(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy /13 EP B1 (13) T3 (1) Int. Cl. A61K39/2 A61K39/116 A61K39/09 (06.01) (06.01) (06.01) (4) Tytuł wynalazku: Kompozycja immunogenna () Pierwszeństwo: GB GB GB00016 GB GB GB (43) Zgłoszenie ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 08/11 (4) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 08/ (73) Uprawniony z patentu: GlaxoSmithKline Biologicals s.a., Brussels, BE (72) Twórca (y) wynalazku: PL/EP T3 BIEMANS Ralph Leon, Rixensart, BE POOLMAN Jan, Rixensart, BE DUVIVIER Pierre, Rixensart, BE DENOEL Philippe, Rixensart, BE CAPIAU Carine, Rixensart, BE BOUTRIAU Dominique, Rixensart, BE (74) Pełnomocnik: Sulima Grabowska i Sierzputowska Biuro Patentów i Znaków Towarowych sp.j. rzecz. pat. Tykarski Wojciech Warszawa skr. poczt. 6 Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 SGS-998VAL EP B1 Opis 1 2 [0001] Niniejsze zgłoszenie dotyczy kompozycji immunogennych i szczepionek zawierających koniugat sacharydu Hib oraz co najmniej dwa dalsze koniugaty sacharydów bakteryjnych, sposobów wytwarzania takich kompozycji immunogennych i szczepionek, zastosowań i sposobów immunizacji z uŝyciem kompozycji immunogennej i szczepionki. [0002] Wykazano, Ŝe polisacharydy bakteryjne są skutecznymi immunogenami do zastosowania w szczepionkach, w szczególności gdy są sprzęŝone z białkiem nośnikowym. Dostępne są handlowe szczepionki sprzęŝone przeciw Haemophilus influenzae typu b (Hibtiter Wyeth-Lederle), z polisacharydami pneumokokowymi (Prevnar -Wyeth-Lederle) i polisacharydami meningokokowymi (Meningitec - Wyeth-Lederle i Menactra - Sanofi). [0003] Opisano takŝe kompozycje immunogenne i szczepionki zawierające koniugat Hib oraz dalsze koniugaty sacharydów bakteryjnych. Przykładowo WO 02/00249 ujawnia kompozycje immunogenne zawierające koniugat Hib PRP i dalsze koniugaty polisacharydów i oligosacharydów, w których koniugaty polisacharydów nie są zaadsorbowane na adiuwancie, w szczególności na solach glinu. Przedstawiono wyniki prób klinicznych z zastosowaniem takich samych dawek wszystkich polisacharydów bakteryjnych. [0004] Choo i wsp., Pediatr. Infect. Dis. J. (00) 19; opisuje zaszczepienie małego dziecka 7-waŜną sprzęŝoną szczepionką przeciw pneumokokom zmieszaną z szczepionką sprzęŝoną przeciw Haemophilus influenzae typu b (hib) znaną jako HbOC. Podana dawka koniugatu hib była -krotnie wyŝsza niŝ dawka kaŝdego z podanych koniugatów polisacharydów pneumokokowych. Tamm i wsp., Vaccine (0) 23; opisuje badanie kliniczne sprzęŝonej szczepionki DtwPHib-CRM197 w którym zbadano niŝsze dawki Hib-CRM197. [000] Niniejszy wynalazek dotyczy dostarczenia szczepionki skojarzonej zawierającej koniugat Hib oraz dalsze koniugaty sacharydów bakteryjnych, która jest zdolna do wywołania ulepszonej odpowiedzi immunogennej ze względu na optymalizację dawek koniugatu Hib i innych koniugatów polisacharydów bakteryjnych. [0006] Zgodnie z tym w pierwszym aspekcie wynalazek dostarcza kompozycję immunogenną zawierającą koniugat sacharydu Hib i co najmniej dwa dalsze koniugaty sacharydów bakteryjnych, w której koniugat Hib jest obecny w niŝszej dawce sacharydu niŝ średnia dawka sacharydu wszystkich co najmniej dwóch dalszych koniugatów sacharydów

3 2 bakteryjnych. Opis szczegółowy 1 2 [0007] Kompozycja immunogenna według wynalazku zawiera koniugat sacharydu koniugat sacharydu Hib i co najmniej dwa dalsze koniugaty sacharydów bakteryjnych, przy czym koniugat Hib jest obecny w niŝszej dawce sacharydu niŝ średnia dawka sacharydu wszystkich co najmniej dwóch dalszych koniugatów sacharydów bakteryjnych. Alternatywnie, koniugat Hib jest obecny w niŝszej dawce sacharydu niŝ dawka sacharydu kaŝdego z co najmniej dwóch dalszych koniugatów sacharydów bakteryjnych. Przykładowo dawka koniugatu Hib moŝe być co najmniej o %, %, %, 40%, 0%, 60%, 70% lub 80% niŝsza niŝ średnia lub najniŝsza dawka sacharydu z co najmniej dwóch dalszych koniugatów sacharydów bakteryjnych. [0008] Określenie "sacharyd" obejmuje polisacharydy lub oligosacharydy. Polisacharydy są izolowane z bakterii lub teŝ izolowane z bakterii i dopasowane pod względem wielkości znanymi metodami (patrz przykładowo EP49724 i EP4972) oraz ewentualnie przez mikrofluidyzację. Polisacharydy moŝna dopasować pod względem wielkości w celu zmniejszenia lepkości próbek polisacharydów i/lub poprawy właściwości filtracyjnych sprzęŝonych produktów. Oligosacharydy zawierają małą liczbę powtarzalnych jednostek (zazwyczaj - powtarzalnych jednostek) i zazwyczaj są polisacharydami hydrolizowanymi. [0009] "Średnią dawkę" ustala się przez dodanie dawek wszystkich dalszych polisacharydów i podzielenie przez liczbę dalszych polisacharydów. "Dawka" oznacza ilość kompozycji immunogennej lub szczepionki podawanej człowiekowi. [00] Polisacharydy ewentualnie dopasowuje się pod względem wielkości do 1,, 2, 4, 6, 8,, 12, 14, 16, 18 lub -krotnie w porównaniu z wielkością polisacharydu wyizolowanego z bakterii. [0011] "Dopasowanie pod względem wielkości o czynnik do x2" oznacza, Ŝe polisacharyd poddaje się procesowi, który ma na celu zmniejszenie wielkości polisacharydu, ale zachowuje wielkość ponad połowy wielkości natywnego polisacharydu. X3, x4 itd. naleŝy interpretować w ten sam sposób, tj. polisacharyd poddaje się procesowi, który ma na celu zmniejszenie wielkości polisacharydu, ale zachowuje wielkość ponad odpowiednio jednej trzeciej, ćwierci itd., wielkości natywnego polisacharydu. [0012] Wielkość sacharydu MenA przykładowo wynosi -0 kda, - kda, - kda, - kda, -40 kda, kda, kda, kda lub kda. Wielkość sacharydu MenC wynosi przykładowo -0 kda, - kda, - kda, -1

