Metody bioinformatyki. Ekspresja genów. prof. dr hab. Jan Mulawka

Transkrypt

1 Metody bioinformatyki Ekspresja genów prof. dr hab. Jan Mulawka

2

3 Genetyczny skład prawie wszystkich komórek somatycznych organizmów wielokomórkowych jest identyczny. Fenotyp (swoistość tkankowa lub komórkowa) podyktowana jest różnicami ekspresji genów w posiadanym zestawie genów. Zmiany w ekstrakcji genów pozwalają komórce adoptować się do zmian środowiskowych. Ekspresja genów może być kontrolowana na różnych poziomach poprzez zmiany w transkrypcji, przekształcaniu, lokalizacji, trwałości lub sposobie użytkowania RNA przez komórkę.

4 Działanie genów eukariotycznych Promotory dla polimerazy II składają się z wielu sekwencji, z którymi wiążą się czynniki transkrypcyjne Obejmują one od kilkudziesięciu do ok. 200 nukleotydów Z sekwencją TATA (-30) wiąże się czynnik TFIID (a dokładniej jego składnik TBP TATA binding protein) Często występuje sekwencja CAAT (-80)

5 Czynniki transkrypcyjne

6 Czynniki transkrypcyjne biorące udział w wiązaniu polimerazy II A D B pol II E F - TFIIA TFIID TFIIB - polimeraza RNA TFIIE TFIIF

7 w komórkach organizmów eukariotycznych mała część całkowitego DNA występuje pod postacią genów i regionów regulatorowych inaczej niż u prokariotów DNA w komórkach eukariotycznych jest mocno upakowany i tworzy z białkami kompleks zwany chromatyną chromatyna zawiera histony jednostką strukturalną chromatyny są nukleosomy chromatyna i histony odgrywają znaczącą rolę w mechanizmach regulacji ekspresji genów

8 włóknista substancja w jądrze komórkowym, stanowiąca główny składnik chromosomów może kurczyć się i rozkurczać, powodując zmianę upakowania struktury chromosomów stopień upakowania chromatyny odgrywa rolę w kontroli ekspresji genów taka zróżnicowana ekspresja jest możliwa dzięki dostępności dla transkrypcji odmiennych regionów chromatyny w komórkach pochodzących z różnych tkanek ważnym czynnikiem określającym aktywność genów jest acetylacja i

9

10

11 acetylacja zachodzi w resztach lizynowych końców aminokwasowych cząsteczek histonu modyfikacja ta zmniejsza ładunek dodatni tych końców, zmniejszając w ten sposób powinowactwo histonu do obdarzonego ujemnym DNA acetylacjaładunkiem histonu może prowadzić do rozpadu struktury nukleosomów i ułatwiać dostęp czynników transkrypcyjnych do pokrewnych im elementów regulatorowych w DNA skutkowałoby to wzmocnieniem wiązania elementu podstawowego mechanizmu transkrypcyjnego z promotorem deacetylacja histonów jak można się spodziewać dawałaby efekt odwrotny

12 u eukariotów w obrębie DNA znajdują się elementy, które ułatwiają lub wzmacniają inicjację transkrypcji w obszarze promotora elementami wzmacniającymi transkrypcję są enhancery

13 działają wówczas, gdy znajdują się w dużej odległości od promotora działają wówczas, gdy znajdują się przed lub za promotorem działają w obu orientacjach działają na promotory homologiczne lub heterologiczne działają przez związanie jednego lub kilku białek ułatwiają wiązanie się podstawowego kompleksu transkrypcyjnego z promotorem

14 Stwierdzono także obecność elementów działających w układzie cis, które zmniejszają lub wyciszają ekspresję swoistych genów. Zostały zbadane tylko nieliczne takie elementy. Uogólnienia co do mechanizmu ich działania nie są możliwe, jakkolwiek uważa się, że do aktywacji genu na poziomie chromatyny są potrzebne kowalencyjne modyfikacje histonów i innych białek przez (redukowane represorami) złożone z wielu podjednostek korepresory.

15 Enhanceosom tworzony na enhancerze genu ludzkiego β-interferonu: u góry schemat rozkładu elementów typu cis tworzących wzmacniacz genu β-interferonu elementy cis tego wzmacniacza są miejscami wiążącymi czynniki trans : HMGI(Y), cjun - ATF-2, IRF7 i NK-κB czynniki oddziałują z tymi elementami w uporządkowany sposób (zgodny z kolejnością zaznaczoną przez strzałkę) do odpowiedniej stymulacji transkrypcji w reakcji na zakażenie wirusowe ludzkiej komórki wymaganych jest wszystkich pięć elementów cis i to w odpowiednim ułożeniu

