UNIWERSYTET WARSZAWSKI

Transkrypt

1 UNIWERSYTET WARSZAWSKI W Y D Z I A Ł B I O L O G I I ZAKŁAD BIOLOGII MOLEKULARNEJ ROŚLIN Paweł Karol Mazur IDENTYFIKACJA, KLONOWANIE i CHARAKTERYSTYKA GENU RETINOBLASTOMA Z ARABIDOPSIS THALIANA Praca licencjacka wykonana pod kierunkiem prof. dr hab. Andrzeja Jerzmanowskiego Warszawa 2003

2 Składam serdeczne podziękowania mojemu opiekunowi naukowemu dr Andrzejowi Wierzbickiemu za przekazaną wiedzę i kształtowanie naukowego myślenia oraz mojemu promotorowi prof. dr hab. Andrzejowi Jerzmanowskiemu za życzliwość, pomoc w rozwijaniu możliwości i chęci tworzenia szans. 2

3 SPIS TREŚCI 1. Wstęp 4 2. Anatomia szlaku kontroli cyklu komórkowego z udziałem białka retinoblastoma Cykliny Kinazy zależne od cyklin Inhibitory kinaz zależnych od cyklin Białko retinoblastoma Białka E2F i DP Białko retinoblastoma zmienia strukturę chromatyny Acetylacja Fosforylacja Metylacja Kompleksy remodelujące chromatynę Fizjologia szlaku kontroli cyklu komórkowego z udziałem białka retinoblastoma Zwierzęta Rola Rb w regulacji cyklu komórkowego Rola Rb w onkogenezie Rola Rb w różnicowaniu komórek Rola Rb w apoptozie Rola Rb w kontrolowaniu długości telomerów Chlamydomonas Rośliny Rola Rb w cyklu komórkowym roślin Aberracje cyklu komórkowego roślin Rola Rb w fotomorfogenezie Cel pracy Materiały i metody Hodowla bakterii Materiał roślinny Synteza cdna PCR Rekombinacja DNA Przygotowanie bakterii elektrokompetentnych i transformacja Izolacja plazmidowego DNA bakterii Metodą lizy alkalicznej (miniprep) Zestaw do izolacji plazmidowego DNA Sekwencjonowanie DNA Techniki komputerowe Wyniki Identyfikacja wszystkich genów Rb w genomie Arabidopsis Charakterystyka filogenetyczna Rb Klonowanie Rb z Arabidopsis Dyskusja Literatura 37 3

4 1. WSTĘP Pół wieku temu w 1953 roku Howard i Pelc wprowadzili nomenklaturę eukariotycznego cyklu komórkowego wyróżniającą fundamentalne fazy replikacji: DNA (S), mitozy (M) i przerw pomiędzy nimi (G1 i G2) występujące w sekwencji G1-S-G2-M. Termin cykl komórkowy sugeruje stałe powtarzanie się cyklicznie następujących procesów, co jest prawdziwe jedynie w odniesieniu do ekspotencjalnego wzrostu organizmów jednokomórkowych lub hodowli komórkowych. Nie ma jednak odniesienia do tego, co dzieje się in vivo w złożonych organizmach wielokomórkowych. W nich bowiem komórka jest częścią tkanek i organów o ściśle zdefiniowanych przestrzennych relacjach z sąsiednimi komórkami. Niezbędny jest mechanizm wrażliwy na sygnały zewnętrzne, który w odpowiednich warunkach decyduje o proliferacji. Pozwala to na tworzenie wyspecjalizowanych struktur wyższego rzędu (tkanek, organów). Komórka posiada system decydujący o kontynuowaniu lub zaprzestaniu podziałów bądź apoptozie. Integruje on informacje o dostępności pokarmu, warunkach zewnętrznych, kontekście położenia, stadium rozwoju oraz zdarzeniach wewnątrzkomórkowych takich jak uszkodzenie DNA. System kontroli cyklu komórkowego sprawowany jest przez kinazy białkowe zależne do cyklin (Cdk), które są regulowane przez nagromadzanie i rozpad cyklin (Cyc). Istnieje wiele cyklin i kinaz zależnych od nich, które tworzą kompleksy włączając różne etapy cyklu komórkowego. Z biochemicznego punktu widzenia podstawową zasadą regulacji cyklu jest uruchamianie kaskadowych reakcji fosforylacji i defosforylacji odpowiednich białek. Dzięki systemowi kontroli, zdarzenia cyklu komórkowego następują w określonej kolejności. Regulacja cyklu komórkowego odbywa się między innymi poprzez punkty kontrolne. Dwa główne weryfikują przejście z faz G1 do S i G2 do M cyklu komórkowego. Punkt kontrolny G1 często nazywany start jest kluczowym, ponieważ jego przejście determinuje komórkę do ukończenia pełnego cyklu (Rys. 1). Przejście fazy G1 w S znajduje się pod kontrolą silnie konserwowanego mechanizmu, którego podstawowym elementem jest białko supresorowe retinoblastoma (Rb) [65]. Rolą białka Rb jest transdukcja sygnału łączącego układ kontroli cyklu komórkowego z transkrypcją. Białko Rb pośredniczy w kontroli ekspresji genów niezbędnych w fazie S. Białko retinoblastoma stanowi główny punkt kontroli integrujący sygnały regulujące podziały komórkowe [117]. 4

5 Rys. 1. Model kontroli cyklu komórkowego u roślin [83]. Pod wpływem czynnika stymulującego proliferację (mitogenu), produkowane są cykliny typu D wiążące się z kinazami zależnymi od cyklin typu A. Rezultatem powstania kompleksu białkowego Cdk2a/CycD jest fosforylacja białka retinoblastoma, w wyniku której uwalniany jest czynnik transkrypcyjny E2F (tworzący heterodimer z białkiem DP). E2F/DP indukuje ekspresje genów niezbędnych w przejściu do fazy S. Po zainicjowaniu fazy S cyklu komórkowego cykliny D są szybko degradowane dzięki obecności sekwencji PEST. Opisane przejście z fazy G1 do S może zostać zatrzymane przez związanie Cdk2a z CKI. Podczas fazy S syntetyzowane są cykliny A, aktywujące Cdk-A. Po osiągnięciu przez komórkę końca fazy S, aktywność Cdk2a jest hamowana przez kinazę tyrozynową. W fazie G2 produkowane są cykliny B. Zarówno Cdk2a i Cdk-B wykazują aktywność w punkcie kontrolnym G2/M, jeśli zwiążą cyklinę B i czynnik Cks1, a w Cdk2a usunięta zostanie grupa fosforanowa. Ponadto przejście G2/M jest uzależnione od cytokinin (hormon). Motywy degradacyjne umożliwiają usunięcie cyklin A i B podczas fazy M [10,33]. 5

6 2. ANATOMIA SZLAKU KONTROLI CYKLU KOMÓRKOWEGO Z UDZIAŁEM BIAŁKA RETINOBLASTOMA Opisane zostaną składniki budujące system kontroli wzrostu, różnicowania i proliferacji, sprawowany przez białko Rb. Uwzględniono przede wszystkim komponenty szlaku roślinnego CYKLINY Cykliny są głównymi regulatorami kinaz zależnych od cyklin, z którymi tworzą kompleksy białkowe [90]. W regulacji szlaku Rb biorą udział cylkiny D [40] (u roślin CycD1, CycD2 i CycD3 [102]). Stwierdza się niewielkie homologie (9%-14%) pomiędzy roślinnymi, a zwierzęcymi cyklinami D, jednak posiadają one silnie konserwowany motyw LxCxE na N- końcu [93]. Ta sama sekwencja występuje w onkoproteinach wirusowych (Tabela 1) i jest motywem wiążącym białko retinoblastoma [35]. Pierwszym elementem kaskady cyklu komórkowego jest nasilenie ekspresji genów cyklin D. Ze względu na pełnioną funkcje CycD jest protoonkogenem, ponieważ zwiększona aktywność (amplifikacja genu, nadekspresja itp.) w komórkach zwierzęcych może prowadzić do transformacji nowotworowej [20,22]. Nadekspresja CycD2 w tytoniu wywołuje intensywny ogólny wzrost rośliny, zwiększenie liczby liści i przyśpieszony rozwój od nasienia do dojrzałości (Rys. 2). Nie zmienia się fenotyp komórek, ani merysemów. Ulegają przyśpieszeniu podziały komórkowe (skracanie fazy G1) oraz zwiększa się aktywność merystemów [19]. Nadekspresja CycD1 w Arabidopsis powoduje znaczny rozrost korzenia i nieco mniejszy całej rośliny [32]. Wpływ ograniczony do korzenia sugeruje tkankowo specyficzną aktywność CycD1. Rys. 2. Fenotyp tytoniu nadprodukującego CycD2 [19]. Roślina dzika (wt) i trzy linie roślin transgenicznych (hem-hemizygoty, homhomozygoty). 48 dzień hodowli (drążek 1metr). 6

