(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/EP03/012160

Transkrypt

1 PL B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/EP03/ (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: , WO04/ (13) B1 (51) Int.Cl. A61K 39/13 ( ) A61P 31/12 ( ) (54) Kompozycja immunogenna, sposób wytwarzania szczepionki, zestaw, szczepionka i pojemnik zawierające tę kompozycję oraz sposób konserwowania kompozycji (30) Pierwszeństwo: , GB, , GB, , GB, , GB, , GB, , GB, (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 01/06 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 04/13 (73) Uprawniony z patentu: GlaxoSmithKline BIOLOGICALS S.A., Rixensart, BE (72) Twórca(y) wynalazku: YVES MAYERESSE, Rixensart, BE JEAN STEPHENNE, Rixensart, BE (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Zofia Sulima

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest kompozycja immunogenna zawierająca IPV, otoczkowy polisacharyd lub oligosacharyd z Haemophilus influenzae b (Hib) i środek stabilizujący, sposób wytwarzania szczepionki zawierającej tę kompozycję immunogenną oraz zestaw, szczepionka i pojemnik zawierające tę kompozycję immunogenną, a ponadto sposób konserwowania kompozycji zawierającej IPV, polisacharyd lub oligosacharyd Hib i środek stabilizujący. Kompozycje immunogenne według wynalazku stanowią suchy stały preparat lub ciekły preparat o wysokiej lepkości inaktywowanego wirusa polio (IPV), który zachowuje immunogenność. Takie preparaty można roztwarzać przed użyciem lub stosować bezpośrednio. IPV jest dobrze znanym składnikiem szczepionek, jednakże jest formułowany w postaci cieczy, np. w Infanrix penta. Proces suszenia sublimacyjnego IPV wiąże się z utratą antygenowości, tak że trudno jest formułować skuteczną szczepionkę zawierającą suszoną postać IPV. Znane są suszone preparaty szczepionek, w szczególności w przypadku bakteryjnych polisacharydów. Polisacharyd PRP Haemophilus influenzae b (Hib) jest często formułowany jako suszona substancja stała, np. w Infanrix hexa (WO 99/48525). Istnieje kilka powodów, dla których suszone preparaty IPV mogą być korzystne. Suszone preparaty wykazują dobre właściwości przy przechowywaniu i mogą wydłużyć okres trwałości szczepionki zawierającej IPV. Możliwość suszenia IPV czyni także IPV bardziej uniwersalnym składnikiem szczepionki i umożliwia jego formułowanie w nowych złożonych szczepionkach, które wcześniej nie były możliwe. Niektóre szczepionki zawierają ciekłe i suszone stałe składniki, które miesza się bezpośrednio przed podaniem (np. Infanrix hexa ). Infanrix hexa zawiera suszony składnik Hib, który roztwarza się z DTPa- HepB-IPV bezpośrednio przed użyciem. Podczas formułowania IPV wraz z Hib jako suszonej substancji stałej można dodawać dodatkowe składniki do ciekłej części szczepionki, które w innym wypadku mogłyby być niezgodne z IPV. Znanych jest kilka sposobów suszenia składników szczepionek. Tradycyjnie realizowano je stosując proces suszenia sublimacyjnego, w którym wytwarza się roztwór substancji i próbkę zamraża się. Podczas początkowej fazy suszenia większość wody usuwa się przez sublimację z lodu w warunkach obniżonego ciśnienia i tworzy się porowaty placek. Zazwyczaj następnie zachodzi wtórna faza suszenia, gdy zmienia się ciśnienie i temperaturę, a wodę odparowuje się ze stałego placka. Powstała zliofilizowana próbka ma polepszoną trwałość w porównaniu z preparatem ciekłym. Jednakże proces suszenia sublimacyjnego trwa długo i może stanowić etap ograniczający szybkość w procesie produkcji. Zmienność produktu stanowi również problem, gdy wiele próbek liofilizuje się okresowo w dużej jednostce suszącej. Warunki panujące na półkach suszarki sublimacyjnej różnią się między różnymi położeniami, co prowadzi do uzyskania próbek liofilizowanych z różną szybkością w różnych warunkach. W przypadku pewnych materiałów biologicznych, takich jak żywe wirusy, podczas procesu suszenia sublimacyjnego może występować istotny spadek aktywności (Pika (1994) ACS Symposium 567: ). Wiele substancji suszonych sublimacyjnie jest w dalszym ciągu nietrwałych w temperaturze otoczenia (Carpenter i in., (1994) ACS Symposium 567: ). Uszkodzenie powodowane przez proces zamrażania można do pewnego stopnia wyeliminować stosując substancje krioprotekcyjne, takie jak poliole. Dokonano dalszych ulepszeń procesu liofilizacji przez niezamrażanie próbki podczas procesu i usuwanie wody przez gotowanie (WO 96/40077; US ). Ten sposób polega na tym, że wytwarza się mieszaninę materiału tworzącego szklistą matrycę w odpowiednim rozpuszczalniku wraz z konserwowaną próbką, odparowuje się rozpuszczalnik z mieszaniny z otrzymaniem syropu, syrop poddaje się działaniu ciśnienia i temperatury wystarczających do zagotowania syropu i usunięcia resztkowego rozpuszczalnika. Podobny sposób opisano w US , przy czym sposób ten polega na tym, że usuwa się częściowo wodę z uzyskaniem lepkiego płynu, a następnie poddaje się syrop działaniu próżni w celu zagotowania go, po czym suszy się w temperaturze zasadniczo niższej od 100 C. Ten sposób w dalszym ciągu ma pewne wady znanego procesu suszenia sublimacyjnego. Gdy sposób realizuje się w dużych suszarkach sublimacyjnych, próbki schną z różną szybkością w zależności od ich położenia na półce, co prowadzi do tego, że różne próbki tracą różną część aktywności podczas procesu suszenia. Prowadzi to do braku jednorodności w obrębie jednej partii. Dotychczas nie opisano żadnego skutecznego przykładu wytwarzania suszonego stałego preparatu szczepionki IPV, który zachowywałby wysoki stopień antygenowości i/lub immunogenności.

3 PL B1 3 Wynalazek dotyczy kompozycji immunogennej zawierającej IPV, otoczkowy polisacharyd lub oligosacharyd z Haemophilus influenzae b (Hib) i środek stabilizujący, charakteryzującej się tym, że jest formułowana w całości jako suszona kompozycja, która po roztworzeniu może wywoływać odpowiedź odpornościową przeciw wirusowi polio, przy czym immunogenność typu 1 jest zachowana na poziomie co najmniej 40% immunogenności próbki odniesienia, która nie została poddana suszeniu. Korzystna jest kompozycja immunogenna według wynalazku, w której polisacharyd lub oligosacharyd jest sprzężony z białkiem nośnikowym. Korzystna jest kompozycja immunogenna, w której polisacharyd lub oligosacharyd jest sprzężony z anatoksyną tężcową. Korzystna jest kompozycja immunogenna, w której polisacharyd lub oligosacharyd jest zaadsorbowany na fosforanie glinu. Korzystnie kompozycja immunogenna zawiera otoczkowy polisacharyd lub oligosacharyd pochodzący z N. meningitidis C. Korzystnie kompozycja immunogenna dodatkowo zawiera otoczkowy polisacharyd lub oligosacharyd pochodzący z dowolnej spośród N. meningitidis A, C, Y i W lub ich połączenie. Korzystna jest kompozycja immunogenna, w której meningokokowe polisacharydy lub oligosacharydy są sprzężone z białkiem nośnikowym. Korzystnie kompozycja immunogenna zawiera polisacharyd lub oligosacharyd Hib i co najmniej jeden meningokokowy polisacharyd lub oligosacharyd sprzężony z białkiem nośnikowym tego samego typu. Korzystnie kompozycja immunogenna zawiera polisacharyd lub oligosacharyd Hib i co najmniej jeden meningokokowy polisacharyd lub oligosacharyd sprzężony z różnymi białkami nośnikowymi. Korzystnie kompozycja immunogenna dodatkowo zawiera czerwień fenolową. Korzystna jest kompozycja immunogenna, charakteryzująca się tym, że suszona kompozycja jest suszona sublimacyjnie. Korzystna jest kompozycja immunogenna, charakteryzująca się tym, że suszoną kompozycję stanowi spieniony produkt szklisty. Korzystna jest kompozycja immunogenna, charakteryzująca się tym, że suszoną kompozycję stanowi ciecz o wysokiej lepkości. Korzystna jest kompozycja immunogenna, charakteryzująca się tym, że ciecz o wysokiej lepkości nie została zamrożona. Wynalazek dotyczy również sposobu wytwarzania szczepionki, który obejmuje etap roztwarzania kompozycji immunogennej zdefiniowanej powyżej w wodnym roztworze. Korzystny jest sposób, w którym roztwór wodny zawiera anatoksynę błoniczą, anatoksynę tężcową i antygeny krztuścowe (bezkomórkowe lub pełnokomórkowe). Korzystny jest sposób, w którym szczepionka DTP jest co najmniej częściowo adiuwantowana wodorotlenkiem glinu. Korzystny jest sposób, w którym wodny roztwór zawiera antygen powierzchniowy wirusa zapalenia wątroby typu B. Wynalazek dotyczy ponadto zestawu, który zawiera kompozycję immunogenną zdefiniowaną powyżej w jednym pojemniku i ciekłą szczepionkę DTP (bezkomórkową lub pełnokomórkową) w drugim pojemniku. Korzystnie zestaw dodatkowo zawiera antygen powierzchniowy wirusa zapalenia wątroby typu B w drugim pojemniku. Wynalazek dotyczy także szczepionki, która zawiera kompozycje immunogenne zdefiniowane powyżej. Korzystna jest szczepionka, którą przed użyciem roztwarza się w roztworze wodnym. Wynalazek dotyczy również pojemnika, który ma hydrofobową powierzchnię wewnętrzną i zawiera szczepionkę zdefiniowaną powyżej. Wynalazek dotyczy ponadto sposobu konserwowania kompozycji zawierającej IPV, polisacharyd lub oligosacharyd Hib i środek stabilizujący, obejmującego etapy: a) wytwarzania konserwowanej próbki przez przeprowadzenie w stan zawiesiny lub rozpuszczenie IPV i bakteryjnego polisacharydu lub oligosacharydu w roztworze środka stabilizującego; b) poddawania konserwowanej próbki takim warunkom ciśnienia i temperatury, że z konserwowanej próbki uwalniany jest rozpuszczalnik; i c) usuwania rozpuszczalnika;

4 4 PL B1 charakteryzującego się tym, że rozpuszczalnik usuwa się do momentu, gdy konserwowana próbka wyschnie z utworzeniem substancji stałej lub cieczy o wysokiej lepkości, w której zachowana jest antygenowość IPV, przy czym immunogenność typu 1 jest zachowana na poziomie co najmniej 40% immunogennośći próbki odniesienia, która nie została poddana suszeniu. Korzystnie konserwowaną próbkę suszy się w pojemniku mającym hydrofobową powierzchnię wewnętrzną. W korzystnym sposobie w konserwowanej próbce powstają pęcherzyki z utworzeniem piany podczas etapu b). Korzystnie próbkę co najmniej częściowo zamraża się przed rozpoczęciem procesu suszenia. W korzystnym sposobie konserwowana próbka ulega co najmniej częściowemu zamrożeniu podczas etapu b). W korzystnym sposobie podczas etapu b) konserwowaną próbkę poddaje się takim warunkom temperatury i ciśnienia, że z konserwowanej próbki uwalniany jest rozpuszczalnik przez odparowanie, bez zamrażania ani powstawania pęcherzyków prowadzącego do tworzenia piany, z utworzeniem lepkiej cieczy, a podczas etapu c) rozpuszczalnik usuwa się do momentu, gdy konserwowana próbka wyschnie z utworzeniem cieczy o wysokiej lepkości. W korzystnym sposobie konserwowana próbka zawiera polisacharyd lub oligosacharyd pochodzący z dowolnej spośród N. meningitidis A, C, Y i W lub ich połączenie. Tak więc ujawniono kompozycję immunogenną zawierającą IPV i środek stabilizujący, formułowaną jako suszoną kompozycję lub ciecz o wysokiej lepkości, która po roztworzeniu jest zdolna do wytwarzania odpowiedzi odpornościowej przeciw wirusowi polio. Obecność środka stabilizującego jest kluczowa dla konserwacji antygenów i wykazano, że poliole są pod tym względem skuteczne. IPV suszy się w obecności polisacharydu bakteryjnego, co prowadzi do zachowania wysokiego odsetka wyjściowych antygenów pod względem antygenowości i/lub immunogenności. Wynalazek obejmuje sposoby konserwacji kompozycji zawierającej IPV, w obecności bakteryjnego polisacharydu i ewentualnie poliolu, przy zachowaniu antygenowości i/lub immunogenności IPV. Liofilizacja IPV w obecności polisacharydów prowadzi do ulepszenia zachowania antygenu dla IPV w porównaniu z samą liofilizacją IPV. Dodatkowo immunogenność Hib ulega także wzmocnieniu przez formułowanie go razem z IPV jako suszonej substancji stałej lub cieczy o wysokiej lepkości. W szczególności stwierdzono, że gdy roztwarza się go przed użyciem w ciekłych szczepionkach DTP (opisanych poniżej), miana Hib nie ulegają takiemu spadkowi pod wpływem wodorotlenku glinu, składnika szczepionki DTP, jak byłoby w przypadku braku IPV. Stosowany proces suszenia może także wpływać na zachowanie antygenowości i/lub immunogenności IPV. Proces suszenia spieniającego w przypadku suszenia IPV był bardziej skuteczny pod względem zachowania antygenowości IPV, niż znane techniki suszenia sublimacyjnego. Nieoczekiwanie dodanie etapu zamrażania do procesu suszenia spieniającego nie doprowadziło do utraty antygenowości, ale raczej doprowadziło do uzyskania szybkiego i skutecznego procesu konserwacji. Inny korzystny sposób według wynalazku umożliwia zachowanie wysokiego stopnia antygenowość i/lub immunogenność IPV przez suszenie próbki zawierającej IPV bez zamrażania ani tworzenia piany, prowadząc do utworzenia suszonego preparatu, korzystnie preparatu ciekłego o wysokiej lepkości. Zgodnie z wynalazkiem uzyskano suszony preparat IPV, którego zaletą jest trwałość w trakcie przechowywania. Suszony preparat można szybko i łatwo roztworzyć tuż przed podaniem. Gdy stosuje się korzystny proces suszenia spieniającego, uzyskany placek jest szczególnie łatwy do roztworzenia ze względu na większą powierzchnię suszu. Dodatkowe zalety suszonego stałego preparatu IPV i Hib lub ciekłego preparatu IPV i Hib o wysokiej lepkości obejmują wzmożoną immunogenność składnika Hib. Dobrze wiadomo, że w wieloskładnikowych szczepionkach inne składniki preparatu szczepionki mogą prowadzić do interferencji z immunogennością Hib (WO 96/40242, WO 97/00697). Uwzględnienie IPV w suszonym preparacie z Hib może zmniejszyć ten problem, szczególnie jeżeli suszoną kompozycję IPV-Hib przed podaniem miesza się ze składnikami błoniczymi, tężcowymi i krztuścowymi. Chociaż liofilizacja IPV w obecności polisacharydu bakteryjnego jest możliwa z zastosowaniem znanego podejścia polegającego na suszeniu sublimacyjnym, korzystne jest stosowanie procesu suszenia spieniającego lub łagodnego procesu suszenia, który nie obejmuje zamrażania ani tworzenia piany. Te procesy prowadzą do jeszcze większego zachowania antygenowości i/lub immunogennośći IPV, a powstały placek" jest także łatwiejszy do roztworzenia i roztwarzanie zachodzi szybciej. Zaletą