4 kda, -0 kda, 0-0 kda, 0- kda, -2 kda. Wielkość sacharydu MenW wynosi przykładowo -0 kda, - kda, - kda, -0 kda, 0-0 kda, 0- kda lub kda. Wielkość sacharydu MenY wynosi przykładowo -0 kda, - kda, - kda, -0 kda, 0-0 kda, kda, kda lub -160 kda zmierzona metodą MALLS. [0013] W jednej postaci polidyspersyjność sacharydów wynosi 1-1,, 1-1,3, 1-1,2, 1-1,1 lub 1-1,0, a po sprzęŝeniu z białkiem nośnikowym polidyspersyjność koniugatu wynosi 1,0-2,0, 1,0-1,, 1,0-1,2 lub 1,-2,0. Wszystkie pomiary polidyspersyjności wykonane metodą MALLS. [0014] W celu analizy sacharydów meningokokowych metodą MALLS moŝna zastosować połączenie dwóch kolumn (TSKG6000 i 000PWxl TOSOH Bioscience), przy czym sacharydy wymywa się wodą. Sacharydy wykrywa się z uŝyciem detektora fotodyspersyjnego (przykładowo Wyatt Dawn DSP wyposaŝonego w mw laser argonowy przy 488 nm) i refraktometru interferometrycznego (przykładowo Wyatt Otilab DSP wyposaŝonego w celkę P0 z czerwonym filtrem przy 498 nm). [001] Sacharydem Hib jest fosforan polirybozylu (PRP), otoczkowy polisacharyd lub oligosacharyd Haemophilus influenzae typu b. [0016] Określenie "co najmniej dwa dalsze koniugaty sacharydów bakteryjnych" dotyczy co najmniej dwóch koniugatów sacharydów, w których sacharydy są róŝne od Hib oraz róŝnią się od siebie nawzajem. Te co najmniej dwa dalsze koniugaty sacharydów bakteryjnych mogą pochodzić z jednego lub większej liczby gatunków z grupy Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, paciorkowców z grupy A, paciorkowców z grupy B, S. typhi, Staphylococcus aureus lub Staphylococcus epidermidis. W jednej postaci kompozycja immunogenna zawiera polisacharydy lub oligosacharydy otoczkowe z jednej lub większej liczby serogrup A, B, C, W13 i Y Neisseria meningitidis. Kolejna postać obejmuje polisacharydy lub oligosacharydy otoczkowe pochodzące z Streptococcus pneumoniae. Pneumokokowe antygeny polisacharydów lub oligosacharydów otoczkowych są ewentualnie wybrane z serotypów 1, 2, 3, 4,, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, A, 11A, 12F, 14, 1B, 17F, 18C, 19A, 19F,, 22F, 23F i 33F (przykładowo z serotypów 1, 3, 4,, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F i 23F). Kolejna postać zawiera typ, typ 8 lub 336 polisacharydów lub oligosacharydów otoczkowych Staphylococcus aureus. Kolejna postać obejmuje typ I, typ II lub typ III otoczkowych polisacharydów Staphylococcus epidermidis. Kolejna postać obejmuje sacharyd Vi (poli lub oligosacharyd) z S. typhi. Kolejna postać obejmuje typ Ia, typ Ic, typ II lub typ III otoczkowych polisacharydów lub oligosacharydów paciorkowca grupy B.

5 Kolejna postać obejmuje otoczkowe polisacharydy lub oligosacharydy paciorkowca grupy A, ewentualnie zawierające ponadto jedno białko M lub wiele typów białka M. W jednej postaci kompozycja immunogenna według wynalazku dalej zawiera antygen z N. meningitidis serogrupy B. Antygenem tym jest ewentualnie polisacharyd otoczkowy N. meningitidis serogrupy B (MenB) lub pochodzący od niego polisacharyd lub oligosacharyd o dopasowanej wielkości. Antygenem jest ewentualnie preparat pęcherzykowy zewnętrznej błony z N. meningitidis serogrupy B jak opisano w EP1992, WO 01/09, WO 04/14417, WO 04/14418 i WO 04/ [0017] W jednej postaci te co najmniej dwa dalsze koniugaty sacharydów bakteryjnych ewentualnie obejmują sacharyd otoczkowy N. meningitidis serogrupy C (MenC), sacharydy otoczkowe serogrupy C i Y (MenCY), sacharydy otoczkowe serogrupy C i A (MenAC), sacharydy otoczkowe serogrupy C i W (MenCW), sacharyd otoczkowy serogrupy A i Y (MenAY), sacharydy otoczkowe serogrupy A i W (MenAW), sacharydy otoczkowe serogrupy W i Y (Men WY), sacharyd otoczkowy serogrupy A, C i W (MenACW), sacharydy otoczkowe serogrupy A, C i Y (MenACY); sacharydy otoczkowe serogrupy A, W13 i Y (MenAWY), sacharydy otoczkowe serogrupy C, W13 i Y (MenCWY); lub sacharydy otoczkowe serogrupy A, C, W13 i Y (MenACWY), sacharydy otoczkowe serogrupy B i C (MenBC), sacharydy otoczkowe serogrupy B, C i Y (MenBCY), sacharydy otoczkowe serogrupy B, C i A (MenABC), sacharydy otoczkowe serogrupy B, C i W (MenBCW), sacharyd otoczkowy serogrupy A, B i Y (MenABY), sacharydy otoczkowe serogrupy A, B i W (MenABW), sacharydy otoczkowe serogrupy B, W i Y (MenBWY), sacharyd otoczkowy serogrupy A, B, C i W (MenABCW), sacharydy otoczkowe serogrupy A, B, C i Y (MenABCY); sacharydy otoczkowe serogrupy A, B, W13 i Y (MenABWY), sacharydy otoczkowe serogrupy B, C, W13 i Y (MenBCWY); lub sacharydy otoczkowe serogrupy A, B, C, W13 i Y (MenABCWY). [0018] Kompozycja immunogenna według wynalazku ewentualnie zawiera koniugat sacharydu Hib w dawce sacharydu pomiędzy 0,1 i 9 µg; 1 i µg lub 2 i 3 µg albo około lub dokładnie 2, µg, a kaŝdy z co najmniej dwóch dalszych koniugatów sacharydów w dawce pomiędzy 2 i µg, 3 i µg lub pomiędzy 4 i 7 µg albo około lub dokładnie µg. [0019] "Około" lub "w przybliŝeniu" definiuje się dla celów wynalazku jako w zakresie % mniej lub więcej względem danej liczby. [00] Kompozycja immunogenna według wynalazku zawiera dawkę sacharydu koniugatu sacharydu Hib, która wynosi przykładowo mniej niŝ 90%, 80%, 7%, 70%, 60%, 0%, 40%, %, % lub % średniej dawki sacharydu co najmniej dwóch dalszych koniugatów sacharydów. Dawka sacharydu Hib wynosi przykładowo pomiędzy % i 60%, %

6 1 2 3 i 60%, 40% i 60% lub około lub dokładnie 0% średniej dawki sacharydu co najmniej dwóch dalszych koniugatów sacharydów. [0021] Kompozycja immunogenna według wynalazku zawiera dawkę sacharydu koniugatu sacharydu Hib, która stanowi przykładowo mniej niŝ 90%, 80%, 7%, 70%, 60%, 0%, 40%, %, % lub % najniŝszej dawki sacharydu z dwóch dalszych koniugatów sacharydów. Dawka sacharydu Hib przykładowo wynosi pomiędzy % i 60%, % i 60%, 40% i 60% albo około lub dokładnie 0% najniŝszej dawki sacharydu z co najmniej dwóch dalszych koniugatów sacharydów. [0022] W jednej postaci wynalazku dawka kaŝdego z dwóch lub większej liczby dalszych sacharydów jest ewentualnie taka sama lub w przybliŝeniu taka sama. [0023] Przykładami kompozycji immunogennych według wynalazku są kompozycje składające się z lub zawierające: koniugat Hib i koniugat MenA oraz koniugat MenC, ewentualnie w stosunkach dawek sacharydów 1:2:2, 1:2:1, 1:4:2, 1:6:3, 1:3:3, 1:4:4, 1::, 1:6:6 (wag./wag.). Dawka sacharydu MenA jest ewentualnie wyŝsza niŝ dawka sacharydu MenC. koniugat Hib i koniugat MenC oraz koniugat MenY, ewentualnie w stosunkach dawek sacharydów 1:2:2, 1:2:1, 1:4:2, 1:4:1, 1:8;4, 1:6:3, 1:3:3, 1:4:4, 1::, 1:6:6 (wag./wag.). Dawka sacharydu MenC jest ewentualnie wyŝsza niŝ dawka sacharydu MenY. koniugat Hib i koniugat MenC oraz koniugat MenW, ewentualnie w stosunkach dawek sacharydów 1:2:2, 1:2:1, 1:4:2, 1:4:1, 1:8;4, 1:6:3, 1:3:3, 1:4:4, 1::, 1:6:6 (wag./wag.). Dawka sacharydu MenC jest ewentualnie wyŝsza niŝ dawka sacharydu MenW. koniugat Hib i koniugat MenA oraz koniugat MenW, ewentualnie w stosunkach dawek sacharydów 1:2:2, 1:2:1, 1:4:2, 1:4:1, 1:8;4, 1:6:3, 1:3:3, 1:4:4, 1::, 1:6:6 (wag./wag.). Dawka sacharydu MenA jest ewentualnie wyŝsza niŝ dawka sacharydu MenW. koniugat Hib i koniugat MenA oraz koniugat MenY, ewentualnie w stosunkach dawek sacharydów 1:2:2, 1:2:1, 1:4:2, 1:4:1, 1:8:4, 1:6:3, 1:3:3, 1:4:4, 1::, 1:6:6 (wag./wag.). Dawka sacharydu MenA jest ewentualnie wyŝsza niŝ dawka sacharydu MenY. koniugat Hib i koniugat MenW oraz koniugat MenY, ewentualnie w stosunkach dawek sacharydów 1:2:2, 1:2:1, 1:1:2, 1:4:2, 1:2:4, 1:4:1, 1:1:4, 1:3;6, 1:1:3, 1:6:3, 1:3:3, 1:4:4, 1::, 1:6:6 (wag./wag.). Dawka sacharydu MenY jest ewentualnie wyŝsza niŝ dawka sacharydu MenW.