7 Cykliny D jak wszystkie cykliny są produkowane w określonym czasie i szybko degradowane - posiadają sekwencje destrukcyjne PEST [90]. Na produkcję cyklin u roślin ma wpływ dostępność cukrów oraz niektóre hormony. Sacharoza i glukoza indukują syntezę mrna cyklin CycD2 i CycD3. Stwierdzono, że po dodaniu do pożywki sacharozy transkrypcja CycD2 wzrasta po 30 minutach, a CycD3 po 4 godzinach [58]. Sugeruje to możliwość istnienia różnych mechanizmów wrażliwości na cukry. Transdukcja sygnału jest wrażliwa na inhibitory fosfataz białkowych oraz nie jest wrażliwa na inhibitory kinaz. Nie wymaga też syntezy białka de novo [95]. Cytokininy - hormony roślinne, stymulują transkrypcję CycD3 [94]. Recepcja i transdukcja sygnału cytokininy odbywa się poprzez tzw. system dwuskładnikowy (His-Asp) [23]. Polega on na wielokrotnym sekwencyjnym transferze grup fosforanowych pomiędzy histydyną a asparaginianem w różnych domenach białek i kolejnymi białkami (Rys. 3) [5]. Rys. 3. Model dwuskładnikowego systemu transdukcji sygnału cytokininy. Opracowano na podstawie [23]. CKI1 jest transbłonowym receptorem o właściwościach kinazy. Związanie cytokininy przez domenę wejściową powoduje dimeryzację CKI1 i aktywację przez autofosforylację histydyny w domenie transmiterowej. Grupa fosforanowa z histydyny jest następnie przenoszona na asparaginian domeny wyjściowej, a stąd na histydynę białka AHP. Ostatnim etapem jest przeniesienie fosforanu na asparaginian białka ARR, którego C-koniec jest aktywatorem transkrypcji [5,23]. Brasinosteroidy - hormony sterydowe biorące udział we wzroście i rozwoju roślin. Stymulują ekspresje CycD3. Stwierdzono, że w kulturach kallusowych i komórkowych Arabidopsis mogą zastępować cytokininy. Na transdukcję sygnału hormonalnego nie wpływają inhibitory kinaz i fosfataz, hamują zaś inhibitory syntezy białka ([62]. Jest to dowód, że brassinosteroidy działają innym szlakiem niż cytokininy i cukry, indukując syntezę białek. 7

8 2.2. KINAZY ZALEŻNE OD CYKLIN Białko retinoblastoma ulega fosforylacji przez cyklinozależne kinazy serynowotreoninowe typ A (Cdk-A, u roślin Cdk2a) [67,87]. Grupa Cdk-A wśród organizmów eukarotycznych jest bardzo jednorodna z homologią sekwencji między 63% a 68%. Zawierają one również charakterystyczny silnie konserwowany motyw PSTAIRE w domenie przyłączającej cyklinę [90]. Kinazy zależne od cykli pełnią funkcje katalityczne w kompleksie z odpowiednimi cyklinami (podjednostki regulatorowe) [90]. Aby kompleks Cdk-A/CycD był aktywny, Cdk-A musi zostać defosforylowane w pozycji treonina 14 i tyrozyna 15 (fosforylacja uniemożliwia przyłączenie ATP kofaktora Cdk - Ramka 2) oraz fosforylowane w pozycji treoniny 160 [74,102]. Jest to element kontroli cyklu komórkowego (Rys. 4). Fosforylacji Tyr 160 dokonują kinazy aktywujące kinazy zależne od cyklin (CAK). Fosforylacja Tyr 15 (białko Wee1) dezaktywuje kompleks Cdk2a/CycD. Ufosforylowanie Tyr 15 następuje w odpowiedzi na stres suszy u pszenicy [99], a wysoki poziom ekspresji Wee1 w bielmie kukurydzy w czasie endoreplikacji sugeruje związek fosforylacji Tyr 15 z endoreplikacją [106]. Konstytutywna ekspresja dominującego negatywnego allelu Cdk2a w tytoniu nie zmieniła wielkości rośliny, odnotowano obecności mniejszej liczby większych komórek. Podobnych obserwacji dokonano u Arabidopsis traktowanej roskowidyną (specyficzny inhibitor Cdk) [104]. Rośliny Arabidopsis z nadekspresją Cdk2a nie mają charakterystycznych fenotypów, niektóre tracą dominację wierzchołkową [29]. Stąd wniosek, że Cdc2a niej jest limitującym czynnikiem cyklu komórkowego. Ramka 1: Dysoxylum binectariferum i Rb Dysoxylum binectariferum rośnie w Indiach. Z kory łodygi tej rośliny wyizolowano alkaloid flawopiridol, który jest inhibitorem Cdk- A. Flawopiridol łączy się z Cdk-A w miejscu wiązania ATP, uniemożliwiając fosforylację Rb, a zatem wyjście z fazy G1 cyklu komórkowego. Flawopiridol jest testowany jako lek przeciwnowotworowy (w fazie klinicznej) [43]. Rys. 4. Model regulacji Cdk2a. Opracowany na podstawie [74,83,102]. Na aktywność Cdk2a wpływa fosforylacja i defosforylacja określonych aminokwasów. Funkcje katalityczne Cdk2a są blokowane przez ICK i inhibitory chemiczne. Ekspresja Cdk2a jest stymulowana przez akusyny [83]. 8

9 2.3. INHIBITORY KINAZ ZALEŻNYCH OD CYKLIN W 1997 roku wyizolowano pierwszy roślinny (Arabidopsis) inhibitor kinazy zależnej od cyklin ICK1. ICK1 wykazuje podobieństwo do ssaczego inhibitora p27 Kip1 (silnie konserwowana jest domena C-końcowa) [114]. ICK jest negatywnym regulatorem cyklu komórkowego [101]. ICK1 oddziałuje bezpośrednio z CycD3 i Cdc2a C-końcową domeną [115]. Związanie ICK1 z Cdk2a i CycD powoduje ich dezaktywację, co w rezultacie redukuje liczbę podziałów komórkowych [101]. Nadekspresja ICK1 u Arabidopsis hamuje wzrost i wywołuje defekty rozwojowe (Rys. 5) [116]. Na ekspresje ICK mają wpływ warunki zewnętrzne np. niska temperatura, kwas abscysynowy [115, 107]. Rys. 5. Arabidopsis z nadekspresją inhibitora ICK1: (a) 4 niezależne linie (prawa strona) i kontrolne dzikie (wt), (b) w fazie kwitnienia [116] 9