5 PL B1 5 tych procesów jest również to, że przebiegają szybciej i są bardziej wydajne energetycznie niż zwykłe procesy suszenia sublimacyjnego. Ponieważ etap liofilizacji jest często etapem ograniczającym szybkość produkcji szczepionki, zastosowanie korzystnych procesów może prowadzić do produkcji większych ilości szczepionki bez dodatkowej inwestycji w instalację. Dodanie etapu zamrażania do korzystnego procesu suszenia spieniającego prowadzi także to ulepszonej powtarzalności serii. Wynalazek bardziej szczegółowo opisano poniżej. Kompozycje immunogenne według wynalazku Wynalazek obejmuje kompozycje immunogenne, formułowane jako suszone substancje stałe lub ciecze o wysokiej lepkości zawierające IPV i środek stabilizujący, w których po roztworzeniu zachowana jest antygenowość i/lub immunogenność IPV. Suszony stały lub ciekły preparat IPV o wysokiej lepkości jest zdolny do wytwarzania odpowiedzi odpornościowej, korzystnie ochronnej odpowiedzi odpornościowej, przeciw wirusowi polio, korzystnie po roztworzeniu i zaszczepieniu. IPV definiuje się jako inaktywowany wirus polio (korzystnie zawierający typy 1, 2 i 3, co jest standardem w szczepionkach, najkorzystniej szczepionkę przeciw polio Salka). Dawka szczepionki IPV zawiera 20-80, korzystnie 40 lub 80 jednostek antygenu D typu 1 (Mahoney), 4-16, korzystnie 8 lub 16 jednostek antygenu D typu 2 (MEF-1) i 20-64, korzystnie 32 lub 64 jednostki antygenu D typu 3 (Saukett). W przypadku suszenia sposobem według wynalazku korzystnie zachowaniu ulega antygenowość typu 1, 2 lub wszystkich 3 typów 1, 2 i 3 wirusa polio; korzystniej zachowane jest co najmniej 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% lub 98% antygenowości typu 1, typu 2, typu 3, typu 1 i typu 2, typu 1 i typu 3, typu 2 i typu 3 lub typu 1, typu 2 i typu 3, w porównaniu z próbką wzorcową, której nie poddawano procesowi suszenia. Można ją zmierzyć po roztworzeniu suszonej substancji stałej lub cieczy o wysokiej lepkości w roztworze wodnym, dowolnym odpowiednim sposobem, obejmującym test ELISA przy użyciu przeciwciał poliklonalnych i/lub monoklonalnych przeciw wirusowi polio typu 1, 2 i/lub 3. W przypadku suszenia sposobem według wynalazku korzystnie zachowaniu ulega immunogenność typu 1, 2 lub wszystkich 3 typów 1, 2 i 3 wirusa polio; korzystniej zachowane jest co najmniej 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% lub 98% immunogenności typu 1, typu 2, typu 3, typu 1 i typu 2, typu 1 i typu 3, typu 2 i typu 3 lub typu 1, typu 2 i typu 3, w porównaniu z próbką wzorcową, której nie poddawano procesowi suszenia. Można ją zmierzyć po roztworzeniu suszonej substancji stałej lub cieczy o wysokiej lepkości w roztworze wodnym, dowolnym odpowiednim sposobem. W korzystnym sposobie suszony preparat roztwarza się w wodnym roztworze i zwierzę, korzystnie szczur, jest nim szczepiony. Po upływie odpowiedniego okresu czasu od szczepionych zwierząt pobiera się surowice i bada się serokonwersję. Korzystnie uzyskuje się względną siłę działania wynoszącą co najmniej 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8 lub 0,9 w porównaniu z niesuszoną próbką wzorcową. Suszona stała kompozycja stanowi preparat, z którego usunięto rozpuszczalnik w procesie liofilizacji, sublimacji, odparowania lub wysuszania, tak że pozostało w nim co najwyżej 15%, 12%, 10%, 7%, 5%, 4%, korzystnie 3%, 2% lub najkorzystniej 1% rozpuszczalnika. Określenie suszona substancja stała" obejmuje produkty szkliste, żywice lub krystaliczne substancje stałe o wyglądzie substancji stałej. Do wytwarzania takiej suszonej substancji stałej można stosować którykolwiek z opisanych wyżej sposobów. Rozpuszczalnik usuwa się przez sublimaeję, gotowanie lub odparowanie, korzystnie przez odparowanie. Ciecz o wysokiej lepkości jest definiowana jako materiał, w którym zawartość rozpuszczalnika wynosi co najwyżej 15, 12, 10, korzystnie 8, 5, 4, 3, 2 lub 1%. Ciecz o wysokiej lepkości ma wystarczająco małą zawartość rozpuszczalnika, tak że środek czynny jest konserwowany w stanie stabilnym przez co najmniej 3, 6, 9, 12 lub 24 miesiące w temperaturze 4 C, umożliwiając czynnemu środkowi zachowanie co najmniej 40, 50, 60, korzystnie 70, 80, 90, 95% antygenowości i/lub immunogenności w tym okresie czasu. Ciecz o wysokiej lepkości nie była poddawana tworzeniu pęcherzyków, co ma miejsce przy tworzeniu piany. Korzystnie ciecz o wysokiej lepkości ma wygląd substancji stałej, ale jest produktem szklistym i ma zdolność bardzo wolnego płynięcia w okresie dni, korzystnie tygodni, korzystniej miesięcy. Kompozycje immunogenne według wynalazku są formułowane jako suszone substancje stałe lub ciecze o wysokiej lepkości zawierające IPV i środek stabilizujący oraz polisacharyd bakteryjny. Środkiem stabilizującym jest którakolwiek z opisanych poniżej kompozycji. Polisacharyd bakteryjny obejmuje otoczkowe polisacharydy pochodzące Haemophilus influenzae b i ewentualnie z Neisseria meningitidis. Można ewentualnie dodać otoczkowe polisacharydy pochodzące z dowolnej innej bakte-

6 6 PL B1 rii, korzystnie jednej lub większej liczby z grupy obejmującej Streptococcus pneumoniae, paciorkowce z Grupy A, paciorkowce z Grupy B, Staphycoloccus aureus lub Staphycococcus epidermidis. Korzystnie w suszonej substancji stałej lub cieczy o wysokiej lepkości obecny jest otoczkowy polisacharyd PRP Haemophilus influenzae b. W dalszej korzystnej postaci immunogenna kompozycja zawiera suszone stałe preparaty lub ciekłe preparaty o wysokiej lepkości otoczkowych polisacharydów pochodzących z jednej lub większej liczby grup serologicznych A, C, W-135 i Y Neisseria meningitidis (polisacharydów meningokokowych). W jednej postaci wynalazku bakteryjne polisacharydy są pełnej długości oczyszczonymi naturalnymi polisacharydami. W alternatywnej postaci wielkość polisacharydów wynosi 2-20 powtarzalnych jednostek, korzystnie 2-5 powtarzalnych jednostek, 5-10 powtarzalnych jednostek, powtarzalnych jednostek lub powtarzalnych jednostek, tak że polisacharydy są mniejsze dla ułatwienia posługiwania się nimi. W korzystnej postaci stosowane są oligosacharydy. Oligosacharydy typowo zawierają 2-20 powtarzalnych jednostek. Wynalazek dodatkowo obejmuje kompozycje immunogenne zawierające więcej niż jeden polisacharyd bakteryjny i IPV w postaci suszonej substancji stałej lub cieczy o wysokiej lepkości. Korzystnie IPV jest łączony z jednym lub większą liczbą polisacharydów z grupy obejmującej: polisacharyd PRP Hib (Haemophilus influenzae typu b) i/lub polisacharydy meningokokowe A, C, W i/lub Y i/lub polisacharydy pneumokokowe. Najkorzystniej środki czynne zawierają IPV i Hib, IPV i Hib i MenC, IPV i Hib i MenA i C, IPV i Hib i Men A i C i Y lub IPV i Hib i Men C i Y. Powyższe środki czynne w postaci cząstek mogą także zawierać jeden lub większą liczbę opisanych poniżej pneumokokowych otoczkowych polisacharydów. W powyższych kompozycjach, gdy stosowane są polisacharydy, mogą także być wykorzystywane oligosacharydy (jak zdefiniowano wyżej). Chociaż kompozycje te mogą być adiuwantowane (jak opisano niżej), korzystnie są nieadiuwantowane lub korzystnie nie zawierają soli glinu. Korzystnie polisacharydy lub oligosacharydy są sprzężone z peptydem lub białkiem nośnikowym zawierającym epitopy limfocytu pomocniczego T (jak opisano niżej). Polisacharydy otoczkowe występujące w kompozycjach immunogennych według wynalazku są niesprzężone lub sprzężone z białkiem nośnikowym, takim jak anatoksyna tężcowa, fragment C anatoksyny tężcowej, anatoksyny błoniczej, CRM197, pneumolizyna, Białko D (US ). Toksyna tężcowa, toksyna błonicza i pneumolizyna są detoksykowane za pomocą mutacji genetycznej i/lub korzystnie obróbki chemicznej. W korzystnej postaci wynalazku Hib jest sprzężony z anatoksyną tężcową. Gdy w kompozycji immunogennej według wynalazku występuje więcej niż jeden sprzężony polisacharyd, polisacharydy są sprzężone z tym samym białkiem nośnikowym lub z różnymi białkami nośnikowymi. W korzystnych postaciach wynalazku meningokokowe polisacharydy są sprzężone z białkiem nośnikowym. Jeżeli występują sprzężone polisacharydy Hib i meningokokowe, są one sprzężone z tym samym białkiem nośnikowym lub z różnymi białkami nośnikowymi. Koniugat polisacharydu może być wytwarzany dowolną znaną techniką sprzęgania. W korzystnej technice sprzęgania polisacharyd jest połączony wiązaniem tioeterowym. Ten sposób sprzęgania opiera się na aktywacji polisacharydu tetrafluoroboranem 1-cyjano-4-dimetyloaminopirydyniowym (CDAP), z utworzeniem estru cyjanianowego. Dlatego aktywowany polisacharyd może być sprzężony bezpośrednio lub przez grupę łącznikową z grupą aminową białka nośnikowego. Korzystnie ester cyjanianowy jest sprzężony z heksanodiaminą, a aminopochodna polisacharydu jest sprzęgana z białkiem nośnikowym z wykorzystaniem chemii heteroligacji obejmującej tworzenie wiązania tioeterowego. Takie koniugaty są opisane w opublikowanym zgłoszeniu PCT WO 93/15760 Uniformed Services University. Koniugaty mogą być także wytwarzane sposobami bezpośredniego aminowania redukcyjnego, opisanymi w US (Jennings) i US (Anderson). Inne sposoby opisano w EP , EP i EP Inny sposób polega na tym, że aktywowane bromkiem cyjanu pochodne polisacharydu sprzęga się z hydrazydem kwasu adypinowego (ADH) z białkiem nośnikowym przez kondensację z karbodiimidem (Chu C. i in., Infect. Immunity, ). Polisacharydy, które są umieszczane jako część kompozycji immunogennej według wynalazku mogą być nieabsorbowane lub absorbowane na adiuwancie, korzystnie soli glinu (fosforanie glinu lub wodorotlenku glinu), najkorzystniej fosforanie glinu.

7 PL B1 7 Kompozycje immunogenne według wynalazku zawierają środek stabilizujący, który może pomóc zapobiec uszkodzeniu podczas procesu wysuszania. W kompozycji immunogennej przy użyciu procesów według wynalazku można umieszczać dowolny środek stabilizujący opisany niżej, także poliole tworzące produkty szkliste, bez względu na to, czy jest to suszona stała kompozycja, spieniony szklisty produkt czy kompozycja ciekła o wysokiej lepkości. Korzystne środki stabilizujące obejmują sacharozę, sorbitol, laktozę i trehalozę. Korzystne połączenia, suszone sposobami według wynalazku, można łączyć z innymi antygenami w szczepionkę złożoną, które są suszonymi lub ciekłymi preparatami, stosowanymi do roztwarzania suszonych składników. Dodatkowe składniki Suszone stałe preparaty lub ciekłe preparaty o wysokiej lepkości według wynalazku zawierające IPV i środek stabilizujący mogą dodatkowo być formułowane z dodatkowymi składnikami szczepionki. Korzystna szczepionka zawiera suszony stały preparat lub ciekły preparat o wysokiej lepkości IPV i bakteryjnego polisacharydu, który można mieszać z ciekłym preparatem zawierającym dodatkowe składniki szczepionki. Po roztworzeniu stałych składników ciekłymi składnikami, pełna szczepionka jest podawana drogą iniekcji. Dodatkowe składniki obejmują otoczkowe polisacharydy pochodzące z jednej lub większej liczby bakterii z grupy obejmującej Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, paciorkowce z grupy A, paciorkowce z grupy B, Staphycoloccus aureus i Staphycococcus epidermidis. W korzystnej postaci kompozycja immunogenna zawiera polisacharydy otoczkowe pochodzące z jednej lub większej liczby grup serologicznych A, C, W-13 5 i Y Neisseria meningitidis. Kompozycja może dodatkowo zawierać otoczkowe polisacharydy pochodzące z Streptococcus pneumoniae. Antygeny otoczkowych polisacharydów pneumokoków są korzystnie wybrane z serotypów 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F i 33F (najkorzystniej z serotypów 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F i 23 F). Ponadto kompozycja może dodatkowo zawierać Typ 5, Typ 8 lub 336 otoczkowych polisacharydów Staphycoloccus aureus. Kompozycja może także dodatkowo zawierać Typ I, Typ II lub Typ III otoczkowych polisacharydów Staphylococcus epidermidis. Kompozycja może także dodatkowo zawierać Typ la, Typ Ic, Typ II lub Typ III otoczkowych polisacharydów paciorkowców z grupy B. Ewentualnie kompozycja może zawierać otoczkowe polisacharydy paciorkowców z grupy A, korzystnie dodatkowo zawierające co najmniej jedno białko M, a korzystniej wiele typów białka M. Kompozycje immunogenne według wynalazku można formułować z antygenami białkowymi. Korzystnymi antygenami białek pneumokokowych są białka pneumokokowe, które są obecne na zewnętrznej powierzchni pneumokoków (mogą być rozpoznawane przez układ odpornościowy gospodarza w trakcie co najmniej części cyklu życiowego pneumokoka) lub są białkami, które są wydzielane lub uwalniane przez pneumokoki. Najkorzystniej białkiem jest toksyna, adhezyna, 2-składnikowy przekaźnik sygnałów lub lipoproteina Streptococcus pneumoniae lub ich fragmenty. Szczególnie korzystne białka obejmują, lecz nie wyłącznie, pneumolizynę (korzystnie detoksykowaną przez obróbkę chemiczną lub mutację) [Mitchell i in., Nucleic Acids Res. 11 lipca 1990; 18(13): 4010 Comparison of pneumolysin genes and proteins from Streptococcus pneumoniae types 1 and 2.", Mitchell i in., Biochim Biophys Acta 23 stycznia 1989; 1007(1): Expression of the pneumolysin gene in Escherichia coli: rapid purification and biological properties, 30 WO 96/05859 (A. Cyanamid), WO 90/06951 (Paton i in.), WO 99/03884 (NAVA)]; PspA i jej odmiany z delecją fragmentu transbłonowego (US Briles i in.); PspC i jej odmiany z delecją fragmentu transbłonowego (WO 97/ Briles i in.); PsaA i jej odmiany delecją fragmentu transbłonowego (Berry & Paton, Infect Immun 1996 grudzień; 64(12) : Sequence heterogeneity of PsaA, a 37-kilodalton putative adhesin essential for virulence of Streptococcus pneumoniae ); białka pneumokoków wiążące cholinę i ich odmiany delecją fragmentu transbłonowego; CbpA i jej odmiany z delecją fragmentu transbłonowego (WO 97/41151; WO 99/51266); Dehydrogenaza gliceraldehydo-3-fosforanu (Infect. Immun : 3544); HSP70 (WO 96/40928); PcpA (Sanchez-Beato i in., FEMS Microbiol Lett 1998, 164: ); Białko M-podobne, (EP ) i adhezyna 18627, (EP ). Dodatkowe korzystne antygeny białek pneumokoków są ujawnione w WO 98/18931, w szczególności te wybrane w 98/18930 i PCT/US99/ Korzystne białka Neisseria formułowane z kompozycją immunogenną według wynalazku obejmują TbpA (W093/06861; EP586266; W092/03467; US ), TbpB (W093/06861; EP586266), Hsf (W099/31132), NspA (W096/29412), Hap (PCT/EP99/02766), PorA, PorB, OMP85 (występujące także

