają miejsce cięcia preoteazy, takiej jak dla czynnika Xa lub trombiny, co pozwala odnośnej proteazie częściowo trawić białka fuzyjne i w ten sposób uwalniać z nich rekombinowane białka. Uwolnione białka można następnie izolować z domeny fuzyjnej przez późniejszy rozdział chromatograficzny. W określonych, korzystnych przykładach wykonania polipeptyd ActRII można sprzęgać z domeną, która stabilizuje polipeptyd ActRIIa in vivo (domena stabilizatora ). Przez stabilizowanie rozumie się dowolne działanie, które wydłuża okres półtrwania w surowicy, niezależnie od tego, czy jest to spowodowane zmniejszonym niszczeniem, zmniejszonym klirensem nerkowym, czy innym efektem farmakokinetycznym. Fuzje z częścią Fc immunoglobuliny są znane z nadawania pożądanych właściwości farmakokinetycznych szerokiemu zakresowi białek. Podobnie, fuzje z ludzką albuminą surowicy mogą nadać pożądane właściwości. Inne rodzaje domen fuzyjnych, które można wybrać obejmują multimeryzację (np. dimeryzację, tetrameryzację) domen i funkcjonalnych domen (które nadają dodatkową funkcję biologiczną, taką jak dalsza stymulacja wzrostu masy mięśniowej). [0068] W charakterze specyficznego przykładu, w wynalazku stosuje się białko fuzyjne zawierające rozpuszczalną domenę pozakomórkową ActRIIa sprzężoną z domeną Fc (np. SEQ ID NO: 6).

29 28 [0069] W charakterze dodatkowego specyficznego przykładu, w wynalazku stosuje się białko fuzyjne zawierające rozpuszczalną domenę pozakomórkową ActRIIb sprzężoną z domeną Fc (np. SEQ ID NO: 21). 1 2 [0070] Opcjonalnie, domena Fc ma jedną lub więcej mutacji w resztach takich jak Asp- 26, lizyna 322 i Asn-434. W niektórych przypadkach, mutant domeny Fc, mający jedną lub więcej tych mutacji (np. mutację Asp-26) ma zredukowaną zdolność wiązania do receptorów Fcγ względem domeny Fc typu dzikiego. W innych przypadkach, mutant domeny Fc mający jedną lub więcej tych mutacji (np. mutację Asn-434) ma zwiększoną zdolność wiązania do receptora Fc, powiązanego z MHC klasy I (FcRN) względem domeny Fc typu dzikiego. [0071] Jest zrozumiałym, że różne elementy białek fuzyjnych można aranżować w dowolny sposób, który jest zgodny z pożądaną funkcjonalnością. Na przykład, polipeptyd ActRII można umieszczać C-końcowo wobec heterologicznej domeny, lub, alternatywnie, heterologiczną domenę można umieszczać C-końcowo wobec polipeptydu ActRII. Domena polipeptydu ActRII i heterologiczna domena nie muszą sąsiadować w białku fuzyjnym, i mogą być obecne dodatkowe domeny lub sekwencje aminokwasowe, C- lub N-końcowo względem dowolnej z domen, lub pomiędzy domenami. [0072] W niektórych przykładach wykonania, polipeptydy ActRII, użyteczne według wynalazku zawierają jedną lub więcej modyfikacji, które są zdolne do stabilizowania polipeptydów ActRII. Na przykład, takie modyfikacje wydłużają okres półtrwania in vitro polipeptydów ActRII, wydłużają okres półtrwania w krążeniu polipeptydów ActRII lub redukują degradację proteolityczną polipeptydów ActRII. Takie stabilizujące modyfikacje obejmują, w sposób nieograniczający; białka fuzyjne (w tym, na przykład, białka fuzyjne zawierające polipeptyd ActRII i domenę stabilizatora), modyfikacje miejsca glikozylacji (w tym, na przykład, addycję miejsca glikozylacji do polipeptydu ActRII) i modyfikacje ugrupowania węglowodanowego (w tym na przykład, usunięcie ugrupowań węglowodanowych z polipeptydu ActRII). Według opisu, pojęcie domena stabilizatora nie dotyczy wyłącznie domeny fuzyjnej (np. Fc) jak w przypadku białek fuzyjnych, ale obejmuje również niebiałkowe modyfikacje, takie jak ugrupowanie węglowodanowe, lub ugrupowanie niebiałkowe, takie jak glikol polietylenowy.

30 [0073] W niektórych przykładach wykonania, wynalazek czyni dostępnymi izolowane i/lub oczyszczane postaci polipeptydów ActRII, które są izolowane z, lub innym sposobem zasadniczo uwalniane, od innych białek. Polipeptydy ActRII będą na ogół produkowane na drodze ekspresji z rekombinowanych kwasów nukleinowych. 3. Kwasy nukleinowe kodujące polipeptydy ActRII [0074] W opisie ujawniono izolowane i/lub rekombinowane kwasy nukleinowe kodujące dowolne polipeptydy ActRII (np. rozpuszczalne polipeptydy ActRIIa i rozpuszczalne polipeptydy ActRIIb), w tym fragmenty, funkcjonalne warianty i białka fuzyjne ujawnione w opisie. Na przykład, SEQ ID NO: 4 koduje naturalnie występujący ludzki prekursor polipeptydu ActRIIa, podczas gdy SEQ ID NO: koduje domenę pozakomórkową ActRIIa po obróbce. Na przykład, SEQ ID NO: 18 koduje naturalnie występujący ludzki prekursor polipeptydu ActRIIb, podczas gdy SEQ ID NO: 19 koduje domenę pozakomórkową ActRIIb po obróbce. Przedmiotowe kwasy nukleinowe mogą być jednoniciowe lub dwuniciowe. Takie kwasy nukleinowe mogą być cząsteczkami DNA lub RNA. Te kwasy nukleinowe można stosować, na przykład, w sposobach do wytwarzania polipeptydów ActRII lub jako bezpośrednie środki terapeutyczne (np. w podejściu typu terapia genowa). [007] W niektórych aspektach, przedmiotowe kwasy nukleinowe kodujące polipeptydy ActRIIa są dodatkowo rozumiane jako obejmujące kwasy nukleinowe, które są wariantami SEQ ID NO: 4 lub. W niektórych aspektach, przedmiotowe kwasy nukleinowe kodujące polipeptydy ActRIIb są dodatkowo rozumiane jako obejmujące kwasy nukleinowe, które są wariantami SEQ ID NO: 18 lub 19. Wariantowe sekwencje nukleotydowe obejmują sekwencje, które różnią się jedną lub więcej substytucjami, addycjami lub delecjami nukleotydów, takie jak warianty alleliczne. [0076] Ujawnione są sekwencje izolowanego lub rekombinowanego kwasu nukleinowego, które są w co najmniej 80%, 8%, 90%, 9%, 97%, 98%, 99% lub 0% identyczne z SEQ ID NO: 4,, 18 lub 19. Znawca dostrzeże, że można zapewnić sekwencje kwasu nukleinowego komplementarne do SEQ ID NO: 4,, 18, lub 19 i warianty SEQ ID NO: 4,, 18 lub 19. Sekwencje kwasu nukleinowego mogą oznaczać sekwencję izolowaną, rekombinowaną i/lub sprzężoną z heterologiczną sekwencją nukleotydową, lub w bibliotece DNA. [0077] Kwasy nukleinowe mogą również obejmować sekwencje nukleotydowe, które hybrydyzują w wysoce rygorystycznych warunkach do sekwencji nukleotydowej oznaczonej w SEQ ID NO: 4,, 18, lub 19, sekwencjach komplementarnych SEQ ID NO: 4,, 18 lub 19, lub ich fragmentach. Jak omówiono powyżej, znawca łatwo zrozumie, że odpowiednie pod względem rygorystyczności warunki, które promują hybrydyzację DNA mogą być