10 2.4. BIAŁKO RETINOBLASTOMA Gen retinoblastoma był pierwszym odkrytym genem supresora nowotworów. Wyizolowany za pomocą klonowania pozycyjnego z nowotworu retinoblastoma [73] (Rozdział 3.1.2). Produktem genu jest białko retinoblastoma (w Arabidopsis 112 kda), jądrowa fosfoproteina [80], hamująca transkrypcję genów niezbędnych do przejścia z fazy G1 do fazy S cyklu komórkowego. Regulacja proliferacji z udziałem Rb jest powszechna wśród organizmów, homologii białka Rb występują u zwierząt i roślin, brak ich u grzybów [18] (Rys. 6). Główną funkcją Rb jest wiązanie czynników transkrypcyjnych (dla genów fazy S) z rodziny E2F. Do złożenia fizjologicznego kompleksu Rb/E2F niezbędne i wystarczające są dwie domeny A i B (pocket domain) oraz 20 aminokwasowy odcinek C-końcowy [15], są to regiony silnie konserwowane w homologach Rb [72] (Rys. 6). Rys. 6. Porównanie budowy homologów białka Rb z różnych organizmów. Na podstawie [18]. Najważniejszymi i silnie konserwowanymi elementami strukturalnymi białka Rb są domeny A i B obecne u wszystkich znanych homologów. Pozostałe sekwencje (np. łącznik) i ich długość cechują się znacznie większą zmiennością. Podobieństwa sekwencji pomiędzy zwierzęcymi Rb sięgają 70% w rejonach domen A i B i ok. 30% łączniku [18]. Natomiast podobieństwo zwierzęcych Rb z roślinnymi wynosi 20-35% w domenach [26]. 10

11 W odcinku pomiędzy domenami A i B (tzw. łącznik - Rys. 10) znajduję się kilkanaście miejsc fosforylacji (najważniejsze wydają się być Ser 576 i Ser 780-Rys. 10). Fosforylacji dokonują kinazy zależne od cyklin. Ufosforylowane Rb nie oddziałuje z E2F. Mechanizm utraty powinowactwa Rb do E2F wiąże się z interakcją domen A i B ze sobą. W aktywnym białku Rb (nie fosforylowanym) domeny A i B oddziaływują ze sobą tworząc odpowiednie warunki do wiązania E2F [120]. Fosforylacja likwiduje wzajemne oddziaływania domen A i B, w czym istotną rolę pełni C-koniec Rb (zmiany konformacyjne C-końca wywołują wewnątrz cząsteczkowe interakcje) [16] (Rys. 7). Rys. 7. Schemat zmian w oddziaływaniu domen A i B białka Rb pod wpływem fosforylacji (P) [16]. Kryształ ludzkiego Rb przedstawia domenę A jako strukturę zbudowaną z dziewięciu α-heliksów, z których dwa tworzą rdzeń a pozostałe otaczają go. Domena B zbudowana jest z ośmiu α-heliksów, a jej najważniejszym elementem jest miejsce wiązania dla motywu LxCxE (leucyna-x-cysteina-x-glutaminian, x dowolny aminokwas) [72]. Miejsce wiązania motywu LxCxE jest drugim po domenach A i B miejscem wiążącym białka. Motyw LxCxE jest silnie konserwowany w białkach oddziałujących z Rb (Tabela 1). Tabela 1. Porównanie sekwencji białek oddziałujących z Rb motywem LxCxE. Część górna przedstawia sekwencje białek wirusowych, środkowa sekwencje białek komórkowych wiążących się z Rb, dolna - sekwencje konsensusowe trzech grup cyklin D z Arabidopsis i wspólną sekwencje cyklin D ludzkich, mysich i szczurzych (kropki oznaczają nie konserwowane aminokwasy). Ad E1A P E V I D L T C H E A G F P P S D D HPV 16 E7 P E T T D L Y C Y E Q L N D S E E D SV40 T A N E E N L F C S E E M P S S D D E BK T K W D E D L F C H E D M F A S D E E Polyoma T K W D E D L F C H E D M F A S D E E Yellow Dwarf RepA F T E S D L R C H E D L H N W R E T Wheat Dwarf C1:C2 F P T E S L I C H E T I E S W K N E Rubella NSP90 A A L L G L P C A E D Y R A L R A G BRG1 A E V E R L T C E E E E E K M F G BRM A E V E R L T C E E E E E K I F G R HDAC S D K R I A C E E E F S D S E E CLF D P S Q S L L S L E Q E P L L S R M SUV39H1 F P T E S L I C H E Q L N D R E T G Cyc D1 At S... D L. C. E D S Cyc D2 At. M A E N L A C G E T D Cyc D3 At S.. D A L. C. E E Cyc D mam..... L L C C E

12 Pierwszym odkrytym białkiem interferującym z Rb za pośrednictwem LxCxE był polipeptyd adenowirusa E1A [37]. Najważniejszym partnerem Rb posiadającym motyw LxCxE są cykliny D [35,67]. Motyw LxCxE zawierają m.in. deacetylaza histonowa (HDAC) [76], metylotransferaza histonowa [112], UBF - czynnik transkrypcyjny polimerazy I RNA, enzymy remodelujące chromatynę BRG1 i BRM (składniki ludzkiego kompleksu SWI/SNF) [123] oraz wirusowe białka onkogenne (Rozdział 3.1.2) i białka niektórych wirusów roślinnych. Motyw ten jest obecny w sumie 19 w białkach komórkowych Arabidopsis [113]. Miejsce wiązania motywu LxCxE w Rb odkryto w badaniach kokrystalizacyjnych. Stwierdzono specyficzne oddziaływanie zagłębienia w domenie B białka retinoblastoma z motywem LxCxE. (Rys. 8). Aminokwasy wiążące motyw (Tyr 709, Lys 713, Tyr 756 i Asn 757) są silnie konserwowane w Rb (Rys. 9), a ich mutacja uniemożliwia oddziaływanie białek z motywem LxCxE [24] (Tabela 1). Rys. 8. Oddziaływanie LxCxE z Rb. Model oparty na badaniu białka kokrystalizowanego z peptydem LxCxE [24]. Rys. 9. Stopień konserwacji miejsca wiązania motywu LxCxE w domenie B białka Rb [41]. Uszkodzenia w miejscu wiążącym LxCxE nie wpływają na łączenie się E2F i Rb, przeciwnie uniemożliwia uwolnienie E2F z kompleksu Rb/E2F (uszkodzenie miejsca oddziałującego z Cdk). Cykl komórkowy u mutantów z uszkodzeniem wiązania LxCxE zostaje zatrzymany w fazie G1 [31]. 12

13 Rys. 10. Modele cząsteczki Rb i fragmentów oddziałujących białek. Zaznaczono najważniejsze miejsca fosforylacji przez Cdk Ser 567 i Ser 780. A-[72], B.C-[PDB id: 1gux] A B C 2.5. BIAŁKA E2F i DP Funkcja Rb jest uwarunkowana współdziałaniem z heterodimerem E2F/DP [118]. E2F jest czynnikiem transkrypcyjny łączącym się z DNA w miejscu konsensusowym TTTCGCGC. Białko DP stabilizuje wiązanie E2F z DNA. Geny zawierające w promotorach miejsca wiązania E2F/DP kodują białka niezbędne w fazie S cyklu komórkowego np. enzymy syntetyzujące dntp (reduktaza rybonukleotydowa [11], reduktaza dihydrofolianowa, syntetaza tymidylanowa) [4], białka zaangażowane w replikację DNA (np. polimeraza α [109]), białka tworzące kompleks prereplikacyjny (HsCdc6, MCM) [6]. E2F i DP strukturalnie należą do białek z grupy winged helix, zawierających motyw wiązania do DNA helisa-pętla-helisa. Bezpośrednio zaangażowaną jest sekwencja RRxYN (silnie konserwowana) oddziałująca przez dużą bruzdę DNA (Rys. 11) z palindromową sekwencją GCGCGC w miejscu konsesusowym dla E2F [42]. E2F/DP aktywuje transkrypcję poprzez bezpośrednią interakcje (C-koniec E2F tzw. domena transaktywująca) z podstawowymi czynnikami transkrypcyjnymi TBP i TFIIH tworząc kompleks preinicjacyjny i transkrypcyjny. Ponadto E2F pośredniczy składaniu kompleksu TFIID/TFIIA. E2F ma również zdolność zginania DNA co pozytywnie wpływa na rozpoznanie promotora i aktywację genu [6]. Rb wiążąc się do E2F maskuje domenę 13