8 8 PL B1 pod nazwą D15) (WO00/23595), PilQ (PCT/EP99/03603), PldA (PCT/EP99/06718), FrpB (WO96/31618 patrz SEQ ID nr: 38), FrpA lub FrpC lub zachowana część wspólna dla obu o długości co najmniej 30, 50, 100, 500, 750 aminokwasów (WO92/01460), LbpA i/lub LbpB (PCT/EP98/05117; Schryvers i in. Med. Microbiol : 1117), FhaB (WO98/02547), HasR (PCT/EP99/05989), lipo02 (PCT/EP99/08315), MltA (WO99/57280) i ctra (PCT/EPOO/00135). Białka Neisseria można dodawać jako oczyszczone białka lub jako część preparatu pęcherzyka zewnętrznej błony. Kompozycję immunogenną korzystnie formułuje się z antygenami zapewniającymi ochronę przed jednym lub większą liczbą zakażeń z grupy obejmującej błonicę, tężec i Bordatella pertussis. Składnik krztuścowy mogą stanowić uśmiercone całe komórki B. pertussis (Pw) lub jest to korzystnie bezkomórkowy składnik krztuścowy (Pa), który zawiera co najmniej jeden antygen (korzystnie dwa lub trzy) wybrany spośród PT, FHA i 69 kda pertaktyny; pewne inne szczepionki bezkomórkowe zawierają także aglutynogeny, takie jak Fim 2 i Fim 3 i wynalazek obejmuje także zastosowanie tych szczepionek. Typowo antygenami dostarczającymi ochronę przed błonicą i tężcem są anatoksyna błonicza i anatoksyna tężcowa. Anatoksyny są chemicznie inaktywowanymi toksynami, na przykład w efekcie obróbki formaldehydem lub toksynami inaktywowanymi przez wprowadzenie jednej lub większej liczby mutacji punktowych. Alternatywnie kompozycję immunogenną według wynalazku można dostarczać w postaci zestawu zawierającego w jednym pojemniku suszoną substancję stałą, spieniony szklisty produkt lub ciecz o wysokiej lepkości, a w drugim pojemniku ciekłe DTPa lub DTPw. Takie zestawy mogą zawierać na przykład dwukomorową strzykawkę, przy czym składniki suszony i ciekły są zawarte w tej samej strzykawce, ale w innych komorach. Suszony składnik następnie roztwarza się ciekłą szczepionką bezpośrednio przed iniekcją pojedynczej szczepionki. Zatem na przykład suszoną substancję stałą, spieniony szklisty produkt lub ciecz o wysokiej lepkości według wynalazku roztwarza się ciekłą szczepionką DTPa lub DTPw (korzystnie bezpośrednio przed użyciem) i podaje się w postaci pojedynczej szczepionki. Szczepionka DTPa lub DTPw typowo jest adiuwantowana przynajmniej częściowo solą glinu, taką jak fosforan glinu i/lub wodorotlenek glinu (na przykład szczepionki Infanrix i Tritanrix GlaxoSmithKline Biological s.a.). Kompozycję immunogenną ewentualnie formułuje się z jednym lub większą liczbą antygenów, które mogą chronić gospodarza przed nietypowalnym Haemophilus influenzae, RSV i/lub jednym lub większą liczbą antygenów, które mogą chronić gospodarza przed wirusem grypy. Korzystne białkowe antygeny nietypowalnych H. influenzae obejmują białko fimbrynę (US ) i białka fuzyjne zawierające jego peptydy (np. białko fuzyjne LB1) (US Ohio State Research Foundation), OMP26, P6, białko D, TbpA, TbpB, Hia, Hmw1, Hmw2, Hap i D15. Korzystne antygeny wirusa grypy obejmują całego, żywego lub inaktywowanego wirusa, rozszczepionego wirusa grypy hodowanego na jajach lub komórkach MDCK lub komórkach Vero lub całe wirosomy grypy (opisane przez R. Glucka, Vaccine, 1992, 10, ) albo ich oczyszczone lub rekombinowane białka, takie jak HA, NP, NA lub białka M lub ich połączenia. Korzystne antygeny RSV (syncytialnego wirusa oddechowego) obejmują glikoproteinę F, glikoproteinę G, białko HN, białko M lub ich pochodne. Znane są złożone szczepionki zawierające DTP-Hib. Jednakże z pewnymi preparatami związane są problemy, które obejmują proste mieszanie Hib z innymi antygenami. Pomimo uważnego formułowania, miana przeciwciał wytworzonych przeciw składnikowi Hib mogą być niższe niż indukowane przez tę samą dawkę Hib szczepionego oddzielnie, ze względu na interferencję z innymi składnikami szczepionki. Chociaż ten problem jest dobrze znany i próbowano go rozwiązać na różne sposoby, kompozycje immunogenne według wynalazku, w których Hib i IPV formułuje się razem jako suszona substancja stała lub ciecz o wysokiej lepkości, dostarczają alternatywne rozwiązanie problemu. Kompozycje immunogenne według wynalazku mogą tworzyć część zestawu szczepionki, w którym w jednym składniku zestawu występują IPV i Hib, a dodatkowe składniki, opisane wyżej, występują w drugim składniku, na przykład opisanej dwukomorowej strzykawki. Te dwa składniki miesza się ze sobą bezpośrednio przed podaniem szczepionki. W takich preparatach składnik zawierający IPV i Hib stanowi korzystnie suszona substancja stała, spieniony szklisty produkt lub ciecz o wysokiej lepkości, chociaż ewentualnie formułuje się go jako ciecz. Ten preparat prowadzi do uzyskania miana przeciwciał przeciw składnikowi Hib, które są klinicznie dopuszczalne do dostarczenia ochrony przeciw patogenowi Haemophilus influenzae b. Typowo miano przeciwciał wywołane przez złożoną szczepionkę wynosi co najmniej 85%, 90%, korzystnie około 100% lub więcej miana wywołanego przez tę samą dawkę Hib w jednoważnej szczepionce Hib.

9 PL B1 9 Szczepionki według wynalazku Opisane wyżej kompozycje immunogenne według wynalazku korzystnie formułuje się jako szczepionkę. Szczepionka może zawierać ilość adiuwanta wystarczającą do wzmożenia odpowiedzi odpornościowej na immunogen. Odpowiednie adiuwanty obejmują, lecz nie wyłącznie, sole glinu, takie jak wodorotlenek glinu i fosforan glinu, mieszaniny skwalenu (SAF-1), peptyd muramylowy, pochodne saponiny, preparaty ścian komórkowych prątków, monofosforylolipid A, pochodne kwasu mykolowego, substancje powierzchniowo czynne będące niejonowymi polimerami blokowymi, Quil A, podjednostkę B toksyny cholery, polifosfazen i pochodne oraz immunostymulujące kompleksy (ISCOM), takie jak opisane przez Takahashi i in., (1990) Nature 344: W zastosowaniu weterynaryjnym i do wytwarzania przeciwciał u zwierząt można stosować mitogenne składniki adiuwanta Freunda. Preparaty szczepionki według wynalazku korzystnie roztwarza się przed użyciem. Roztwarzanie obejmuje zmieszanie ciekłego składnika szczepionki z suszonym stałym preparatem, spienionym szklistym produktem lub ciekłym preparatem o wysokiej lepkości według wynalazku. Wynalazek obejmuje także pojemnik mający hydrofobową powierzchnię wewnętrzną, zawierający immunogenną kompozycję lub szczepionkę według wynalazku. Zastosowanie takiego pojemnika stanowi zaletę, ponieważ prowadzi do osadzania się suszonego składnika na dnie probówki w postaci, w której jej roztwarzanie jest łatwiejsze. Korzystne jest dodanie kolorowego barwnika do konserwowanej próbki dla łatwiejszego uwidocznienia suszonej kompozycji według wynalazku. Jest to szczególnie ważne podczas roztwarzania, aby zagwarantować, że suszona substancja stała lub ciecz o wysokiej lepkości jest całkowicie roztworzona przed użyciem. Korzystnie kolorowy barwnik zachowuje kolor w obojętnym ph i nadaje się do wstrzyknięcia pacjentowi. Najkorzystniej kolorowym barwnikiem jest czerwień fenolowa. Tak jak w przypadku wszystkich immunogennych kompozycji lub szczepionek, immunologicznie skuteczne ilości immunogenów muszą być określone empirycznie. Czynniki, które należy wziąć pod uwagę, obejmują immunogenność, to, czy immunogen tworzy kompleks czy jest kowalencyjnie związany z adiuwantem lub białkiem nośnikowym lub innym nośnikiem, drogę podawania i liczbę podawanych immunizujących dawek. Takie czynniki są znane w dziedzinie wytwarzania szczepionek i w zakresie umiejętności immunologów leży wykonanie takich określeń bez zbędnych eksperymentów. Substancja może występować w różnych stężeniach w kompozycji immunogennej według wynalazku. Typowo minimalne stężenie substancji oznacza ilość niezbędną do uzyskania zamierzonego zastosowania, natomiast maksymalne stężenie oznacza ilość, która pozostanie w roztworze lub w jednorodnej zawiesinie w wyjściowej mieszaninie. Na przykład korzystnie minimalną ilością środka terapeutycznego jest ilość, która dostarczy pojedynczą terapeutycznie skuteczną dawkę. Jeżeli spieniony szklisty produkt zostanie utworzony przed krystalizacją, mogą także być stosowane roztwory przesycone. W przypadku substancji biologicznie czynnych minimalne stężenie oznacza ilość niezbędną do uzyskania działania biologicznego po roztworzeniu, a maksymalne stężenie oznacza stężenie, po przekroczeniu którego nie można utrzymać jednorodnej zawiesiny. W przypadku jednostek jednodawkowch ilość oznacza ilość w pojedynczym zastosowaniu terapeutycznym. Ogólnie oczekuje się, że każda dawka będzie zawierała μg antygenu białkowego, korzystnie 5-50 μg a najkorzystniej 5-25 μg. Korzystne dawki polisacharydów bakteryjnych wynoszą μg, 10-5 μg, 5-2,5 μg lub 2,5-1 μg. Korzystna ilość substancji różni się w zależności od substancji, ale fachowiec określi ją z łatwością. Sposoby według wynalazku Jeden ze sposobów według wynalazku służy konserwowaniu kompozycji zawierającej IPV i środek stabilizujący, prowadząc do uzyskania kompozycji, w której zachowana jest antygenowość IPV. W suszonej próbce zawarty jest polisacharyd bakteryjny. W jednej postaci sposób według wynalazku polega na suszeniu IPV i obejmuje etapy: wytwarzania konserwowanej próbki przez przeprowadzenie w stan zawiesiny lub rozpuszczenie IPV w roztworze środka stabilizującego; w konserwowanej próbce występuje bakteryjny polisacharyd i ewentualnie poliol tworzący produkty szkliste; poddawania konserwowanej próbki takim warunkom temperatury i ciśnienia, że z konserwowanej próbki uwalniany jest rozpuszczalnik i usuwania rozpuszczalnika do momentu, gdy konserwowana próbka wyschnie z utworzeniem substancji stałej lub cieczy o wysokiej lepkości, w której antygenowość i/lub immunogenność IPV jest zachowana.

10 10 PL B1 W korzystnej postaci przed suszeniem konserwowaną próbkę umieszcza się w pojemniku mającym wnętrze hydrofobowe. Kolejny sposób według wynalazku polega na suszeniu spieniającym, obejmującym etapy: wytwarzania konserwowanej próbki przez przeprowadzenie w stan zawiesiny lub rozpuszczanie IPV w roztworze środka stabilizującego; w konserwowanej próbce występuje bakteryjny polisacharyd i ewentualnie poliol tworzący produkt szklisty; poddawania konserwowanej próbki takim warunkom temperatury i ciśnienia, że konserwowana próbka tworzy pianę; i usuwania rozpuszczalnika do momentu, gdy piana wyschnie z utworzeniem substancji stałej, w której antygenowość i/lub immunogenność IPV jest zachowana. W korzystnym sposobie suszenia spieniającego według wynalazku wykorzystuje się pojemnik mający hydrofobową powierzchnię wewnętrzną i obejmuje on etapy: wytwarzania konserwowanej próbki przez przeprowadzenie w stan zawiesiny lub rozpuszczanie IPV i bakteryjnego polisacharydu w roztworze środka stabilizującego; umieszczenia konserwowanej próbki w pojemniku mającym hydrofobową powierzchnię wewnętrzną; poddawania konserwowanej próbki w pojemniku takim warunkom temperatury i ciśnienia, że konserwowana próbka tworzy pianę i usuwania rozpuszczalnika do momentu, gdy piana wyschnie z utworzeniem substancji stałej, w której antygenowość i/lub immunogenność IPV jest zachowana. Opisane wyżej sposoby suszenia spieniającego według wynalazku ewentualnie obejmują etap zamrażania. Konserwowaną próbkę można zamrażać całkowicie lub częściowo. Dlatego niektóre sposoby według wynalazku obejmują etapy: wytwarzania co najmniej częściowo zamrożonej konserwowanej próbki przez przeprowadzanie w stan zawiesiny lub rozpuszczanie IPV i bakteryjnego polisacharydu w roztworze środka stabilizującego i zamrożenie mieszaniny; poddawania co najmniej częściowo zamrożonej konserwowanej próbki takim warunkom temperatury i ciśnienia, że konserwowana próbka tworzy pianę; i usuwania rozpuszczalnika do momentu, gdy piana wyschnie z utworzeniem substancji stałej, w której antygenowość i/lub immunogenność IPV jest zachowana. Etap zamrażania w powyższym sposobie przebiega korzystnie w procesie gwałtownego zamrażania, w którym obniżenie ciśnienia jest przyczyną zamarznięcia przez odparowanie. To powoduje szybkie zamarznięcie próbki, co prowadzi do mniejszej utraty antygenu. Dlatego proces według wynalazku obejmuje etapy: wytwarzania konserwowanej próbki przez przeprowadzenie w stan zawiesiny lub rozpuszczanie IPV i bakteryjnego polisacharydu w roztworze środka stabilizującego; poddawania konserwowanej próbki działaniu obniżonego ciśnienia, tak że konserwowana próbka ulega co najmniej częściowemu zamrożeniu; poddawania co najmniej częściowo zamrożonej konserwowanej próbki takim warunkom temperatury i ciśnienia, że konserwowana próbka tworzy pianę; i usuwania rozpuszczalnika do momentu, gdy piana wyschnie z utworzeniem substancji stałej, w której antygenowość i/lub immunogenność IPV jest zachowana. Kolejny korzystny sposób według wynalazku jest stosowany do konserwowania IPV i obejmuje etapy: wytwarzania konserwowanej próbki przez przeprowadzenie w stan zawiesiny lub rozpuszczanie IPV w roztworze środka stabilizującego; poddawania konserwowanej próbki takim warunkom temperatury i ciśnienia, że z konserwowanej próbki uwalniany jest rozpuszczalnik przez odparowanie, bez powstawania pęcherzyków tworzących pianę i korzystnie bez zamrażania; usuwania rozpuszczalnika do momentu, gdy konserwowana próbka wyschnie z utworzeniem cieczy o wysokiej lepkości, w której antygenowość i/lub immunogenność IPV jest zachowana. Sposoby według wynalazku prowadzą do wytworzenia preparatu IPV, który może przetrzymać długie przechowywanie, w trakcie którego antygenowość i/lub immunogenność IPV jest zachowana. Korzystnie IPV zachowuje co najmniej 40, 50, 60, 70, korzystniej 80, 90, 95% wyjściowej antygenowości i/lub immunogenności w okresie wynoszącym co najmniej 3, 6, 9, 12, 24 miesięcy przechowy-