31 1 2 3 zróżnicowane. Znawca łatwo zrozumie, że odpowiednie pod względem rygorystyczności warunki, które promują hybrydyzację DNA mogą być zróżnicowane. Na przykład, można prowadzić hybrydyzację w 6,0 x chlorku sodu/cytrynianie sodu (SSC) w około 4 C, z następczym odmywaniem 2,0 x SSC w 0 C. Na przykład, stężenie soli na etapie odmywania można wybrać spośród niskiej rygorystyczności około 2,0 x SSC w 0 C do wysokiej rygorystyczności około 0,2 x SSC w 0 C. Dodatkowo, temperaturę na etapie odmywania można zwiększać od warunków niskiej rygorystyczności w temperaturze pokojowej, około 22 C, do warunków wysokiej rygorystyczności w około 6 C. Zarówno temperatura, jak i sól mogą być zróżnicowane, lub temperaturę lub stężenie soli można utrzymywać na stałym poziomie, podczas gdy zmienia się inną zmienną. Możliwe jest dostarczenie kwasów nukleinowych, które hybrydyzują w warunkach niskiej rygorystyczności, 6 x SSC w temperaturze pokojowej, z następczym odmywaniem 2 x SSC w temperaturze pokojowej. [0078] Izolowane kwasy nukleinowe, które różnią się od kwasów nukleinowych jak podano w SEQ ID NOs: 4,, 18 lub 19 ze względu na degenerację kodu genetycznego są również możliwe do zapewnienia. Na przykład, szereg aminokwasów jest kodowanych przez więcej niż jeden triplet. Kodony, które określają ten sam aminokwas, lub synonimy (na przykład, CAU i CAC są synonimami histydyny) mogą prowadzić do powstania cichych mutacji, które nie wpływają na sekwencję aminokwasową białka. Jednakże, oczekuje się, że polimorfizmy sekwencji DNA, które prowadzą do zmian w sekwencjach aminokwasowych przedmiotowych białek będą występować pomiędzy ssaczymi komórkami. Znawca dostrzeże, że te wariacje w jednym lub większej liczbie nukleotydów (aż do około 3-% nukleotydów) kwasów nukleinowych kodujących określone białko mogą występować u poszczególnych osobników danego gatunku, w związku z naturalną zmiennością alleliczną. [0079] Rekombinowane kwasy nukleinowe mogą być funkcjonalnie połączone z jedną lub większą ilością regulatorowych sekwencji nukleotydowych w konstrukcie ekspresyjnym. Regulatorowe sekwencje nukleotydowe będą na ogół odpowiednie dla komórki gospodarza użytego do ekspresji. Liczne rodzaje odpowiednich wektorów ekspresyjnych i odpowiednich sekwencji regulatorowych są znane ze stanu techniki dla szeregu komórek gospodarzy. Typowo, jedna lub więcej nukleotydowych sekwencji regulatorowych może zawierać, w sposób nieograniczający, sekwencje promotorowe, sekwencje liderowe lub sygnałowe, miejsca wiązania rybosomu, sekwencje startu i terminacji transkrypcji, sekwencje startu i terminacji translacji i sekwencje enhancerowe lub aktywatorowe. Rozważa się konstytutywne lub indukowalne promotory znane ze stanu techniki. Promotory mogą oznaczać albo naturalnie występujące promotory, lub hybrydowe promotory, które łączą

32 elementy więcej niż jednego promotora. Konstrukt do ekspresji może być obecny w komórce na episomie, takim jak plazmid, lub konstrukt do ekspresji może zostać wprowadzony do chromosomu. Wektor ekspresyjny może zawierać geny markera selekcyjnego, dla umożliwienia selekcji transformowanych komórek gospodarza. Geny markera selekcyjnego są dobrze znane ze stanu techniki i będą się różnić, w zależności od użytych komórek gospodarza. [0080] Kwas nukleinowy można zapewniać w wektorze ekspresyjnym, zawierającym sekwencje nukleotydową kodującą polipeptyd ActRII i funkcjonalnie połączoną z co najmniej jedną regulatorową sekwencją. Sekwencje regulatorowe są znane ze stanu techniki, i dobierane dla kierowania ekspresji polipeptydu ActRII. Stosownie do tego, pojęcie sekwencja regulatorowa obejmuje promotory, enhancery i inne elementy kontrolujące ekspresję. Przykładowe sekwencje regulatorowe opisano w Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, CA (1990). Przykładowo, dowolną z szerokiej gamy sekwencji kontrolujących ekspresję, które kontrolują ekspresję sekwencji DNA, gdy są funkcjonalnie z nią połączone, można stosować w tych wektorach, w celu eksprymowania sekwencji DNA kodującej polipeptyd ActRII. Takie użyteczne sekwencje kontrolujące ekspresję, obejmują, na przykład, wczesne i późne promotory SV40, promotor tet, bezpośredni wczesny promotor adenowirusa lub cytomegalowirusa, promotory RSV, system lac, system trp, system TAC lub TRC, promotor T7, którego ekspresją kieruje polimeraza T7 RNA, główne regiony operatorowe i promotorowe faga lambda, regiony kontrolne białka płaszcza fd, promotor dla kinazy 3-fosfoglicerynianu lub innych enzymów glikolitycznych, promotory kwaśnej fosfatazy, np. Pho, promotory czynników koniugacyjnych α drożdży, polihedronowy promotor z systemu bakulowirusowego i inne sekwencje znane z kontrolowania ekspresji genów prokariotycznych lub eukariotycznych komórek lub ich wirusów, i różne ich kombinacje. Należy rozumieć, że projekt wektora ekspresyjnego może zależeć od takich czynników, jak wybór komórki gospodarza do transformacji i/lub rodzaj białka, którego ekspresja jest pożądana. Co więcej, należy także rozważyć liczbę kopii wektora, zdolność do kontrolowania tej liczby kopii i ekspresję dowolnego innego białka kodowanego przez wektor, takiego jak markery antybiotykowe. [0081] Rekombinowany kwas nukleinowy można produkować poprzez ligowanie sklonowanego genu lub jego części, do wektora odpowiedniego do ekspresji w prokariotycznych komórkach, eukariotycznych komórkach (drożdżowe, ptasie, owadzie lub ssacze), lub obydwu. Nośniki do ekspresji do produkcji rekombinowanego polipeptydu ActRII obejmują plazmidy i inne wektory. Przykładowo, odpowiednie wektory obejmują plazmidy typu: plazmidy pochodzące od pbr322, plazmidy pochodzące od pembl, plazmidy pochodzą-