14 transaktywującą znosząc pozytywną regulację transkrypcji [61]. Utworzenie kompleksu Rb/E2F/DP uniemożliwia również zaginanie DNA, co także wpływa hamująco na inicjację transkrypcji [6]. Rys. 11. Model oddziaływania heterodimeru E2F/DP z cząsteczką DNA (E2F kolor fioletowy DP czerwony) [PDB id: 1cf7] Niektóre homologi E2F powodują represję transkrypcji. Mechanizm nie jest dobrze poznany. Prawdopodobnie E2F jest fosforylowany przez kompleks Cdk/Cyc [28]. E2F i DP tworzą rodzinę białek silnie konserwowanych ewolucyjnie. Homologii białek E2F i DP występują u wszystkich organizmów, w których funkcjonuje szlak regulacji z udziałem Rb (Rys. 12, Rys. 13). W 1999 roku zidentyfikowano gen E2F w tytoniu [100] i wyizolowano białko E2F z pszenicy [92]. Obecnie wiemy o sześciu białkach E2F u Arabidopsis [81]. W roku 2000 potwierdzono obecność białka DP (dwa homologi) i heterodimeru E2F-DP u pszenicy [91], marchwi [3] i Arabidopsis.[79]. Białka należące do grupy E2F zawierają charakterystyczne regiony wiązania DNA, Rb (z domeną transaktywującą) i DP, oraz sekwencje NLS. Unikalną cechą E2Fd, E2Fe i E2Ff z Arabidopsis jest brak domeny dimeryzacyjnej i duplikacja domeny wiążącej DNA (Rys. 14), co pozwala na łączenie się tych białek w formie monomerycznej z sekwencją konsensusową DNA [70]. Nie wywołuje to jednak aktywacji transkrypcji [81]. Nie wiadomo, jaką funkcje pełnią w komórkach Arabidopsis. 14

15 Rys. 12. Drzewo filogenetyczne białek E2F (wykonanie Rozdział 5. Materiały i metody). Skala 0,1 reprezentuje 10% różnice w sekwencji aminokwasowej. E2Ff, E2Fd, E2Fe z Arabidopsis i E2F innych roślin oraz E2F1-3 człowieka mają podobną organizację domen i wykazują duże podobieństwo sekwencji. Pozostałe E2F Arabidopsis są unikalne tworzą oddzielną gałąź (Rys. 14). Rys. 13. Drzewo filogenetyczne białek DP (wykonanie Rozdział 5. Materiały i metody). Skala 0,1 reprezentuje 10% różnice w sekwencji aminokwasowej. Drzewo filogenetyczne wskazuje istnienie zwierzęcych subrodzin DP1 i DP2. Przyrównanie (nie zamieszczono) wskazuje bliższą relację DPa (Arabidopsis) z DP2 niż DP1 (zwierzęcych), a także bliskość homologów DPb (Arabidopsis) i DP1 (zwierząt). Drzewo filogenetyczne nie grupuje jednak białek DP Arabidopsis z subrodzinami zwierzęcych DP1 i DP2 formując oddzielną gałąź. Podobieństwo pomiędzy białkami DP Arabidopsis (ok. 35%) jest dużo mniejsze niż pomiędzy DP zwierząt (ok. 70%). Nadekspresja E2Fa i DPa w Arabidopsis indukuje w dojrzałych (wyróżnicowanych) komórkach liści wejście w fazę S [96]. Nadeksprymowany E2Fa w Arabidopsis podnosi ekspresje genów fazy S i indukuje podziały komórkowe w koleoptylu i hipokotylu. Komórki rośliny są mniejsze, częsta staje się endoreplikacja [27]. Natomiast E2Fc wywołuje odwrotny efekt. Jest represorem transkrypcji i redukuje częstość podziałów, powoduje wzrost objętościowy komórek [53]. 15

16 Rys. 14. Schemat sekwencji i charakterystycznych regionów białek E2F i DP u Arabidopsis Opracowano na podstawie [81]. U myszy również scharakteryzowano sześć homologów. Myszy z wyłączeniami poszczególnych genów E2F wykazują różne defekty, co sugeruje odmienne role lub (i) specyficzność tkankową homologów E2F [105] (Tabela 2). Tabela 2. Charakterystyka białek E2F i DP myszy [6,105,122]. Białko Ekspresja Domeny wiążące Indukcja Supresja Myszy z wyłączeniem Indukcja NLS genów nowotworótność Żywo- DNA Rb DP apoptozy Fenotyp fazy S E2F1 G1/S Nowotwory E2F2 G1/S Defekty immunologiczne E2F3 G1/S Red. ekspresji genów fazy S E2F4 konstyt Defekty rozwojowe E2F5 konstyt Wodogłowie E2F6 konstyt ?? DP1 konstyt. + - E2F ?? DP2 konstyt. + - E2F + + -??? 16

17 2.6. BIAŁKO RETINOBLASTOMA ZMIENIA STRUKTURĘ CHROMATYNY Chromatyna wywiera represyjny wpływ na proces transkrypcji. W ewolucji doszło do wykształcenia wyspecjalizowanych białek i kompleksów białkowych, zdolnych do przebudowy struktur chromatynowych. Stwierdzono, że niektóre mają zdolności do oddziaływania z Rb Acetylacja Acetylacja neutralizuje pozytywny ładunek nadawany histonom przez lizyny, destabilizując strukturę nukleosomową (zwiększając dostępność DNA dla białek transkrypcyjnych). Deacetylacja działa przeciwnie (hamuje transkrypcję). Białko Rb tworzące kompleks z heterodimerem E2F/DP wiąże deacetylazę histonową (HDAC) (Rys. 15), poprzez motyw LxCxE (Tabela 1) [8]. Jest to mechanizm hamowania transkrypcji przez Rb uzupełniający rolę E2F-DP (maskowanie promotora). Rys. 15. W hamowaniu transkrypcji niezbędnych w fazie S genów przez Rb, bierze udział deacetylaza i metylaza histonów. Uniemożliwienie wiązania HDAC do Rb skutkuje dziewięciokrotnym wzrostem transkrypcji w komórkach Jurkat (usunięcie Rb powoduje ponad 30-krotny wzrost transkrypcji) [78]. Deacetylaza pozostaje w kontakcie fizycznym z Rb i dlatego deacetylacja obejmuje tylko jeden nukleosom [85]. Nie we wszystkich promotorach genów regulowanych przez kompleks Rb/E2F/DP obserwowana jest deacetylacja [76]. Stąd wniosek, że mechanizmy represji są redundantne Fosforylacja Struktura chromatyny jest zmieniona w komórkach mysich fibroblastów Rb i Rb -/-. Chromatyna w komórkach Rb -/- jest bardziej narażona na trawienie nukleazą Micrococcus, czyli ma luźniejszą strukturę. Koreluje to m.in. z wyższą fosforylacją histonów H1 17

18 stwierdzoną w fibroblastach Rb -/- [59]. Nie wiadomo jednak, jaką rolę w tym zjawisku odgrywa białko Rb Metylacja Kolejnym mechanizmem, indukowanej przez Rb inhibicji transkrypcji jest metylcja histonu H3 przez metylazę Suv39H1. Metylaza łączy się z Rb za pomocą motywu LxCxE (Tabela 1). Powstały kompleks Suv39H1/Rb/E2F/DP, w komórkach U20S i HEK-293, metyluje lizynę 9 (K9) histonu H3 w nukleosomie wcześniej deacetylowanym (m.in. w K9) (Rys. 15) [89,112] Kompleksy remodelujące chromatynę Niewiele wiadomo o współdziałaniu Rb z kompleksami remodelującymi chromatynę. Obecna wiedza jest bardzo wycinkowa i niespójna. Metylacja K9 histonu H3 indukuje przyłączenie białek heterochromatynowych z rodziny HP1. Białko HP1 zawiera motyw LxCxE wiążący do Rb [119] i chromodomenę, charakterystyczny motyw występujący w dużej rodzinie białek Polycomb związanych z regulacją genów i organizacją chromatyny. CLF jest roślinnym białkiem należącym do grupy Polycomb. Zawiera motyw LxCxE (Tabela 2), a jego oddziaływanie z Rb wykazano w teście dwuhybrydowym [119]. CLF jest niezbędne do regulacji genów homeotycznych zaangażowanych w proces kwitnienia [45]. Prawdopodobnie działanie roślinnych białek z grupy polycomb związane jest z wygaszaniem ekspresji genów, przez tworzenie represywnych transkrypcyjnie struktur chromatynowych [25] (Rys. 16). Do Rb wiążą się białka BRG1 i Brm (przez motyw LxCxE -Tabela 2). Białka te należą do głównych komponentów kompleksu remodelującego chromatynę SWI/SNF. Kompleks Rb/E2F/DP/SWI/SNF hamuje transkrypcje uniemożliwiając przejście do fazy S [123]. Nadekspresja BRG1 i Brm objawia się powolnym wzrostem komórek podczas, gdy BRG1 i Brm -/- są niezdolne do zatrzymania się w fazie G1 [55,57]. 18