16

17 Dobrze dobrany gen reporterowy wykazuje cechy: nie występuje naturalnie u organizmu-biorcy, pojawia się u niego dopiero w następstwie udanej transformacji dostarcza produktu dającego łatwo dostrzegalną fenotypową zmianę, np. powoduje syntezę jakiegoś barwnika albo świecenie nie powoduje żadnych zakłóceń fizjologicznych w organizmie-biorcy jego produkt jest stosunkowo nietrwały kodowane przez ten gen białko zachowuje swoją aktywność po przyłączeniu do jego końca (N lub C) innego peptydu

18 wyróżniamy geny fuzyjne i chimeryczne wykorzystując ligację regionów DNA z różnymi genami reporterowymi można określić te regiony w sąsiedztwie genów strukturalnych, które mają wpływ na ich ekspresję fragmenty DNA, które są podejrzane o funkcje elementów regulatorowych są przyłączane do odpowiedniego genu reporterowego i wprowadzane do komórki gospodarza podstawowa ekspresja genu reporterowego będzie się zwiększała, jeśli fragment DNA zawiera sekwencję wzmacniającą przykładowo: dodanie do pożywki hodowlanej hormonu lub metalu ciężkiego będzie powodowało zwiększenie ekspresji genu reporterowego, jeśli DNA zawiera element reagujący na hormon lub jony metalu

19 Geny eukariotyczne bardzo rzadko są regulowane metodą włączania-wyłączania (zwłaszcza w przypadku ssaków) W przypadku eukariotów wymagane są procesy zapewniające duży stopień elastyczności Odpowiedź genu na złożone bodźce środowiskowe może mieć różne cechy natury fizjologicznej Odpowiedź genu ma szeroki zakres gdy sumującym się lub synergistycznym odpowiedziom dodatnim są przeciwstawione efekty negatywne lub represyjne Koniecznym jest mechanizm za pomocą którego efektor (np. hormon) aktywuje pewne geny w komórkach, jednocześnie hamuje inne, a na niektóre nie wpływa w ogóle.

20

21 Grubość strzałek na rysunku wskazuje na wielkość aktywacji Gen A - jest aktywowany kombinacją aktywatorów 1, 2 i 3 Gen B - zostaje aktywowany kombinacją aktywatorów 1, 3 i 4 - czynnik 4 nie wchodzi w kontakt z DNA bezpośrednio - aktywatory bądź tworzą mostek łączący maszynerię z promotorem, bądź DNA może się wypętlać Gen C - jest inaktywowany czynnikami 1,5 i 3. - czynnik 5 uniemożliwia czynnikowi 2 związanie się z DNA

22 Jeśli aktywator 1 pomaga w przyłączaniu się represora 5 i jeśli przyłączanie się aktywatora 1 wymaga obecności liganda (zaczernione kółko na rysunku), to ligand może aktywować w komórce jeden gen (gen A) i hamować drugi (gen C).

23 Chromatyny tworzą specjalną strukturę z macierzą jądrową, innymi elementami fizycznymi lub podprzedziałami jądrowymi, które ograniczają wrzozec ekspresji genu Niektóre regiony są kontrolowane przez złożone elementy DNA, zwane Regionami Kontrolnymi Locus (LCR, ang. Locus control regions) Obecność regionów izolacyjnych czyli elementów DNA związanych z białkami, zapobiegających działaniu sekwencji wzmacniających na promotor po drugiej stronie sekwencji izolujących i w innej domenie transkrypcyjnej

24 Helisa-skręt-helisa Palec cynkowy Suwak leucynowy

25

26

27 Na podstawie analizy trójwymiarowej struktury regulatora transkrypcji λ, białka Cro, stwierdzono że każdy z monomerów składa się z trzech antyrównoległych struktur (harmonijek) β i trzech helis α. Dimer powstaje przez połączenie się przeciwrównoległych struktur β3. Helisy α3 tworzą powierzchnię rozpoznającą DNA, a reszta cząsteczek najprawdopodobniej stabilizuje te struktury. Przeciętna średnica helisy α wynosi 1,2 nm, co odpowiada w przybliżeniu szerokości większego rowka DNA w formie B. Domena każdego monomeru Cro, rozpoznająca DNA, oddziałuje z pięcioma parami zasad, a miejsca wiążące dimer mają długość 3,4 nm.

28

29

30 Białko TFIIIA, które jest regulatorem pozytywnym transkrypcji genu 5S RNA, wymaga do swej aktywności jonów cynku. Każda cząsteczka TFIIIA ma dziewięć jonów cynku w powtarzającym się kompleksie koordynacyjnym, utworzonym przez ściśle ułożone reszty cysteina-cysteina, po których następuje sekwencja reszt aminokwasowych, a następnie para histydyna-histydyna. W niektórych przypadkach, zwłaszcza rodziny steroidowych tarczycowych receptorów jądrowych, dublet His-His jest zastąpiony przez drugą parę Cys-Cys. Białko zawierające palec cynkowy przypuszczalnie leży na jednej płaszczyźnie helisy DNA, a kolejne palce są ułożone naprzemiennie w obrębie jednego skrętu w dużym rowku. Każdy palec cynkowy białka TFIIIA łączy około pięć par zasad DNA.

31

32 Region białka tworzy helisę α, w której reszty leucynowe zajmują cyklicznie powtarzające się miejsca, co siedem reszt aminokwasowych. Takie ułożenie obejmuje osiem helikalnych skrętów i cztery powtarzające się leucyny. Sądzi się że suwak leucynowy umożliwia połączenie dwóch identycznych monomerów lub heterodimerów na wzór zamka błyskawicznego i powstanie mocnego dimerycznego kompleksu o strukturze oplatających się helis. Tego typu oddziaływanie białko-białko może wzmacniać wiązanie oddzielnych domen wiążących DNA z ich sekwencjami docelowymi.

33

34

35 Wiązanie musi cechować silne powinowactwo do swoistego miejsca w DNA, oraz słabe powinowactwo do innych regionów DNA Bezpośrednio z DNA łączą się niewielkie regiony białka. Pozostała część białka tworzy domeny transaktywujące, może uczestniczyć w dimeryzacji monomerów białka wiążącego, może zapewniać powierzchnię kontaktu do tworzenia heterodimerów, może zapewniać miejsca wiążące ligand lub może zapewnić powierzchnię do oddziaływań z koaktywatorami lub korepresorami. Oddziaływania białko-dna są utrzymywane dzięki wiązaniom wodorowym i siłom van der Waalsa

36 Hierarchia składania kompleksów aktywujących transkrypcję genów obejmuje białka wiążące DNA i transaktywujące; białka, które tworzą kompleksy białko-białko mostkujące białka wiążące DNA z białkami transaktywującymi oraz białka tworzące kompleksy białko-białko ze składnikami podstawowego aparatu transkrypcyjnego. W danym białku może zatem występować wiele powierzchni lub domen spełniających oddzielne funkcje.

37

38 Mechanizmy kontroli transkrypcji działają na poziomie oddziaływań białkodna oraz białko-białko. Oddziaływania te pokazują modularność domen białkowych oraz wysoki stopień swoistości W czynnikach transkrypcyjnych rozpoznano wiele różniących się klas domen wiążących DNA Modyfikacje chromatyny są ważnym czynnikiem kontroli transkrypcji u eukariotów

39 transkrypcja amplifikacja genów rearanżacja genów edytowanie (redagowanie) RNA alternatywny splicing mrna transport mrna z jądra do cytoplazmy regulacja trwałości mrna

40 Zwiększanie liczby genów dostępnych do transkrypcji cząsteczek, niezbędnych do wczesnego rozwoju organizmów wielokomórkowych. Geny te istnieją w postaci wielu kopii w materiale genetycznym gamet, przez co są przenoszone z pokolenia na pokolenie w ogromnej liczbie kopii.

41

42 Sekwencje kodujące, odpowiedzialne za powstawanie swoistych cząsteczek białkowych (np. przeciwciał), nie występują u ssaków w jednym bloku Sekwencje kodujące DNA cechują się dużą zmiennością. Zmiany takie są integralną częścią systemu generowania wymaganej różnorodności rozpoznawania antygenów, będącej istotą należytego działania układu odpornościowego W reakcji na niektóre leki możliwe jest zwiększenie o kilka tysięcy liczby kopii określonych genów.

43

44 Komórki eukariotyczne, oprócz tego że wpływają na wydajność użytkowania promotora, wykorzystują do kontroli ekspresji genów alternatywne przekształcenia RNA, wynikające z: użycia alternatywnych promotorów użycia miejsc splicingu intron-ekson użycia miejsc poliadenylacji

45 Struktura typowego eukariotycznego mrna pokazująca elementy biorące udział w regulacji stabilności mrna.

46 Końce cząsteczek mrna mają swój udział w zjawisku stabilizacji mrna. Czapeczka na końcu 5 mrna zapobiega atakowi 5 -egzonukleoz, ogon poli(a) zaś uniemożliwia działanie 3 -egzonukleoz. Zakłada się że w cząsteczkach mrna zawierających tego typu struktury atak egzonukleoz i strawienie całej cząsteczki umożliwia pojedyncze cięcie endonukleoityczne. Mechanizmów regulacji stabilności mrna jest wiele, tak jak wiele jest mechanizmów regulacji syntezy mrna. Skoordynowana regulacja tych dwóch procesów daje komórce niezwykłe zdolności adaptacyjne.