33 ce od pex, plazmidy pochodzące od pbtac i plazmidy pochodzące od puc do ekspresji w komórkach prokariotycznych, takich jak E. coli. [0082] Niektóre ssacze wektory ekspresyjne zawierają zarówno sekwencje prokariotyczne, dla ułatwienia namnażania wektora w bakteriach, jak i jedną lub więcej eukariotycznych jednostek transkrypcyjnych, które są eksprymowane w eukariotycznych komórkach. Wektory pochodzące od pednai/amp, pednai/neo, prc/cmv, psv2gpt, psv2neo, psv2- dhfr, ptk2, prsvneo, pmsg, psvt7, pko-neo i phyg to przykłady ssaczych wektorów ekspresyjnych, odpowiednich do transfekowania eukariotycznych komórek. Niektóre z tych wektorów są modyfikowane sekwencjami z bakteryjnych plazmidów, takich jak pbr322, dla ułatwienia replikacji i selekcji opartej na oporności na lek zarówno w prokariotycznych, jak i eukariotycznych komórkach. Alternatywnie, można stosować pochodne wirusów, takich jak bydlęcy wirus brodawczaka (BPV-1), lub wirus Epsteina-Barra (phe- Bo, pochodzący od prep i p) do przejściowej ekspresji białek w eukariotycznych komórkach. Przykłady innych wirusowych (w tym retrowirusowych) systemów ekspresji można znaleźć w opisie systemów dostarczania terapii genowej. Różne sposoby wykorzystywane w przygotowywaniu plazmidów i transformacji organizmów gospodarza są dobrze znane ze stanu techniki. Inne odpowiednie systemy ekspresji dla zarówno prokariotycznych i eukariotycznych komórek, jak również ogólne procedury rekombinacji, patrz Molecular Cloning A Laboratory Manual, wydanie trzecie, ed. by Sambrook, Fritsch i Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 01). W niektórych przypadkach, pożądane może być eksprymowanie rekombinowanych polipeptydów przy użyciu bakulowirusowego systemu ekspresji. Przykłady takich bakulowirusowych systemów ekspresji obejmują wektory pochodzące od pvl (takie jak pvl1392, pvl1393 i pvl941), wektory pochodzące od pacuw (takie jak pacuw1), i wektory pochodzące od pbluebac (takie jak zawierający β-gal pbluebac III). [0083] Można zaprojektować wektor do produkcji przedmiotowych polipeptydów ActRII w komórkach CHO, taki jak wektor Pcmv-Script (Stratagene, La Jolla, Calif.), wektory pcdna4 (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) i wektory pcl-neo (Promega, Madison, Wisc.). Jak będzie oczywistym, przedmiotowe konstrukty genowe można stosować do wywołania ekspresji przedmiotowych polipeptydów ActRII w komórkach namnażanych w kulturze, np. do produkcji białek, w tym białek fuzyjnych lub wariantów białek, do oczyszczania. [0084] W opisie ujawniono komórkę gospodarza transfekowaną rekombinowanym genem, w tym sekwencją kodującą (np. SEQ ID NO: 4,, 18 lub 19) dla jednego lub więcej przedmiotowych polipeptydów ActRII. Komórka gospodarza może oznaczać dowolną prokariotyczną lub eukariotyczną komórkę. Na przykład, polipeptyd ActRII według wyna-

34 lazku można eksprymować w bakteryjnych komórkach, takich jak E. coli, owadzich komórkach (np. przy użyciu bakulowiruowego systemu ekspresji), drożdżach lub komórkach ssaczych. Inne odpowiednie komórki gospodarza są znane znawcom. [008] Stosownie do tego, w opisie ujawnione są sposoby produkowania przedmiotowych polipeptydów ActRII. Na przykład, komórkę gospodarza transfekowaną wektorem ekspresyjnym kodującym polipeptyd ActRIIa lub ActRIIb można hodować w odpowiednich warunkach, w celu umożliwienia zajścia ekspresji polipeptydu ActRII. Polipeptyd ActRII może być wydzielany i izolowany z mieszaniny komórek i pożywki zawierającej polipeptyd ActRII. Alternatywnie, polipeptyd ActRII można zachowywać w cytoplazmie lub we frakcji błon i zbierać komórki, poddawać lizie i izolować białko. Kultura komórkowa obejmuje komórki gospodarza, pożywki i inne produkty uboczne. Odpowiednie pożywki do kultur komórkowych są dobrze znane ze stanu techniki. Przedmiotowe polipeptydy ActRIIa można izolować z pożywki kultury komórkowej, komórek gospodarza, lub obydwu, przy użyciu technik znanych ze stanu techniki do oczyszczania białek, w tym chromatografia jonowymienna, chromatografia z filtracją żelową, ultrafiltracja, elektroforeza, oczyszczanie typu immunopowinowactwa, z przeciwciałami swoistymi dla określonych epitopów polipeptydów ActRII i oczyszczanie typu immunopowinowactwa, z środkiem, który wiąże się z domeną sprzęgniętą do polipeptydu ActRIIa (np. można stosować kolumnę z białkiem A do oczyszczania fuzji ActRIIa-Fc lub ActRIIb-Fc). Polipeptyd ActRII może oznaczać białko fuzyjne zawierające domenę, która ułatwia jego oczyszczanie. Oczyszczanie można osiągnąć za pomocą serii etapów chromatografii na kolumnie, w tym, na przykład, trzy lub więcej z poniższych, w dowolnej kolejności: chromatografia białka A, chromatografia Q sefarozy, chromatografia fenylosefarozy, chromatografia wykluczania ze względu na rozmiar i chromatografia kationowymienna. Oczyszczanie można zakończyć poprzez filtrację wirusa i wymianę buforu. Jak zademonstrowano w opisie, białko ActRIIa-hFc oczyszczono do czystości rzędu >98%, jak ustalono za pomocą chromatografii wykluczania ze względu na rozmiar i >9%, jak ustalono za pomocą SDS PAGE. Ten poziom oczyszczenia był wystarczający do osiągnięcia pożądanych wyników u myszy, szczurów i naczelnych różnych od człowieka. [0086] Gen fuzyjny kodujący oczyszczaną sekwencję liderową, taki jak sekwencja miejsca cięcia poli-(his)/enterokinazy na końcu N pożądanej części rekombinowanego polipeptydu ActRII, może umożliwić oczyszczanie eksprymowanego białka fuzyjnego przez chromatografię powinowactwa przy użyciu żywicy z metalem Ni 2+. Oczyszczaną sekwencję liderową można następnie usunąć, poprzez potraktowanie enterokinazą, dla dostarczenia

35 oczyszczonego polipeptydu ActRII (np. patrz Hochuli et al., (1987) J. Chromatography 411 :177; i Janknecht et al., PNAS USA 88:8972). [0087] Znane są sposoby wytwarzania genów fuzyjnych. Zasadniczo, łączenie różnych fragmentów DNA, kodujących sekwencje różnych polipeptydów prowadzi się zgodnie z konwencjonalnymi technikami, wykorzystując tępe lub odstające końce do ligacji, trawienie enzymem restrykcyjnym dla zapewnienia odpowiednich końców, wypełnianie lepkich końców, jak jest to odpowiednie, traktowanie fosfatazą alkaliczną, dla uniknięcia niepożądanego połączenia i ligację enzymatyczną. Gen fuzyjny można syntetyzować konwencjonalnymi technikami, w tym na zautomatyzowanych syntetyzerach DNA. Alternatywnie, można prowadzić amplifikację PCR fragmentów genów, przy użyciu kotwiczących starterów, które prowadzą do uzyskania komplementarnych wystających końców pomiędzy dwoma kolejnymi fragmentami genów, które można później hybrydyzować, w celu wygenerowania chimerycznej sekwencji genu (patrz, na przykład, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons: 1992). 4. Oznaczenia przesiewowe [0088] W niektórych aspektach, wynalazek zapewnia sposób identyfikowania środka, który podwyższa poziomy krwinek czerwonych i dotyczy zastosowania polipeptydów ActRII (np. rozpuszczalne polipeptydy ActRIIa lub ActRIIb) i polipeptydów aktywiny do identyfikowania związków (środków), które są agonistami lub antagonistami szlaku sygnalizacyjnego aktywina-actriia i/lub aktywina-actriib. Związki zidentyfikowane poprzez te badania przesiewowe można testować dla dokonania oceny ich zdolności do modulowania poziomów czerwonych krwinek, hemoglobiny i/lub retikulocytów in vivo lub in vitro. Związki te można badać, na przykład, w modelach zwierzęcych. [0089] Istnieją liczne podejścia do badań przesiewowych dla środków terapeutycznych do podwyższania poziomu czerwonych krwinek lub hemoglobiny przez nakierowywanie na sygnalizację aktywinę i ActRII. W niektórych przykładach wykonania, można prowadzić wysokowydajne badania przesiewowe związków, w celu identyfikacji środków, które zakłócają oddziaływanie wywierane przez aktywinę lub ActRII na wybraną linię komórkową. W niektórych przykładach wykonania, oznaczenie wykonuje się w celu przeprowadzenia badań przesiewowych i identyfikacji związków, które swoiście inhibują lub redukują wiązanie polipeptydu ActRIIa lub ActRIIb do aktywiny. Alternatywnie, oznaczenie można stosować w celu identyfikacji związków, które wzmagają wiązanie polipeptydu ActRIIa lub ActRIIb do aktywiny. W dalszym przykładzie wykonania, można identyfikować związki poprzez ich zdolność do oddziaływania z aktywiną, polipeptydem ActRIIb lub polipeptydem ActRIIa.