19 Rys. 16. Retinoblastoma jest pomostem do tworzenia heterochromatyny [119]. 19

20 3. FIZJOLOGIA SZLAKU KONTROLI CYKLU KOMÓRKOWEGO Z UDZIAŁEM BIAŁKA RETINOBLASTOMA Retinoblastoma stanowi rodzinę białek podobnych strukturalnie i funkcjonalnie. Homologi białka Rb występują u zwierząt i roślin odkryto je także u jednokomórkowych glonów Chlamydomonas. Nie odkryto komponentów szlaku Rb u grzybów w tym drożdży. Najlepiej poznano rolę Rb u zwierząt ZWIERZĘTA Rola Rb w regulacji cyklu komórkowego Większość komórek dorosłego organizmu wielokomórkowego ulega regularnym podziałom. Wielokrotnie powtarzające się cykle komórkowe są ściśle kontrolowane. Białko retinoblastoma kontroluje cykl komórkowy w najważniejszym etapie przejścia ze stanu G1 do fazy S. Rb za pośrednictwem E2F/DP hamuje transkrypcję genów związanych z przejściem do fazy S [61]. Uwolnienie E2F i tym samym umożliwienie przejścia do fazy S, następuje po fosforylacji Rb [44] przez kinazy zależne od cyklin (u zwierząt Cdk4) będące w kompleksie z cyklinami D. [35]. (Rys. 17). Ramka 2: Rb i Fe Jon żelaza jest niezbędny do życia, jego brak powoduje zatrzymanie podziałów komórkowych i wzmożenie apoptozy. Stwierdzono, że Fe powoduje hipofosforylację Rb (prawdopodobnie przez obniżenie ekspresji cyklin). Powstrzymanie fosforylacji Rb powoduje zatrzymanie komórki w fazie G1. Istotne dla onkologii wydaje się poznanie chelatorów jonu żelaza [125]. Rys. 17. Schemat mechanizmu funkcjonowania szlaku kontroli przejścia faz G1 do S z udziałem białka Rb 20

21 Zapoczątkowanie proliferacji jest pod kontrolą szeregu czynników zewnątrz- (np. czynniki wzrostu), jak i wewnątrzkomórkowych (np. specyficzne inhibitory) Rola Rb w onkogenezie Patologia cyklu komórkowego odgrywa główną rolę w inicjacji i progresji nowotworu, a przez wielu autorów choroba nowotworowa jest uważana za chorobę wynikającą z zaburzonego cyklu komórkowego. Proces onkogenezy najczęściej związany jest z uszkodzeniem punktu restrykcyjnego G1/S cyklu komórkowego. Uszkodzenie białka Rb całkowicie eliminuje ten ważny punkt kontrolny [77,97] i jest bardzo częste w nowotworach człowieka. Samo odkrycie białka Rb jest efektem badań nad przyczynami rzadkiego nowotworu oka u dzieci nazwanego retinoblastoma (siatkówczak złośliwy). W tym schorzeniu, dotykającym 1 na dzieci, obserwuje się utratę lub nieprawidłowe funkcjonowanie białka Rb. Nowotwór rozwija się w macierzystych komórkach nerwowych siatkówki [54,69]. Wiadomo, że defekty w funkcjonowaniu białka Rb są przyczyną również innych nowotworów człowieka (ponad 30-krotny wzrost u heterozygot) jak kostniakomięsak, drobnokomórkowy rak płuca, rakowiak [57,22]. Najczęściej spotykanymi zmianami dotyczącymi Rb są mutacje inaktywujące [31] i zmiany metylacji promotora genu Rb oraz zahamowanie aktywności białka Rb poprzez interakcję z onkoproteinami wirusowymi (białko E7 wirusa HPV [72], antygen T wirusa SV40, onkoproteina E1B-55K adenowirusa) Z punktu widzenia procesów nowotworowych istotny jest związek Rb z angiogenezą. Prawidłowe unaczynnienie jest warunkiem sine qua non formowania się guza nowotworowego i inwazyjności zmian nowotworowych (zdolności do tworzenia przerzutów). Waskularyzację stymuluje śródbłonkowy czynnik wzrostu naczyń krwionośnych (VEGF). Stwierdzono, że myszy z wyciszoną ekspresją Rb mają obniżoną ekspresję VEGF, zahamowaną angiogenezę i onkogenezę [17]. Ramka 3. Zielona herbata i Rb Badania epidemiologiczne wskazują, że picie zielonej herbaty obniża częstość pojawiania się niektórych rodzajów nowotworów. Efekt ochrony wywołują polifenole głównie epigalokatechino-3- galusan (EGCG). Ciekawy wydaje się efekt molekularny działania EGCG. Badając nowotworowe komórki A431 stwierdzono, że EGCG obniża fosforylację seryny 780 w Rb (Rys. 10), co zwiększa powinowactwo do E2F/DP i hamuje przejście do fazy S cyklu komórkowego. Nie znamy mechanizmu działania EGCG, ale zauważono wzrost aktywności inhibitorów CKI (rozdział 2.4.3) i obniżenie ekspresji E2F i DP (onkogeny). Zaobserwowano także wzrost częstości apoptozy (prawdopodobnie pośredni efekt utrzymywania komórki w fazie G0/G1) [2]. 21

22 Rola Rb w różnicowaniu komórek Białko retinoblastoma u zwierząt pełni rolę w procesach różnicowania takich jak myogeneza [49], adipogeneza [13], angiogeneza (rozdział 3.1.2) [17], hematopoeza i neurogeneza [60,77]. Rb pełni rolę w różnicowaniu przez oddzaiływanie z tkankowo specyficznym czynnikami transkrypcyjnymi (poza E2F, np. MyoD [49], NF-Il6 [14], C/EBP [13]). Różne są mechanizmy działania kompleksów białka Rb z czynnikami transkrypcyjnymi. Na przykład podczas różnicowania się komórek mięśniowych Rb formuje kompleks z miogennym czynnikiem transkrypcyjnymi MyoD aktywując geny mięśniowo specyficzne (linie komórkowe Rb -/-, które nie są zdolne do wyróżnicowania w komórki mięśniowe) [49]. Dowodem roli Rb w różnicowaniu jest efekt mutacji unieczynniającej Rb u myszy. Objawia się on śmiercią mysich zarodków pomiędzy 14 a 15 dniem ciąży, której bezpośrednią przyczyną jest obumieranie neuronów w centralnym układzie nerwowym i defektywna erytropoeza [65] Rola Rb w apoptozie Białko retinoblastoma pełni rolę czynnika antyapoptotycznego. Potwierdzeniem tego jest fakt cięcia Rb przez kaspazy podczas apoptozy. Udowodniono także odporność na indukowaną apoptozę u myszy eksprymujących Rb odporne na cięcie przez kaspazy [12]. Stwierdzono, że utrata funkcji Rb uruchamia szlak apoptozy poprzez białko p53. Eliminuje to komórki z rozregulowanym systemem kontroli proliferacji. Istnienie tego zabezpieczenia potwierdza fakt częstej inaktywacji p53 w komórkach nowotworowych z uszkodzonym Rb [56]. Z przeprowadzonych badań na myszach z wyłączonym genem Rb wynika, że nowotwór rozwijający się w splocie naczyniówki oka tworzy się powoli, bo duża część komórek obumiera. Natomiast u myszy z wyłączonymi genami Rb i p53 obserwuje się gwałtowny wzrost zmian nowotworowych i niski poziom apoptozy [84]. Prawdopodobnie utrata Rb uwalnia E2F, który może Ramka 4: Rb i promieniowanie γ Promieniowanie γ indukuje w komórkach apoptozę. Odkryto, że linia komórkowa nowotworu prostaty DU-145, z uszkodzonym Rb, jest odporna na apoptozę indukowaną promieniowaniem jonizujący. Co więcej przywrócenie prawidłowego Rb powoduje uwrażliwienie na promieniowanie γ. Natomiast funkcjonalne Rb chroni przed apoptozą indukowaną promieniowaniem UV. Sugeruje to możliwość istnienia różnych szlaków apoptozy związanych z Rb. Pośrednictwo Rb w apoptozie może wynikać ze specyficzności uszkodzeń powodowanych przez promieniowanie γ (podwójne pęknięcia DNA) i UV (dimeryzacja tyminy u DNA) [124]. Rozwój tych badań może mieć istotne znaczenie w poznaniu przyczyn odporności niektórych nowotworów na radioterapię. 22

23 uruchomić szlak apoptozy aktywując ARF p19 i inne proapoptotyczne białka. Hipotezę taką oparto m.in. na doświadczeniach: z wyłączeniem Rb u myszy (obumieranie embrionów) [65] oraz wyłączeniem E2F (znaczące obniżenie poziomu apoptozy) [122] (Rys. 18) Rys. 18. Funkcje Rb w komórce zwierzęcej (opracowano na podstawie [105,50,77]). Znak oznacza przejście do następnego etapu, znak oznacza hamowanie procesu Rola Rb w kontrolowaniu długości telomerów Poznanie molekularnych mechanizmów śmiertelności komórek stało się bliższe wraz z odkryciem roli telomerazy. W komórkach, w których brak telomerazy dochodzi do skracania telomerów z każdą kolejną rundą replikacji. Doprowadza to do utraty ochrony jaką dają chromosomom telomerowe odcinki DNA. Stwierdzono, że brak Rb powoduje nieśmiertelność komórek [43]. Jednak barierą do uzyskania nieśmiertelności jest rozwiązanie problemu telomerów. Niedawno odkryto związek Rb z mechanizmem regulacji długości odcinków telomerowych DNA. W komórkach mysich fibroblastów z wyłączonymi genami Rb zauważono znaczące wydłużenie telomerów nie związane z podwyższeniem aktywności telomerazy. Nie znamy jednak molekularnej roli Rb w nowo odkrytym mechanizmie kontroli długości telomerów. Wydaje się on kluczowy w zjawiskach nieśmiertelności komórek nowotworowych. Tłumaczy również sens inaktywacji Rb przez wirusowe białka onkogenne. 23

24 3.2. CHLAMYDOMONAS Homolog białka retinoblastoma (Mat3) został odnaleziony w jednokomórkowych fotosyntetuzujących Chlamydomonas reinhardtii [111]. Należą one do klasy zielenic właściwych, rząd zawłotniowców, których cykl komórkowy odbywa się według mechanizmu wielokrotnych podziałów [108]. Wegetatywna komórka Chlamydomonas (haploidalna) wchodzi w przedłużoną fazę G1, w trakcie której wielokrotnie się powiększa. Następnie szybko przechodzi kilka rund faz S i mitozy. W efekcie powstają komórki potomne o stałej wielkości. Mutacje w genie Mat3 powodują powstanie większej liczby mniejszych komórek (Rys. 19). Mutacja w homologu Rb u Chlamydomonas wywołuje inne efekty niż u zwierząt - nie skraca fazy G1, ani nie wprowadza komórki stale w fazę S. Utrata funkcjonalnego Mat3 upośledza zależną od wielkości komórki regulację liczby i czasu podziału (Tabela 3). Jest, więc zależnym od wielkości represorem cyklu komórkowego, prawdopodobnie hamuje przejście fazy G1 do S (czas rozpoczęcia podziału zależny do wielkości) i fazy S do mitozy (liczba podziałów zależna od wielkości) [21,111]. (a) (b) Rys. 19. Komórki Chlamydomonas (a) typ dziki (wt) i (b) mutanty Mat3 -/- Tabela 3. Charakterystyka cyklu komórkowego i wielkości komórek Chlamydomonas typ dziki (wt) i mutanta w genie. Śr. wielkość komórki potomnej µm 3 Śr. liczba podziałów komórki macierzystej Min. wielkość dzielącej się kom. macierzystej µm 3 Czas podwojenia masy [h] Wt 113 1, ,5 Mat3 -/- 23 2, ,8 24

25 3.3. ROŚLINY Pierwszą przesłanką wskazującą na istnienie u roślin szlaku związanego z Rb było wyizolowanie trzech różnych cyklin typu D [102] wykazujących podobieństwo do zwierzęcych cyklin D regulujących kinazy Cdk w szlaku Rb. Poparciem dla istnienia szlaku było pokazanie oddziaływania łączenia się niektórych białek roślinnych wirusów z ludzkim Rb [121]. Homolog ludzkiego białka retinoblastoma został w 1998 roku odkryty w kukurydzy [48]. Obecność homologów Rb stwierdzono u: tytoniu [87], Arabidopsis [51], Chenopodium rubrum [41] i grochu [103]. Rozpoczęto poszukiwania szlaku kontroli, z udziałem Rb, podobnego do zwierzęcego. W 1999 sklonowano E2F z pszenicy [92], który wykazywał duże podobieństwo do ludzkiej rodziny czynników E2F. W 2000 roku odkryto dwa geny kodujące korepresor DPa i DPb w Arabidopsis [79] Rola Rb w cyklu komórkowym roślin Ogólny mechanizm funkcjonowania szlaku kontroli cyklu komórkowego z udziałem Rb u roślin jest podobny do zwierzęcego (Rys. 20). Rys. 20. Schemat funkcjonowania szlaku kontroli przejścia faz G1 do S z udziałem Rb 25

26 Aberracje cyklu komórkowego roślin U roślin nie ma naturalnie występujących mutacji Rb i nie ma związku Rb z nowotworzeniem. Geminiwirusy to roślinne wirusy DNA o małym genomie kodująym białka uszkadzające szlak Rb [52]. Do tej grupy wirusów należą Mastrewirusy eksprymujące w komórkach gospodarza białko RepA, które łączy się z Rb (za pośrednictwem motywu LxCxE [121]). Obecność RepA stymuluje wzrost kallusa kukurydzy i podziały komórek BY-2 [46]. Podobnie funkcjonują Begomowirusy i Cutovirusy, przy czym w ich białkach nie ma motywu LxCxE i wiążą się z Rb za pomocą innych regionów [52] Rola Rb w fotomorfogenezie W Arabidopsis występuje sześć homologów E2F (Rozdział 2.5). Rb działa na heterodimer E2Fa/DP uniemożliwiając mu aktywację genów fazy S. Natomiast E2Fc/DP sam i (lub) w kompleksie z Rb powoduje hamowanie podziałów, poprzez obniżenie wyrażania niektórych niezbędnych genów. Stwierdzono jednak, że E2Fc jest usuwane przez kompleks ubikwitynujący SCF SKP2, stymulowany z kolei przez światło. Wysunięto hipotezę o roli Rb i E2Fc w przejściu od skotomorfogenezy do fotomorfogenezy [28] (Rys. 24). Rys. 21. Hipoteza roli E2Fc/DP i E2Fa/DP w szlaku kontroli cyklu komórkowego Rb. 26

27 4. CEL PRACY Identyfikacja i klonowanie sekwencji kodującej genu Rb z Arabidopsis thaliana. 27