11 PL B1 11 wania w temperaturze 4 C. Antygenowość i immunogenność mierzy się po roztworzeniu IPV w odpowiednim roztworze wodnym i przy użyciu odpowiedniego sposobu, na przykład opisanych wyżej. Sposób suszenia bez zamrażania i tworzenia piany ma szczególne zastosowanie gdy suszone środki czynne są podatne na utratę aktywności i/lub antygenowości podczas procesu suszenia ze względu na ekspozycję na zamrażanie lub powstawanie pęcherzyków związane z tworzeniem piany. Ma także szczególne zastosowanie gdy korzystne jest niskie stężenie poliolu tworzącego produkt szklisty i/lub gdy korzystny jest krótszy proces suszenia. Środek stabilizujący Środek stabilizujący stosowany w sposobach według wynalazku będzie korzystnie zawierał poliole tworzące produkty szkliste. Odpowiednie materiały obejmują, lecz nie wyłącznie, wszystkie poliole, również poliole będące węglowodanami i niebędące węglowodanami. Korzystnie stabilizujący poliol umożliwia przechowywanie środka czynnego bez zasadniczej utraty aktywności podczas denaturacji, agregacji lub innych procesów. Szczególnie odpowiednie substancje obejmują cukry, alkohole cukrowe i pochodne węglowodanów. Korzystnie poliol tworzący produkt szklisty stanowi węglowodan lub jego pochodne, obejmujące glukozę, maltulozę, izomaltulozę, laktulozę, sacharozę, maltozę, laktozę, izomaltozę, maltitol, laktitol, palatinit, trehalozę, rafinozę, stachiozę, melezytozę lub dekstran, najkorzystniej trehalozę, sacharozę, sorbitol, rafinozę, mannit, laktozę, laktitol i palatynit. Bakteryjne polisacharydy działają jako środek stabilizujący i postacie wynalazku zawierają bakteryjne polisacharydy jako składnik środka stabilizującego. W tej postaci bakteryjny polisacharyd odgrywa podwójną rolę środka stabilizującego i immunogenu. Węglowodany obejmują, lecz nie wyłącznie, monosacharydy, disacharydy, trisacharydy, oligosacharydy i ich odpowiednie alkohole cukrowe, związki polihydroksylowe, takie jak pochodne węglowodanów i chemicznie modyfikowane węglowodany, skrobia hydroksyetylowa i kopolimery cukrów. Odpowiednie do użycia są zarówno naturalne, jak i syntetyczne węglowodany. Syntetyczne węglowodany obejmują, lecz nie wyłącznie, węglowodany, w których glikozydowe wiązanie zastąpione jest wiązaniem tiolowym lub węglowym. Mogą być stosowane zarówno postacie D, jak i L węglowodanów. Węglowodan może być nieredukujący lub redukujący. Gdy stosowany jest węglowodan redukujący, korzystne jest dodanie inhibitorów reakcji Maillarda. Redukujące węglowodany odpowiednie do stosowania zgodnie z wynalazkiem są znane i obejmują, lecz nie wyłącznie, glukozę, maltozę, laktozę, fruktozę, galaktozę, mannozę, maltulozę i laktulozę. Nieredukujące węglowodany obejmują, lecz nie wyłącznie, nieredukujące glikozydy związków polihydroksylowych wybranych z alkoholi cukrowych i innych prostołańcuchowych polioli. Inne użyteczne węglowodany obejmują rafinozę, stachiozę, melezytozę, dekstran, sacharozę, celobiozę, mannobiozę i alkohole cukrowe. Glikozydami alkoholi cukrowych są korzystnie monoglikozydy, w szczególności związki otrzymane przez redukcję disacharydów, takich jak laktoza, maltoza, laktuloza i maltuloza. Szczególnie korzystnymi węglowodanami są trehaloza, sacharoza, sorbitol, maltitol, laktitol, palatynit i glukopiranozylo-1-6-mannit. Aminokwasy mogą pełnić funkcję środków stabilizujących i mogą być stosowane osobno, a korzystnie w połączeniu z polioiem. Korzystne aminokwasy obejmują glicynę, alaninę, argininę, lizynę i glutaminę, chociaż funkcję środka stabilizującego może pełnić dowolny aminokwas lub połączenie aminokwasów, peptyd, hydrolizowane białka lub białko, takie jak albumina surowicy. Korzystnie konserwowana próbka będzie zawierać składnik mogący hamować tworzenie kryształów w zgodnej z wynalazkiem suszonej substancji stałej lub cieczy o wysokiej lepkości. Sole i inne cząsteczki obejmujące aminokwasy i czerwień fenolową hamują tworzenie kryształów. Stężenie środka stabilizującego stosowanego w sposobie według wynalazku może wynosić 1% - 50% wag./obj., korzystnie 1-5%, 5-10%, 5-10%, 15-20%, 20-25% lub 25-50%, a najkorzystniej poniżej 25% (wag./obj.). Wymagane ilości środka stabilizującego są proporcjonalne do ilości soli. Dlatego chociaż korzystne są stężenia środka stabilizującego między 3% - 10%, do suszenia próbek o dużej zawartości soli mogą byćwymagane wyższe stężenia: 10% - 25% (wag./obj.). Pojemnik Różne mieszaniny i pojemniki o różnych kształtach i wielkości mogą być jednocześnie wykorzystywane. Idealnie wielkość stosowanego pojemnika jest wystarczająca do pomieszczenia wyjściowej mieszaniny i pomieszczenia objętości utworzonego z niej suszonego preparatu. Typowo determinuje to masa substancji tworzącej produkt szklisty, pole powierzchni pojemnika i warunki temperatury i ciśnienia, od których zależy czy wystąpi pienienie. Masa substancji tworzącej produkt szklisty musi

12 12 PL B1 być wystarczająca do uzyskania lepkiego syropu, ewentualnie spienionego, co praktycznie odpowiada minimalnej masie na jednostkowe pole powierzchni pojemnika. Tens stosunek jest różny dla różnych mieszanin i stosowanych pojemników, ale fachowiec z łatwością określi go empirycznie stosując procedurę podaną w opisie. Mogą być stosowane dowolne takie pojemniki, obejmujące formowane fiolki Wheaton i fiolki z ciętych rurek. W sposobach według wynalazku korzystnie stosuje się pojemniki mające hydrofobową powierzchnię wewnętrzną. Osiąga się to przez powlekanie wewnętrznej powierzchni kompozycją hydrofobową, na przykład drogą silikonizacji. Silikonizację uzyskuje się stosując procesy, które są dobrze znane fachowcom. W jednym sposobie pojemnik jest silikonizoawany przez przepłukanie wnętrza pojemnika emulsją silikonu, a następnie włożenie do pieca i poddanie działaniu wysokiej temperatury, typowo 350 C. Alternatywnie hydrofobową powierzchnię wewnętrzną uzyskuje się przez wykonanie pojemnika z kompozycji hydrofobowej. Hydrofobowa powierzchnia wewnętrzna pojemnika sprawia, że tworzenie piany jest bardziej prawdopodobne i jest bardziej powtarzalne. Umożliwia to zastosowanie niższych stężeń poliolu w konserwowanej próbce, co z kolei skraca czas niezbędny do wysuszenia próbki, zmniejsza efekt reakcji Maillarda i inne interakcje z poliolem uszkadzające środek czynny. Gdy konserwowana próbka stanowi szczepionkę, powstały spieniony szklisty produkt roztwarza się szybko i z łatwością ze względu na mniejszą ilość występującego poliolu, a powstały roztwór szczepionki ma mniejszą lepkość, co umożliwia łatwiejsze podawanie. Hydrofobowa powierzchnia wewnętrzna umożliwia łatwiejsze roztworzenie suszonej substancji stałej lub cieczy o wysokiej lepkości, gdyż sprzyja pozostawaniu próbki na dnie pojemnika tak, że staje się łatwiejsza do wydajnego roztworzenia. Chociaż w wynalazku można stosować pojedyncze postacie, może występować więcej niż jeden środek stabilizujący, więcej niż jeden dodatek i więcej niż jedna substancja. Fachowiec z łatwością określi skuteczne ilości tych składników. Rozpuszczalnik Konserwowaną próbkę sporządza się przez rozpuszczenie/przeprowadzenie w stan zawiesiny IPV i środka stabilizującego w wodzie z wytworzeniem wodnego roztworu. Korzystnie woda występuje w konserwowanej próbce w ilości 5-98% obj., korzystniej 80-98% obj., najkorzystniej 85-98% obj. Objętość rozpuszczalnika może być różna i będzie zależała od środka stabilizującego i umieszczanej substancji oraz wszystkich dodatków. Minimalną wymaganą objętością jest ilość niezbędna do rozpuszczenia różnych składników. Jednakże można stosować również jednorodnie zdyspergowane zawiesiny substancji. Fachowcy z łatwością określą odpowiednie ilości składników w konkretnych postaciach w świetle przykładów dostarczonych w opisie. W konserwowanej próbce można umieszczać różne dodatki. Zazwyczaj dodatki nasilają tworzenie piany i/lub proces suszenia i/lub przyczyniają się do rozpuszczenia substancji. Alternatywnie dodatki przyczyniają się do stabilizacji substancji umieszczonej w substancji stałej. Może występować jeden lub większa liczba dodatków. Jako przykład, dodanie lotnych/musujących soli umożliwia stosowanie większych wyjściowych objętości i prowadzi do uzyskania większego pola powierzchni spienionego szklistego produktu, co zapewnia lepsze tworzenie piany i szybsze wysychanie. W opisie lotne sole oznaczają sole, które ulatniają się w warunkach stosowanych do tworzenia spienionego szklistego produktu. Przykłady odpowiednich lotnych soli obejmują, lecz nie wyłącznie, octan amonu, wodorowęglan amonu i węglan amonu. Sole, które rozkładają się z wytworzeniem produktów gazowych, również prowadzą do nasilonego tworzenia piany i szybszego wysychania. Przykładami takich soli są wodorowęglan sodu i pirosiarczyn sodu. Korzystnie lotne sole występują w ilości około 0,01-5 M. Odpowiednie do stosowania są stężenia do 5 M. Otrzymany spieniony szklisty produkt ma jednorodną strukturę piany i jest znacznie bardziej suchy w porównaniu ze spienionym szklistym produktem, w którym nie stosowano lotnych/musujących soli. Kolejnym odpowiednim dodatkiem jest środek stabilizujący pianę, który można stosować w połączeniu z lotną solą lub solą ulegającą rozkładowi. Może nim być albo składnik powierzchniowo czynny, taki jak cząsteczka amfipatyczna (tj. taka jak fosfolipidy i substancje powierzchniowo czynne) lub środek do zwiększenia lepkości pieniącego się syropu, taki jak środek zagęszczający, taki jak guma guarowa i ich pochodne. Kolejnym dodatkiem jest inhibitor reakcji Maillarda. Korzystnie jeżeli substancja i/lub materiał tworzący szklaną matrycę zawiera grupy karbonylowe i aminowe, iminowe lub guanidynowe, kompozycje dodatkowo zawierają co najmniej jeden fizjologicznie dopuszczalny inhibitor reakcji Maillarda

13 PL B1 13 w ilości skutecznej do zasadniczego zapobiegnięcia kondensacji grup aminowych i reaktywnych grup karbonylowych w kompozycji. Inhibitorem rekcji Maillarda może być dowolny znany inhibitor. Inhibitor występuje w ilości wystarczającej do zapobiegnięcia lub zasadniczego zapobiegnięcia kondensacji grup aminowych i reaktywnych grup karbonylowych. Zazwyczaj grupy aminowe występują w substancji, a grupy karbonylowe występują w materiale tworzącym szklaną matrycę albo odwrotnie. Jednakże aminokwasy i grupy karbonylowe mogą występować wewnątrz cząsteczek którejkolwiek substancji lub węglowodanu. Wiadomo, że różne grupy związków wywierają działanie hamujące na reakcję Maillarda i dlatego są użyteczne w kompozycjach opisanych w opisie. Związki te są ogólnie albo konkurencyjnymi albo niekonkurencyjnymi inhibitorami reakcji Maillarda. Konkurencyjne inhibitory obejmują, lecz nie wyłącznie, reszty aminokwasowe (zarówno D, jak i L), połączenia reszt aminokwasowych i peptydów. Szczególnie korzystne są lizyna, arginina, histydyna i tryptofan. Najbardziej skuteczne są lizyna i arginina. Znanych jest wiele niekonkurencyjnych inhibitorów. Obejmują one, lecz nie wyłącznie, amino guanidynę i pochodne oraz amfoterycynę B. W EP-A opisano również odpowiednie inhibitory Maillarda, które obejmują pochodne 4-hydroksy-5,8-dioksochinoliny. Środki czynne Sposoby według wynalazku stosuje się do konserwowania inaktywowanego wirusa polio (IPV - korzystnie obejmującego typy 1, 2 i 3, co jest standardem w dziedzinie szczepionek, a najkorzystniej szczepionkę przeciw polio Salka). IPV zawiera 20-80, korzystnie 4 lub 8 jednostek antygenu D typu 1 (Mahoney), 4-20, korzystnie 8 lub 16 jednostek antygenu D typu 2 (MEF-1) i 20-64, korzystnie 32 lub 64 jednostek antygenu D typu 3 (Saukett). Preparat szczepionki IPV jest odpowiedni do iniekcji po roztworzeniu w wodnym roztworze, który korzystnie zawiera dodatkowe składniki szczepionki. Bakteryjnymi polisacharydami umieszczonymi z wykorzystaniem sposobu według wynalazku są otoczkowe polisacharydy Haemophilus influenzae b i ewentualnie Neisseria meningitidis. Można również dodać otoczkowe polisacharydy pochodzące z jednej lub większej liczby bakterii z grupy obejmującej Streptococcus pneumoniae, paciorkowce z Grupy A, paciorkowce z Grupy B, Staphylococcus aureus i Staphylococcus epidermidis. Korzystne są otoczkowe polisacharydy PRP Haemophilus influenzae. Korzystnymi otoczkowymi polisacharydami są także pochodzące z jednej lub większej liczby grup serologicznych A, C, W- 135 i Y Neisseria meningitidis). Inne otoczkowe polisacharydy pochodzą ze Streptococcus pneumoniae. Antygeny otoczkowego polisacharydu pneumokoków są korzystnie wybrane z serotypów 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F i 33F (najkorzystniej z serotypów 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F i 23F). Kompozycja może dodatkowo zawierać Typ 5, Typ 8 lub 336 otoczkowych polisacharydów Staphylococcus aureus. Inne polisacharydy obejmują Typ I, Typ II lub Typ III otoczkowych polisacharydów Staphycococcus epidermidis, Typ la, Typ Ic, Typ II lub Typ III otoczkowych polisacharydów paciorkowców z Grupy B. Inne polisacharydy obejmują otoczkowe polisacharydy paciorkowców z Grupy A, korzystnie dodatkowo zawierające co najmniej jedno białko M, a korzystniej wiele typów białka M. Połączenia środków czynnych konserwowanych sposobem według wynalazku zawierają IPV. IPV łączy się z polisacharydami bakteryjnymi obejmującymi jeden lub większą liczbę spośród: polisacharydu PRP Hib i/lub polisacharydów meningokokowych A, C, W i/lub Y i/lub polisacharydów pneumokokowych. Korzystne połączenia obejmują IPV i Hib, IPV i Hib i MenC lub IPV, Hib, MenA i C. Każdy polisacharyd bakteryjny może występować w dawkach 1-5 μg, 5-10 μg, μg lub μg. Bakteryjne polisacharydy są niesprzężone lub sprzężone z białkiem nośnikowym, takim jak anatoksyna tężcowa, fragment C anatoksyny tężcowej, anatoksyna błonicza, CRM197, pneumolizyna, Białko D (US ). Koniugat polisacharydu jest wytwarzany dowolną znaną techniką sprzęgania. Korzystny sposób sprzęgania opiera się na aktywacji polisacharydu tetrafluoroboranem 1-cyjano-4-dimetyloaminopirydyny (CDAP) z utworzeniem estru cyjanianowego. Aktywowany polisacharyd sprzęga się bezpośrednio lub przez grupę rozdzielającą z grupą aminową białka nośnikowego. Korzystnie ester cyjanianowy sprzęga się z heksanodiaminą i amino pochodną polisacharydu sprzęga się z białkiem nośnikowym z wykorzystaniem chemii heteroligacji obejmującej tworzenie wiązania tioeterowego. Takie koniugaty są opisane w opublikowanym zgłoszeniu PCT WO 93/15760, Uniformed Services University. Koniugaty ewentualnie wytwarza się sposobami bezpośredniego aminowania redukcyjnego, opisanymi w US (Jennings) i US (Anderson). Inne sposoby są opisane w EO , EP i EP

14 14 PL B1 Kolejny sposób polega na tym, że aktywowane bromkiem cyjanu pochodne polisacharydu sprzęga się z hydrazydem kwasu adypinowego (ADH) z białkiem nośnikowym przez kondensację z karbodiimidem (Chu C. i in., Infect. Immunity, ). Proces suszenia W jednej postaci sposób według wynalazku polega na suszeniu IPV w obecności środka stabilizującego, korzystnie w obecności polisacharydu bakteryjnego. Zgodnie z tym sposobem konserwowaną próbkę poddaje się ekspozycji na warunki obniżonej temperatury i ciśnienia. Temperaturę obniża się do wartości poniżej 20 C lub 0 C, korzystnie poniżej -10 C lub -20 C, korzystniej -40 C lub - 60 C. Ciśnienie obniża się do wartości poniżej 100 Pa, korzystnie ciśnienia poniżej 50, 10, korzystniej 5 lub 1 Pa. Warunki obniżonej temperatury i ciśnienia utrzymuje się przez co najmniej 10, 12, 16, 20, korzystnie 24, 36, korzystniej 48 lub 72 godziny. Rozpuszczalnik usuwa się do momentu, gdy konserwowana próbka wyschnie z utworzeniem substancji stałej. W niniejszym opisie substancja stała obejmuje produkty szkliste, gumy i kryształy, które powstają po wysuszeniu próbki. Takie substancje stałe korzystnie zachowują zawartość wody 10-20% lub 5-10%, korzystnie 5-6%, 4-5% lub 3-4% albo 2-3%, korzystniej 1-2% lub 0-1% (wag./wag.). Proces suszenia spieniającego Korzystny sposób według wynalazku polega na poddawniu konserwowanej próbki takim warunkom ciśnienia i temperatury, że w próbce zaczynają pojawiać się pęcherzyki tworząc pianę. Temperatura w konserwowanej próbce będzie inna niż temperatura na zewnątrz próbki ze względu na endotermiczny charakter procesu parowania. Odniesienia do temperatury dotyczą warunków zewnętrznych wobec konserwowanej próbki, na przykład gdy stosuje się dużą suszarkę sublimacyjną, temperatury na półce. Odpowiada ona zazwyczaj ustawionej temperaturze suszarki sublimacyjnej. W korzystnej postaci wynalazku osiąga się to przez obniżenie ciśnienia przy utrzymaniu warunków temperatury. Ciśnienie jest uregulowane do co najwyżej 800, 700, 600, korzystnie 500, 400, 300, korzystniej 200, 150, 100, najkorzystniej 80 lub 50 Pa, przy utrzymaniu ustawienia temperatury na poziomie powyżej 0 C, korzystnie 10 C - 15 C, 15 C - 20 C, 20 C - 25 C, 25 C - 30 C lub 30 C - 37 C. Te warunki utrzymuje się przez co najmniej 1, 2, 3, 4, 5, 8, 10, 12, 16 lub 24 godziny. W innej postaci wynalazku tworzenie piany osiąga się przez zmianę temperatury przy utrzymaniu warunków obniżonego ciśnienia. Ustawienie temperatury podnosi się do poziomu powyżej 20 C, korzystnie 20 C - 30 C, 30 C - 40 C, 40 C - 50 C lub 50 C - 70 C lub temperaturę ustawia się w zakresie C, korzystnie C, korzystniej C. Utrzymuje się warunki obniżonego ciśnienia wynoszącego co najwyżej 800, 700, 600, korzystnie 500, 400, 300, korzystniej 200, 150, , najkorzystniej 80 lub 50 Pa. Te warunki utrzymuje się przez co najmniej 1, 2, 3, 4, 5, 8, 10, 12, 16 lub 24 godziny. Usuwanie rozpuszczalnika w celu wytworzenia spienionego szklistego produktu Następny etap sposobu suszenia spieniającego według wynalazku obejmuje usuwanie rozpuszczalnika do momentu, gdy wyschnie piana tworząc substancję stałą. W jednej postaci wynalazku osiąga się to utrzymując warunki ciśnienia i temperatury na poziomie stosowanym do uzyskania tworzenia piany. Na przykład utrzymuje się ciśnienie wynoszące co najwyżej 800, 700, 600, korzystnie 500, 400, 300, korzystniej 200, 150, 100, najkorzystniej 80 lub 50 Pa jednocześnie utrzymując ustawienie temperatury na poziomie powyżej 0 C, korzystnie 2 C - 10 C, 10 C - 20 C, 20 C - 30 C, 30 C - 35 C, 35 C - 40 C, najkorzystniej 5 C - 25 C. Te warunki temperatury i ciśnienia utrzymuje się przez co najmniej 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 18 godzin lub dłużej w celu uzyskania substancji stałej o zawartości rozpuszczalnika co najwyżej 10, 8, 5, 4, korzystnie 3, 2 lub najkorzystniej 1% (wag./wag.). Inna postać wynalazku obejmuje wzrost ustawienia temperatury w trakcie usuwania rozpuszczalnika do wyższej temperatury niż utrzymywana na wcześniejszym etapie procesu. To korzystnie umożliwia szybsze usuwanie rozpuszczalnika z próbki, tak że sposób według wynalazku można ukończyć w krótszym czasie. Na przykład ustawienie temperatury zwiększa się do poziomu powyżej 0 C, korzystnie 2 C - 10 C, 10 C - 20 C, 20 C - 30 C, 30 C - 40 C, 40 C - 50 C, 50 C - 60 C, jednocześnie utrzymując ciśnienie wynoszące co najwyżej 800, 700, 600, korzystnie 500, 400, 300, korzystniej 200, 150, 100, najkorzystniej 80 lub 50 Pa. Te warunki temperatury i ciśnienia utrzymuje się przez co najmniej 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 18 godzin lub dłużej w celu uzyskania substancji stałej o zawartości wody co najwyżej 10, 8, 5, 4, korzystnie 3, 2 lub najkorzystniej 1% (wag./wag.). Inna postać wynalazku obejmuje obniżenie ciśnienia w trakcie usuwania rozpuszczalnika do wartości ciśnienia niższej, niż stosowana podczas tworzenia piany. To korzystnie umożliwia szybsze usuwanie rozpuszczalnika z próbki, tak że sposób według wynalazku można ukończyć w krótszym

15 PL B1 15 czasie. Na przykład ciśnienie obniża się do wartości co najwyżej 500, 400, 300, korzystnie 200, 100, 80, korzystniej 50, 10, najkorzystniej 5 lub 1 Pa, jednocześnie utrzymując temperaturę na poziomie co najmniej 0 C, korzystnie 10 C - 20 C, 20 C - 30 C, 30 C - 35 C lub powyżej 40 C. Te warunki temperatury i ciśnienia utrzymuje się przez co najmniej 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 18 godzin lub dłużej dla uzyskania substancji stałej o zawartości rozpuszczalnika co najwyżej 5, 4, korzystnie 3, 2 lub korzystniej 1% (wag./wag.). Proces suszenia spieniającego obejmujący etap zamrażania Sposób według wynalazku ewentualnie obejmuje zamrażanie próbki. Zamrażanie próbki przed suszeniem spieniającym ma zaletę większej powtarzalności między poszczególnymi próbkami w serii. Spowodowane jest to tym, że wszystkie próbki rozpoczynają proces mając te same warunki fizyczne w postaci zamrożenia. Konserwowane próbki można zamrażać całkowicie lub częściowo. Zamrażanie ewentualnie prowadzi się przed poddaniem próbki działaniu obniżonego ciśnienia przez umieszczenie konserwowanej próbki w temperaturze poniżej 0 C przez odpowiedniej długości czas, aby umożliwić zamarznięcie próbki. Korzystnie stosowana temperatura wynosi co najwyżej -10 C, -15 C, -20 C, -30 C, -40 C, -70 C lub -140 C. Próbkę można pozostawić w temperaturze poniżej 0 C na 1, 2, 3, 4, 5, 8, 16 lub więcej godzin, umożliwiając zajście zamrożenia. W przypadku niektórych próbek, w szczególności próbek, które z łatwością ulegają uszkodzeniu przez tworzenie kryształów rozpuszczalnika, takich jak preparaty komórek lub inne układy biologiczne, korzystne jest wolne zamrażanie próbki z szybkością co najwyżej 0,1, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5 C na godzinę. Inne kompozycje są konserwowane bardziej wydajnie przez natychmiastowe zamrożenie, na przykład zamrażanie natychmiastowe w ciekłym azocie. Ten sposób jest szczególnie korzystny dla białek lub cząstek wirusowych. Zamrażanie przez odparowanie także prowadzi do szybkiego zamrożenia próbki. Alternatywnie konserwowaną próbkę zamraża się przez wystawienie próbki na obniżone ciśnienie, tak że próbka zostaje w całości lub częściowo zamrożona. Takie gwałtowne zamrażanie przeprowadza się w aparacie do zamrażania sublimacyjnego, przy temperaturze na półce co najmniej 0 C, 10 C, 15 C, 20 C, 30 C, 37 C. Korzystnie temperatura na półce wynosi 5-35 C, korzystniej C, najkorzystniej 15 C. Ciśnienie jest ewentualnie początkowo obniżane do 20 kpa na 5, 10, 20, 30, 60 minut lub dłużej, aby umożliwić odgazowanie. Aby zamrozić próbkę ciśnienie jest dodatkowo obniżane do ciśnienia wynoszącego co najwyżej 200, 100, 50, 20, 10 Pa. To ciśnienie utrzymuje się przez co najmniej 5, 10, 20 lub 30 minut, dopóki próbka nie zamarznie w całości lub częściowo. Następne etapy tworzenia piany i usuwania rozpuszczalnika w celu utworzenia substancji stałej są takie, jak opisano wyżej. W korzystnej postaci wynalazku etapy zamrażania próbki w suszarce sublimacyjnej i tworzenia piany przeprowadza się w stałej temperaturze, korzystnie przez zmianę warunków ciśnienia. W kolejnej korzystnej postaci etapy zamrażania próbki w suszarce sublimacyjnej, tworzenia piany i usuwania rozpuszczalnika w celu utworzenia substancji stałej przeprowadza się w stałej temperaturze, korzystnie przez zmianę warunków ciśnienia. W kolejnej korzystnej postaci wynalazku warunki zarówno ciśnienia, jak i temperatury są różne w czasie etapów zamrażania próbki, tworzenia piany i usuwania rozpuszczalnika w celu utworzenia substancji stałej. W sposobach według wynalazku korzystnie stosuje się pojemniki mające hydrofobową powierzchnię wewnętrzną. Osiąga się to przez powlekanie wewnętrznej powierzchni kompozycją hydrofobową, na przykład silikonizacją. Silikonizację uzyskuje się stosując procesy, które są dobrze znane fachowcom. Alternatywnie hydrofobową powierzchnię wewnętrzną uzyskuje się przez wykonanie pojemnika z kompozycji hydrofobowej. Obecność hydrofobowej powierzchni wewnętrznej pojemnika sprawia, że tworzenie piany jest bardziej prawdopodobne i jest bardziej powtarzalne. To umożliwia zastosowanie niższych stężeń poliolu w konserwowanej próbce, co z kolei skraca czas niezbędny do wysuszenia próbki, zmniejsza efekt reakcji Maillarda i inne szkodliwe interakcje między poliolem a środkiem czynnym. Gdy konserwowana próbka stanowi szczepionkę, powstałą substancję stałą roztwarza się szybko ze względu na niższą ilość występującego poliolu, a powstały roztwór szczepionki ma mniejszą lepkość, co umożliwia łatwiejsze jego podawanie. Suszenie bez zamrażania i tworzenia piany Szczególnie korzystny sposób według wynalazku polega na suszeniu IPV w obecności środka stabilizującego i korzystnie bakteryjnego polisacharydu, przy użyciu delikatnego procesu, w którym

16 16 PL B1 unika się ekspozycji IPV na zamrażanie i tworzenie piany, tak że IPV jest narażony na mniejszy stres podczas procesu suszenia i antygenowość zostaje zachowana w dużym stopniu. Ten sposób jest szczególnie przydatny gdy korzystne jest zastosowanie niższego stężenia poliolu tworzącego produkt szklisty, na przykład w stężeniu poniżej 10% (wag./obj.), korzystniej poniżej 5% (wag./obj.) i korzystne jest krótsze suszenie. Usuwanie rozpuszczalnika przez odparowanie (suszenie wyparne - etap b) Proces suszenia bez zamrażania i tworzenia piany obejmuje poddanie konserwowanej próbki takim warunkom ciśnienia i temperatury, że dochodzi do uwalniania rozpuszczalnika z konserwowanej próbki przez odparowanie bez zamrażania próbki i powstawania pęcherzyków z utworzeniem piany. Temperatura w konserwowanej próbce okresowo będzie różna od temperatury na zewnątrz próbki ze względu na endotermiczny charakter procesu parowania. Odniesienia do temperatury dotyczą warunków zewnętrznych wobec konserwowanej próbki, na przykład gdy stosuje się dużą przemysłową suszarkę sublimacyjną, do temperatury na półce. Odpowiada ona zazwyczaj ustawionej temperaturze suszarki sublimacyjnej. Ewentualnie w tym sposobie według wynalazku występuje wstępny etap odgazowania konserwowanej próbki. Ciśnienie jest obniżane do wartości co najwyżej 20 kpa, korzystnie 20-3,5 kpa, na okres czasu trwający co najmniej 5 minut przed dalszym obniżeniem ciśnienia. W korzystnej postaci wynalazku suszenie wyparne realizuje się przez obniżenie ciśnienia przy jednoczesnej kontroli warunków temperatury. Ciśnienie modyfikuje się do wartości co najwyżej 3, 2,5, 2, korzystnie 1,5, 1,2, najkorzystniej 1, 0,8, 0,7, 0,6, 0,5, 0,4, 0,3, 0,2 lub 0,1 kpa, jednocześnie utrzymując ustawienie temperatury na poziomie powyżej 0 C, korzystnie 4 C - 37 C, 4 C - 10 C, 10 C - 15 C, 15 C - 20 C, 20 C - 25 C, 25 C - 30 C, 30 C - 37 C lub 37 C - 45 C. Te warunki utrzymuje się przez co najmniej 1, 2, 3, 4, 5, 8, 10, 12, 16 lub 24 godziny, korzystnie przez 2-4 godziny, 4-6 godzin, 6-8 godzin, 8-12 godzin, godzin. W szczególnie korzystnej postaci ciśnienie jest utrzymywane powyżej 0,2 kpa, podczas gdy temperatura ustawiona jest na 15 C, aby uniknąć zamrożenia próbki. W korzystnej postaci temperaturę utrzymuje się na poziomie 15 C, a ciśnienie jest ustawione na 0,5-1 kpa, korzystniej 0,6-0,9 kpa, najkorzystniej około 0,8 kpa. Gdy stosuje się wyższą ustawioną temperaturę, możliwe jest użycie nieco niższego ciśnienia bez zamrażania próbki, a gdy stosuje się niższą ustawioną temperaturę, aby zapobiec zamrożeniu ciśnienie należy utrzymywać na wyższym poziomie. Korzystnie warunki te utrzymuje się przez wystarczający okres, aby spowolnić szybkość parowania tak, żeby temperatura próbki była orientacyjnie taka sama, jak temperatura na zewnątrz próbki. Korzystnie konserwowana próbka nie powinna zamarzać ani gotować się z utworzeniem piany; usuwany jest z niej rozpuszczalnik i powstaje lepka ciecz lub ciecz o wysokiej lepkości. Usuwanie rozpuszczalnika z wytworzeniem cieczy o wysokiej lepkości Następny etap sposobu według wynalazku polega na usuwaniu rozpuszczalnika do momentu, gdy konserwowana próbka wyschnie z utworzeniem cieczy o wysokiej lepkości bez tworzenia piany i korzystnie bez zamarzania. W jednej postaci wynalazku realizuje się to utrzymując warunki ciśnienia i temperatury na poziomie stosowanym w pierwszym stadium suszenia wyparnego. Na przykład ciśnienie utrzymuje się na poziomie co najwyżej 3, 2,5, 2, korzystnie 1,5, 1,2, najkorzystniej 1, 0,8, 0,7, 0,6, 0,5, 0,4, 0,3, 0,2 lub 0,1 kpa przy jednoczesnym utrzymaniu ustawienia temperatury na poziomie powyżej 0 C, korzystnie 5 C - 37 C, 5 C - 10 C, 10 C - 15 C, 15 C - 20 C, 20 C - 25 C, 25 C - 30 C lub 30 C - 37 C. W przypadku ustawienia temperatury na 15 C, ciśnienie 0,5-1 kpa, korzystnie 0,6-0,9 kpa, najkorzystniej około 0,8 kpa utrzymuje się przez 4-24 godziny, korzystnie 1-4, 4-8, 8-12 lub godzin. Te warunki temperatury i ciśnienia utrzymuje się przez 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 18 godzin lub dłużej dla uzyskania cieczy o wysokiej lepkości o zawartości rozpuszczalnika wynoszącej co najwyżej 15, 12, korzystnie 10, 8, 5, 4, 3, 2 lub 1% (wag./wag.). Inna postać wynalazku obejmuje wzrost ustawienia temperatury w trakcie usuwania rozpuszczalnika do wyższej temperatury ustawionej niż utrzymywana na wcześniejszym etapie procesu. To korzystnie umożliwia szybsze usuwanie rozpuszczalnika z próbki, tak że sposób według wynalazku może być ukończony w krótszym czasie. Na przykład ustawienie temperatury zwiększa się do poziomu powyżej 0 C, korzystniej powyżej 20 C, korzystnie 5 C - 37 C, 5 C - 10 C,10 C - 20 C i 20 C - 30 C, korzystniej 30 C - 40 C, korzystniej 40 C - 50 C, najkorzystniej 50 C - 60 C, jednocześnie utrzymując ciśnienie na poziomie co najwyżej 3, 2,5, 2, korzystnie 1,5, 1,2, najkorzystniej 1, 0,8, 0,7, 0,6, 0,5, 0,4, 0,3, 0,2 lub 0,1 kpa. Te warunki temperatury i ciśnienia utrzymuje się przez 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12,

17 PL B godzin lub dłużej w celu otrzymania substancji stałej o zawartości rozpuszczalnika co najwyżej 15, 12, korzystnie 10, 8, 5, 4, 3, 2 lub 1%. Ta postać wymaga, aby środek czynny był stabilny termicznie w stosowanej temperaturze, aby sposób mógł być przeprowadzony z powodzeniem Korzystna postać wynalazku obejmuje obniżenie ustawienia ciśnienia podczas usuwania rozpuszczalnika (etap c) do wartości ciśnienia niższej, niż stosowana na wcześniejszym etapie procesu (etap b). Umożliwia to szybsze usuwanie rozpuszczalnika z próbki, tak że sposób według wynalazku można ukończyć w krótszym czasie. Umożliwia to także usunięcie większej części rozpuszczalnika. Na przykład ciśnienie ustawia się na poziomie co najwyżej 700, 600, korzystnie 500, 400, 300, korzystniej 200, 150, 100, najkorzystniej 80, 50, 20, 10, 5, 2, 1 lub 0,5 Pa, jednocześnie utrzymując temperaturę na poziomie co najmniej 0 C, korzystnie 10 C - 20 C, 20 C - 30 C, 30 C - 35 C lub powyżej 40 C. Te warunki temperatury i ciśnienia utrzymuje się przez co najmniej 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 18 godzin lub dłużej w celu uzyskania substancji stałej o zawartości rozpuszczalnika co najwyżej 15, 12 korzystnie 10, 8, 5, 4, 3, 2 lub 1% (wag./wag.), korzystnie określoną aparatem do analizy wilgoci metodą kulometryczną Karla Fischera (Eur. J. Pharm. Biopharm. (2000) 50; ). Korzystnie etapy b) i c) powinny zostać ukończone w czasie co najwyżej 18 godzin, korzystniej 16, 14, 12, najkorzystniej 10, 8, 6 lub 4 godzin. Suszoną kompozycję stanowi kompozycja, z której usunięto rozpuszczalnik przez odparowanie, gotowanie lub sublimację, pozostawiając zawartość rozpuszczalnika na poziomie co najwyżej 15, 12, 10, korzystniej 8, 5, 4, 3, 2 lub 1% (wag./wag.), korzystnie określoną metodą Karla Fischera. Korzystne zakresy zawartości rozpuszczalnika wynoszą 1-3%, 3-5%, 5-10% lub 10-15% (wag./wag.). Określenie obejmuje ciecze o wysokiej lepkości oraz suszony spieniony szklisty produkt i liofilizowane substancje stałe. Ciecz o wysokiej lepkości jest definiowana jako materiał, z którego usunięto rozpuszczalnik przez odparowanie bez gotowania, pozostawiając zawartość rozpuszczalnika na poziomie co najwyżej 15, 12, 10, korzystniej 8, 5, 4, 3, 2 lub 1% (wag./wag.), korzystnie określoną metodą Karla Fischera. Korzystne zakresy zawartości rozpuszczalnika wynoszą 1-3%, 3-5%, 5-10% lub 10-15% (wag./wag.). Ciecz o wysokiej lepkości ma wystarczająco niską zawartość rozpuszczalnika, że środek czynny jest zakonserwowany w trwałym stanie przez co najmniej 3, 6, 9, 12 lub 24 miesiące w temperaturze 4 C, co umożliwia czynnemu środkowi zachowanie co najmniej 40, 50, 60, korzystnie 70, 80, 90 lub 95% jego aktywności i/lub antygenowości w tym czasie. Korzystnie ciecz o wysokiej lepkości ma wygląd substancji stałej, ale jest produktem szklistym i ma zdolność bardzo wolnego płynięcia w okresie 2, 4 lub 6 dni, korzystniej 1, 2, 3, 4, 6, 7, 10 lub 12 miesięcy. Bardzo wolne płynięcie można mierzyć przez odwrócenie zbiornika zawierającego ciecz o wysokiej lepkości i pozostawienie w temperaturze pokojowej do zaobserwowania płynięcia cieczy o wysokiej lepkości. W korzystnej postaci będzie wydawało się, że ciecz o wysokiej lepkości nie płynie po 2, 4 lub 6 dniach, korzystnie 2, 3 lub 4 tygodniach, korzystniej 2, 4, 6, 8, 10 lub 12 miesiącach w odwróconym położeniu naczynia. Lepka ciecz jest definiowana jako produkt pierwotnej fazy usuwania rozpuszczalnika, po zakończeniu której z próbki usunięta jest większość rozpuszczalnika. Ten punkt można ustalić, ponieważ szybkość parowania spada, tak że temperatura próbki wraca do temperatury otoczenia, gdyż znika endotermiczny efekt parowania. Spieniony szklisty produkt stanowi suszona kompozycja zawierająca poliol tworzący produkt szklisty, która jest wytwarzana sposobem, w którym konserwowaną próbkę poddaje się takim warunkom temperatury i ciśnienia, że w próbce intensywnie powstają pęcherzyki lub próbka gotuje się, tak że podczas suszenia próbki tworzy się piana. Wynalazek przedstawiono w odniesieniu do figur rysunku opisanych poniżej. Fig. 1 - Zdjęcia fiolek zawierających konserwowaną próbkę na różnych etapach procesu suszenia spieniającego A- pokazuje wygląd konserwowanych próbek poddawanych suszeniu sublimacyjnemu w postaci ciekłego preparatu B- pokazuje wygląd konserwowanych próbek, gdy ciśnienie jest obniżone do 150 Pa. Próbki zaczynają zamarzać z nieznacznie różniącymi się szybkościami ze względu na różne warunki panujące w każdej próbce. C- pokazuje wygląd konserwowanych próbek przy ciśnieniu 10 Pa, gdy wszystkie próbki są całkowicie zamarznięte.

18 18 PL B1 D- pokazuje wygląd konserwowanych próbek, gdy ciśnienie zwiększono do Pa. Tworzy się spieniony szklisty produkt, gdy konserwowana próbka pieni się, a rozpuszczalnik odparowuje. Fig. 2 - Zdjęcie cieczy o wysokiej lepkości w odwróconych fiolkach. Wynalazek ilustrują poniższe przykłady. Poniższe przykłady realizuje się przy użyciu zwykłych technik, które są dobrze znane i rutynowe dla fachowca, poza przypadkami, które szczegółowo opisano. P r z y k ł a d 1. Proces zamrażania wyparnego Proces przeprowadzono stosując suszarkę sublimacyjną Heto Drywinner 8-85, w której temperaturę na półce można było regulować z dokładnością 1 C, końcowa temperatura kondensatora wynosiła -85 C, ciśnienie było regulowane za pomocą zaworu upustowego, a 6 termoelementów mierzyło temperaturę produktu. Konserwowaną próbkę wytworzono przez dodanie środka stabilizującego (10% trehalozy lub 3,5 sacharozy) i środka czynnego do wodnego roztworu. Próbki umieszczono w suszarce subiimacyjnej i utrzymywano temperaturę na półce na stałym poziomie 15 C podczas całego procesu. Ciśnienie początkowo obniżono do 20 kpa i utrzymywano na tym poziomie przez 10 minut przed dalszym obniżeniem. Przy ciśnieniu 150 Pa roztwory zaczęły zamarzać w wyniku chłodzenia wyparnego, co pokazano na fig. 1. Ciśnienie dalej obniżono do 10 Pa, aby próbka całkowicie zamarzła. Następnie ciśnienie zwiększono do 80 do 350 Pa, w którym to punkcie tworzyła się piana podczas usuwania wody z próbki. W tych warunkach eksperymentu nie obserwowano wrzenia w próbce kontrolnej zawierającej tylko wodę. Z próbek usunięto wodę raczej przez odparowanie niż wrzenie. Po 18 godzinach w tych warunkach próbki są wysuszone i spieniony roztwór staje się spienionym szklistym produktem. Podobny proces z powodzeniem przeprowadzono, utrzymując temperaturę na półce na innych poziomach do 37 C. P r z y k ł a d 2. Ustalenie warunków zamrażania Sporządzono próbki przez rozpuszczenie sacharozy w wodzie i uzyskano 1%, 5%, 10% i 20% roztwory. Próbki umieszczono w suszarce sublimacyjnej, utrzymując temperaturę na półce na stałym poziomie 15 C podczas całego procesu. Ciśnienie początkowo obniżono do 20 kpa i utrzymywano na tym poziomie przez 10 minut przed jego dalszym obniżeniem do 5 kpa, 500 Pa, 250 Pa, 75 Pa, 40 Pa i 20 Pa. Każdą wartość ciśnienia utrzymywano przez 20 minut, aby umożliwić wyrównanie temperatur i temperaturę próbki odczytywano za pomocą termoelementu. Termoelementy były połączone z próbkami o różnych stężeniach sacharozy, a temperatury podane w tabeli 1 są wartościami średnimi temperatury. Wyniki Wszystkie próbki zamarzły przy ciśnieniu Pa, bez względu na stężenie sacharozy. Temperatury zmierzone przy różnych ciśnieniach były bardzo zbliżone do przewidywanych wartości z krzywej trzypunktowej. Dlatego wydaje się, że obecność sacharozy nie wywiera dużego wpływu na temperaturę próbek przy różnych ciśnieniach. W korzystnym sposobie według wynalazku konieczne jest uniknięcie zamrożenia próbki. Można to osiągnąć przez utrzymywanie ciśnienia powyżej 200 Pa przy temperaturze 15 C na półce. Przy niższych temperaturach ciśnienie należy utrzymywać na wyższym poziomie, natomiast wyższa temperatura może umożliwić dalsze obniżenie ciśnienia bez zamrożenia próbek. T a b e l a 1 Ciśnienie Temperatura zmierzona Temperatura teoretyczna Ciekła/zamrożona kpa 15 C ciekła 5 kpa 15 C ciekła 500 Pa 1 C 1 C ciekła 250 Pa -5 C -7 C ciekła 75 Pa -21 C -21 C zamrożona 40 Pa -22 C -27 C zamrożona 20 Pa -27 C -32 C zamrożona

19 PL B1 19 P r z y k ł a d 3. Warunki pienienia dla próbek o różnym stężeniu cukru Sporządzono konserwowane próbki zawierające 0%, 5%, 10%, 15 15%, 20%, 25% i 50% sacharozy. Próbki umieszczono w suszarce sublimacyjnej i utrzymywano temperaturę na półce na stałym poziomie 15 C podczas całego procesu. Ciśnienie początkowo obniżono do 20 kpa i utrzymywano na tym poziomie przez 10 minut przed jego dalszym obniżeniem. Ciśnienie dalej obniżano do 10 Pa, co umożliwiło pełne zamrożenie próbki. Następnie ciśnienie zwiększono do 78,8 Pa, 81,2 Pa lub 350 Pa w kolejnych eksperymentach. Te warunki utrzymywano przez 3 godziny dla eksperymentów pod ciśnieniem 350 Pa i 81,2 Pa i przez 6 godzin dla eksperymentów pod ciśnieniem 78,8 Pa. Oceniono właściwości fizyczne każdej próbki. Wyniki Jak przedstawiono w tabeli 2 przy ciśnieniu 350 Pa do intensywnego tworzenia piany wymagane było wysokie stężenie sacharozy, wynoszące 50%. Przeciwnie, niższe ciśnienie 80 Pa umożliwiało intensywne tworzenie piany przy niższych stężeniach sacharozy, wynoszących 10-25%. Niższe stężenie sacharozy może być korzystne dla konserwowanych próbek na przykład do stosowania w szczepionkach. Dlatego korzystny jest sposób realizowany pod ciśnieniem 80 Pa i przy stężeniu sacharozy 10-25%. T a b e l a 2 Ciśnienie % sacharozy Charakterystyka fizyczna 350 Pa 20 4/5 spieniony, 1/5 lepka ciecz 350 Pa 25 2/5 spieniony, 3/5 lepka ciecz 350 Pa 50 5/5 spieniony 81,2 Pa 5 Pierścień krystalizacji i pęcherzyki 81,2 Pa 10 Całość spieniona 81,2 Pa 15 Całość spieniona 81,2 Pa 20 Całość spieniona 81,2 Pa 25 Całość spieniona 78,8 Pa 5 Pierścień krystalizacji i pęcherzyki 78,8 Pa 20 Całość spieniona 78,8 Pa 25 Całość spieniona 78,8 Pa 50 Spieniony i syrop P r z y k ł a d 4. Wpływ stosowania silikonizowanych pojemników Sporządzono konserwowane próbki zawierające 5%, 10%, 15% i 25% sacharozy i dodano do fiolek, z których niektóre były silikonizowane. W jednym eksperymencie próbki umieszczono w suszarce sublimacyjnej i utrzymywano temperaturę na półce na stałym poziomie 15 C podczas całego procesu. Ciśnienie początkowo obniżono do 20 kpa i utrzymywano na tym poziomie przez 10 minut przed jego dalszym obniżeniem. Ciśnienie dalej obniżano do 280 Pa przez 3 godziny. W tym okresie ciśnienie spadło do 200 Pa, przy czym zmniejszyło się stężenie pary wodnej. Oceniono właściwości fizyczne każdej próbki. W drugim eksperymencie próbki umieszczono w suszarce sublimacyjnej, utrzymywano temperaturę na półce na stałym poziomie 37 C podczas całego procesu. Ciśnienie początkowo obniżono do 20 kpa i utrzymywano na tym poziomie przez 10 minut przed jego dalszym obniżeniem. Ciśnienie dalej obniżano do 240 Pa przez 3 godziny. W tym okresie ciśnienie spadło do 106 Pa, przy czym zmniejszyło się stężenie pary wodnej. Oceniono właściwości fizyczne każdej próbki. Wyniki Silikonizacja miała wpływ na odgazowanie próbek. Obniżenie ciśnienia do 20 kpa doprowadziło do odgazowania próbek w silikonizowanych, lecz nie doprowadziło do odgazowania w niesilikonizowanych fiolkach. Odgazowanie obserwowano na podstawie powstawania pęcherzyków w próbce. Silikonizacja fiolki również sprawiła, że tworzenie piany było bardziej prawdopodobne i bardziej powtarzalne (tabela). Silikonizacja fiolek umożliwia tworzenie piany przy niższych stężeniach poliolu. Niższe stężenie poliolu skraca czas niezbędny do wysuszenia próbki i zmniejsza efekt reakcji

20 20 PL B1 Maillarda i inne interakcje z poliolem uszkadzające środek czynny. Gdy konserwowana próbka stanowi szczepionkę, obniża to lepkość próbki i umożliwia łatwiejsze podawanie. T a b e l a 3 Temperatura i ciśnienie % sacharozy Charakterystyka dla niesilikonizowanych fiolek 15 C, 280 Pa 5% Lepki płyn Charakterystyka dla silikonizowanych fiolek 15 C, 280 Pa 10% Lepki płyn Spienione 15 C, 280 Pa 15% Lepki płyn 15 C, 280 Pa 25% Lepki płyn 37 C, 240 Pa 5% 3 lepki płyn, 2 spienione 37 C, 240 Pa 10% Wszystkie lepki płyn 5 spienionych, 1 lepki płyn 37 C, 240 Pa 15% Wszystkie spienione 37 C, 240 Pa 25% Wszystkie spienione P r z y k ł a d 5. Porównanie konserwowania Hib-IPV w znanym procesie suszenia sublimacyjnego albo w procesie suszenia spieniającego. Konserwowanym środkiem czynnym była mieszanina polisacharydu PRP Haemophilus influenzae b (Hib) i trzech szczepów inaktywowanego wirusa polio (IPV). Konserwowaną próbkę wytwarzano przez rozpuszczenie Hib-IPV w 3,15% roztworze sacharozy lub 10% roztworze trehalozy. Próbki liofilizowano stosując znany proces suszenia sublimacyjnego próbki, którego realizacja trwała trzy dni w dużej suszarce sublimacyjnej, albo stosując proces suszenia spieniającego opisany w przykładzie 1. Próbki roztworzono w wodzie i stosowano test ELISA do oceny zachowania antygenowości trzech szczepów wirusa polio. W oddzielnych testach ELISA stosowano trzy poliklonalne przeciwciała i trzy przeciwciała monoklonalne, jedno przeciw każdemu szczepowi. Wyniki przedstawiono w postaci odsetka odczytu uzyskanego dla próbki, której nie poddano procesowi suszenia sublimacyjnego ani suszenia spieniającego. Zbadano immunogenność konserwowanych próbek in vivo przez szczepienie grup dziesięciu myszy roztworzonym IPV-Hib, przez pobranie krwi od myszy i monitorowanie stężenia przeciwciał przeciw IPV i polisacharydom Hib, np. z zastosowaniem testu ELISA lub Western blotting. Stopień ochrony oceniano w modelu prowokacji myszy. Wyniki Przy użyciu sacharozy lub trehalozy jako poliolu, antygenowość IPV była lepiej zachowana w przypadku zastosowania procesu suszenia spieniającego w porównaniu z zastosowaniem znanego procesu suszenia sublimacyjnego. T a b e l a 4 Sposób suszenia Zawartość poliolu ELISA - typ 1/2/3% Poliklonalne Monoklonalne Suszenie sublimacyjne 3,15% sacharozy 46/49/58* 25/0/0 Suszenie spieniające 3,15% sacharozy 85/97/106 55/68/57 Suszenie sublimacyjne 10% trehalozy 47/43/58 Suszenie spieniające 10% trehalozy 93/86/84 72/75/87 * Eksperyment suszenia sublimacyjnego w obecności 3,15% sacharozy powtórzono pięciokrotnie, a przedstawione wyniki pochodzą z jednego przykładowego eksperymentu. P r z y k ł a d 6. Ochronny wpływ procesu suszenia sublimacyjnego IPV w obecności polisacharydów Hib

21 PL B1 21 Wytworzono konserwowane próbki zawierające 3,15% sacharozy i IPV lub mieszaninę IPV i polisacharydów Hib. Próbki umieszczono w suszarce sublimacyjnej Heto Drywinner 8-85 i suszono sublimacyjnie w temperaturze nastawionej na -32 C przez 40 godzin, a następnie kontynuowano suszenie w 4 C przez 16 godzin. Próbki roztworzono w wodzie i stosowano test ELISA do oceny zachowania antygenowości trzech szczepów wirusa polio. Do oceny stopnia zachowania antygenu w roztworzonej, suszonej sublimacyjnie próbce w porównaniu z próbką wzorcową, której nie zamrażano, w oddzielnych testach ELISA stosowano trzy przeciwciała monoklonalne, jedno przeciw każdemu szczepowi. Wyniki przedstawiono w postaci odsetka odczytu uzyskanego dla próbki, której nie poddano procesowi suszenia sublimacyjnego ani suszenia spieniającego. Wyniki Jak przedstawiono w tabeli 5, obecność polisacharydu Hib w konserwowanej próbce z IPV prowadziła do większego zachowania antygenów IPV po suszeniu sublimacyjnym niż uzyskiwane gdy suszono sublimacyjnie sam IPV. Polisacharydy wywierają konserwujący wpływ na antygenowość IPV, dodatkowy w stosunku do uzyskiwanego przy użyciu sacharozy jako środka konserwującego. T a b e l a 5 Kompozycja suszona sublimacyjnie Zawartość poliolu ELISA - typ 1/2/3% IPV 3,15% sacharozy 26/25/0 IPV-Hib 3,15% sacharozy 52/68/0 P r z y k ł a d 7. Wpływ różnych środków stabilizujących na proces suszenia sublimacyjnego IPV-Hib Sporządzono konserwowane próbki zawierające IPV-Hib stosując jako środek stabilizujący 3,15% sacharozę, 2,5% sorbitol, 0,8% glutaminę i 0,01% HSA, stabilizator MMR i laktozę, 3% glicynę, 2% argininę i 4% sacharozę lub 4% sacharozę i 2% glicynę. W eksperymencie zastosowano próbkę zawierającą 3,15% sacharozy jako środek stabilizujący przy użyciu IPV-Hib w podwójnym stężeniu. Próbki suszono sublimacyjnie z zastosowaniem znanego trzydniowego cyklu suszenia sublimacyjnego w okresowej suszarce sublimacyjnej. Próbki roztworzono w wodzie i stosowano test ELISA do oceny zachowania antygenowości trzech szczepów wirusa polio. W oddzielnych testach ELISA stosowano trzy przeciwciała poliklonalne i trzy przeciwciała monoklonalne, jedno przeciw każdemu szczepowi. Wyniki przedstawiono w postaci odsetka odczytu uzyskanego dla próbki, której nie poddano procesowi suszenia sublimacyjnego ani suszenia spieniającego. Oceniano immunogenność konserwowanych próbek in vivo przez szczepienie grup dziesięciu myszy roztworzonym IPV-Hib, pobranie krwi od myszy i monitorowanie stężenia przeciwciał przeciw IPV i polisacharydom Hib, na przykład z zastosowaniem testu ELISA lub Western blotting. Stopień ochrony oceniano w modelu prowokacji myszy. Wyniki Zwiększenie dawki IPV z 40/8/32 DU/dawkę do 80/16/64 DU/dawkę doprowadziło do wzrostu zachowania antygenowości IPV, jak przedstawiono w tabeli 6. Zmiana środka stabilizującego również wpływała na zachowanie antygenów, przy czym 4% sacharoza/2% glicyna i 2,5% sorbitol/0,8% glutamina/0,01% HAS powodowały lepsze zachowanie antygenów, co wykazują dane uzyskane na podstawie testu ELISA. T a b e l a 6 Środek stabilizujący Wyniki poliklonalnego testu ELISA Wyniki monoklonalnego testu ELISA ,15% sacharoza 50/50/70 25/0/0 2,5% sorbitol 0,8% glutamina 0,01% HSA 55/72/72 33/50/0 Stabilizator MMR laktoza 59/62/65 28/25/0

22 22 PL B1 3,15% sacharoza Podwójna dawka IPV-Hib 3% glicyna 2% arginina 4% sacharoza 4% sacharoza 2% glicyna 84/92/ /138/0 46/62/78 25/50/15 P r z y k ł a d 8. Powtarzalność jakości próbki po procesie suszenia sublimacyjnego, suszenia spieniającego lub suszenia spieniającego z etapem zamrażania Sporządzono konserwowane próbki zawierające jako środek czynny IPV, wirusa świnki, odry, różyczki, ospy wietrznej i półpaśca, CMV, zapalenia wątroby, HSV1, HSV2, wirusa oddechowego, dengi, paramyxoviridae, takie jak wirus parainfluency, togaviridae i wirusy grypy i/lub Hib. Środek czynny rozpuszczono w wodnym roztworze zawierającym poliol. Wiele próbek konserwowano albo przez suszenie sublimacyjne, suszenie spieniające z etapem zamrażana zgodnie z protokołem opisanym w przykładzie 1, albo suszenie spieniające bez etapu zamrażania zgodnie z protokołem opisanym w przykładzie 4. Próbki roztworzono w roztworze wodnym i oceniono ich aktywność. Zrealizowano to z zastosowaniem testów ELISA, opisanych w przykładzie 5, przy użyciu przeciwciał specyficznych wobec naturalnych antygenów. W przypadku żywych wirusów ustalono miano w każdej próbce przez zastosowanie wirusa do zakażenia odpowiednich komórek gospodarzy i ocenę zakaźności na podstawie tworzenia łysinek lub immunocytochemicznie. Gdy immunogenne kompozycje lub szczepionki były suszone spieniająco, zachowanie immunogenności można było zbadać w modelu zwierzęcym przez immunizację grup zwierząt szczepionką, którą suszono spieniająco lub suszono sublimacyjnie i pobudzano odpowiedzi odpornościowej na przykład 14 i 28 dni po pierwszej immunizacji. Od zwierząt wyizolowano surowicę po zakończeniu schematu immunizacji i oceniono w niej miano wobec szczepionki z zastosowaniem zwykłych testów, na przykład testu ELISA, immunocytochemii, Western blotting, immunoprecypitacji, testu bakteriobójczości surowicy lub testu aglutynacji. Wyniki podsumowano na początku przez porównanie aktywności środka czynnego po suszeniu sublimacyjnym, suszeniu spieniającym z etapem zamrażania lub suszeniu spieniającym bez etapu zamrażania. Następnie oceniono stopień powtarzalności sposobu konserwacji przez porównanie zakresu aktywności po poddaniu próbek każdemu z trzech sposobów konserwacji. P r z y k ł a d 9. Długookresowe przechowywanie środków czynnych konserwowanych w procesie suszenia sublimacyjnego i suszenia spieniającego Sporządzono konserwowane próbki zawierające jako środek czynny IPV, wirusa świnki, odry, różyczki, ospy wietrznej i półpaśca, CMV, zapalenia wątroby, HSV1, HSV2, wirusa oddechowego, dengi, paramyxoviridae, takie jak wirus parainfluency, togaviridae i wirusy grypy i/lub Hib. Środek czynny rozpuszczono w wodnym roztworze zawierającym poliol. Wiele próbek konserwowano albo przez suszenie sublimacyjne, suszenie spieniające z etapem zamrażania zgodnie z protokołem opisanym w przykładzie 1, albo suszenie spieniające bez etapu zamrażania zgodnie z protokołem opisanym w przykładzie 4. Próbki poddano starzeniu przez przechowywanie ich w temperaturze 37 C lub 23 C przez siedem dni i ich aktywność porównano z próbkami przetrzymywanymi w temperaturze 4 C. Próbki roztworzono w roztworze wodnym i oceniono ich aktywność. Prowadzono to z zastosowaniem testów ELISA opisanych w przykładzie 5, przy użyciu przeciwciał specyficznych wobec naturalnych antygenów. W przypadku żywych wirusów ustalono miano w każdej próbce przez zastosowanie wirusa do zakażenia odpowiednich komórek i ocenę zakaźności na podstawie tworzenia łysinki lub immunocytochemicznie. Wyniki podsumowano na początku przez porównanie aktywności środka czynnego po przechowywaniu w podwyższonych temperaturach z przechowywaniem w temperaturze 4 C. Następnie oceniono stopień powtarzalności sposobu konserwacji przez porównanie zakresu aktywności po poddaniu próbek każdemu z trzech zestawów warunków. P r z y k ł a d 10. Proces suszenia bez zamrażania i tworzenia piany Sporządzono konserwowane próbki zawierające 5%, 10%, 15% i 25% sacharozy i dodano do fiolek. Próbki umieszczono w suszarce sublimacyjnej przy temperaturze ustawionej na 15 C podczas całego procesu. Ciśnienie początkowo obniżono do 20 kpa i utrzymywano na tym poziomie przez 10 minut przed jego dalszym obniżeniem, aby umożliwić odgazowanie próbek. Ciśnienie dalej obniżano do 0,8 kpa na dwie do trzech godzin; w tym czasie termoelementy wewnątrz próbek pokazały, że temperatura próbki spadła do 4 C wskutek chłodzenia wyparnego. Po 2-3 godzinach temperatura

23 PL B1 23 próbek powróciła do 15 C, co wskazywało, że parowanie w tych warunkach temperatury i ciśnienia było bliskie zakończenia. W tym stadium procesu próbki nie wrzały i nie tworzyły piany ani nie zamarzały, tak że środek czynny w próbce był narażony na możliwie najmniejszy stres. Próbki wyglądały jak substancja stała, podobna do końcowego produktu. Dalsze suszenie próbek prowadzono przez dalsze obniżenie ciśnienia do 10 Pa, jednocześnie utrzymując temperaturę na półce na poziomie 15 C. Te warunki utrzymywano przez dalsze godzin. Podczas tej fazy temperatura próbki utrzymywała się na poziomie 15 C, gdyż szybkość parowania była niewielka. Zachodziło dalsze suszenie i powstała próbka miała wygląd substancji stałej. Jeżeli próbkę umieszczano na boku, zawartość próbki płynęła bardzo wolno, w okresie dni lub miesięcy, co wskazywało, że próbka jest ciekłym produktem szklistym o wysokiej lepkości. Fig. 2 pokazuje, że można odwrócić pojemnik zawierający ciecz o wysokiej lepkości bez powodowania natychmiastowego przepływu cieczy o wysokiej lepkości. P r z y k ł a d 11. Zachowanie immunogennośći IPV po procesie suszenia bez zamrażania i tworzenia piany Próbki suszone zgodnie ze sposobem z przykładu 10 nie były narażone na stresy związane z powstawaniem pęcherzyków, co towarzyszy tworzeniu piany i zamrażaniu. Eksperymenty przeprowadzono dla określenia czy ten sposób, stosowany do suszenia IPV, prowadzi do wysokiego stopnia zachowania antygenu. Przeprowadzono trzy odrębne eksperymenty, w których IPV przeprowadzono w stan zawiesiny w wodnym roztworze z 10% sacharozą lub 10% trehalozą jako środkiem stabilizującym. Próbki umieszczo w silikonizowanych fiolkach, które umieszczono w suszarce sublimacyjnej Heto Drywinner 8-85 i temperaturę nastawiono na 15 C. Początkowo, aby odgazować próbkę, ciśnienie obniżono do 3,5 kpa. Po 10 minutach ciśnienie dalej obniżono do 0,8 kpa i utrzymywano na tym poziomie przez dwie godziny. W tym okresie utrzymywano ustawienie temperatury na 15 C i monitorowano temperaturę w próbce. W czasie gdy woda parowała z próbki, temperatura spadła do 4 C, ale pod koniec drugiej godziny, gdy szybkość parowania spadła, temperatura powróciła do 15 C. W tych warunkach nie powstawały pęcherzyki i nie doszło do tworzenia piany. Następnie ciśnienie dalej obniżono do 10 Pa i te warunki utrzymywano przez 16 dodatkowych godzin w pierwszych dwóch eksperymentach i przez 10 dodatkowych godzin w trzecim eksperymencie. Próbki roztworzono w wodzie, a do oceny zachowania antygenowości trzech szczepów wirusa polio zastosowano test ELISA. W teście ELISA stosowano przeciwciało monoklonalne przeciw wirusowi IPV typu 3 dla oceny stopnia zachowania antygenu w roztworzonej próbce, suszonej sublimacyjnie, w porównaniu z próbką wzorcową, która nie była zamrożona. Wyniki przedstawiono w postaci odsetka odczytu uzyskanego dla próbki, której nie poddano procesowi suszenia. Wyniki Suszone próbki miały wygląd substancji stałej, jednakże okazało się, że mają postać cieczy o wysokiej lepkości/produktu szklistego, gdyż w okresie 2 dni suszona substancja stała mogła płynąć, jeżeli pojemnik odwrócono w temperaturze pokojowej. T a b e l a 7. Zachowanie antygenu IPV typu 3, określane za pomocą testu ELISA przy użyciu przeciwciała monoklonalnego (suszenie bez tworzenia piany i zamrażania) Preparat 1. eksperyment (cykl 18 godzinny) 2. eksperyment (cykl 18 godzinny) 3. eksperyment (cykl 12 godzinny) 10% sacharoza 75% 78% 91% 10% trehaloza 82% 79% 93% Trzy poziomy zachowania antygenu IPV typu 3 są korzystne w porównaniu z przedstawionymi niżej wynikami suszenia sublimacyjnego, przy czym zazwyczaj stwierdzano bardzo niskie wartości w tym samym formacie ELISA, gdy zastosowano przeciwciało monoklonalne przeciw typowi 3. T a b e l a 8. Zachowanie antygenów IPV typu 1, 2 i 3, określane za pomocą testu ELISA przy użyciu przeciwciał monoklonalnych i poliklonalnych (suszenie sublimacyjne) Sposób suszenia Zawartości poliolu ELISA - typ 1/2/3% Poliklonalne Monoklonalne Suszenie sublimacyjne 3,15% sacharoza 46/49/58* 19/25/0

24 24 PL B1 Suszenie sublimacyjne 10% trehaloza 47/43/58 25/0/0 *Eksperyment suszenia sublimacyjnego w obecności 3,15% sacharozy powtórzono pięciokrotnie, a przedstawione wyniki pochodzą z jednego przykładowego eksperymentu. P r z y k ł a d 12. Trwałość suszonego IPV przechowywanego w postaci cieczy o wysokiej lepkości/produktu szklistego przy długotrwałym przechowywaniu IPV suszony sposobem opisanym w przykładzie 11 przechowywano w temperaturze 4 C przez 9 miesięcy. Próbki roztworzono w wodzie zawierającej 150 mm NaCl i stosowano test ELISA do oceny zachowania antygenowości trzech szczepów wirusa polio. Do oceny stopnia zachowania antygenu w roztworzonej przechowywanej próbce w oddzielnych testach ELISA stosowano trzy przeciwciała monoklonalne, jedno przeciw każdemu szczepowi. Roztworzone próbki z tej samej serii przed przechowywaniem zbadano podobnymi testami ELISA. Wszystkie wyniki porównano z próbką wzorcową, której nie suszono. Wyniki przedstawiono w postaci odsetka odczytu uzyskanego dla próbki, której nie poddano procesowi suszenia. Wyniki T a b e l a 9. Zachowanie antygenów IPV po przechowywaniu w postaci cieczy o wysokiej lepkości przez 9 miesięcy Traktowanie ELISA typ 1 ELISA typ 2 ELISA typ 3 Suszona/roztworzona Nie przechowywana Suszona/roztworzona 9 miesięcy w temperaturze 4 C 72% 75% 88% 70% 94% 90% Dlatego IPV suszony sposobem opisanym w przykładzie 11 można przechowywać w temperaturze 4 C przez co najmniej 9 miesięcy bez utraty antygenowości. P r z y k ł a d 13. Porównanie immunogenności in vivo IPV po wysuszeniu z utworzeniem cieczy o wysokiej lepkości i roztworzeniu, w porównaniu z niesuszonym IPV Grupę 10 szczurów Wistar zaszczepiono rozcieńczonym w różnym stopniu IPV, który wysuszono w obecności 10% sacharozy z utworzeniem cieczy o wysokiej lepkości przy użyciu sposobu ujawnionego w przykładzie 10 i roztworzono. Kolejne grupy 10 szczurów Wistar zaszczepiono wzorcowymi próbkami IPV, które wytwarzano w taki sam sposób, ale których nie suszono. Po 21 dniach od wszystkich szczurów pobrano surowicę i surowice zbadano w oddzielnych testach immunoprecypitacji przy użyciu wirusa polio Typu 1, Typu 2 i Typu 3. Wyniki przedstawiono w tabeli 10, w której podano: a) liczbę odpowiadających szczurów dla każdego rozcieńczonego IPV, b) ED50, która stanowi dawkę wymaganą do zagwarantowania, że u 50% szczurów dojdzie do serokonwersji, ocenianej testem immunoprecypitacji i c) względną siłę działania suszonego i roztworzonego IPV w porównaniu z niesuszonym wzorcowym IPV. T a b e l a 10. Immunogenność IPV po suszeniu z utworzeniem cieczy o wysokiej lepkości (JLE017/05) i roztworzeniu w porównaniu z niesuszonym wzorcowym IPV (JLE097) Próbka Liczba odpowiadających szczurów ED50 RP względna siła działania Nierozcieńczony IPV 1/1,25 1/3,125 1,7,81 JLE017/05 Typu ,37 0,956 Typu ,14 0,825 Typu ,18 1,051 JLE097 Typu ,33 1,120 Typu ,12 0,951 Typu ,91 1,172 Wzorcowa Typu ,37

25 PL B1 25 Typu ,93 Typu ,57 JLE017/05 stanowi serię IPV, którą wysuszono z utworzeniem cieczy o wysokiej lepkości, a następnie roztworzono. JLE097 to niesuszona seria wzorcowa. Tabela 10 pokazuje, że liczba zwierząt odpowiadających, zaszczepionych każdym rozcieńczonym IPV jest podobna dla obu serii suszonego i roztworzonego IPV i niesuszonej próbki wzorcowej. Ogólnie Typ 1 IPV wywoływał najlepszą odpowiedź odpornościową, natomiast Typ 2 wywoływał odpowiedź odpornościową u nieznacznie mniejszej liczby szczurów. Typ 3 wywoływał najsłabszą odpowiedź odpornościową. Proces suszenia z utworzeniem cieczy o wysokiej lepkości nie zmniejsza zdolności IPV do wywołania immunoprecypitujących przeciwciał in vivo. Odczyt względnej siły działania (RP) 1,0 wskazuje, że próbka wywołuje równoważną odpowiedź na próbkę wzorcową. Obie suszone próbki mają RP zbliżone do 1,0 dla wszystkich trzech typów wirusa polio, co wskazuje, że proces suszenia nie wpływa na zdolność próbki do wywołania odpowiedzi odpornościowej. P r z y k ł a d 14. Wpływ procesu suszenia na utworzenie cieczy o wysokiej lepkości przy użyciu sacharozy lub trehalozy jako środka stabilizującego, na zdolność IPV do wywołania immunoprecypitującej odpowiedzi odpornościowej in vivo Grupy 10 szczurów Wistar zaszczepiono IPV, który suszono w obecności 10% sacharozy lub 10% trehalozy, jak opisano w przykładzie 2, a następnie roztworzono. Kolejne grupy 10 szczurów Wistar zaszczepiono równoważną ilością IPV, który nie był suszony, jako próbkami wzorcowymi. Po 21 dniach od wszystkich szczurów pobrano surowice i do oceny immunoneutralizujących przeciwciał wytworzonych przeciw każdemu z Typu 1 Typu 2 i Typu 3 wirusa polio, zastosowano test immunoneutralizacji, jak opisano w przykładzie 5. Względną siłę działania obliczono dla każdej próbki przez porównanie odpowiedzi odpornościowej z odpowiedzią wywoływaną przez niesuszoną próbkę wzorcową. Wyniki podano w tabeli 11. T a b e l a 11. Porównanie suszenia w sacharozie i trehalozie Numer partii Obecny cukier Względna siła działania in vivo Typ 1 / Typ 2 / Typ 3 Wilgotność % Karl Fischer Czas trwania (godziny) Jle017 10% trehalozy 0,95 /0,82/ 1,05 n.o. 7 31C03/01 10% sacharozy 0,69/ 1,20/0,97 4,6% 18 31C03/02 10% trehalozy 0,60 / 0,94 / 0,9 11,5% 18 03D02/01 10% sacharozy 0,74/ 1,05 /0,96 5,9% 12 03D02/02 10% trehalozy 0,58 /0,98/ 1,06 10,6% 12 Ilość wody pozostającej w próbkach, mierzona metodą Karla Fischera była niższa przy użyciu sacharozy jako środka stabilizującego: pozostało około 5% wilgotności w porównaniu z około 10%, gdy jako środek stabilizujący zastosowano trehalozę. Zarówno sacharoza, jak i trehaloza były skuteczne pod względem stabilizacji IPV podczas procesu suszenia, tak że dla większości różnych typów wirusa polio siła działania roztworzonego IPV była bliska 1,0. Względna siła działania była szczególnie dobra dla wirusa polio Typu 3, który stosunkowo łatwo traci immunogenność. P r z y k ł a d 15. Pomiar wilgotności metodą Karla Fischera Analizę przeprowadzono w titrometrze Karla Fischera (Aqua 30,00 - Elektrochemie Halle). Próbkę ważono i umieszczano w piecu ustawiając temperaturę na 80 C. Próbkę przepłukano gazowym azotem, a następnie dodaano do odczynnika hydranal (Riedel de Hahn) w celu wykonania analizy kulometrycznej. Zastrzeżenia patentowe

26 26 PL B1 1. Kompozycja immunogenna zawierająca IPV, otoczkowy polisacharyd lub oligosacharyd z Haemophilus influenzae b (Hib) i środek stabilizujący, znamienna tym, że jest formułowana w całości jako suszona kompozycja, która po roztworzeniu może wywoływać odpowiedź odpornościową przeciw wirusowi polio, przy czym immunogenność typu 1 jest zachowana na poziomie co najmniej 40% immunogenności próbki odniesienia, która nie została poddana suszeniu. 2. Kompozycja immunogenna według zastrz. 1, znamienna tym, że polisacharyd lub oligosacharyd jest sprzężony z białkiem nośnikowym. 3. Kompozycja immunogenna według zastrz. 2, znamienna tym, że polisacharyd lub oligosacharyd jest sprzężony z anatoksyną tężcową. 4. Kompozycja immunogenna według zastrz. 2 albo 3, znamienna tym, że polisacharyd lub oligosacharyd jest zaadsorbowany na fosforanie glinu. 5. Kompozycja immunogenna według zastrz. 1-4, znamienna tym, że zawiera otoczkowy polisacharyd lub oligosacharyd pochodzący z N. meningitidis C. 6. Kompozycja immunogenna według zastrz. 1-5, znamienna tym, że dodatkowo zawiera otoczkowy polisacharyd lub oligosacharyd pochodzący z dowolnej spośród N. meningitidis A, C, Y i W lub ich połączenie. 7. Kompozycja immunogenna według zastrz. 5 albo 6, znamienna tym, że meningokokowe polisacharydy lub oligosacharydy są sprzężone z białkiem nośnikowym. 8. Kompozycja immunogenna według zastrz. 7, znamienna tym, że zawiera polisacharyd lub oligosacharyd Hib i co najmniej jeden meningokokowy polisacharyd lub oligosacharyd sprzężony z białkiem nośnikowym tego samego typu. 9. Kompozycja immunogenna według zastrz. 7, znamienna tym, że zawiera polisacharyd lub oligosacharyd Hib i co najmniej jeden meningokokowy polisacharyd lub oligosacharyd sprzężony z różnymi białkami nośnikowymi. 10. Kompozycja immunogenna według zastrz. 1-9, znamienna tym, że dodatkowo zawiera czerwień fenolową. 11. Kompozycja immunogenna według zastrz. 1-10, znamienna tym, że suszona kompozycja jest suszona sublimacyjnie. 12. Kompozycja immunogenna według zastrz. 1-11, znamienna tym, że suszoną kompozycję stanowi spieniony produkt szklisty. 13. Kompozycja immunogenna według zastrz. 1-10, znamienna tym, że suszoną kompozycję stanowi ciecz o wysokiej lepkości. 14. Kompozycja immunogenna według zastrz. 13, znamienna tym, że ciecz o wysokiej lepkości nie została zamrożona. 15. Sposób wytwarzania szczepionki, znamienny tym, że obejmuje etap roztwarzania kompozycji immunogennej zdefiniowanej w zastrz w wodnym roztworze. 16. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że roztwór wodny zawiera anatoksynę błoniczą, anatoksynę tężcową i antygeny krztuścowe (bezkomórkowe lub pełnokomórkowe). 17. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że szczepionka DTP jest co najmniej częściowo adiuwantowana wodorotlenkiem glinu. 18. Sposób według zastrz. 16 albo 17, znamienny tym, że wodny roztwór zawiera antygen powierzchniowy wirusa zapalenia wątroby typu B. 19. Zestaw, znamienny tym, że zawiera kompozycję immunogenną zdefiniowaną w zastrz w jednym pojemniku i ciekłą szczepionkę DTP (bezkomórkową lub pełnokomórkową) w drugim pojemniku. 20. Zestaw według zastrz. 19, znamienny tym, że dodatkowo zawiera antygen powierzchniowy wirusa zapalenia wątroby typu B w drugim pojemniku. 21. Szczepionka, znamienna tym, że zawiera kompozycje immunogenne zdefiniowane w zastrz Szczepionka według zastrz. 21, znamienna tym, że przed użyciem roztwarza się ją w roztworze wodnym. 23. Pojemnik, znamienny tym, że ma hydrofobową powierzchnię wewnętrzną i zawiera szczepionkę zdefiniowaną w zastrz. 21 albo Sposób konserwowania kompozycji zawierającej IPV, polisacharyd lub oligosacharyd Hib i środek stabilizujący, obejmujący etapy:

27 PL B1 27 a) wytwarzania konserwowanej próbki przez przeprowadzenie w stan zawiesiny lub rozpuszczenie IPV i bakteryjnego polisacharydu lub oligosacharydu w roztworze środka stabilizującego; b) poddawania konserwowanej próbki takim warunkom ciśnienia i temperatury, że z konserwowanej próbki uwalniany jest rozpuszczalnik; i c) usuwania rozpuszczalnika; znamienny tym, że rozpuszczalnik usuwa się do momentu, gdy konserwowana próbka wyschnie z utworzeniem substancji stałej lub cieczy o wysokiej lepkości, w której zachowana jest antygenowość IPV, przy czym immunogenność typu 1 jest zachowana na poziomie co najmniej 40% immunogenności próbki odniesienia, która nie została poddana suszeniu. 25. Sposób według zastrz. 24, znamienny tym, że konserwowaną próbkę suszy się w pojemniku mającym hydrofobową powierzchnię wewnętrzną. 26. Sposób według zastrz. 24 albo 25, znamienny tym, że w konserwowanej próbce powstają pęcherzyki z utworzeniem piany podczas etapu b). 27. Sposób według zastrz. 26, znamienny tym, że próbkę co najmniej częściowo zamraża się przed rozpoczęciem procesu suszenia. 28. Sposób według zastrz. 26, znamienny tym, że konserwowana próbka ulega co najmniej częściowemu zamrożeniu podczas etapu b). 29. Sposób według zastrz. 24, znamienny tym, że podczas etapu b) konserwowaną próbkę poddaje się takim warunkom temperatury i ciśnienia, że z konserwowanej próbki uwalniany jest rozpuszczalnik przez odparowanie, bez zamrażania ani powstawania pęcherzyków prowadzącego do tworzenia piany, z utworzeniem lepkiej cieczy, a podczas etapu c) rozpuszczalnik usuwa się do momentu, gdy konserwowana próbka wyschnie z utworzeniem cieczy o wysokiej lepkości. 30. Sposób według zastrz , znamienny tym, że konserwowana próbka zawiera polisacharyd lub oligosacharyd pochodzący z dowolnej spośród N. meningitidis A, C, Y i W lub ich połączenie. Rysunki

28 28 PL B1

29 PL B1 29

30 30 PL B1 Departament Wydawnictw UP RP Cena 4,92 zł (w tym 23% VAT)