36 [0090] Szereg formatów oznaczeń będzie wystarczająca, a, w świetle ujawnienia, te nieopisane w sposób wyraźny w opisie nadal będą zrozumiałe dla znawcy. Według opisu, testowe związki (środki) można tworzyć w dowolny kombinatoryczny chemiczny sposób. Alternatywnie, przedmiotowe związki mogą oznaczać naturalnie występujące biocząsteczki syntetyzowane in vivo lub in vitro. Można produkować związki (środki) do testowania pod kątem ich zdolności do działania jako modulatory wzrostu tkanki, na przykład, w bakteriach, drożdżach, roślinach lub innych organizmach (np. naturalne produkty), produkować chemicznie (np. drobne cząsteczki, w tym peptydomimetyki), lub produkować rekombinacyjnie. Testowane związki rozważane w wynalazku obejmują niepeptydylowe organiczne cząsteczki, peptydy, polipeptydy, peptydomimetyki, cukry, hormony i cząsteczki kwasu nukleinowego. W określonym przykładzie wykonania, testowany środek oznacza małą organiczną cząsteczkę, mającą masę cząsteczkową mniejszą niż około 00 daltonów. [0091] Testowane związki według wynalazku można dostarczać jako pojedyncze, odrębne jednostki, lub dostarczać w bibliotekach o większej złożoności, takich jak uzyskane metodami chemii kombinatorycznej. Te biblioteki mogą zawierać, na przykład, alkohole, halogenki alkilu, aminy, amidy, estry, aldehydy, etery i inne klasy organicznych związków. Prezentowanie testowanych związków w systemie testowania może zachodzić albo w izolowanej postaci, albo jako mieszaniny związków, szczególnie na początkowych etapach badań przesiewowych. Opcjonalnie, związki mogą być opcjonalnie derywatyzowane innymi związkami i mieć derywatyzujące grupy, które ułatwiają izolację związków. Nieograniczające przykłady grup derywatyzujących obejmują biotynę, fluoresceinę, digoksygeninę, białko zielonej fluorescencji, izotopy, polihistydynę, kulki magnetyczne, glutationo- S-transferazę (GST), zdolne do fotoaktywacji łączniki sieciujące lub dowolne ich kombinacje. [0092] W wielu programach badań przesiewowych leków, które testują biblioteki związków i naturalnych ekstraktów, pożądane są wysokowydajne oznaczenia, do maksymalizacji liczby związków analizowanych w danym okresie czasu. Często, korzystne są oznaczenia wykonywane w systemach pozakomórkowych, takich, które mogą być uzyskane z oczyszczonych lub częściowo oczyszczonych białek, jako pierwotne badania przesiewowe, pod tym względem, że mogą one być generowane dla umożliwienia szybkiego opracowywania i względnie prostego wykrywania zmiany celu molekularnego, w czym pośredniczy testowany związek. Co więcej, skutki oddziaływania komórkowej toksyczności lub biodostępności testowanego związku można na ogół pominąć w systemie in vitro, oznaczenie zamiast tego koncentruje się głównie na oddziaływaniu leku na cel molekular-

37 ny, co może przejawiać się w zmianie powinowactwa wiązania pomiędzy polipeptydem ActRIIa i aktywiną i/lub pomiędzy polipeptydem ActRIIb i aktywiną. [0093] W celu zilustrowania, w przykładowych oznaczeniach badań przesiewowych według wynalazku, przedmiotowy związek jest kontaktowany z izolowanym i oczyszczonym polipeptydem ActRIIa, który jest zwyczajowo zdolny do wiązania do aktywiny. Do mieszaniny związku i polipeptydu ActRIIa jest następnie dodawana kompozycja zawierająca ligand ActRIIa. Wykrywanie i oznaczanie ilościowe kompleksów ActRIIa/aktywina zapewnia sposób wyznaczania skuteczności związku w inhibowaniu (lub wzmacnianiu) tworzenia kompleksów pomiędzy polipeptydem ActRIIa i aktywiną. Skuteczność związku można oceniać przez generowanie krzywych odpowiedzi na dawkę z danych uzyskanych przy użyciu różnych stężeń testowanych związków. Co więcej, można również wykonać kontrolne oznaczenie, dla zapewnienia poziomu wyjściowego do porównań. Na przykład, w kontrolnym oznaczeniu, izolowaną i oczyszczoną aktywinę dodaje się do kompozycji zawierającej polipeptyd ActRIIa, a tworzenie się kompleksu ActRIIa/aktywina ocenia się ilościowo pod nieobecność testowanego związku. Będzie zrozumiałym, że, na ogół, kolejność mieszania reagentów może być zróżnicowana, i mogą one być mieszane równocześnie. Co więcej, zamiast oczyszczonych białek, można stosować ekstrakty komórkowe i lizaty, do otrzymania odpowiedniego pozakomórkowego układu oznaczeń. Związki, które oddziałują na sygnalizację ActRIIb można identyfikować w podobny sposób, stosując polipeptyd ActRIIb i ligand ActRIIb. [0094] Tworzenie się kompleksu pomiędzy polipeptydem ActRII i aktywiną można wykrywać za pomocą szeregu technik. Przykładowo, modulację tworzenia się kompleksów można oznaczać ilościowo przy użyciu, na przykład, wykrywalnych znakowanych białek, takich jak znakowany izotopem promieniotwórczym (np. 32 P, 3 S, 14 C lub 3 H), znakowany fluorescencyjnie (np. FITC), lub znakowany enzymatycznie polipeptyd ActRIIa lub ActRIIb lub aktywina, za pomocą wykrywania w immunooznaczeniu, lub chromatograficznie. [009] W niektórych przykładach wykonania, wynalazek rozważa zastosowanie oznaczeń polaryzacji fluorescencji i oznaczeń transferu energii rezonansu fluorescencji (FRET) w pomiarach, bezpośrednich lub pośrednich, stopnia oddziaływania pomiędzy polipeptydem ActRII i jego białkiem, partnerem wiązania. Ponadto, inne tryby wykrywania, takie jak te oparte na światłowodach optycznych (publikacja PCT WO 96/26432 i patent amerykański nr,677,196), rezonans plazmonów powierzchniowych (SPR), czujniki ładunków powierzchniowych i czujniki sił powierzchniowych są zgodne z wieloma przykładami wykonania wynalazku.