28 5. MATERIAŁY I METODY 5.1. Hodowla bakterii Używano szczepu Escherichia coli XL1 Blue (Stratagene) reca1 enda1 gyra46 thi hsdr17 supe44 rela1 lac F`[proAB laci q ΔlacZ M15::Tn10 (Tet r )]. Bakterie hodowano przez noc w temperaturze 37 C na pożywce stałej lub płynnej. Hodowle płynne prowadzono z intensywnym mieszaniem (150 obr./min). Stosowano pożywkę LB (Luria Bertani: 1% bakto-trypton, 1% NaCl, 0,5% wyciąg drożdżowy, ph 7,2). Pożywki stałe LB zestalono baktoagarem (1%). Antybiotyk selekcyjny: ampicylina (Sigma) stosowano w stężeniu100 µg/ml. Do selekcji stosowano także IPTG (100mM) i X-gal (20mg/ml) [98] Materiał roślinny Arabidopsis thaliana L. Heynh. Ekotyp Columbia (Lehle Seeds), hodowla w koreczkach torfowych (Agrowit), w komorze fitotronowej w temperaturze C przy fotoperiodzie 16/8 godzin dzień/noc Synteza cdna RNA izolowano z liści Arabidopsis zestawem RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen) zgodnie z zaleceniami producenta. Syntezę cdna przeprowadzono zestawem Superscript First Stand Synthesis System (Invitrogen) według instrukcji producenta PCR W celu sklonowania fragmentu mrna genu Rb (At3g12280), amplifikowano wybrany fragment metodą łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR). Skonstruowano startery oskrzydlające powielaną sekwencje (od 278bp do 1288bp mrna EMBL: AF245395) i posiadające miejsca rozpoznawane przez wybrane enzymy restrykcyjne. Produkty PCR rozdzielano w żelu agarozowym. KpnI SpeI AscI PstI Sekwencja komplementarna do cdna F 5`AT GGTACC ACTAGT GGCGCGCC CTGCAG GTTCCATAGATGCATGCTTGCTTGCTCA BamH1 SwaI PstI Sekwencja komplementarna do cdna R 5`AT GGATCC ATTTAAAT CTGCAG GGTCGTTTCTTACAGGACCTAGCTCCA 28

29 Starter R F Pozycja w mrna Rb Temp. topnienia Zawartość % GC Etap Czas Temperatura Denaturacja wstępna 4 m 94 C Denaturacja 5 sek 94 C Przyłączenie 30 sek 65 C Synteza 1 m 20 sek 72 C Synteza końcowa 4 m 72 C Zakończenie reakcji 4 C 30x 5.5. Rekombinacja DNA Plazmid pbluescript SK+ i produkt PCR trawiono enzymami restrykcyjnymi BamHI i KpnI (Invitrogen) według zaleceń producenta. DNA rozdzielano w 1% żelu agarozowym z dodatkiem bromku etydyny (0,5 µg/ml) Wielkość prążków oceniano względem markera wielkości 1kb+ Ladder (Invitrogen). DNA izolowano z żelu przy pomocy zestawu QIAquick (Qiagen) zgodnie z zaleceniami producenta. Ligację DNA prowadzono w obecności 0,5U ligazy T4 (Invitrogen) przez 60 minut w 26 C. Reakcje prowadzono w objętości 20 µl przy proporcji stężeń molarnych wstawki do plazmidu 3:1. Otrzymaną mieszaniną ligacyjną transformowano bakterie Przygotowanie bakterii elektrokompetentnych i transformacja Bakterie E.coli XL-1 Blue zaszczepiono do 5 ml pożywki LB i hodowano przez noc w 37 C (hodowla wstępna). 0,5 ml nocnej hodowli przenoszono do 500 ml czystej pożywki LB i hodowano w 23 C aż do osiągnięcia przez bakterie gęstości optycznej OD 600 0,5. Następnie hodowle schładzano w lodzie i wirowano (5000 obr./min) przez 5 min w temp. 4ºC. Po dokładnym odsączeniu bakterii od pożywki, dwukrotnie zawieszano je w 500 ml sterylnej wody i wirowano jak wyżej. Otrzymane bakterie zawieszano w 10% glicerolu i przechowywano w temp. 80ºC. Testowano wydajność transformacji (10 7 /1µgDNA) Bakterie transformowano przez elektroporację (Multiporator firmy Eppendorf). Mieszaninę do elektroporacji, czyli preparat DNA, 40 µl bakterii i sterylną wodę do objętości 150 µl, umieszczono w schłodzonej kuwecie elektroporacyjnej (średnica szczeliny 1mm). Przeprowadzono elektroporację przy napięciu 2,5 kv, przez kilka milisekund. Następnie do mieszaniny dodano 700 µl pożywki LB i inkubowano w 37 C przez 40 min w celu wyrażenia genu oporności na antybiotyk, po czym odpłukiwano pożywkę, a bakterie wysiewano na szalki z ampicyliną. 29

30 5.7. Izolacja plazmidowego DNA bakterii Metodą lizy alkalicznej (miniprep) Zwirowywano 3 ml nocnej hodowli bakterii. Osad zawieszano w 100 µl buforu I (50mM glukoza, 10mM EDTA, 25 mm Tris-HCl, ph 8,0), dodawano 5 µl Rnazy (10 µg/ml) i inkubowano przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Następnie dodawano 200 µl świeżo przygotowanego roztworu do lizy alkalicznej (0,2 M NaOH, 1% SDS), próbki mieszano delikatnie i pozostawiano w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Po tym czasie dodawano 150 µl zimnego roztworu neutralizującego (7,5 M octan amonu), silnie wstrząsano i inkubowano w lodzie 10 minut. Następnie próbki wirowano przez 15 minut w mikrowirówce. Zbierano supernatant i dodawano 900 µl zimnego 96% etanolu i inkubowano 20 minut w -20 C. Preparat wirowano przez 15 minut. Powstały osad przemywano 70% etanolem i suszono przez 5 minut w wirówce próżniowej SpeedVac (Savant). Osad czyli plazmidowe DNA zawieszano w TE (10mM Tris-HCl ph 8,0, 1mM EDTA) lub wodzie Zestaw do izolacji plazmidowego DNA Preparat DNA plazmidowego przeznaczony do sekwencjonowania oczyszczano zestawem do izolacji plazmidów Wizard Plus SV Minipreps (Promega) 5.8. Sekwencjonowanie DNA Sekwencjonowanie DNA wykonane w Pracowni Sekwencjonowania i Syntezy Oligonukleotydów IBB, PAN. Użyto standardowych starterów do sekwencjonowania T7, M Techniki komputerowe Analizę filogenetyczną wykonano programami z pakietu PHILIP ( Dystanse między sekwencjami obliczono algorytmem PAM matrix, drzewo obliczono algorytmem UPGMA. Porównanie sekwencji wykonano programem ClustalX []. Sekwencje przeszukiwano programem Blast ( Startery zaprojektowano programen GeneFisher Wyniki sekwencjonowania (chromatogram) odczytywano w programie Chromas Modele cząsteczek wizualizowano w programie Swiss-pdbViewer 30

31 6. WYNIKI 6.1. IDENTYFIKACJA WSZYSTKICH GENÓW Rb W GENOMIE ARABIDOPSIS Bazę sekwencji genomowych przeszukiwano programem Blastp względem podobieństwa do sekwencji białka retinoblastoma. Spośród znalezionych sekwencji usunięto powtarzające się i przeprowadzono analizę filogenetyczną. Porównanie sekwencji wykonano programem ClustalX. Analizę filogenetyczną wykonano programami z pakietu PHYLIP. W bazie danych sekwencji Arabidopsis znaleziono niewiele białek wykazujących, chociaż częściowe podobieństwo do Rb. W analizie filogenetycznej sekwencja białka retinoblastoma (gen: AT3G12280) nie wykazywała powiązania filogenetycznego pozostałymi. Oznacza to, że w genomie Arabidopsis istnieje jeden gen kodujący Rb. Rys. 22. Identyfikacja wszystkich wariantów genu Rb w Arabidopsis CHARAKTERYSTYKA FILOGENETYCZNA Rb Homologi białka retionblastoma wykazują podobieństwo funkcjonalne oraz podobieństwo budowy domenowej. Z przeprowadzonej analizy filogenetycznej wynika, że rodzina białek Rb jest mocno konserwowana ewolucyjnie. Mat3 homolog z Chlamydomonas tworzy oddzielną gałąź ewolucji Rb. Szlak kontroli Mat3 funkcjonuje odmiennie od pozostałych białek Rb (patrz 3.2.), co tłumaczy mniej konserwowaną sekwencje. Wszystkie białka Rb mają jednak wspólną budowę domen A i B (Rys. 6) i silnie konserwowane regiony wiążące oddziaływujące z nim białka. 31

32 Rys. 23. Drzewo filogenetyczne białek Rb (wykonanie Rozdział 5. Materiały i metody). Liczby wskazują długości gałęzi, czyli różnice w sekwencji aminokwasowej, liczby w nawiasach przy rozgałęzieniach oznaczają wartości boostrap KLONOWANIE Rb Z ARABIDOPSIS Na matrycy cdna uzyskanego z Arabidopsis thaliana zamplifikowano metodą PCR fragment (1kb) sekwencji kodującej Rb. Rys. 24. Obraz rozdziału elektroforetycznego produktów reakcji PCR z matrycą cdna (1) i kontrolnie bez matrycy (K). M marker wielkości. 32

33 Zamplifikowany fragment cdna wstawiono do plazmidu pbluescript przy użyciu enzymów restrykcyjnych KpnI i BamHI. Otrzymano klon fragmentu genu Rb (Rys. 25). W celu potwierdzenia pochodzenia wstawki plazmid sekwencjonowano (Rys. 26). Rys. 25. Obraz rozdziału elektroforetycznego: (1) plazmid z klonem Rb trawiony KpnI i BamHI, (2) plazmid z klonem Rb nie trawiony, (3) pusty plazmid, (M) marker wielkości Rys. 26. Strona wynikowa programu BLAST, w którym sprawdzono wynik sekwencjonowania. Uzyskano potwierdzenie sklonowania fragmentu cdna Rb Arabidopsis. Sekwencjonowanie wykazało, że osiągnięto zamierzony cel. Sklonowano fragment cdna genu Rb z Arabidopsis. 33

34 7. DYSKUSJA Jak dowiedziono rola szlaku kontroli cyklu komórkowego z udziałem białka retinoblastoma jest istotna we wzroście i różnicowaniu komórek zwierzęcych i roślinnych. Funkcjonowanie tego mechanizmu jest jednak dużo słabiej poznane u roślin. Z przeprowadzonej analizy filogenetycznej wynika bliskie pokrewieństwo podstawowych białek szlaku regulacji z udziałem Rb wśród organizmów je posiadających. Zyskuje to potwierdzenie w danych eksperymentalnych dowodzących oddziaływania homologów łączących się białek z różnych organizmów [92]. Identyfikacja jedynego genu Rb w Arabidopsis dokonana w tej pracy wydaje się być prawidłowa. Niedawno ukazała się publikacja, w której dokonano identyfikacji wszystkich genów kontrolujących cykl komórkowy u Arabidopsis, również Rb [113]. Rezultaty dowodzą istnienia pojedynczego genu kodującego Rb, co potwierdza prawidłowość wyniku uzyskanego, w niniejszej pracy. Sklonowany fragmentu genu Rb z Arabidopsis posłuży w dalszych etapach doświadczenia do wyciszenia ekspresji białka Rb metodą dsrna. Wyłączenie Rb u zwierząt powoduje zmiany nowotworowe. Warto w tym miejscu zadać pytanie, dlaczego rośliny nie chorują na raka? Nadmiarowe komórki są bardzo groźne dla zwierząt - mogą powodować nowotwory. Jak dowiedziono, proces onkogenezy najczęściej związany jest z mutacją białek regulujących fazę G1 cyklu komórkowego. Jednak u roślin typowo protoonkogenne mutacje nie wywołują tak poważnych następstw. Na przykład, nadprodukcja CycD powodująca u zwierząt nowotwory, u roślin wywołuje jedynie przyśpieszony wzrost (Rozdział 2.1). Kontrola wzrostu i podziałów komórek powinna determinować ostateczną wielkość rośliny, kształt liści, łodyg, korzeni. Jednak eksperymenty, w których stymulowano lub hamowano podziały komórkowe sugerują, że nie jest to twierdzenie słuszne. Oczywiście efekt obu manipulacji przynosił obniżenie albo podwyższenie ilości komórek, co jednak powodowało niewielkie różnice w wyglądzie rośliny. Rośliny mają zdolność do włączania pojawiających się dodatkowych komórek w normalne tkanki. Wynika to prawdopodobnie ze strategii rozwoju. U roślin następuje intensywne postembrionalne formowanie organów z nie wyróżnicowanych stref proliferacji, czyli merystemów. Gdy komórka opuszcza strefę merystematyczną częstość podziałów 34

35 zmniejsza się, a los komórki jest determinowany bardziej przez otoczenie, niż pochodzenie. Pozostaje to w kontraście do zwierząt, u których najczęściej tożsamość komórki jest determinowana przez jej pochodzenie. Zwiększenie ilości komórek np. w korzeniu rośliny, zwiększa tylko pulę komórek przeznaczoną do formowania korzenia. Nadnormatywne komórki w strefach zróżnicowanych są zdeterminowane przez otoczenie i zostają wbudowane w otaczającą tkankę. Przy zmniejszeniu ilości komórek występuje dodatkowy efekt w postaci zwiększenia wymiarów komórek. Rośliny wykazują wyjątkową oporność na transformacje neoplastyczne. Znany przypadek tworzenia u roślin guzów lub narośli powodowany jest interakcją z patogenną bakterią Agrobacterium. Trudno uznać to jednak za zmianę natury nowotworowej (jest to raczej hormonalna indukcja proliferacji komórek). Rośliny są również oporne na kancerogeny np. UV, promieniowanie jonizujące. Taka uderzająca różnica pomiędzy zwierzętami, a roślinami wskazuje, że oporność na nowotwory jest elementem strategii rozwoju roślin. Pomimo, że molekularne podstawy tych oczywistych różnic między roślinami a zwierzętami są wieloczynnikowe, wiemy o nich coraz więcej [34]. Lepsze zrozumienie funkcjonowania szlaku Rb, przybliża ich poznanie. Tolerancja roślin na zwiększoną liczbę komórek mogłaby zostać wykorzystana do zwiększenia biomasy (np. większe owoce). Pierwszym krokiem będzie lepsze zrozumienie molekularnych zależności pomiędzy cyklem komórkowym, wzrostem i rozwojem. Do wyjaśnienia pozostaje zganienie powiązania białka Rb z białkami remodelującymi chromatynę. Planowany eksperyment, którego pierwszym etap przedstawiono w niniejszej pracy, obejmuje również wyciszenie wraz z Rb trzech wariantów histonu H1. Celem jest sprawdzenie czy białko Rb pozostaje w zależności funkcjonalnej z histonem H1. Podwójne wyciszenie Rb i H1 może spowodować różne defekty (morfologiczne i biochemiczne). Brak sumowania się defektów sugerowałby, że Rb współdziała z histonem, synergizm wyłączenia pokazywałby niezależność funkcjonowania i wzajemne zastępowanie się funkcji H1 i Rb. Od 1987 roku, kiedy to wyizolowano gen Rb, udało się stworzyć spójny model regulacji fazy G1 cyklu komórkowego u zwierząt. Uszkodzenia dotyczące mechanizmów kontroli fazy G1 prowadzą najczęściej do onkogenezy. Zrozumienie molekularnych mechanizmów regulujących tę fazę ma istotne znaczenie w poznaniu etiologii chorób nowotworowych oraz ich terapii. Dotyczy to szczególnie terapii genowej, w której przy pomocy odpowiednich wektorów wprowadza się do komórki nowotworowej prawidłowe 35