7 [0024] Hib oraz co najmniej dwa dalsze sacharydy włączone do kompozycji farmaceutycznych według wynalazku są sprzęŝone z białkiem nośnikowym, takim jak anatoksyna tęŝcowa, fragment C anatoksyny tęŝcowej, nietoksyczne mutanty anatoksyny tęŝcowej, anatoksyna błonicza, CRM197, inne nie toksyczne mutanty anatoksyny błoniczej [takie jak CRM176, CRM 197, CRM228, CRM 4 (Uchida i wsp. J. Biol. Chem. 218; , 1973); CRM 9, CRM 4, CRM2, CRM 3 i CRM7 oraz inne mutacje opisane w Nicholls i Youle, Genetically Engineered Toxins, red: Frankel, Maecel Dekker Inc, 1992; delecje i mutacje Glu-148 do Asp, Gln lub Ser i/lub Ala 18 do Gly oraz inne mutacje ujawnione w US lub US ; mutacja co najmniej jednej lub większej liczby reszt Lys 16, Lys 26, Phe i/lub Lys 34 oraz inne mutacje ujawnione w US lub US 64673; lub fragment ujawniony w US ], pneumolizyna pneumokokowa, OMPC (meningokokowe białko błony zewnętrznej zazwyczaj ekstrahowane z N. meningitidis serogrupy B - EP0371), syntetyczne peptydy (EP , EP ), białka szoku cieplnego (WO 93/17712, WO 94/038), białka krztuścowe (WO 98/8668, EP ), cytokiny, limfokiny, czynniki wzrostowe lub hormony (WO 91/01146), sztuczne białka zawierające wiele epitopów dla ludzkich komórek CD4+ T z róŝnych antygenów pochodzących z patogenów (Falugi i wsp. (01) Eur J Immunol 31; ), takie jak białko N19 (Baraldoi i wsp. (04) Infect Immun 72; ), pneumokokowe białko powierzchniowe PspA (WO 02/091998), pneumolizyna (Kuo i wsp. (199) Infect Immun 63; ), białka wychwytujące Ŝelazo (WO 01/72337), toksyna A i B C. difficile (WO 00/61761) lub białko D (US ). [002] W jednej postaci w kompozycji immunogennej według wynalazku stosuje się białko nośnikowe (wybrane niezaleŝnie) w koniugacie Hib oraz w co najmniej dwóch dalszych koniugatach sacharydów bakteryjnych, ewentualnie w koniugacie Hib oraz w kaŝdym z co najmniej dwóch dalszych koniugatach sacharydów bakteryjnych (np. we wszystkich innych koniugatach sacharydów obecnych w kompozycji immunogennej). [0026] W jednej postaci, kompozycja immunogenna ewentualnie zawiera koniugat sacharydu Hib i koniugat polisacharydu MenA, koniugat sacharydu Hib i koniugat polisacharydu MenC, koniugat sacharydu Hib i koniugat polisacharydu MenW, koniugat sacharydu Hib i koniugat polisacharydu MenY, koniugat sacharydu Hib oraz koniugaty polisacharydów MenA i MenC, koniugat sacharydu Hib oraz koniugaty polisacharydów MenA i MenW, koniugat sacharydu Hib oraz koniugaty polisacharydów MenA i MenY, koniugat sacharydu Hib oraz koniugaty polisacharydów MenC i MenW, koniugat sacharydu Hib oraz koniugaty polisacharydów MenC i MenY, koniugat sacharydu Hib oraz koniugaty polisacharydów MenW i MenY, koniugat sacharydu Hib oraz koniugaty polisacharydów

8 MenA, MenC i MenW, koniugat sacharydu Hib oraz koniugaty polisacharydów MenA, MenC i MenY, koniugat sacharydu Hib oraz koniugaty polisacharydów MenA, MenW i MenY, koniugat sacharydu Hib oraz koniugaty polisacharydów MenC, MenW i MenY lub koniugat sacharydu Hib oraz koniugaty polisacharydów MenA, MenC, MenW i MenY. [0027] W jednej postaci, pojedyncze białko nośnikowe moŝe nieść więcej niŝ jeden antygen sacharydowy (WO 04/08321). Przykładowo pojedyncze białko nośnikowe moŝe zostać sprzęŝone z Hib i MenA, Hib i MenC, Hib i MenW, Hib i MenY, MenA i MenC, MenA i MenW, MenA i MenY, MenC i MenW, MenC i MenY lub Men W i MenY. [0028] W jednej postaci kompozycja immunogenna według wynalazku zawiera koniugat sacharydu Hib z białkiem nośnikowym wybranym z grupy obejmującej TT, DT, CRM197, fragment C z TT oraz białko D. [0029] Gdy białkiem nośnikowym jest TT lub jej fragment dla Hib i co najmniej dwóch dalszych sacharydów całkowita dawka nośnika wynosi pomiędzy 2,-2 µg, 3- µg, 4-1 µg, -12, µg, 1- µg, µg lub µg. [00] W jednej postaci, kompozycja immunogenna według wynalazku zawiera co najmniej dwa dalsze sacharydy bakteryjne sprzęŝone z białkiem nośnikowym wybranym z grupy obejmującej TT, DT, CRM197, fragment C z TT oraz białko D. [0031] Kompozycja immunogenna według wynalazku ewentualnie zawiera koniugat sacharydu Hib przy stosunku Hib do białka nośnikowego pomiędzy 1: i :1; 1:2 i 2:1; 1:1 i 1:4; 1:2 i 1:3,; albo około lub dokładnie 1:2, lub 1:3 (wag./wag.). [0032] Kompozycja immunogenna według wynalazku ewentualnie zawiera co najmniej jeden koniugat sacharydu meningokokowego (przykładowo MenA i/lub MenC i/lub MenW i/lub MenY) o stosunku sacharydu Men do białka nośnikowego pomiędzy 1: i :1, pomiędzy 1:2 i :1, pomiędzy 1:0, i 1:2, lub pomiędzy 1:1,2 i 1:2,(wag./wag.). [0033] Stosunek sacharydu do białka nośnikowego (wag./wag.) w koniugacie moŝna wyznaczyć przy zastosowaniu jałowego koniugatu. Ilość białka wyznacza się stosując test Lowry ego (przykładowo Lowry i wsp. (191) J. Biol. Chem. 193, lub Peterson i wsp., Analytical Biochemistry 0, 1-2 (1979)), a ilość sacharydu wyznacza się stosując ICP-OES (emisyjna spektroskopia optyczna ze wzbudzeniem w plazmie sprzęŝonej indukcyjnie) dla MenA, test DMAP dla MenC oraz test rezorcynolowy dla MenW i MenY (Monsigny i wsp. (1988) Anal. Biochem. 17, 2-). [0034] W jednej postaci, w kompozycji immunogennej według wynalazku sacharyd Hib jest sprzęŝony z białkiem nośnikowym przez łącznik, przykładowo łącznik bifunkcyjny. Łącznik jest ewentualnie heterobifunkcyjny lub homobifunkcyjny, zawierający przykładowo reaktywną grupę aminową i reaktywną grupę karboksylową, 2 reaktywne grupy

9 aminowe lub dwie reaktywne grupy karboksylowe. Łącznik przykładowo zawiera pomiędzy 4 i, 4 i 12, i atomów węgla. MoŜliwym łącznikiem jest ADH. Inne łączniki obejmują B-propionoamid (WO 00/99), nitrofenyloetyloaminę (Gever i wsp. (1979) Med. Microbiol. Immunol. 16; ), halogenki fluorowcoalkilu (US40768), wiązania glikozydowe (US467374, US ) i kwas 6-aminokapronowy (US449286). [003] Koniugaty sacharydu obecne w kompozycjach immunogennych według wynalazku moŝna wytwarzać dowolną ze znanych technik sprzęgania. Przykładowo sacharyd moŝna sprzęgać przez wiązanie tioeterowe. Metoda sprzęgania moŝe zaleŝeć od aktywacji sacharydu tetrafluoroboranem 1-cyjano-4-dimetyloaminopirydyny (CDAP) z wytworzeniem estru cyjanianowego. Aktywowany sacharyd moŝe być w ten sposób sprzęgany bezpośrednio lub przez grupę odstępnikową (łącznikową) z grupą aminową na białku nośnikowym. Ewentualnie, ester cyjanianowy jest sprzęgany z heksanodiaminą lub ADH oraz pochodna aminowa sacharydu jest sprzęgana z białkiem nośnikowym według w reakcji heteroligacji obejmującej wytworzenie wiązania tioeterowego lub jest sprzęgany z białkiem nośnikowym w reakcji z karbodiimidem (np. EDAC lub EDC). Takie koniugaty opisano w opublikowanym zgłoszeniu PCT WO 93/1760 Uniformed Services University oraz w WO 9/08348 i WO 96/ [0036] Inne odpowiednie techniki wykorzystują karboimidy, hydrazydy, aktywne estry, norboran, kwas p-nitrobenzoesowy, N-hydroksybursztynowy, S-NHS, EDC, TSTU. Wiele z nich opisano w WO 98/ Sprzęganie moŝe obejmować łącznik karbonylowy, który moŝe powstać w reakcji wolnej grupy hydroksylowej sacharydu z CDI (Bethell i wsp. J. Biol. Chem. 1979, 24; 272-4, Hearn i wsp. J. Chromatogr ; 09-18), po czym przeprowadza się reakcję z białkiem z wytworzeniem wiązania karbaminianowego. MoŜe to obejmować redukcję końca anomerycznego do pierwszorzędowej grupy hydroksylowej, ewentualnie zabezpieczenie/odbezpieczenie pierwszorzędowej grupy hydroksylowej, reakcję pierwszorzędowej grupy hydroksylowej z CDI z wytworzeniem produktu pośredniego karbaminianu CDI i sprzęganie produktu pośredniego karbaminianu CDI z grupą aminową na białku. [0037] Koniugaty moŝna takŝe wytwarzać drogą bezpośredniego aminowania redukcyjnego, jak to opisano w US (Jennings) i US (Anderson). Inne metody opisano w EP , EP-837 i EP [0038] Dalsza metoda obejmuje sprzęganie sacharydu aktywowanego bromocyjanem (lub CDAP) derywatyzowanego hydrazydem kwasu adypinowego (ADH) z białkiem nośnikowym drogą kondensacji karbodiimidowej (Chu C. i wsp. Infect. Immunity, ), przykładowo z zastosowaniem EDAC.

10 [0039] W jednej postaci, grupa hydroksylowa z sacharydu jest sprzęgana z grupą aminową lub karboksylową z białka bezpośrednio lub pośrednio (przez łącznik). Gdy jest obecny łącznik, grupę hydroksylową z sacharydu ewentualnie sprzęga się z grupą aminową z łącznika, przykładowo przez zastosowanie sprzęgania CDAP. Kolejną grupę aminową z łącznika (przykładowo ADH) moŝna sprzęgać z grupą karboksylową z białka, przykładowo przez zastosowanie reakcji karbodiimidowej, przykładowo z zastosowaniem EDAC. W jednej postaci, Hib lub co najmniej dwa dalsze sacharydy najpierw sprzęga się z łącznikiem przed sprzęganiem łącznika z białkiem nośnikowym. [0040] W jednej postaci, sacharyd Hib sprzęga się z białkiem nośnikowym z zastosowaniem CNBr lub CDAP, lub połączenia CDAP i reakcji z karbodiimidem (takim jak EDAC), lub połączenia CNBr i reakcji z karbodiimidem, (przykładowo z EDAC). Ewentualnie Hib sprzęga się z zastosowaniem CNBr i reakcji z karbodiimidem (takim jak EDAC). Przykładowo CNBr stosuje się do połączenia sacharydu i łącznika, a następnie reakcję z karbodiimidem stosuje się do połączenia łącznika z nośnikiem białkowym. [0041] W jednej postaci, co najmniej jeden z co najmniej dwóch dalszych sacharydów jest bezpośrednio sprzęŝony z białkiem nośnikowym, ewentualnie sacharyd(y) Men W i/lub MenY i/lub MenC jest bezpośrednio sprzęŝony z białkiem nośnikowym. Przykładowo MenW; MenY; MenC; MenW oraz MenY; MenW i MenC; MenY i MenC; lub MenW, MenY i MenC są bezpośrednio sprzęŝone z białkiem nośnikowym. Ewentualnie co najmniej jeden z co najmniej dwóch dalszych sacharydów jest bezpośrednio sprzęŝony z CDAP. Przykładowo MenW; MenY; MenC; MenW i MenY; MenW i MenC; MenY i MenC; lub MenW, MenY i MenC sprzęga się bezpośrednio z białkiem nośnikowym z uŝyciem CDAP (patrz WO 9/08348 i WO 96/29094). [0042] W jednej postaci, stosunek sacharydu Men W i/lub Y do białka nośnikowego jest z zakresu pomiędzy 1:0, i 1:2 (wag./wag.) lub stosunek sacharydu MenC do białka nośnikowego jest pomiędzy 1:0, i 1:2 lub 1:1,2 i 1:1, lub 1:0, i 1:1 (wag./wag.), w szczególności gdy te sacharydy są bezpośrednio sprzęŝone z białkiem, ewentualnie z zastosowaniem CDAP. [0043] W jednej postaci, co najmniej jeden z co najmniej dwóch dalszych sacharydów jest sprzęŝony z białkiem nośnikowym przez łącznik, przykładowo łącznik bifunkcjonalny. Łącznik jest ewentualnie heterobifunkcjonalny lub homobifunkcjonaly oraz zawiera przykładowo reaktywną grupę aminową i reaktywną grupę karboksylową, 2 reaktywne grupy aminowe lub dwie reaktywne grupy karboksylowe. Łącznik zawiera przykładowo pomiędzy 4 i, 4 i 12, i atomów węgla. MoŜliwym łącznikiem jest ADH. [0044] W jednej postaci, MenA; MenC; lub MenA i MenC jest sprzęŝony z białkiem

11 1 2 3 nośnikowym przez łącznik. [004] W jednej postaci dalszy sacharyd jest sprzęŝony z białkiem nośnikowym przez łącznik z zastosowaniem CDAP i EDAC. Przykładowo MenA; MenC lub MenA i MenC sprzęga się z białkiem przez łącznik (przykładowo przez takie łączniki, które zawierają dwie grupy aminowe na swoich końcach, taki jak ADH) z zastosowaniem CDAP i EDAC jak opisano powyŝej. Przykładowo, CDAP stosuje się do sprzęgania sacharydu z łącznikiem i EDAC stosuje się do sprzęgania łącznika z białkiem. Ewentualnie sprzęganie przez łącznik prowadzi do stosunku sacharydu do białka nośnikowego pomiędzy 1:0, i 1:6; 1:1 i 1: lub 1:2 i 1:4, dla MenA; MenC; lub MenA i MenC. [0046] W jednej postaci wynalazku kompozycja immunogenna zawiera polisacharydy otoczkowe N. meningitidis z co najmniej jednej, dwóch, trzech lub czterech serogrup A, C, W i Y, sprzęŝone z białkiem nośnikowym, przy czym jeden, dwa, trzy lub cztery albo kaŝdy z polisacharydów N. meningitidis jest natywnym polisacharydem lub jest dopasowany pod względem wielkości o czynnik do x2, x3, x4, x, x6, x7, x8, x9, x lub x. Przykładowo, średnia wielkość co najmniej jednego, dwóch, trzech lub czterech albo kaŝdego z polisacharydów N. meningitidis wynosi powyŝej 0 kda, 60 kda, 7 kda, 0 kda, 1 kda, 1 kda lub 1 kda. [0047] Określenie "natywny polisacharyd" dotyczy polisacharydu, który nie został poddany obróbce, która ma na celu zmniejszenie wielkości polisacharydu. [0048] W jednym aspekcie wynalazku, kompozycja immunogenna zawiera polisacharydy otoczkowe N. meningitidis z co najmniej jednej, dwóch, trzech lub czterech serogrup A, C, W i Y sprzęŝonych z białkiem nośnikowym, przy czym co najmniej jeden, dwa, trzy lub cztery albo kaŝdy z polisacharydów N. meningitidis jest natywnym polisacharydem. [0049] W jednym aspekcie wynalazku, kompozycja immunogenna zawiera polisacharydy otoczkowe N. meningitidis z co najmniej jednej, dwóch, trzech lub czterech serogrup A, C, W i Y sprzęŝonych z białkiem nośnikowym, przy czym co najmniej jeden, dwa, trzy lub cztery albo kaŝdy z polisacharydów N. meningitidis jest dopasowany pod względem wielkości o czynnik do x2, x3, x4, x, x6, x7, x8, x9 lub x. [000] W jednej postaci, średnia wielkość co najmniej jednego, dwóch, trzech lub czterech albo kaŝdego z polisacharydów N. meningitidis, gdy są one obecne, jest pomiędzy 0 kda i 0 kda, 0 kda i 00 kda, 0 kda i 0 KDa, 1 kda i 0 kda, 1 kda i 00 kda, 1 kda i 0 kda zmierzona metodą MALLS. [001] W jednej postaci, sacharyd MenA, gdy jest obecny, ma masę cząsteczkową 0-00 kda, 0-0 kda, 0-00 kda, -90 kda, kda lub kda albo kda. [002] W jednej postaci, sacharyd MenC, gdy jest obecny, ma masę cząsteczkową 0-0

12 kda, 0-0 kda, 0- kda, 1-1 kda, -2 kda lub kda. [003] W jednej postaci sacharyd MenY, gdy jest obecny, ma masę cząsteczkową kda, kda, kda, kda, 0- kda lub kda, 0-0 kda, kda, kda lub -160 kda. [004] W jednej postaci sacharyd MenW, gdy jest obecny, ma masę cząsteczkową kda, kda, kda, kda, 0- kda, kda, 0-0 kda lub kda. [00] Masy cząsteczkowe sacharydu dotyczą masy cząsteczkowej polisacharydu zmierzonej przed sprzęganiem i mierzy się je metodą MALLS. [006] W jednej postaci dowolne obecne sacharydy N. meningitidis są natywnymi polisacharydami lub natywnymi polisacharydami, które mają zmniejszoną wielkość podczas normalnego procesu ekstrakcji. [007] W jednej postaci, dowolne obecne sacharydy N. meningitidis są dopasowane pod względem wielkości przez mechaniczne rozszczepienie, przykładowo przez mikrofluidyzację lub sonifikację. Zaletę mikrofluidyzacji i sonifikacji stanowi zmniejszenie wielkości większych natywnych polisacharydów w wystarczającym stopniu, aby dostarczyć dający się sączyć koniugat. [008] W jednej postaci, polidyspersyjność sacharydu wynosi 1-1,, 1-1,3, 1-1,2, 1-1,1 lub 1-1,0, a po sprzęganiu z białkiem nośnikowym, polidyspersyjność koniugatu wynosi 1,0-2,, 1,0-2,0. 1,0-1,, 1,0-1,2, 1,-2,, 1,7-2,2 lub 1,-2,0. Wszystkie pomiary polidyspersyjności wykonuje się metodą MALLS. [009] W celu analizy sacharydów meningokokowych metodą MALLS moŝna zastosować połączenie dwóch kolumn (TSKG6000 i 000PWxl TOSOH Bioscience), a sacharydy wymywa się wodą. Sacharydy wykrywa się z uŝyciem detektora fotodyspersyjnego (przykładowo Wyatt Dawn DSP wyposaŝonego w mw laser argonowy przy 488 nm) i refraktometru interferometrycznego (przykładowo Wyatt Otilab DSP wyposaŝonego w celkę P0 z czerwonym filtrem przy 498 nm). [0060] W jednej postaci, sacharyd MenA, gdy jest obecny, jest co najmniej częściowo O- acetylowany tak, Ŝe co najmniej 0%, 60%, 70%, 80%, 90%, 9% lub 98% powtórzonych jednostek jest O-acetylowanych co najmniej w jednej pozycji. O-acetylowanie przykładowo występuje co najmniej w pozycji O-3. [0061] W jednej postaci, sacharyd MenC, gdy jest obecny, jest co najmniej częściowo O- acetylowany tak, Ŝe co najmniej %. 40%, 0%, 60%, 70%, 80%, 90%, 9% lub 98% (α2 9)-ustawionych powtórzonych jednostek NeuNAc jest O-acetylowanych w co najmniej jednej lub dwóch pozycjach. O-acetylowanie występuje przykładowo w pozycji O-7 i/lub

13 O-8. [0062] W jednej postaci, sacharyd MenW, gdy jest obecny, jest co najmniej częściowo O- acetylowany tak, Ŝe co najmniej %, 40%, 0%, 60%, 70%, 80%, 90%, 9% lub 98% powtórzonych jednostek jest O-acetylowanych co najmniej w jednej lub dwóch pozycjach. O-acetylowanie występuje przykładowo co najmniej w pozycji O-7 i/lub O-9. [0063] W jednej postaci, sacharyd MenY, gdy jest obecny, jest co najmniej częściowo O- acetylowany tak, Ŝe co najmniej w 40%, 0%, 60%, 70%, 80%, 90%, 9% lub 98% powtórzonych jednostek jest O-acetylowanych co najmniej w jednej lub dwóch pozycjach. O- acetylowanie występuje przykładowo co najmniej w pozycji 7 i/lub 9. [0064] Procent O-acetylowania dotyczy procentu powtórzonych jednostek zawierających O-acetylowanie. MoŜna to mierzyć w sacharydzie przed sprzęganiem i/lub po sprzęganiu. [006] Kolejny aspekt wynalazku stanowi szczepionka zawierająca kompozycję immunogenną według wynalazku i farmaceutycznie dopuszczalną zaróbkę. [0066] Ewentualnie, kompozycja immunogenna lub szczepionka zawiera adiutant w ilości wystarczającej do zwiększenia odpowiedzi immunologicznej na immunogen. Odpowiednie adiuwanty obejmują, ale nie wyłącznie, sole glinu (fosforan glinu lub wodorotlenek glinu), mieszaniny skwalenu (SAF-1), peptyd muramylowy, pochodne saponiny, preparaty ściany komórkowej Mycobacterium, monofosforylowany lipid A, pochodne kwasu mykolowego, środki powierzchniowo czynne typu niejonowych kopolimerów blokowych, Quil A, podjednostka B toksyny cholery, polifosfazeny i pochodne, oraz kompleksy immunostymulujące (ISCOM),takie jak te opisane przez Takahashi i wsp. (1990) Nature 344: [0067] Dla omówionych powyŝej połączeń HibMen, korzystne moŝe być niestosowanie jakiegokolwiek adiuwanta typu soli glinu lub jakiegokolwiek adiutanta w ogóle. [0068] W jednej postaci, kompozycja immunogenna zawiera sacharyd Hibd sprzęŝony z anatoksyną tęŝcową przez łącznik oraz sacharyd MenC sprzęŝony z anatoksyną tęŝca bezpośrednio lub przez łącznik oraz sacharyd MenY sprzęŝony z anatoksyną tęŝca. [0069] W jednej postaci, kompozycja immunogenna według wynalazku jest buforowana do lub doprowadzona do ph pomiędzy 7,0 i 8,0, ph 7,2 i 7,6 albo ph około lub dokładnie 7,4. [0070] Kompozycje immunogenne lub szczepionki według wynalazku są ewentualnie liofilizowane w obecności środka stabilizującego, przykładowo poliolu takiego jak sacharoza lub trehaloza. [0071] Tak jak w przypadku wszystkich kompozycji immunogennych lub szczepionek, immunologicznie skuteczne ilości immunogenów naleŝy wyznaczyć empirycznie. Czynniki, które naleŝy uwzględnić obejmują immunogenność, to czy immunogen będzie czy teŝ

14 nie będzie skompleksowany lub kowalencyjnie przyłączony do adiuwanta lub białka nośnikowego lub innego nośnika, droga podawania oraz liczba dawek immunizacyjnych, które mają być podane. Takie czynniki są znane w dziedzinie szczepionek i fachowiec w dziedzinie immunologii powinien przeprowadzić takie oznaczenia bez nadmiernego eksperymentowania. [0072] Środek czynny moŝe być obecny w róŝnych stęŝeniach w kompozycji farmaceutycznej lub szczepionce według wynalazku. Zazwyczaj minimalne stęŝenie substancji jest ilością wymaganą do uzyskania jej zamierzonego zastosowania, podczas gdy stęŝeniem maksymalnym jest maksymalna ilość, która pozostanie w roztworze lub zostanie homogennie zawieszona w początkowej mieszaninie. Przykładowo minimalna ilość środka terapeutycznego jest taka, która będzie dostarczać pojedynczą skuteczną terapeutycznie dawkę. W przypadku substancji bioaktywnych, minimalne stęŝenie oznacza ilość wymaganą do bioaktywności po roztworzeniu, a stęŝenie maksymalne oznacza punkt, w którym nie moŝna utrzymać homogennej zawiesiny. W przypadku jednostek jednodawkowych, ilość jest taka, jak dla pojedynczego zastosowania terapeutycznego. Ogólnie oczekuje się, Ŝe kaŝda dawka będzie zawierać 1-0 µg antygenu białkowego, przykładowo -0 µg lub - 2 µg. W jednej postaci, dawki poszczególnych sacharydów bakteryjnych wynoszą - µg, - µg, -2, µg lub 2,-1 µg. Korzystna ilość substancji róŝni się pomiędzy jedną substancją i drugą, ale moŝe ją łatwo wyznaczyć specjalista w dziedzinie wynalazku. [0073] Preparaty szczepionek według niniejszego wynalazku moŝna stosować w profilaktyce lub leczeniu ssaka (przykładowo pacjenta będącego człowiekiem) podatnego na zaka- Ŝenie, przez podawanie wspomnianej szczepionki drogą ogólnoustrojową lub śluzówkową. Podawanie to moŝe obejmować zastrzyki drogą domięśniową, śródotrzewnową, śródskórną lub podskórną; lub przez podawanie śluzówkowe do układu pokarmowego, oddechowego, moczowo-płciowego. Korzystne jest podawanie donosowe szczepionek do leczenia zapalenia płuc lub zapalenia ucha środkowego (poniewaŝ moŝe ono skuteczniej zapobiegać nosowo-gardłowemu przenoszeniu pneumokoków, co osłabia infekcję na jej najwcześniejszym etapie). Pomimo, Ŝe szczepionka według wynalazku moŝe być podawana w postaci pojedynczej dawki, jej składniki moŝna takŝe współpodawać razem w tym samym punkcie czasowym lub w róŝnych punktach czasowych (przykładowo jeŝeli sacharydy są obecne w szczepionce moŝna je podawać osobno w tym samym punkcie czasowym lub 1-2 tygodnie po podaniu szczepionki z białkiem bakteryjnym w celu optymalnej koordynacji odpowiedzi immunologicznych względem siebie). Ponadto oprócz pojedynczej drogi podawania moŝna zastosować 2 róŝne drogi podawania. Przykładowo antygeny wirusowe moŝna podawać ID (śródskórnie), podczas gdy białka bakteryjne moŝna podawać IM

15 (domięśniowo) lub IN (donosowo). JeŜeli obecne są sacharydy, moŝna je podawać IM (lub ID), a białka bakteryjne moŝna podawać IN (lub ID). Ponadto szczepionki według wynalazku moŝna podawać IM przy dawkach początkowych oraz IN przy dawkach przypominających. [0074] Wytwarzanie szczepionek ogólnie opisano w Vaccine Design ("The subunit and adjuvant approach" (red. Powell M.F. i Newman M.J.) (199) Plenum Press New York). Zamykanie w liposomach opisał Fullerton, opis patentowy US [007] Kolejny aspekt wynalazku stanowi zestaw szczepionkowy do równoczesnego lub kolejnego podawania, zawierający dwie wielowaŝne kompozycje immunogenne do zapewniania ochrony u gospodarza przeciw chorobie wywołanej przez Bordetella pertussis, Clostridium tetani, [0076] Corynebacterium diphtheriae, Haemophilus influenzae i Neisseria meningitidis. Przykładowo zestaw ewentualnie zawiera pierwszy pojemnik zawierający jedną lub większą liczbę z: anatoksyny tęŝcowej (TT), anatoksyny błoniczej (DT), oraz całych komórek lub bezkomórkowych składników krztuścowych oraz drugi pojemnik zawierający: koniugat sacharydu Hib, oraz co najmniej dwa dalsze koniugaty sacharydów bakteryjnych, przy czym koniugat Hib jest obecny w niŝszej dawce sacharydu niŝ średnia dawka wszystkich co najmniej dwóch dalszych koniugatów sacharydów bakteryjnych; lub koniugat sacharydu Hib, oraz co najmniej dwa dalsze koniugaty sacharydów bakteryjnych, przy czym koniugat Hib jest obecny w niŝszej dawce sacharydu niŝ kaŝdy z dwóch dalszych koniugatów sacharydów bakteryjnych; (np. w niŝszej dawce sacharydu niŝ którykolwiek sacharyd obecny w kompozycji). [0077] Przykłady koniugatu Hib oraz co najmniej dwóch dalszych koniugatów sacharydów bakteryjnych opisano powyŝej. [0078] Dalszym aspektem wynalazku jest zestaw szczepionkowy do podawania równocześnie lub kolejno, zawierający dwie wielowaŝne kompozycje immunogenne do wywoływania ochrony u gospodarza przeciw chorobom wywoływanym przez Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae i Neisseria meningitidis. Przykładowo zestaw ewentualnie zawiera pierwszy pojemnik zawierający:

16 jeden lub większą liczbę koniugatów białka nośnikowego oraz sacharyd otoczkowy z Streptococcus pneumoniae [gdzie sacharyd(y) otoczkowy jest/są ewentualnie z serotypu pnemokokowego wybranego z grupy obejmującej 1, 2, 3, 4,, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, A, 11A, 12F, 14, 1B, 17F, 18C, 19A, 19F,, 22F, 23F i 33F]. oraz drugi pojemnik zawierający: koniugat sacharydu Hib, oraz co najmniej dwa dalsze koniugaty sacharydów bakteryjnych, przy czym koniugat Hib jest obecny w niŝszej dawce sacharydu niŝ średnia dawka sacharydu wszystkich tych co najmniej dwóch dalszych koniugatów sacharydów bakteryjnych; lub koniugat sacharydu Hib, oraz co najmniej dwa dalsze koniugaty sacharydów bakteryjnych, przy czym koniugat Hib jest obecny w niŝszej dawce sacharydu niŝ kaŝdy z co najmniej dwóch dalszych koniugatów sacharydów bakteryjnych (np. w niŝszej dawce sacharydu niŝ jakikolwiek sacharyd obecny w kompozycji). [0079] Przykłady koniugatu Hib i co najmniej dwóch dalszych koniugatów sacharydów bakteryjnych są takie jak opisano powyŝej. [0080] Zazwyczaj szczepionka Streptococcus pneumoniae w zestawie szczepionkowym według wynalazku będzie zawierać antygeny polisacharydowe (ewentualnie sprzęŝone), przy czym polisacharydy pochodzą z co najmniej czterech serotypów pneumokoków wybranych z grupy obejmującej 1, 2, 3, 4,, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, A, 11A, 12F, 14, 1B, 17F, 18C, 19A, 19F,, 22F, 23F i 33F. Ewentualnie cztery serotypy obejmują 6B, 14, 19F i 23F. Dodatkowo ewentualnie do kompozycji jest włączonych7 serotypów, przykładowo te pochodzące z serotypów 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F i 23F. Ewentualnie do kompozycji jest włączonych ponad 7 serotypów, przykładowo co najmniej, 11, 12, 13 lub 14 serotypów. Przykładowo kompozycja w jednej postaci zawiera 11 polisacharydów otoczkowych pochodzących z serotypów 1, 3, 4,, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F i 23F (ewentualnie sprzęŝonych). W jednej postaci według wynalazku włączonych jest co najmniej 13 antygenów polisacharydowych (ewentualnie sprzęŝonych), jednakŝe dalsze antygeny polisacharydowe, przykładowo 23-waŜne (takie jak serotypy 1, 2, 3, 4,, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, A, 11A, 12F, 14, 1B, 17F, 18C, 19A, 19F,, 22F, 23F i 33F) są takŝe rozwaŝane w wynalazku. [0081] Sacharydy pneumokokowe są sprzęŝone z dowolnym znanym białkiem nośnikowym, przykładowo CRM197, anatoksyną tęŝcową, anatoksyną błoniczą, białkiem D lub

17 dowolnym innym wspomnianym powyŝej białkiem nośnikowym. [0082] Ewentualnie, zestawy szczepionkowe według wynalazku zawierają trzeci składnik. Przykładowo zestaw ewentualnie zawiera pierwszy pojemnik zawierający jedną lub większą liczbę z: anatoksyny tęŝcowej (TT), anatoksyny błoniczej (DT), oraz całych komórek lub bezkomórkowych składników krztuścowych oraz drugi pojemnik zawierający: jeden lub większą liczbę koniugatów białka nośnikowego oraz sacharyd otoczkowy z Streptococcus pneumoniae [gdzie sacharyd(y) otoczkowy(e) jest/są ewentualnie z serotypu pnemokokowego wybranego z grupy obejmującej 1, 2, 3, 4,, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, A, 11A, 12F, 14, 1B, 17F, 18C, 19A, 19F,, 22F, 23F i 33F]. oraz trzeci pojemnik zawierający: koniugat sacharydu Hib, oraz co najmniej dwa dalsze koniugaty sacharydów bakteryjnych, przy czym koniugat Hib jest obecny w niŝszej dawce sacharydu niŝ średnia dawka sacharydu wszystkich co najmniej dwóch dalszych koniugatów sacharydów bakteryjnych; lub koniugat sacharydu Hib, oraz co najmniej dwa dalsze koniugaty sacharydów bakteryjnych, przy czym koniugat Hib jest obecny w niŝszej dawce sacharydu niŝ kaŝdy z co najmniej dwóch dalszych koniugatów sacharydów bakteryjnych (np. w niŝszej dawce sacharydu niŝ jakikolwiek sacharyd obecny w kompozycji). [0083] Kompozycje immunogenne zawierające koniugaty meningokokowe, przykładowo HibMenC, HibMenAC, HibMenAW, HibMenAY, HibMenCW, HibMenCY, HibMenWY, MenAC, MenAW, MenAY, MenCW, MenCY, MenWY lub MenACWY, włącznie z zestawami o podobnym składzie do tych opisanych powyŝej, ewentualnie zawierają antygeny odry i/lub świnki i/lub róŝyczki i/lub ospy wietrznej. Przykładowo meningokokowa kompozycja immunogenna zawiera antygeny z odry, świnki, i róŝyczki lub odry, świnki, róŝyczki i ospy wietrznej. W jednej postaci, te antygeny wirusowe są ewentualnie obecne w tym samym opakowaniu co meningokokowe i/lub koniugat(y) sacharydu Hib. W jednej postaci te antygeny wirusowe są liofilizowane. [0084] Kolejny aspekt wynalazku stanowi sposób wytwarzania kompozycji immunogennej według wynalazku, obejmujący etap mieszania koniugatu sacharydu Hib z co najmniej

18 dwoma dalszymi koniugatami sacharydów bakteryjnych z wytworzeniem kompozycji, w której koniugat Hib jest obecny w niŝszej dawce sacharydu niŝ średnia dawka sacharydu co najmniej dwóch dalszych koniugatów sacharydów bakteryjnych. [008] Wytwarzanie szczepionki ogólnie opisano w Vaccine Design ("The subunit and adjuvant approach" (red. Powell M.F. & Newman M.J.) (199) Plenum Press New York). Zamykanie w liposoamach opisano w Fullerton, opis patentowy US [0086] Kolejny aspekt wynalazku stanowi sposób szczepienia gospodarza będącego człowiekiem przeciw chorobie wywołanej zakaŝeniem Haemophilus influenzae oraz ewentualnie N. meningitidis, obejmujący podawanie gospodarzowi immunoochronnej dawki kompozycji immunogennej lub szczepionki albo zestawu według wynalazku. [0087] Kolejny aspekt wynalazku stanowi kompozycja immunogenna według wynalazku do zastosowania w leczeniu lub profilaktyce choroby wywołanej przez Haemophilus influenzae oraz ewentualnie N. meningitidis. [0088] Kolejny aspekt wynalazku stanowi zastosowanie kompozycji immunogennej lub szczepionki lub zestawu według wynalazku do wytwarzania leku do leczenia lub profilaktyki chorób wywoływanych przez Haemophilus influenzae i ewentualnie N. meningitidis. [0089] W zamierzeniu twórców uŝywane określenia "zawierający", "zawierać" i "zawiera" w kaŝdym przypadku są ewentualnie zamienne z określeniami odpowiednio "składający się z", "składać się z" oraz "składa się z". [0090] Wynalazek jest zilustrowany przez dołączone przykłady. PoniŜsze przykłady wykonano z zastosowaniem standardowych technik, które są dobrze znane i rutynowo stosowane fachowców w dziedzinie wynalazku, z wyjątkiem przypadków gdy opisano je szczegółowo. Przykłady zamieszczono w celu zilustrowania wynalazku i nie ograniczają one jego zakresu. Przykłady Przykład 1 wytwarzanie koniugatów polisacharydu [0091] Kowalencyjne sprzęganie polisacharydu PRP Haemophilus influenzae (Hib) z TT przeprowadzono w reakcji sprzęgania opracowanej przez Chu i wsp. (Infection and Immunity 1983, 40 (1); 24-26). Polisacharyd Hib PRP aktywowano przez dodanie CNBr i inkubację w ph, przez 6 minut. ph obniŝono do 8,7, dodano dihydrazyd kwasu adypinowego (ADH) i inkubacje kontynuowano przez dalsze 90 minut. Aktywowany PRP sprzęŝono z oczyszczoną anatoksyną tęŝcową przez kondensację karbodiimidową z uŝyciem 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodiimidu (EDAC). EDAC dodano do aktywowanego PRP do uzyskania końcowej stosunku 0,6 mg EDAC/mg aktywowanego PRP. ph doprowadzono do,0 i dodano oczyszczoną anatoksynę tęŝcową do uzyskania 2 mg

19 TT/mg aktywowanego PRP. Otrzymany roztwór pozostawiono na trzy dni w trakcie łagodnego mieszania. Po przesączeniu przez membranę 0,4 µm koniugat oczyszczono na kolumnie Sephacryl S00HR (Pharmacia, Szwecja) równowaŝonej 0,2M NaCl. [0092] Koniugaty MenC-TT wytworzono z zastosowaniem natywnych polisacharydów (o masie ponad kda zmierzonej metodą MALLS). Koniugaty MenA-TT wytworzono z zastosowaniem natywnego polisacharydu lub w niewielkim stopniu mikrofluidyzowanego polisacharydu o masie ponad 60 kda zmierzonej metodą MALLS z Przykładu 2. Koniugaty MenW i MenY-TT wytworzono z zastosowaniem polisacharydów o dopasowanej wielkości około 0-0 kda zmierzonej metodą MALLS (patrz Przykład 2). Dopasowywanie wielkości przeprowadzono przez mikrofluidyzację z zastosowaniem homogenizatora aparatu Emulsiflex C-0. Następnie polisacharydy przesączono przez filtr 0,2µm. [0093] Aktywację i sprzęganie przeprowadzono tak jak opisano w WO96/29094 i WO 00/6360. W skrócie polisacharyd w stęŝeniu - mg/ml w 2M NaCl ph,-6,0 zmieszano z roztworem CDAP (0 mg/ml świeŝo przygotowany w acetonitrilu/wfi, 0/0) do końcowego stosunku CDAP/polisacharyd 0,7/1 lub 1,/1. Po 1, minuty ph podwyŝszono wodorotlenkiem sodu do ph,0. Po trzech minutach dodano anatoksynę tęŝcową do uzyskania stosunku białko/polisacharyd 1,/1 dla MenW, 1,2/1 dla MenY, 1,/1 dla MenA lub 1,/1 dla MenC. Reakcję kontynuowano przez jedną do dwóch godzin. [0094] Po etapie sprzęgania dodano glicynę do końcowego stosunku glicyna/ps (wag./wag.) 7,/1 i ph doprowadzono do 9,0. Mieszaninę pozostawiono na minut. Koniugat oczyszczono z zastosowaniem filtru µm Kleenpak, a następnie naniesiono na kolumnę Sephacryl S400HR z zastosowaniem buforu do wymywania mm NaCl, mm lub mm Tris ph 7,. Kliniczne partie przesączono przez membranę sterylizującą Opticap 4. Otrzymane koniugaty miały średnia proporcję polisacharyd:białko 1:1-1: (wag./wag.). [009] W celu sprzęŝenia polisacharydu otoczkowego MenA z anatoksyną tęŝcową przez odstępnik zastosowano następująca metodę. Kowalencyjne sprzęganie polisacharydu i odstępnika (ADH) przeprowadzono w reakcji sprzęgania, zgodnie z którym polisacharyd aktywuje się w kontrolowanych warunkach środkiem cyjanylującym, tetrafluoroboranem 1- cyjano-4-dimetyloaminopirydyny (CDAP). Odstępnik reaguje z cyjanylowanym PS przez swoje grupy hydrazynowe z wytworzeniem stabilnego wiązania izomocznikowego pomiędzy odstępnikiem a polisacharydem. [0096] Roztwór mg/ml MenA potraktowano świeŝo przygotowanym roztworem 0 mg/ml CDAP w acetonitrylu/wodzie (0/0 (obj./obj.)) do uzyskania stosunku CDAP/MenA 0,7 (wag./wag.). Po 1, minuty ph podwyŝszono do ph,0. Trzy minuty później dodano ADH do uzyskania stosunku ADH/MenA 8,9. ph roztworu obniŝono do

20 19 1 8,7 i reakcję prowadzono przez 2 godziny. Przed reakcją sprzęgania roztwór oczyszczonej TT i roztwór PSA AH rozcieńczono do uzyskania stęŝenia mg/ml PSA AH i mg/ml dla TT. EDAC dodano do roztworu PS AH do uzyskania końcowego stosunku 0,9 mg EDAC/mg PSA AH. ph doprowadzono do,0. Oczyszczoną anatoksynę tęŝcową dodano z uŝyciem pompy perystaltycznej (przez 60 minut) do uzyskania 2 mg TT/mg PSA AH. Powstały roztwór pozostawiono na 60 minut w +2 C w trakcie mieszania, do osiągnięcia końcowego czasu sprzęgania 1 minut. Koniugat oczyszczono z zastosowaniem filtra µm i oczyszczono stosując kolumnę Sephacryl S400HR. Przykład 2 wyznaczenie masy cząsteczkowej metodą MALLS [0097] Detektory sprzęgnięto z kolumną HPLC do chromatografii z wykluczeniem wielkości, z której wymywano próbki. Z jednej strony laserowy detektor fotodyspersyjny mierzył natęŝenie światła rozpraszanego w 16 kątach przez roztwór makrocząsteczek, a z drugiej strony refraktometr interferometryczny umieszczony szeregowo umoŝliwiał wyznaczenie ilości wymytej próbki. Na podstawie tych natęŝeń moŝna wyznaczyć wielkość i kształt makrocząsteczek w roztworze. [0098] Średnią masę cząsteczkową (M w ) zdefiniowano jako sumę mas wszystkich form cząsteczek pomnoŝoną przez ich odpowiednie masy cząsteczkowe i podzielona przez sumę mas wszystkich form cząsteczek. a) Wagowo średnia masa cząsteczkowa: -Mw- b) Liczbowo średnia masa cząsteczkowa: -Mn- 2 c) Średnia kwadratowa wartość promienia: -Rw-, przy czym R 2 w oznacza kwadrat promienia zdefiniowany jako:

21 1 2 (-m i - oznacza masę centrum rozpraszającego, a i oraz -r i - oznaczają odległość pomiędzy centrum rozpraszającym i oraz centrum cięŝkości makrocząsteczki). d) Polidyspersyjność jest zdefiniowana jako stosunek -Mw/Mn-. [0099] Polisacharydy meningokokowe analizowano metodą MALLS przez naniesienie na dwie kolumny HPLC (TSKG6000 i 000PWxl) stosowane w połączeniu. 2 µl polisacharydu naniesiono na kolumnę i wymyto 0,7 ml przesączonej wody. Poliacharydy wykrywano z uŝyciem detektora fotodyspersyjnego (Wyatt Dawn DSP wyposaŝonego w mw laser argonowy przy 488 nm) i refraktometru interferometrycznego (Wyatt Otilab DSP wyposaŝonego w celkę P0 z czerwonym filtrem przy 498 nm) [00] Polidyspersyjności masy cząsteczkowej oraz odzysk wszystkich próbek obliczono metodą Debye a z zastosowaniem dopasowania wielomianowego rzędu 1 w oprogramowaniu Astra Przykład 3 Próba kliniczna fazy II ze szczepionką sprzęŝoną HibMenAC -TT zmieszaną z DTPw-HepB [01] Projekt badania: Otwarte, randomizowane (1:1:1:1:1) badanie w jednym ośrodku z pięcioma grupami. Pięć grup otrzymało poniŝszy harmonogram szczepienia odpowiednio w wieku 6, i 14 tygodni. Tritanrix -HepB/Hib-MenAC 2,/2,/2,: poniŝej określana jako 2,/2,/2, Tritanrix -HepB/Hib-MenAC 2,//: poniŝej określana jako 2,// Tritanrix -HepB/Hib-MenAC //: poniŝej określana jako // Tritanrix -HepB + Hiberix : poniŝej określana jako Hiberix Tritanrix -HepB/Hiberix + Meningitec : poniŝej określana jako Meningitec. Próbki krwi pobierano w momencie podania pierwszej dawki szczepionki (Pre) oraz jeden miesiąc po trzeciej dawce szczepionki (Post-dose 3). [02] Tritanrix jest szczepionką DTPw wytwarzana przez GlaxoSmithKline Biologicals S.A. [03] W kaŝdej z pięciu grup zastosowano pacjentów, tak Ŝe całkowita liczbę pacjentów w badaniu wynosiła 2. Tabela 1 Składniki na dawkę (0, ml) 2,/2,/2,* 2,// // Polisacharyd otoczkowy Hib PRP sprzęŝony z anatoksyną tęŝcową (TT) 2, µg 2, µg µg