38 [0096] Ponadto, wynalazek rozważa zastosowanie oznaczenia oddziaływania typu pułapka, znanego również jako oznaczenie dwuhybrydowe do identyfikowania środków, które zakłócają lub nasilają oddziaływanie pomiędzy polipeptydem ActRII i jego białkiem partnerem wiązania. Patrz na przykład, patent amerykański nr,283,317; Zervos et al. (1993) Cell 72: ; Madura et al. (1993) J Biol Chem 268:146-14; Bartel et al. (1993) Biotechniques 14:9-924; i Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8: W określonym przykładzie wykonania, wynalazek rozważa zastosowanie odwrócenia systemów dwuhybrydowych, w celu identyfikacji związków (np. małych cząsteczek lub peptydów), które usuwają oddziaływania pomiędzy polipeptydem ActRII i jego białkiem partnerem wiązania. Patrz na przykład, Vidal i Legrain, (1999) Nucleic Acids Res 27:919-29; Vidal i Legrain, (1999) Trends Biotechnol 17:374-81; i patenty amerykańskie nr,2,490;,9,280; i,96,368. [0097] W niektórych przykładach wykonania, przedmiotowe związki identyfikuje się poprzez ich zdolność do oddziaływania z polipeptydem ActRII lub polipeptydem aktywiny według wynalazku. Oddziaływania pomiędzy związkiem i polipeptydem ActRIIa, ActRIIb lub polipeptydem aktywiny mogą być kowalencyjne lub niekowalencyjne. Na przykład, takie oddziaływanie można identyfikować na poziomie białka przy użyciu sposobów biochemicznych in vitro, w tym fotosieciowania, wiązania ligandu znakowanego izotopem promieniotwórczym i chromatografii powinowactwa (Jakoby WB et al., 1974, Methods in Enzymology 46: 1). W niektórych przypadkach, związki mogą być testowane przesiewowo przy pomocy oznaczenia opartego na mechanizmie, takim jak oznaczenie do wykrywania związków, które wiążą się do aktywiny lub polipeptydu ActRII. Może to obejmować zdarzenie wiązania w fazie stałej lub fazie ciekłej. Alternatywnie, gen kodujący aktywinę lub polipeptyd ActRII można transfekować w układzie reporterowym (np. β-galaktozydaza, lucyferaza, lub białko zielonej fluorescencji) do komórki i badać przesiewowo względem biblioteki, opcjonalnie za pomocą wysokowydajnych badań przesiewowych lub poszczególnych członków biblioteki. Można stosować inne oznaczenia oparte na mechanizmie wiązania, na przykład, oznaczenia wiązania, które wykrywają zmiany w energii swobodnej. Oznaczenia wiązania można prowadzić z obiektem docelowym związanym do studzienki, kulki lub chipu, lub wychwyconym przez immobilizowane przeciwciało lub rozdzielanym w elektroforezie kapilarnej. Związane związki można wykrywać zazwyczaj przy użyciu kolorymetrii lub fluorescencji lub rezonansu plazmonów powierzchniowych.. Zastosowania terapeutyczne [0098] Antagonistów aktywiny-actrii (np. polipeptydy ActRIIa lub ActRIIb) można stosować do podwyższania poziomów krwinek czerwonych u ssaków, takich jak gryzonie i

39 naczelne, a szczególnie u pacjentów ludzi. Niektórych antagonistów aktywiny-actrii można stosować w sposobach leczenia lub zapobiegania niedokrwistości u osobnika, który tego wymaga lub w sposobach stymulowania tworzenia czerwonych krwinek u osobnika. Te sposoby można stosować w terapeutycznym i profilaktycznym leczeniu ssaków, a szczególnie ludzi. [0099] Według opisu, terapeutyk, który zapobiega zaburzeniu lub stanowi dotyczy związku, który, w statystycznej próbce, zmniejsza częstość występowania zaburzenia lub stanu w leczonej próbie, względem nietraktowanej próby kontrolnej, lub opóźnia wystąpienie lub zmniejsza nasilenie jednego lub więcej objawów zaburzenia lub stanu, względem nietraktowanej próby kontrolnej. Pojęcie leczenie według opisu obejmuje profilaktykę określonego stanu lub polepszenie lub eliminację stanu, po jego ustabilizowaniu. W każdym z przypadków, zapobieganie lub leczenie może być rozróżnione w diagnozie zapewnionej przez lekarza lub innego pracownika służby zdrowia i zamierzonym wyniku podawania środka terapeutycznego. [00] Jak pokazano w opisie, antagonistów aktywiny-actriia i antagonistów aktywiny- ActRIIb można stosować do podwyższania poziomów czerwonych krwinek, hemoglobiny lub retikulocytów u zdrowych osobników, a takich antagonistów można stosować w wybranych populacjach pacjentów. Przykłady odpowiednich populacji pacjentów obejmują te z niepożądanie niskimi poziomami czerwonych krwinek lub hemoglobiny, takie jak pacjentów z niedokrwistością, i tych, którzy są obarczeni ryzykiem rozwinięcia się niepożądanie niskich poziomów czerwonych krwinek lub hemoglobiny, takie jak tych pacjentów, którzy mają być poddani poważnej operacji chirurgicznej lub innym procedurom, które mogą skutkować znaczącą utratą krwi. Pacjenta z odpowiednim poziomem krwinek czerwonych można traktować antagonistą aktywiny-actriia lub antagonistą aktywiny-actriib do podwyższania poziomu krwinek czerwonych, a następnie pobiera się krew i przechowuje do późniejszego użycia w transfuzji. [01] Antagonistów aktywiny-actrii ujawnionych w opisie, a szczególnie białka ActRIIa-Fc i ActRIIb można stosować do podwyższania poziomu krwinek czerwonych u pacjentów z niedokrwistością. Przy obserwowaniu poziomów hemoglobiny u ludzi, poziom niższy od normalnego dla stosownych kategorii wieku i płci może wskazywać na niedokrwistość, chociaż należy uwzględnić indywidualne różnice. Na przykład, poziom hemoglobiny rzędu 12 g/dl jest na ogół uważany za dolną granicę normy w ogólnej populacji dorosłych. Do potencjalnych przyczyn zalicza się utratę krwi, niedobory żywieniowe, reakcję na leki, różne problemy ze szpikiem kostnym i wiele chorób. Dokładniej, niedokrwistość może być powiązana z szeregiem zaburzeń, które obejmują, na przykład, przewlekłą

40 niewydolność nerek, zespół mielodysplastyczny, reumatoidalne zapalenie stawów i przeszczepienie szpiku kostnego. Niedokrwistość może być również powiązana z poniższymi stanami: nowotwory lite (np. rak sutka, rak płuc, rak jelita grubego); nowotwory układu limfatycznego (np. przewlekła białaczka limfocytarna, chłoniak nieziarniczy i chłoniak Hodgkina); nowotwory układu krwiotwórczego (np. białaczka, zespół mielodysplastyczny, szpiczak mnogi); radioterapia; chemioterapia (np. schematy zawierające platynę); choroby zapalne i autoimmunologiczne, w tym, w sposób nieograniczający, reumatoidalne zapalenie stawów, inne stany zapalne stawów, toczeń rumieniowaty układowy (SLE), ostre lub przewlekłe choroby skóry (np. łuszczyca), nieswoiste zapalenie jelit (np. choroba Crohna i wrzodziejące zapalenie okrężnicy); ostra lub przewlekła choroba nerek lub niewydolność, w tym stany idiopatyczne lub wrodzone; ostra lub przewlekła choroba wątroby; ostre lub przewlekłe krwawienie; sytuacje, w których niemożliwa jest transfuzja czerwonych krwinek, ze względu na allo- lub auto-przeciwciała pacjenta i/lub z powodów religijnych (np. niektórzy Świadkowie Jehowy); infekcje (np. malaria, zapalenie szpiku); hemoglobinopatie, w tym, na przykład, niedokrwistość sierpowata, talasemie; stosowanie lub nadużywanie leków, np. nadużywanie alkoholu; pacjenci pediatryczni z niedokrwistością spowodowaną jakąkolwiek przyczyną, w celu uniknięcia transfuzji; i pacjenci w podeszłym wieku lub pacjenci z podstawową chorobą tętnic wieńcowych, z niedokrwistością, którzy nie mogą otrzymywać transfuzji ze względu na obawy dotyczące przeciążenia układu krążenia. [02] Pacjentów można leczyć przy pomocy schematu dawkowania mającego na celu przywrócenie u pacjenta docelowego poziomu hemoglobiny, zazwyczaj pomiędzy około g/dl i około 12, g/dl, i typowo około 11,0 g/dl (patrz również Jacobs et al. (00) Nephrol Dial Transplant 1, 1-19), chociaż niższe poziomy docelowe mogą powodować mniej sercowo-naczyniowych działań niepożądanych. Alternatywnie, można stosować poziomy hematokrytu (procent objętości próbki krwi zajęty przez komórki) jako miarę stanu czerwonych krwinek. Poziomy hematokrytu u zdrowych osobników wahają się od 41 do 1% dla dorosłych mężczyzn i od 3 do 4% dla dorosłych kobiet. Docelowe poziomy hematokrytu wynoszą zazwyczaj około -33%. Ponadto, poziomy hemoglobiny/hematokrytu różnią się w zależności od osoby. Tym sposobem, optymalnie, docelowy poziom hemoglobiny/hematokrytu może być zindywidualizowany dla każdego pacjenta. [03] Szybkie oddziaływanie antagonistów aktywiny-actriia ujawnionych w opisie na poziomy krwinek czerwonych świadczy o tym, że środki te działają poprzez inny mechanizm niż Epo. Stosownie do tego, antagoniści ci mogą być użyteczni do podwyższania poziomów czerwonych krwinek i hemoglobiny u pacjentów, którzy nie odpowiadają dobrze na Epo. Na przykład, antagonista aktywina-actriia może być korzystny dla pacjenta, u

41 którego podawanie normalnej do podwyższonej (>0 IU/kg/tydzień) dawki Epo nie skutkuje wzrostem poziomu hemoglobiny do docelowego poziomu. Pacjentów z nieadekwatną odpowiedzią Epo można znaleźć we wszystkich rodzajach niedokrwistości, ale wyższe liczby osobników niereagujących na leczenie obserwowano szczególnie często u pacjentów z nowotworami i pacjentów z końcowym stadium choroby nerek. Nieadekwatna odpowiedź na Epo może być albo konstytutywna (tj. widoczna po pierwszym leczeniu Epo) lub nabyta (np. widoczna po kolejnych terapiach Epo). [04] Antagonistów aktywiny-actrii można również stosować do leczenia pacjentów, którzy są podatni na działania niepożądane Epo. Pierwotnymi działaniami niepożądanymi Epo są nadmierny wzrost poziomu hematokrytu lub hemoglobiny i policytemia. Podwyższone poziomy hematokrytu mogą prowadzić do nadciśnienia (dokładniej pogorszenia nadciśnienia) i zakrzepicy naczyń. Inne działania niepożądane Epo, o których donoszono, z których niektóre są powiązane z nadciśnieniem, to bóle głowy, zespół grypopodobny, niedrożność przetok, zawały mięśnia sercowego i drgawki mózgowe, spowodowane zakrzepicą, encefalopatią nadciśnieniową i aplazją czerwonokrwinkową (Singibarti, (1994) J. Clin Investig 72(suppl 6), S36-S43; Horl et al. (00) Nephrol Dial Transplant 1(suppl 4), 1-6; Delanty et al. (1997) Neurology 49, ; Bunn (02) N Engl J Med 346(7), 22-23). 6. Kompozycje farmaceutyczne [0] Antagonistów aktywiny-actrii (np. polipeptydy ActRIIa i ActRIIb) można poddawać formulacji z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem. Na przykład, polipeptyd ActRII można podawać samodzielnie lub jako składnik formulacji farmaceutycznej (terapeutyczna kompozycja). Przedmiotowe związki można formułować do podawania dowolną dogodną drogą do stosowania w medycynie lub medycynie weterynaryjnej. [06] W niektórych przykładach wykonania, wynalazek obejmuje podawanie kompozycji układowo, lub miejscowo, jako implant lub urządzenie. Po podaniu, terapeutyczna kompozycja do stosowania według wynalazku oznacza, co oczywiste, wolną od pirogenów, fizjologicznie dopuszczalną postać. Terapeutycznie użyteczne środki, inne niż antagoniści ActRII, które można również opcjonalnie zawrzeć w kompozycji, jak opisano powyżej, można podawać równocześnie lub sekwencyjnie z przedmiotowymi związkami (np. polipeptydami ActRIIa i ActRIIb) w sposobach według wynalazku. [07] Typowo, antagonistów aktywiny-actrii będzie się podawać pozajelitowo. Kompozycje farmaceutyczne odpowiednie do podawania pozajelitowego mogą zawierać jeden lub więcej polipeptydów ActRII, w połączeniu z jednym lub więcej farmaceutycznie dopuszczalnymi jałowymi izotonicznymi wodnymi lub niewodnymi roztworami, dyspersjami,

42 zawiesinami lub emulsjami, lub jałowe proszki, które mogą być odtwarzane do jałowych wstrzykiwanych roztworów lub dyspersji tuż przed użyciem, które mogą zawierać przeciwutleniacze, bufory, bakteriostatyny, soluty, które czynią formulację izotoniczną z krwią zamierzonego dawcy lub środki zawieszające lub zagęszczające. Przykłady odpowiednich wodnych i niewodnych nośników, które można stosować w kompozycjach farmaceutyczne według wynalazku obejmują wodę, etanol, poliole (takie jak glicerol, glikol propylenowy, glikol polietylenowy i podobne), i odpowiednie ich mieszaniny, oleje roślinne, takie jak olej z oliwek i wstrzykiwane estry organiczne, taki jak oleinian etylu. Właściwą płynność można utrzymać, na przykład, przez użycie materiałów powlekających, takich jak lecytyna, utrzymywanie właściwych rozmiarów cząstek, w przypadku dyspersji, i przez stosowanie środków powierzchniowo czynnych. [08] Ponadto, kompozycję można kapsułkować lub wstrzykiwać, w postaci przeznaczonej do dostarczenia do miejsca tkanki docelowej (np. szpik kostny). W niektórych przykładach wykonania, kompozycje według wynalazku mogą zawierać macierz zdolną do dostarczania jednego lub więcej terapeutycznych związków (np. polipeptydy ActRIIa lub ActRIIb) do miejsca tkanki docelowej (np. szpik kostny), zapewniającą strukturę do rozwoju tkanki i optymalnie zdolną do wchłonięcia przez organizm. Na przykład, macierz może zapewniać powolne uwalnianie polipeptydów ActRII. Takie macierze można tworzyć z materiałów stosowanych w innych aplikacjach implantów medycznych. [09] Wybór materiału macierzy opiera się na biokompatybilności, biodegradowalności, właściwościach mechanicznych, wyglądzie kosmetycznym i właściwościach międzyfazowych. Określone zastosowanie przedmiotowych kompozycji będzie definiować odpowiednią formulację. Potencjalne macierze dla kompozycji mogą oznaczać biodegradowalny i definiowany chemicznie siarczan wapnia, fosforan trójwapniowy, hydroksyapatyt, kwas polimlekowy i polibezwodniki. Inne potencjalne materiały są biodegradowalne i biologicznie dobrze zdefiniowane, takie jak kość lub kolagen dermatologiczny. Dalsze macierze składają się z czystych białek lub pozakomórkowych składników macierzy. Inne potencjalne macierze są niebiodegradowalne i chemicznie definiowane takie jak spiekany hydroksyapatyt, bioszkło, gliniany lub inne materiały ceramiczne. Macierze mogą składać się z kombinacji dowolnych powyższych rodzajów materiałów, takich jak kwas polimlekowy i hydroksyapatyt lub kolagen i fosforan trójwapniowy. Materiały bioceramiczne mogą być zmienione w kompozycji, tak jak w fosforanie wapniowo-glinowym, i poddane obróbce mającej na celu zmianę rozmiarów porów, rozmiarów cząstek, kształtu cząstek i biodegradowalności.

43 [01] W niektórych przykładach wykonania, kompozycje według wynalazku można podawać doustnie, np. w postaci kapsułek, saszetek, pigułek, tabletek, tabletek do ssania (przy użyciu aromatyzowanej bazy, zazwyczaj sacharozy i gumy akacjowej lub traganku), proszków, granulek, lub jako roztwór lub zawiesinę w wodnej lub niewodnej cieczy, lub jako emulsję typu olej w wodzie lub woda w oleju, lub jako eliksir lub syrop, lub jako pastylki (przy użyciu obojętnej bazy, takiej jak żelatyna i gliceryna, lub sacharoza i guma arabska) i/lub jako płukanki do ust i podobne, przy czym każdy zawiera ustaloną z góry ilość środka, jako składnika czynnego. Środek można również podawać jako wstrzyknięcie dożylne, lekarstwo zmieszane z miodem lub syropem lub pastę. [0111] W stałych postaciach dawkowania do podawania doustnego (kapsułki, tabletki, pigułki, drażetki, proszki, granulki i podobne), jeden lub więcej terapeutycznych związków według wynalazku można mieszać z jednym lub więcej farmaceutycznie dopuszczalnymi nośnikami, takimi jak cytrynian sodu lub fosforan dwuwapniowy, i/lub dowolne z poniższych: (1) substancje wypełniające lub domieszki, takie jak skrobie, laktoza, sacharoza, glukoza, mannitol i/lub krzemionka; (2) substancje wiążące, takie jak, na przykład, karboksymetyloceluloza, alginiany, żelatyna, poliwinylopirolidon, sacharoza, i/lub guma arabska; (3) środki utrzymujące wilgotność, takie jak glicerol; (4) środki rozsadzające, takie jak agar-agar, węglan wapnia, skrobia ziemniaczana lub z tapioki, kwas alginowy, niektóre krzemiany i węglan sodu; () środki spowalniające roztwór, takie jak parafina; (6) środki przyspieszające wchłanianie, takie jak czwartorzędowe związki amonowe; (7) środki zwilżające, takie jak, na przykład, alkohol cetylowy i monostearynian glicerolu; (8) absorbenty, takie jak kaolin i glina bentonitowa; (9) substancje nawilżające, takie jak talk, stearynian wapnia, stearynian magnezu, stałe glikole polietylenowe, laurylosiarczan(vi) sodu i ich mieszaniny i () środki barwiące. W przypadku kapsułek, tabletek i pigułek, kompozycje farmaceutyczne mogą również zawierać środki buforujące. Stałe kompozycje podobnego typu mogą również być stosowane jako wypełniacze w miękkich i twardych kapsułkach żelatynowych, przy użyciu takich rozczynników jak laktoza lub cukry mleka, jak również glikole polietylenowe o dużej masie cząsteczkowej i podobne. [0112] Płynne postaci dawkowania do podawania doustnego obejmują farmaceutycznie dopuszczalne emulsje, mikroemulsje, roztwory, zawiesiny, syropy i eliksiry. Oprócz składnika czynnego, płynne postaci dawkowania mogą zawierać obojętne rozcieńczalniki, powszechnie stosowane w stanie techniki, takie jak woda lub inne rozpuszczalniki, środki solubilizujące i emulgatory, takie jak alkohol etylowy, alkohol izopropylowy, węglan etylu, octan etylu, alkohol benzylowy, benzoesan benzylu, glikol propylenowy, glikol 1,3- butylenowy, oleje (w szczególności, z nasion bawełny, orzeszków ziemnych, kukurydzy,

44 kiełków, oliwy, rącznika i sezamowy), glicerol, alkohol tetrahydrofurylowy, glikole polietylenowe i estry sorbitanowe kwasów tłuszczowych, i ich mieszaniny. Poza obojętnymi rozcieńczalnikami, kompozycje doustne mogą również zawierać adjuwanty, takie jak środki zwilżające, emulgujące i zawieszające, słodzące, aromatyzujące, barwiące, zapachowe i konserwujące. [0113] Zawiesiny, oprócz związków aktywnych, mogą zawierać środki zawieszające, takie jak etoksylowane alkohole izostearylowe, sorbitol polioksyetylenu i estry sorbitanu, celuloza mikrokrystaliczna, metawodorotlenek glinu, bentonit, agar-agar i tragakant, i ich mieszaniny. [0114] Kompozycje według wynalazku mogą również zawierać adjuwanty, takie jak konserwanty, środki zwilżające, emulgatory i środki dyspergujące. Zapobieganie działaniu mikroorganizmów można gwarantować przez inkluzję różnych środków antybakteryjnych i przeciwgrzybowych, na przykład, parabenu, chlorobutanolu, fenolu, kwasu sorbinowego i podobnych. Może również być pożądane zawarcie w kompozycjach środków izotonicznych, takich jak cukry, chlorek sodu, i podobne. Dodatkowo, przedłużone wchłanianie wstrzykiwalnej postaci farmaceutycznej można spowodować poprzez włączenie środków, które opóźniają wchłanianie, takich jak monostearynian glinu i żelatyna. [011] Jest zrozumiałym, że schemat dawkowania zostanie ustalony przez lekarza prowadzącego, z uwzględnieniem różnych czynników, które modyfikują działanie przedmiotowych związków według wynalazku (np. polipeptydów ActRIIa i ActRIIb). Różne czynniki obejmują, w sposób nieograniczający, liczbę czerwonych krwinek pacjenta, poziom hemoglobiny lub inne oceny diagnostyczne, pożądaną docelową liczbę czerwonych krwinek, wiek, płeć i dietę pacjenta, nasilenie jakiejkolwiek choroby, która może przyczyniać się do obniżenia poziomu czerwonych krwinek, czas podania i inne czynniki kliniczne. Dodanie innych znanych czynników wzrostu do końcowej kompozycji może również wpływać na dawkowanie. Postęp można monitorować poprzez okresowe oceny poziomu czerwonych krwinek i hemoglobiny, jak również oceny poziomu retikulocytów i inne wskaźniki procesu krwiotwórczego. [0116] Eksperymenty na naczelnych i ludziach wykazały, że efekty oddziaływania ActRIIa-Fc na poziomy krwinek czerwonych są wykrywalne, gdy związek jest dawkowany z odstępami i w ilościach wystarczających do osiągnięcia stężeń w surowicy rzędu około 0 ng/ml lub wyższych, przez okres co najmniej około do dni. Dopuszcza się także stosowanie dawkowania do uzyskania poziomów w surowicy rzędu 0 ng/ml, 00 ng/ml, 00 ng/ml lub wyższego, przez okres co najmniej do dni. Oddziaływania na kość można obserwować przy poziomach w surowicy rzędu około 0 ng/ml, przy czym zna-

45 czące skutki oddziaływania zaczynają występować od około 00 ng/ml lub powyżej, przez okres co najmniej około do dni. Tym sposobem, jeżeli pożądane jest osiągnięcie oddziaływania na czerwone krwinki, z oddziaływaniem w niewielkim stopniu na kość, można zaprojektować schemat dawkowania do zapewniania stężenia w surowicy rzędu pomiędzy około 0 i 00 ng/ml przez okres około do dni. U ludzi, poziomy w surowicy rzędu 0 ng/ml można osiągać za pomocą pojedynczej dawki 0,1 mg/kg lub większej, a poziomy w surowicy rzędu 00 ng/ml można osiągać za pomocą pojedynczej dawki 0,3 mg/kg lub większej. Obserwowany okres półtrwania cząsteczki w surowicy wynosi pomiędzy około i dni, zasadniczo dłużej niż większości białek fuzyjnych Fc, a zatem utrzymujący się, skuteczny poziom w surowicy można osiągnąć, na przykład, przez dawkowanie około 0,0 do 0, mg/kg w schemacie cotygodniowym lub co dwa tygodnie, lub można stosować wyższe dawki z dłuższymi odstępami pomiędzy dawkowaniami. Na przykład, można stosować dawki rzędu 0,1 do 1 mg/kg w trybie raz na miesiąc lub raz na dwa miesiące. [0117] W opisie ujawniono terapię genową do produkcji in vivo polipeptydów ActRII. Taka terapia osiągnęłaby swój efekt terapeutyczny poprzez wprowadzenie sekwencji polinukleotydowych ActRIIa lub ActRIIb do komórek lub tkanek mających zaburzenia, jak wyszczególniono powyżej. Dostarczanie sekwencji polinukleotydowych ActRII można osiągnąć przy użyciu rekombinowanego wektora ekspresyjnego, takiego jak wirus chimeryczny lub koloidalny system dyspersyjny. Przy dostarczaniu terapeutycznym sekwencji polinukleotydowych ActRII korzystne jest zastosowanie nakierowywanych liposomów. [0118] Różne wektory wirusowe, które można stosować do terapii genowej, jak przedstawiono w opisie obejmują adenowirusy, wirusa opryszczki, wirusa ospy bydlęcej lub wirusa RNA, takiego jak retrowirus. Retrowirusowy wektor może być pochodną mysiego lub ptasiego retrowirusa. Przykłady retrowirusowych wektorów, do których można wprowadzić pojedynczy, obcy gen obejmują, w sposób nieograniczający: wirusa białaczki mysiej Moloney a (MoMuLV), wirusa mięsaka mysiego Harvey a (HaMuSV), mysiego wirusa raka sutka (MuMTV) i wirusa mięsaka Rousa (RSV). Szereg dodatkowych wektorów retrowirusowych może pomieścić liczne geny. Wszystkie z tych wektorów mogą przenosić lub inkorporować gen markera selekcyjnego, aby można było identyfikować i generować komórki po takiej transdukcji. Wektory retrowirusowe można uczynić swoistymi dla obiektu docelowego poprzez dołączenie, na przykład, cukru, glikolipidu lub białka. Korzystne nakierowywanie osiąga się przy użyciu przeciwciała. Znawcy rozpoznają, że można wprowadzać specyficzne sekwencje polinukleotydowe do genomu retrowirusa lub dołączać do

46 4 1 2 wirusowej otoczki, dla umożliwienia swoistego względem obiektu docelowego dostarczania wektora retrowirusowego, zawierającego polinukleotyd ActRII. [0119] Alternatywnie, komórki kultur tkankowych można bezpośrednio transfekować plazmidami kodującymi geny strukturalne retrowirusa gag, pol i env, poprzez konwencjonalną transfekcję fosforanem wapnia. Komórki te są następnie transfekowane wektorem plazmidem zawierającym przedmiotowe geny. Powstałe komórki uwalniają wektor retrowirusowy do pożywki hodowlanej. [01] Kolejnym nakierowywanym systemem dostarczania dla polinukleotydów ActRII jest koloidalny system dyspersyjny. Koloidalne systemy dyspersyjne obejmują kompleksy makrocząsteczek, nanokapsułki, mikrosfery, kulki, i systemy oparte na lipidach, w tym emulsje typu olej w wodzie, micele, micele mieszane i liposomy. Korzystne, system koloidalny oznacza liposom. Liposomy są sztucznymi pęcherzykami błonowymi, które są użyteczne jako nośniki do dostarczania in vitro i in vivo. RNA, DNA i nienaruszone wiriony można kapsułkować w wodnym wnętrzu i dostarczać do komórek w biologicznie aktywnej postaci (patrz np. Fraley, et al., Trends Biochem. Sci., 6:77, 1981). Sposoby skutecznego przenoszenia genów, przy użyciu nośnika liposomowego, są znane ze stanu techniki, patrz np. Mannino, et al., Biotechniques, 6:682, Kompozycja liposomu to zazwyczaj kombinacja fosfolipidów, zazwyczaj w połączeniu ze steroidami, szczególnie cholesterolem. Można także stosować inne fosfolipidy lub inne lipidy. Charakterystyka fizyczna liposomów zależy od ph, siły jonowej i obecności kationów dwuwartościowych. [0121] Przykłady lipidów użytecznych w produkcji liposomów obejmują związki fosfatydylowe, takie jak fosfatydyloglicerol, fosfatydylocholina, fosfatydyloseryna, fosfatydyloetanoloamina, sfingolipidy, cerebrozydy i gangliozydy. Do ilustrujących fosfolipidów zalicza się fosfatydylocholinę z jaja, dipalmitoilofosfatydylocholinę i distearoilofosfatydylocholinę. Możliwe jest również nakierowywanie liposomów, na podstawie, na przykład, swoistości do narządu, swoistości do komórki i swoistości do organelli, i jest znane ze stanu techniki. 3 PRZYKŁADY [0122] Wynalazek opisany ogólnie, stanie się lepiej zrozumiałym dzięki odniesieniu do poniższych przykładów, które zawarto jedynie dla celów ilustracji niektórych przykładów wykonania wynalazku, i nie mają one na celu ograniczania zakresu wynalazku. Przykład 1: Białka fuzyjne ActRIIa-Fc [0123] Zgłaszający skonstruowali rozpuszczalne białko fuzyjne ActRIIa, które ma domenę pozakomórkową ludzkiego ActRIIa, sprzężoną z ludzką lub mysią domeną Fc z minimal-

47 46 nym łącznikiem pomiędzy nimi. Konstrukty są określane odpowiednio ActRIIa-hFc i ActRIIa-mFc. [0124] ActRIIa-hFc pokazano poniżej, jako oczyszczony z linii komórkowych CHO (SEQ ID NO: 7): [012] Białka ActRIIa-hFc i ActRIIa-mFc eksprymowano w liniach komórkowych CHO. Rozważano trzy różne sekwencje liderowe: (i) Melityna miodu pszczelego (HBML): MKFLVNVALVFMVVYISYIYA (SEQ ID NO: 8) (ii) Aktywator plazminogenu tkankowego (TPA): MDAMKRGLCCVLLLCGAV- FVSP (SEQ ID NO: 9) (iii) Natywna: MGAAAKLAFAVFLISCSSGA (SEQ ID NO: ). [0126] Wybrana postać wykorzystuje lider TPA i ma poniższą, niepoddawaną obróbce sekwencję aminokwasową: 1 [0127] Ten polipeptyd jest kodowany przez poniższą sekwencję kwasu nukleinowego: