(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2012/47 EP B1 (13) (51) T3 Int.Cl. A61K 39/095 ( ) A61K 39/102 ( ) A61K 39/09 ( ) (54) Tytuł wynalazku: Płynne szczepionki przeciw wielu grupom serologicznym meningokoków (30) Pierwszeństwo: GB GB (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2006/25 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 2013/04 (73) Uprawniony z patentu: Novartis AG, Basel, CH (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 MARIO CONTORNI, Siena, IT (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Aleksandra Twardowska KANCELARIA PATENTOWA KULIKOWSKA & KULIKOWSKI SP.J. SKR. POCZT Warszawa 12 Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 NZ:22851/PE/13 EP Opis Dziedzina techniki [0001] Wynalazek dotyczy immunizacji przeciw bakteryjnemu zapaleniu opon mózgowo-rdzeniowych, a w szczególności kombinowanej immunizacji przeciw bakteryjnemu zapaleniu opon mózgowo-rdzeniowych powodowanemu przez wiele patogenów. Dotychczasowy stan wiedzy [0002] N.meningitidis jest nieruchliwym, Gram-ujemnym ludzkim patogenem, który kolonizuje gardło i powoduje zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych (i, czasami, posocznicę bez zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych). Wywołuje ona zarówno endemiczną, jak i epidemiczną postać choroby. Po wprowadzeniu skoniugowanej szczepionki przeciw Haemophilus influenzae typ B (Hib), N.meningitidis jest głównym czynnikiem etiologicznym bakteryjnych zapaleń opon mózgowo-rdzeniowych w USA. Trzecim patogenem odpowiedzialnym za bakteryjne zapalenie opon mózgowordzeniowych jest Streptococcus pneumoniae, ale obecnie dostępna jest skuteczna szczepionka (PrevNar [1]). Podobnie jak szczepionka przeiw Hib, szczepionka pneumokokowa opiera się na koniugacie sacharydowych antygenów otoczkowych. [0003] Opierając się na polisacharydach otoczkowych organizmu, zidentyfikowano róŝne grupy serologiczne N.meningitidis, obejmujące A, B, C, H, I, K, L, 29E, W135, X, Y oraz Z. Grupa serologiczna A obejmuje patogeny najczęściej zaangaŝowane w epidemiczne choroby w Afryce subsaharyjskiej. Grupy serologiczne B i C są odpowiedzialne za ogromną większość

3 2 przypadków w Stanach Zjednoczonych i w większości rozwiniętych krajów. Grupy serologiczne W135 i Y są odpowiedzialne za pozostałe przypadki zachorowań w USA i krajach rozwiniętych. ChociaŜ polisacharyd otoczkowy jest skutecznym immunogenem ochronnym, kaŝda grupa serologiczna wymaga odrębnego antygenu sacharydowego, a takie podejście jest nieodpowiednie w przypadku immunizacji przeciw grupie serologicznej B. Zatem, ostatnim sukcesem skoniugowanych szczepionek sacharydowych przeciw grupie serologicznej C (Menjugate [2], Meningitec and NeisVac-C ) był brak wpływu na chorobę wywoływaną przez grupy serologiczne A, B, W135 lub Y; przeciwnie, stwarzały one ciśnienie selekcyjne w kierunku wyłonienia się tych grup serologicznych jako głównych czynników etiologicznych choroby meningokokowej. [0004] Iniekcyjna tetrawalentna szczepionka oparta na polisacharydach otoczkowych z grup serologicznych A, C, Y oraz W135 jest znana od wielu lat [3,4] i jest zarejestrowana do stosowania u ludzi. Polisacharydy w tej szczepionce są nieskoniugowane i występują w stosunku wagowym 1:1:1:1 [5], w ilości 50 µg kaŝdego oczyszczonego polisacharydu. ChociaŜ skuteczna u młodych ludzi i dorosłych, indukuje ona słabą odpowiedź immunologiczną i krótkotrwałą ochronę i nie moŝe być stosowana u niemowląt [np. pozycja literatury 6]. Ponadto, wadą szczepionek jest konieczność rekonstytucji z postaci liofilizowanych w momencie uŝycia. [0005] W opisie WO 02/ opisano kompozycję immunologiczną zawierającą dwa lub więcej koniugatów białkowopolisacharydowych z polisacharydów otoczkowych grup

4 3 serologicznych A, C, W135 i Y N.meningitidis. Opisane są równieŝ postacie szczepionki i sposoby podawania kompozycji, oraz omówione są problemy związane z immunogennością polisacharydów z grupy serologicznej B. [0006] W przypadku grupy serologicznej B, szczepionka okazała się być zawodna. Testowano szczepionki opierające się na błonie zewnętrznej [np. pozycja literatury 7], ale ochrona ograniczała się zazwyczaj do szczepu stosowanego do przygotowania szczepionki. [0007] A zatem, nadal istnieje potrzeba szczepionki, która chroni przed grupami serologicznymi meningokoków A, C, W135 oraz Y u dzieci, jak równieŝ takiej, która nie wymaga rekonstytucji przed podawaniem. Ponadto, istnieje potrzeba szczepionki, która zapewnia szeroką ochronę przeciw grupie serologicznej B. Ujawnienie wynalazku [0008] Wynalazek spełnia te wszystkie potrzeby, i opiera się na odkryciu, Ŝe skuteczność koniugatu grupy serologicznej W135 ulega wzmocnieniu w wyniku dodania antygenów pochodzących ze szczepu z grupy serologicznej B. [0009] Wynalazek dostarcza wodną kompozycję immunogenną, która po podaniu osobnikowi jest zdolna do indukowania odpowiedzi immunologicznej, która jest bakteriobójcza wobec grup serologicznych B, C, W135 oraz Y N.meningitidis, która zawiera: (i) skoniugowany otoczkowy antygen sacharydowy grupy serologicznej C; (ii) skoniugowany otoczkowy antygen sacharydowy grupy serologicznej W135; (iii) skoniugowany

5 4 otoczkowy antygen sacharydowy grupy serologicznej Y; oraz (iv) białko NadA w postaci oligomerycznej, białko 741, białko 936, białko 953 oraz białko 287. Wodna kompozycja moŝe równieŝ indukować odpowiedź immunologiczną, która jest bakteriobójcza wobec grupy serologicznej A N.meningitidis, i moŝe więc ponadto zawierać: (v) skoniugowany otoczkowy antygen sacharydowy grupy serologicznej A. [0010] Korzystnymi antygenami sacharydowymi są oligosacharydy. Grupy serologiczne C, W135 i Y [0011] Techniki przygotowywania polisacharydów otoczkowych z meningokoków są znane od wielu lat i zazwyczaj obejmują sposób obejmujący etapy precypitacji polisacharydów (np. przy uŝyciu detergentu kationowego), frakcjonowanie etanolem, ekstrakcję zimnym fenolem (w celu usunięcia białka) i ultrawirowanie (w celu usunięcia LPS) [np. patrz pozycja literatury 8]. [0012] Korzystniejszy sposób [9] obejmuje precypitację polisacharydów, a następnie solubilizację wytrąconych polisacharydów z wykorzystaniem niŝszego alkoholu. Precypitację moŝna uzyskać stosując detergent kationowy, taki jak sole tetrabutyloamoniowe i cetylotrimetyloamoniowe (np. sole bromkowe), lub bromek heksadimetryny i sole mirystylotrimetyloamoniowe. Szczególnie preferowany jest bromek cetylotrimetyloamoniowy ( CTAB ) [10]. Solubilizację wytrąconego materiału moŝna uzyskać stosując niŝszy alkohol, taki jak metanol, propan-1-ol, propan-2-ol, butan-1-ol, butan- 2-ol, 2-metylo-propan-l-ol, 2-metylo-propan-2-ol, diole, itp., ale etanol jest szczególnie odpowiedni do solubilizacji kompleksów CTAB-polisacharydowych. Etanol moŝna dodawać do

6 5 wytrąconego polisacharydu do uzyskania końcowego stęŝenia etanolu (w oparciu o całkowitą zawartość etanolu i wody) wynoszącego pomiędzy 50% a 95%. [0013] Po ponownej solubilizacji, polisacharyd moŝna poddać dalszemu przetwarzaniu w celu usunięcia zanieczyszczeń. Jest to szczególnie waŝne w sytuacji kiedy niedopuszczalne są nawet niewielkie zanieczyszczenia (np. przy wytwarzaniu szczepionek dla ludzi). Zazwyczaj obejmuje to jeden lub więcej etapów filtracji np. moŝna zastosować głęboką filtrację, filtrację przez węgiel aktywowany, filtrację przez sito molekularne i/lub ultrafiltrację. [0014] Po filtracji w celu usunięcia zanieczyszczeń, polisacharyd moŝna wytrącać w celu dalszego traktowania i/lub poddawania obróbce. MoŜna to dogodnie osiągnąć stosując kationy wymienne (np. przez dodawanie soli wapniowych lub sodowych). [0015] Po oczyszczeniu, sacharydy otoczkowe koniuguje się z nośnikami białkowymi, jak opisano poniŝej. [0016] Kolejne i alternatywne metody oczyszczania i koniugacji sacharydów meningokokowych ujawniono w pozycjach literaturowych 11 i 12. [0017] Jako alternatywę do oczyszczania, sacharydy otoczkowe według wynalazku moŝna otrzymywać przez całkowitą lub częściową syntezę, np. syntezę Hib ujawniono w pozycji literaturowej 13, a syntezę MenA w pozycji literaturowej 14. [0018] Jedna lub więcej z grup serologicznych C, W 135 i Y jest O-acetylowana. KaŜdą hiper-acetylację moŝna przeprowadzać w określonych pozycjach w sacharydzie. Na przykład, większość szczepów grupy serologicznej C posiada grupy O-acetylowe w

7 6 pozycji C-7 i/lub C-8 reszt kwasu sialowego, ale około 15% izolatów klinicznych jest pozbawionych tych grup O-acetylowych [15,16]. Okazało się, Ŝe acetylacja nie wpływa na skuteczność ochrony (np. w przeciwieństwie do produktu Menjugate, w produkcie NeisVac-C wykorzystuje się de-o-acetylowany sacharyd, ale obydwie szczepionki są skuteczne). Sacharyd grupy serologicznej W135 jest polimerem jednostek disacharydowych kwas sialowy - galaktoza. Sacharyd grupy serologicznej Y jest podobny do sacharydu grupy serologicznej W135, z tym wyjątkiem, Ŝe powtarzająca się jednostka disacharydowa obejmuje glukozę zamiast galaktozy. Podobnie jak sacharydy grupy serologicznej C, sacharydy MenW135 i MenY charakteryzują się zmienną O- acetylacją, ale w pozycjach 7 oraz 9 kwasu sialowego [17]. Wszelkie takie chemiczne modyfikacje korzystnie mają miejsce przed koniugacją, ale alternatywnie, bądź dodatkowo mogą być równieŝ przeprowadzane podczas koniugacji. [0019] Sacharydy z róŝnych grup serologicznych korzystnie oczyszcza się oddzielnie, i moŝna je następnie łączyć albo przed, albo po koniugacji. Grupa serologiczna A [0020] Kompozycja według wynalazku moŝe obejmować skoniugowany sacharydowy antygen otoczkowy grupy serologicznej A. Sacharyd moŝna oczyszczać i koniugować w taki sam sposób jak opisano dla grup serologicznych C, W135 i Y (patrz powyŝej), chociaŝ jest strukturalnie odmienny podczas gdy otoczki grup serologicznych C, W 135 i Y bazują na kwasie sialowym (kwas N- acetyloneuramininowy, NeuAc), otoczka grupy serologicznej A

8 7 opiera się na N-acetylo-mannozoaminie, która jest naturalnym prekursorem kwasu sialowego. Sacharyd grupy serologicznej A jest szczególnie podatny na hydrolizę, i jego niestabilność w środowiskach wodnych oznacza, Ŝe (a) immunogenność płynnych szczepionek przeciw grupie serologicznej A zmniejsza się w czasie, oraz (b) kontrola jakości jest trudniejsza ze względu na uwalnianie produktów hydrolizy sacharydu do szczepionki. [0021] Natywny sacharyd otoczkowy MenA jest homopolimerem (α1 6)-związanego N-acetylo-D-mannozoamino-1-fosforanu, z częściową O-acetylacją w pozycji C3 i C4. Głównym wiązaniem glikozydowym jest wiązanie 1-6 fosfodiestrowe obejmujące grupę hemiacetalową C1 i grupę alkoholową C6 D-mannozoaminy. Średnia długość łańcucha wynosi 93 monomery. Posiada on następujący wzór:

9 8 [0022] Twórcy wynalazku przygotowali zmodyfikowany antygen sacharydowy, który zachowuje aktywność immunogenną natywnego sacharydu grupy serologicznej A, ale który jest duŝo bardziej stabilny w wodzie. Grupy hydroksylowe przyłączone do atomów węgla 3 i 4 jednostek monosacharydowych zastąpiono grupą blokującą [pozycja literatury 18]. [0023] Liczba jednostek monosacharydowych posiadających grupy blokujące w miejscu grup hydroksylowych moŝe być róŝna. Na przykład, wszystkie lub zasadniczo wszystkie jednostki monosacharydowe mogą posiadać grupy blokujące. Alternatywnie, co najmniej 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% lub 90% jednostek monosacharydowych moŝe posiadać grupy blokujące. Co

10 9 najmniej 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 lub 30 jednostek monosacharydowych moŝe posiadać grupy blokujące. [0024] Podobnie, liczba grup blokujących na jednostkach monosacharydowych moŝe być róŝna. Na przykład, liczba grup blokujących na kaŝdej określonej jednostce monosacharydowej moŝe wynosić 1 lub 2. [0025] Końcowa jednostka monosacharydowa moŝe posiadać lub nie grupę blokującą, zamiast natywnej grupy hydroksylowej. Korzystne jest zachowanie wolnej anomerycznej grupy hydroksylowej na końcowej jednostce monosacharydowej w celu zapewnienia punktu zaczepienia dla dalszych reakcji (np. koniugacji). Anomeryczne grupy hydroksylowe moŝna przekształcać w grupy aminowe (-NH 2 lub -NH-E, gdzie E jest azotową grupą blokującą) przez redukcyjną aminację (z wykorzystaniem, na przykład, NaBH 3 CN/NH 4 Cl), i moŝna je następnie regenerować po przekształceniu innych grup hydroksylowych w grupy blokujące. [0026] Grupy blokujące do zastępowania grup hydroksylowych mogą być bezpośrednio dostępne w wyniku reakcji przeprowadzania w pochodne grupy hydroksylowej tj. przez zastąpienie atomu wodoru grupy hydroksylowej inną grupą. Odpowiednimi pochodnymi grup hydroksylowych, które działają jako grupy blokujące są, na przykład, karbaminiany, sulfoniany, węglany, estry, etery (np. etery sililowe lub etery alkilowe) oraz acetale. Niektórymi konkretnymi przykładami takich grup blokujących są grupy alilowa, Aloc, benzylowa, BOM, t-butylowa, tritylowa, TBS, TBDPS, TES, TMS, TIPS, PMB, MEM, MOM, MTM, THP, itp. Inne grupy blokujące, które nie są dostępne bezpośrednio i, które

11 10 całkowicie zastępują grupę hydroksylową obejmują grupy C 1-12 alkilową, C 3-12 alkilową, C 5-12 arylową, C 5-12 arylową-c 1-6 alkilową, NR 1 R 2 (R 1 i R 2 są takie jak zdefiniowano w poniŝszym akapicie), H, F, Cl, Br, CO 2 H, CO 2 (C 1-6 alkilową), CN, CF 3, CCl 3, itp. [0027] Korzystnymi grupami blokującymi są grupy o wzorach: -O-X-Y lub -OR 3 gdzie: X jest C(O), S(O) lub SO 2 ; Y jest grupą C 1-12 alkilową, C 1-12 alkolsylową, C 3-12 cykloalkilową, C 5-12 arylową lub C 5-12 arylowo-c 1-6 alkilową, z których kaŝda moŝe być ewentualnie podstawiona 1, 2 lub 3 grupami, niezaleŝnie wybranymi spośród atomu F, Cl, Br, grupy CO 2 H, CO 2 (C 1-6 alkilowej), CN, CF 3 lub CCl 3 ; lub Y jest grupą NR 1 R 2 ; R 1 i R 2 niezaleŝnie wybiera się spośród atomu H, grupy C 1-12 alkilowej, C 3-12 cykloalkilowej, C 5-12 arylowej, C 5-12 arylo-c 1-6 alkilowej; bądź R 1 i R 2 moŝna łączyć tworząc C 3-12 nasyconą grupę heterocykliczną; R 3 jest grupą C 1-12 alkilową lub C 3-12 cykloalkilową, z których kaŝda moŝe być ewentualnie podstawiona 1, 2 lub 3 grupami, niezaleŝnie wybranymi spośród atomu F, Cl, Br, grupy CO 2 H, CO 2 (C 1-6 alkilowej), CN, CF 3 lub CCl 3 ; lub R 3 jest grupą C 5-12 arylową lub C 5-12 arylo-c 1-6 alkilową, z których kaŝda moŝe być ewentualnie podstawiona 1, 2, 3, 4 lub 5 grupami, wybranymi spośród atomu F, Cl, Br, grupy CO 2 H, CO 2 (C 1-6 alkilowej), CN, CF 3 lub CCl 3. Kiedy R 3 jest grupą C 1-12 alkilową lub C 3-12 cykloalkilową, zazwyczaj jest ona postawiona 1, 2 lub 3 grupami, jak zdefiniowano powyŝej. Kiedy R 1 i R 2 są połączone tworząc C 3-12 nasyconą grupę heterocykliczną, oznacza to, Ŝe R 1 i R 2 razem z atomem azotu tworzą nasyconą grupę heterocykliczną zawierającą dowolną liczbę atomów węgla od 3 do 12 (np. C 3, C 4,

12 11 C 5, C 6, C 7, C 8, C 9, C 10, C 11, C 12 ). Grupa heterocykliczna moŝe zawierać 1 lub 2 heteroatomy (takie jak N, O lub S) inne niŝ atom azotu. Przykładami nasyconych grup heterocyklicznych C 3-12 są grupy pirolidynylowa, piperydynylowa, morfolinylowa, piperazynylowa, imidazolidynylowa, azetydynylowa oraz azyrydynylowa. [0028] Grupy blokujące -O-X-Y i -OR 3 moŝna uzyskać z grup -OH stosując standardowe procedury przekształcania w pochodne, takie jak reakcja grupy hydroksylowej z halogenkiem acylowym, halogenkiem alkilowym, halogenkiem sulfonylowym, itp. Stąd, atom tlenu w -O-X-Y jest korzystnie atomem tlenu w grupie hydroksylowej, podczas gdy grupa -X-Y w -O-X-Y korzystnie zastępuje atom wodoru grupy hydroksylowej. [0029] Alternatywnie, grupy blokujące moŝna uzyskiwać przez reakcję podstawienia, taką jak podstawienie typu Mitsonobu. Te i inne sposoby otrzymywania grup blokujących z grup hydroksylowych są dobrze znane. [0030] Korzystniej, grupą blokującą jest -OC(O)CF 3 [19], lub grupa karbaminianowa -OC(O)NR 1 R 2, gdzie R 1 oraz R 2 niezaleŝnie wybiera się spośród grup C 1-6 alkilowych. Korzystniej, obydwa R 1 i R 2 są grupami metylowymi, tj. grupą blokującą jest -OC(O)NMe 2. Blokujące grupy karbaminianowe wpływają stabilizująco na wiązanie glikozydowe i moŝna je otrzymywać w łagodnych warunkach. [0031] Korzystne zmodyfikowane sacharydy MenA zawierają n jednostek monosacharydowych, przy czym co najmniej h% jednostek monosacharydowych nie zawiera grup -OH w pozycjach 3 i 4. Wartość h wynosi 24 lub więcej (np. 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35,

13 12 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99 lub 100), a korzystnie wynosi 50 lub więcej. Nieobecne grupy -OH są korzystnie grupami blokującymi, jak zdefiniowano powyŝej. [0032] Inne korzystne zmodyfikowane sacharydy MenA zawierają jednostki monosacharydowe, w których co najmniej s jednostek monosacharydowych nie zawiera -OH w pozycji 3 i nie zawiera -OH w pozycji 4. Wartość s wynosi co najmniej 1 (np. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90). Nieobecne grupy -OH są korzystnie grupami blokującymi, jak zdefiniowano powyŝej. [0033] Odpowiednie zmodyfikowane sacharydy MenA do stosowania według wynalazku posiadają wzór: w którym

14 13 n jest liczbą całkowitą od 1 do 100 (korzystnie liczbą całkowitą od 5 do 25, korzystniej 15-25); T posiada wzór (A) lub (B): kaŝdą grupę Z niezaleŝnie wybiera się spośród grupy OH lub grupy blokującej, jak zdefiniowano powyŝej; i kaŝdą grupę Q niezaleŝnie wybiera się spośród grupy OH lub grupy blokującej, jak zdefiniowano powyŝej; Y wybiera się spośród grupy OH lub grupy blokującej, jak zdefiniowano powyŝej; E oznacza atom H lub azotową grupą ochronną; i gdzie więcej niŝ około 7% (np. 8%, 9%, 10% lub więcej) grup Q jest grupami blokującymi. [0034] KaŜda z n+2 grup Z moŝe być taka sama lub róŝna od innych. Podobnie, kaŝda z n+2 grup Q moŝe być taka sama lub róŝna od innych. Wszystkie grupy Z mogą być grupami OH. Alternatywnie, co najmniej 10%, 20, 30%, 40%, 50% lub 60% grup Z moŝe być grupami OAc. Korzystnie, około 70% grup Z jest grupami OAc, a pozostałe grupy Z są grupami OH lub grupami blokującymi, jak zdefiniowano powyŝej. Co najmniej około 7% grup Q jest grupami blokującymi. Korzystnie co najmniej 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% lub nawet 100% grup Q jest grupami blokującymi.

15 14 [0035] Korzystne grupy blokujące są grupami elektronoakceptorowymi. Bez wiązania się z teorią, uwaŝa się, Ŝe wiązania glikozydowe są podatne na hydrolizę z powodu wewnątrzcząsteczkowego ataku nukleofilowego grup hydroksylowych sacharydu na wiązanie glikozydowe (tj. przez tworzenie cyklicznego półproduktu). Im większa nukleofilowość grupy hydroksylowej tym większa tendencja do wewnątrzcząsteczkowego ataku nukleofilowego. Elektronoakceptorowa grupa blokująca działa delokalizująco na niezwiązaną parę elektronów w atomie tlenu, zmniejszając w ten sposób nukleofilowość i zmniejszając tendencję do wewnątrzcząsteczkowego ataku nukleofilowego. [0036] Dlatego teŝ, dla ochrony przeciw grupie serologicznej A, wodna kompozycja moŝe zawierać zmodyfikowany sacharyd MenA, jak zdefiniowano powyŝej. [0037] Korzystne kompozycje według wynalazku moŝna przechowywać przez 28 dni w temperaturze 37 C i, po tym okresie, mniej niŝ f% początkowej całkowitej ilości skoniugowanego sacharydu MenA będzie w postaci nieskoniugowanej, przy czym f wynosi 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5 lub mniej. Koniugacja kowalencyjna [0038] Sacharydy otoczkowe w kompozycjach według wynalazku zazwyczaj koniuguje się z białkiem(kami) nośnikowym(i). Ogólnie rzecz biorąc, koniugacja wzmacnia immunogenność sacharydów, poniewaŝ powoduje ich przekształcenie z antygenów T- niezaleŝnych (grasiczoniezaleŝnych) w antygeny T-zaleŜne (grasiczozalezne), umoŝliwiając w ten sposób uczulanie pamięci immunologicznej. Koniugacja jest szczególnie uŝyteczna w

16 15 przypadku szczepionek pediatrycznych i jest ona dobrze znaną techniką [np. przegląd w pozycjach literaturowych 20 do 29]. [0039] Korzystnymi białkami nośnikowymi są toksyny lub anatoksyny bakteryjne, takie jak anatoksyna błonicza lub anatoksyna tęŝcowa, lub zmutowana toksyna błonicza CRM 197 [30-32]. Inne odpowiednie białka nośnikowe obejmują białka błony zewnętrznej N.meningitidis [33], syntetyczne peptydy [34,35], białka szoku cieplnego [36,37], białka krztuścowe [38,39], cytokiny [40], limfokiny [40], hormony [40], czynniki wzrostowe [40], sztuczne białka zawierające wiele epitopów komórek T CD4 + pochodzących z antygenów róŝnych patogenów [41], takie jak białko N19 [42], białko D z H.influenzae [43,44], pneumolizyna [45], pneumokokowe białko powierzchniowe PspA [46], białka wychwytujące Ŝelazo [47], toksyna A lub B z C.difficile [48], zmutowane bakteryjne toksyny (np. toksyna cholery CT lub ciepłolabilna toksyna E.coli LT ), takie jak CT z podstawieniem w pozycji Glu-29 [49], itp. Korzystnymi nośnikami są anatoksyna błonicza, anatoksyna tęŝcowa, białko D H.influenzae, a zwłaszcza CRM 197. [0040] W kompozycji według wynalazku moŝliwe jest zastosowanie więcej niŝ jednego białka nośnikowego np. w celu zmniejszenia ryzyka supresji nośnika. A zatem róŝne białka nośnikowe moŝna stosować dla róŝnych grup serologicznych np. sacharydy grupy serologicznej A moŝna koniugować z CRM 197, podczas gdy sacharydy grupy serologicznej C moŝna koniugować z anatoksyną tęŝcową. MoŜliwe jest równieŝ stosowanie więcej niŝ jednego białka nośnikowego dla określonego antygenu sacharydowego np. sacharydy grupy serologicznej A mogą występować w dwóch

17 16 grupach, jedne skoniugowane z CRM 197, a pozostałe skoniugowane z anatoksyną tęŝcową. Ogólnie, jednakŝe, preferuje się stosowanie tego samego białka nośnikowego dla wszystkich grup serologicznych, przy czym preferowanym wyborem jest CRM 197. [0041] Jedno białko nośnikowe moŝe nieść więcej niŝ jeden antygen sacharydowy [50]. Na przykład, jedno białko nośnikowe moŝe być skoniugowane z sacharydami pochodzącymi z grup serologicznych A i C. Dla osiągnięcia tego celu, sacharydy moŝna mieszać przed reakcją koniugacji. Ogólnie, jednakŝe, preferuje się przygotowywanie odrębnych koniugatów dla kaŝdej z grup serologicznych. [0042] Korzystne są koniugaty charakteryzujące się stosunkiem sacharyd:białko (wag./wag.) wynoszącym pomiędzy 1:5 (tj. nadmiarem białka) a 5:1 (tj. nadmiarem sacharydu). Korzystne są stosunki wynoszące pomiędzy 1:2 a 5:1, chociaŝ korzystniejsze są stosunki wynoszące pomiędzy 1:1,25 a 1:2,5. Nadmiar białka nośnikowego moŝe być korzystny w przypadku MenA i MenC. [0043] Koniugaty moŝna stosować w połączeniu z wolnym białkiem nośnikowym [51]. Jeśli dane białko nośnikowe jest obecne w obydwu formach, wolnej i skoniugowanej, w kompozycji według wynalazku, to formy nieskoniugowanej jest korzystnie nie więcej niŝ 5% całkowitej ilości białka nośnikowego w kompozycji jako całości, a korzystniej mniej niŝ 2% wagowe. [0044] MoŜna wykorzystywać kaŝdą odpowiednią reakcję koniugacji, z dowolnym łącznikiem jeśli jest to konieczne. [0045] Sacharyd zazwyczaj aktywuje się lub funkcjonalizuje przed koniugacją. Aktywacja moŝe obejmować, na przykład, stosowanie odczynników cyjanujących takich jak CDAP (np.

18 17 tetrafluoroboran 1-cyjano-4-dimetyloaminopirydyniowy [52, 53, itd.]). Inne odpowiednie techniki wykorzystują karbodiimidy, hydrazydy, aktywne estry, norboran, kwas p-nitrobenzoesowy, N- hydroksysukcynoimid, S-NHS, EDC, TSTU; patrz równieŝ wprowadzenie do pozycji literaturowej 27). [0046] Wiązanie przez grupy łącznikowe moŝna przeprowadzać wykorzystując dowolne znane procedury, na przykład, procedury opisane w pozycjach literaturowych 54 i 55. Jeden typ wiązania obejmuje redukcyjną aminację polisacharydu, sprzęgania otrzymanej grupy aminowej z jednym końcem łącznikowej grupy kwasu adypinowego, a następnie sprzęganie białka z drugim końcem łącznikowej grupy kwasu adypinowego [25,56,57]. Inne łączniki obejmują grupę B-propionoamidową [58], nitrofenyloetyloaminową [59], halogenki chlorowcoacylowe [60], wiązania glikozydowe [61], kwas 6-aminokapronowy [62], ADH [63], reszty C 4 do C 12 [64] itd. Jako alternatywę do stosowania łącznika, moŝna zastosować wiązanie bezpośrednie. Bezpośrednie wiązanie z białkiem moŝe obejmować utlenianie polisacharydu, po którym prowadzi się redukcyjną aminację z białkiem, jak opisano w, na przykład, pozycjach literaturowych 65 i 66. [0047] Proces obejmuje wprowadzenie grup aminowych do sacharydu (np. przez zastąpienie końcowych grup =O, grupami -NH 2 ), a następnie korzystne jest przeprowadzanie w pochodne z wykorzystaniem diestru adypinowego (np. diestru N- hydroksysukcynoimidowego kwasu adypinowego) i reakcja z białkiem nośnikowym. Inna korzystna reakcja wykorzystuje aktywację CDAP białkiem nośnikowym D np. w przypadku MenA lub MenC.

19 18 [0048] Po koniugacji wolne i skoniugowane sacharydy moŝna rozdzielić. Istnieje wiele odpowiednich metod, obejmujących chromatografię hydrofobową, ultrafiltrację styczną, diafiltrację itd. [patrz równieŝ pozycje literaturowe 67 i 68, itd.]. [0049] Jeśli kompozycja według wynalazku obejmuje skoniugowany oligosacharyd, to korzystne jest, aby przygotowanie oligosacharydu poprzedziła koniugacja. [0050] Po koniugacji, metody według wynalazku mogą obejmować etap pomiaru poziomu nieskoniugowanego białka nośnikowego. Jeden ze sposobów takiego pomiaru obejmuje elektroforezę kapilarną [69] (np. w wolnym roztworze), lub micelarną chromatografię elektrokinetyczną [70]. [0051] Po koniugacji, metody według wynalazku mogą obejmować etap pomiaru poziomu nieskoniugowanego sacharydu. Jeden ze sposobów takiego pomiaru obejmuje HPAEC-PAD [67]. [0052] Po koniugacji, metody według wynalazku mogą obejmować etap oddzielania skoniugowanego sacharydu od nieskoniugowanego sacharydu. Jednym ze sposobów rozdzielania takich sacharydów jest zastosowanie metody, w której selektywnie precypituje się jeden ze składników. Selektywna precypitacja skoniugowanego sacharydu jest korzystna, aby pozostawić nieskoniugowany sacharyd w roztworze, np. przez działanie deoksycholanem [67]. [0053] Po koniugacji, metody według wynalazku mogą obejmować etap pomiaru wielkości cząsteczki i/lub masy molowej koniugatu. W szczególności, moŝe być mierzony rozkład. Jeden ze sposobów takich pomiarów obejmuje chromatografię z zastosowaniem sita molekularnego z wykrywaniem za pomocą fotometrii wielokątowego

20 19 rozpraszania światła i refraktometrii róŝnicowej (SEC-MALS/RI) [71]. Oligosacharydy [0054] Sacharydy otoczkowe najczęściej będą stosowane w postaci oligosacharydów. Otrzymuje się je dogodnie przez fragmentację oczyszczonych polisacharydów otoczkowych (np. przez hydrolizę), po której zazwyczaj następuje oczyszczanie fragmentów o poŝądanej wielkości. [0055] Fragmentację polisacharydów przeprowadza się korzystnie do uzyskania końcowego średniego stopnia polimeryzacji (DP) w oligosacharydzie wynoszącego mniej niŝ 30 (np. pomiędzy 10 a 20, korzystnie około 10 dla grupy serologicznej A; pomiędzy 15 a 25 dla grupy serologicznej W135 oraz Y, korzystnie około 15-20; pomiędzy 12 a 22 dla grupy serologicznej C; itd.). DP moŝna dogodnie mierzyć chromatografią jonowymienną lub oznaczeniami kolorymetrycznymi [72]. [0056] Jeśli przeprowadza się hydrolizę, hydrolizat na ogół segreguje się według wielkości w celu usunięcia krótkich oligosacharydów [73]. Osiąga się to róŝnymi sposobami, takimi jak ultrafiltracja, a następnie chromatografia jonowymienna. W przypadku grupy serologicznej A korzystnie usuwa się oligosacharydy o stopniu polimeryzacji mniejszym lub równym około 6, a w przypadku grup serologicznych W135 oraz Y korzystnie usuwa się te mniejsze niŝ około 4. [0057] Chemiczna hydroliza sacharydów obejmuje na ogół traktowanie albo kwasem albo zasadą w warunkach uznawanych w tej dziedzinie za standardowe. Warunki depolimeryzacji

21 20 sacharydów otoczkowych do ich składowych monosacharydów są dobrze znane w stanie techniki. Jedna z metod depolimeryzacji obejmuje stosowanie nadtlenku wodoru [11]. Nadtlenek wodoru dodaje się do sacharydu (np. do uzyskania końcowego stęŝenia H 2 O 2 wynoszącego 1%), i mieszaninę inkubuje się następnie (np. w temperaturze około 55 C) do uzyskania poŝądanej redukcji długości łańcucha. W trakcie redukcji, z mieszaniny moŝna pobierać próbki i mierzyć (średnią) wielkość cząsteczki sacharydu w próbce. Depolimeryzację moŝna następnie zatrzymać przez gwałtowne schłodzenie, po uzyskaniu poŝądanej długości łańcucha. Grupa serologiczna B [0058] Szczepionki przeciw patogenom takim jak wirus zapalenia wątroby typu B, błonicy i tęŝcowi zawierają zazwyczaj pojedynczy antygen białkowy (np. antygen powierzchniowy HBV lub anatoksynę tęŝcową). W przeciwieństwie, bezkomórkowe szczepionki przeciw kokluszowi zawierają co najmniej trzy białka B.pertussis, a szczepionka przeciw pneumokokom PrevNar zawiera siedem oddzielnie skoniugowanych antygenów sacharydowych. Inne szczepionki, takie jak komórkowe szczepionki przeciw krztuścowi, szczepionka przeciw odrze, inaktywowana szczepionka przeciw chorobie Heinego-Medina (IPV) i szczepionki OMV przeciw meningokokom zawierają dzięki swojej złoŝonej naturze mieszaniny duŝej liczby antygenów. Dlatego teŝ, to czy ochronę moŝna wywołać za pomocą pojedynczego antygenu, niewielkiej liczby zdefiniowanych antygenów, lub

22 21 złoŝonej mieszaniny niezdefiniowanych antygenów zaleŝy od określonego patogenu. [0059] Jak wspomniano powyŝej, szczepionka przeciw grupie serologicznej B meningokoków okazała się być zawodna. Szczepionki oparte na OMV wykazują wąską skuteczność. Ponadto, duŝa liczba niezdefiniowanych antygenów obecnych w OMV, w połączeniu z ich zmienną naturą, oznacza, Ŝe OMV stwarzają róŝne problemy podczas kontroli jakości. [0060] Autorzy wynalazku stwierdzili, Ŝe moŝna osiągnąć szeroką ochronę przeciw grupie serologicznej B i, Ŝe moŝna to uzyskać stosując niewielką liczbę zdefiniowanych antygenów polipeptydowych dla grupy serologicznej B, i stąd kompozycje według wynalazku obejmują białko Nad A w oligomerycznej formie, białko 741, białko 936, białko 953 oraz białko 287. [0061] Opisane są sekwencje genomowe dla meningokokowych grup serologicznych A [74]i B [75,76]. [0062] Kompozycja obejmuje następujące pięć antygenów [96]: (1) białko NadA, korzystnie w formie oligomerycznej (np. w formie trimerycznej); (2) białko 741 ; (3) białko 936 ; (4) białko 953 oraz (5) białko 287. [0063] NadA (adhezynę A z Neisseria) z MenB ujawniono jako białko 961 w pozycji literaturowej 80 (SEQ ID 2943 i 2944) i jako NMB1994 w pozycji literaturowej 75 (patrz równieŝ GenBank pod numerami dostępu: i ). Szczegółowe badania dotyczące białka moŝna znaleźć w pozycji literaturowej 97. Jeśli stosuje się według wynalazku, NadA moŝe mieć róŝne formy. Korzystnymi formami NadA są warianty skrócone lub

23 22 delecyjne, takie jak te ujawnione w pozycjach literaturowych 83 do 85. W szczególności, preferowana jest NadA bez jej części C- końcowej zakotwiczającej w błonie (np. delecja reszt dla szczepu 2996, daje SEQ ID NO:1 w niniejszym opisie), którą czasami wyróŝnia się w tym opisie przez zastosowanie C w indeksie górnym np. NadA (C). Ekspresja w E.coli NadA bez jej domeny zakotwiczającej prowadzi do sekrecji białka do supernatantu hodowlanego z jednoczesnym usunięciem 23- merycznego peptydu liderowego tego białka (np. pozostawiąjąc 327-mer w przypadku szczepu 2996 [SEQ ID NO:2 w niniejszym opisie]). Polipeptydy bez ich peptydów liderowych wyróŝnia się czasami w niniejszym opisie przez NL w indeksie górnym np. NadA (NL) lub NadA (C)(NL). Korzystne polipeptydy NadA posiadają sekwencję aminokwasową, która: (a) wykazuje 50% lub więcej identyczności (np. 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% lub więcej) z SEQ ID NO:2; i/lub (b) zawiera fragment co najmniej n kolejnych aminokwasów SEQ ID NO: 1, gdzie n wynosi 7 lub więcej (np. 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 lub więcej). Korzystne fragmenty w przypadku (b) są pozbawione jednego lub więcej aminokwasów (np. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 lub więcej) z końca C i/lub końca N w SEQ ID NO: 1 (np. NadA (C), NadA (NL), NadA (C)(NL) ). Inne korzystne fragmenty zawierają epitop z SEQ ID NO: 1, a szczególnie korzystny fragment SEQ ID NO: 1 stanowi sekwencja SEQ ID NO 2. Te róŝne sekwencje obejmują warianty NadA (np. warianty alleliczne, homologi, ortologi, paralogi, mutanty, itd). RóŜne sekwencje NadA przedstawiono na Figurze 9 pozycji literaturowej 98.

24 23 [0064] Białko 741 z MenB ujawniono w pozycji literaturowej 80 (SEQ IDs 2535 i 2536) i jako NMB1870 w pozycji literaturowej 75 (patrz równieŝ GenBank numer dostępu GI: ). Odpowiadające mu białko w grupie serologicznej A [74] posiada w GenBank numer dostępu jest naturalnie lipoproteiną. Jeśli stosuje się według wynalazku, białko 741 moŝe mieć róŝne formy. Preferowanymi formami 741 są warianty skrócone lub delecyjne, takie jak te ujawnione w pozycjach literaturowych 83 do 85. W szczególności, moŝe być wydeletowany N-koniec 741 aŝ do i włącznie z jego sekwencją poliglicynową (tj. delecja reszt 1 do 72 w przypadku szczepu MC58 [SEQ ID NO: 3 w niniejszym opisie]), co czasami wyróŝnia się w tym opisie stosując prefiks G. Ta delecja moŝe wzmacniać ekspresję. Delecja usuwa równieŝ miejsce wprowadzania reszt tłuszczowych w 741. Sekwencje 741 posiadają sekwencję aminokwasową, która: (a) wykazuje 50% lub większą identyczność z SEQ ID NO: 3; i (b) i/lub zawiera fragment o przynajmniej 1 kolejnej reszcie aminokwasowej z SEQ ID No. 3, i zawiera epitop z 741. Inne preferowane fragmenty są pozbawione jednego lub więcej aminokwasów (np. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 lub więcej) z C-końca i/lub N-końca SEQ ID NO: 3. Sekwencje te obejmują warianty 741 (np. warianty alleliczne, homologi, ortologi, paralogi, mutanty, itd.). RóŜne sekwencje 741 moŝna znaleźć w SEQ IDs 1 do 22 w pozycji literaturowej 85, w SEQ ID od 1 do 23 w pozycji literaturowej 99, oraz w SEQ ID od w pozycji literaturowej 100. [0065] Białko 936 z grupy serologicznej B ujawniono w pozycji literaturowej 80 (SEQ IDs 2883 i 2884) oraz jako NMB2091 w

25 24 pozycji literaturowej 75 (patrz równieŝ w GenBank pod numerem dostępu GI: ). Odpowiadający gen w grupie serologicznej A [74] posiada w GenBank numer dostępu Jeśli stosuje się według wynalazku, białko 936 moŝe mieć róŝne formy. Preferowanymi formami 936 są warianty skrócone lub delecyjne, takie jak te ujawnione w pozycjach literaturowych 83 do 85. W szczególności, wydeletowany moŝe być N-końcowy peptyd liderowy 936 (np. delecja reszt 1 do 23 w przypadku szczepu MC58, dająca 936 (NL) [SEQ ID NO: 4 w niniejszym opisie]). Sekwencje 936 posiadają sekwencję aminokwasową, która: (a) wykazuje 50% lub większą identyczność z SEQ ID NO: 4; i/lub (b) zawiera fragment co najmniej l kolejnych aminokwasów z SEQ ID NO: 4, i zawiera epitop z 936. Inne korzystne fragmenty pozbawione są jednego lub więcej aminokwasów (np. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 lub więcej) z C-końca i/lub N-końca SEQ ID NO: 4. Sekwencje te obejmują warianty 936 (np. warianty alleliczne, homologi, ortologi, paralogi, mutanty, itd.). [0066] Białko 953 z grupy serologicznej B ujawniono w pozycji literaturowej 80 (SEQ IDs: 2917 i 2918) i jako NMB1030 w pozycji literaturowej 75 (patrz równieŝ GenBank pod numerem dostępu GI: ). Odpowiadające mu białko w grupie serologicznej A [74] posiada w GenBank numer dostępu Jeśli stosuje się według wynalazku, białko 953 moŝe mieć róŝne formy. Preferowanymi formami 953 są warianty skrócone lub delecyjne, takie jak te ujawnione w pozycjach literaturowych 83 do 85. W szczególności, wydeletowany moŝe być N-końcowy peptyd liderowy 953 (np. delecja reszt 1 do 19 w przypadku szczepu MC58, dająca 953 (NL) [SEQ ID NO: 5 w niniejszym opisie])

26 25 Korzystne sekwencje 953 posiadają sekwencję aminokwasową, która: (a) wykazuje 50% lub większą identyczność (np. 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% lub większą) z SEQ ID NO: 5; i/lub (b) zawiera fragment co najmniej n kolejnych aminokwasów z SEQ ID NO: 5, w którym n wynosi 7 lub więcej (np. 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 lub więcej). Korzystne fragmenty w przypadku (b) zawierają epitop z 953. Inne korzystne fragmenty pozbawione są jednego lub więcej aminokwasów (np. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 lub więcej) z C-końca i/lub N-końca SEQ ID NO: 5. Te sekwencje obejmują warianty 936 (np. warianty alleliczne, homologi, ortologi, paralogi, mutanty, itd.). Alleliczne formy 953 przedstawiono na Figurze 19 pozycji literaturowej 82. [0067] Białko 287 z grupy serologicznej B ujawniono w pozycji literaturowej 80 (SEQ IDs: 3103 i 3104), jako NMB2132 w pozycji literaturowej 75, i jako GNA2132 w pozycji literaturowej 77 (patrz równieŝ GenBank pod numerem dostępu GI: ). Odpowiadające mu białko w grupie serologicznej A [74] posiada w GenBank numer dostępu Jeśli stosuje się według wynalazku, białko 287 moŝe mieć róŝne formy. Preferowanymi formami 287 są warianty skrócone lub delecyjne, takie jak te ujawnione w pozycjach literaturowych 83 do 85. W szczególności, moŝe być wydeletowany N-koniec 287 aŝ do i włącznie z jego sekwencją poliglicynową (tj. delecja reszt 1 do 24 w przypadku szczepu MC58, dająca G287 [SEQ ID NO: 6 w niniejszym opisie]). Ta delecja moŝe wzmacniać ekspresję. Korzystne sekwencje 287 posiadają sekwencję aminokwasową, która: (a) wykazuje 50% lub większą identyczność (np. 60%, 70%,

27 26 80%, 90%, 95%, 99% lub większą) z SEQ ID NO:6; i/lub (b) zawiera fragment co najmniej n kolejnych aminokwasów z SEQ ID NO: 6, w którym n wynosi 7 lub więcej (np. 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 lub więcej). Korzystne fragmenty w przypadku (b) zawierają epitop z 287. Inne korzystne fragmenty pozbawione są jednego lub więcej aminokwasów (np. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 lub więcej) z C-końca i/lub N-końca SEQ ID NO: 6. Te sekwencje obejmują warianty 287 (np. warianty alleliczne, homologi, ortologi, paralogi, mutanty, itd.). Alleliczne formy 287 przedstawiono na Figurach 5 i 15 w pozycji literaturowej 82, oraz w przykładzie 13 i na figurze 21 pozycji literaturowej 80 (SEQ IDs 3179 do 3184). [0068] Korzystne antygeny MenB zawierają sekwencję znalezioną w jednym z następujących szczepów 2996, MC58, 95N477 oraz 394/98. Białko 287 pochodzi korzystnie ze szczepu 2996 lub, korzystniej, ze szczepu 394/98. Białko 741 pochodzi korzystnie z grupy serologicznej B szczepów MC58, 2996, 394/98 lub 95N477, bądź z grupy serologicznej C szczepu 90/ Szczep MC58 jest korzystniejszy. Białka 936, 953 oraz NadA pochodzą korzystnie ze szczepu Kompozycja moŝe zawierać określony antygen (np. 741 lub 287) w więcej niŝ jednym wariancie formy, np. to samo białko, ale pochodzące z więcej niŝ jednego szczepu. Białka te mogą występować jako tandemy lub odrębne białka. [0069] W niektórych rozwiązaniach, jednakŝe, kompozycja według wynalazku obejmuje takie samo białko, ale pochodzące z więcej niŝ jednego szczepu. Takie podejście okazało się skuteczne dla białka 741. Białko to jest bardzo skutecznym antygenem do

28 27 wywoływania odpowiedzi humoralnej skierowanej przeciw meningokokom, i jego ekspresja zachodzi we wszystkich grupach serologicznych meningokoków. Analiza filogenetyczna wykazuje, Ŝe białko dzieli się na dwie grupy, i Ŝe jedna z nich dzieli się znów, dając w całości trzy warianty [101], i chociaŝ surowica wytworzona przeciw danemu wariantowi jest bakteriobójcza w obrębie tej samej grupy wariantowej, to nie jest aktywna wobec szczepów, w których zachodzi ekspresja jednego z pozostałych dwóch wariantów tj. istnieje wewnątrzwariantowa ochrona krzyŝowa, ale nie międzywariantowa ochrona krzyŝowa [99,101]. Dlatego teŝ, dla maksymalnej skuteczności krzyŝowej wobec szczepu, korzystne jest aby kompozycja mogła zawierać więcej niŝ jeden wariant białka 741. Przykładowe sekwencje pochodzące z kaŝdego wariantu podano w SEQ ID NOs: 10, 11 i 12 w niniejszym opisie, rozpoczynając od N-końcowej reszty cysteiny, do której będzie kowalencyjnie przyłączony lipid w natywnej lipoproteinowej formie. Dlatego teŝ, korzystnie, kompozycja powinna zawierać co najmniej dwa spośród: (1) pierwszego białka, zawierającego sekwencję aminokwasową wykazującą co najmniej a% identyczność z SEQ ID NO: 10 i/lub zawierającego sekwencję aminokwasową składającą się z fragmentu co najmniej x sąsiadujących aminokwasów z SEQ ID NO: 10; (2) drugiego białka, zawierającego sekwencję aminokwasową wykazującą co najmniej b% identyczność z SEQ ID NO: 11 i/lub zawierającego sekwencję aminokwasową składającą się z fragmentu co najmniej y ciągłych aminokwasów z SEQ ID NO: 11; oraz (3) trzeciego białka, zawierającego sekwencję aminokwasową wykazującą co najmniej c% identyczność z SEQ ID

29 28 NO: 12 i/lub zawierającego sekwencję aminokwasową składającą się z fragmentu co najmniej z ciągłych aminokwasów z SEQ ID NO: 12. Wartość a wynosi co najmniej 85 np. 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,5 lub więcej. Wartość b wynosi co najmniej 85 np. 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,5 lub więcej. Wartość c wynosi co najmniej 85 np. 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,5 lub więcej. Wartości a, b i c nie są nierozłącznie związane ze sobą wzajemnie. Wartość x wynosi co najmniej 7 np. 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 250). Wartość y wynosi co najmniej 7 np. 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 250). Wartość z wynosi co najmniej 7 np. 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 250). Wartości x, y i z nie są nierozłącznie związane ze sobą wzajemnie. Korzystne jest, aby kaŝda dana sekwencja aminokwasowa 741 nie naleŝała do więcej niŝ jednej z kategorii (1), (2) i (3). KaŜda dane sekwencja 741 będzie zatem naleŝeć tylko do jednej kategorii (1), (2) i (3). A zatem, korzystne jest aby: białko (1) wykazywało mniej niŝ i% identyczności sekwencji z białkiem (2); białko(1) wykazywało mniej niŝ j% identyczności sekwencji z białkiem (3); oraz białko (2) wykazywało mniej niŝ k% identyczności sekwencji z białkiem (3). Wartość i wynosi 60 lub więcej (np. 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67,

30 29 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, itd.), przy czym najwięcej wynosi a. Wartość j wynosi 60 lub więcej (np. 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, itd.), przy czym najwięcej wynosi b. Wartość k wynosi 60 lub więcej (np. 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, itd.), przy czym najwięcej wynosi c. Wartości i, j oraz k nie są nierozłącznie związane ze sobą wzajemnie. [0070] Kompozycje według wynalazku obejmują małą liczbę oczyszczonych antygenów grupy serologicznej B (np. mniejszą niŝ t antygenów, gdzie t wynosi 10, 9, 8, 7, lub 6). Jest szczególnie korzystne, aby kompozycja nie zawierała złoŝonych lub niezdefiniowanych mieszanin antygenów, np. korzystne jest aby kompozycja nie zawierała pęcherzyków błony zewnętrznej. Korzystnie przeprowadza się rekombinacyjną ekspresję antygenów w gospodarzu heterologicznym, a następnie oczyszcza się je. W przypadku kompozycji obejmującej t antygenów MenB, moŝe być t odrębnych polipeptydów, ale dla zmniejszenia złoŝoności, korzystne jest aby co najmniej dwa z antygenów ulegały ekspresji jako pojedynczy łańcuch polipeptydowy (białko hybrydowe [pozycje literaturowe 83 do 85]) tj. tak, aby 5 antygenów tworzyło mniej niŝ 5 polipeptydów. Białka hybrydowe oferują dwie główne korzyści: po pierwsze, białko, które moŝe być niestabilne lub samo w sobie słabo ulegać ekspresji, moŝna wspomóc dodając odpowiedniego partnera hybrydowego, który rozwiąŝe te problemy; po drugie, wytwarzanie komercyjne jest

31 30 ułatwione, poniewaŝ konieczna jest tylko jednokrotna ekspresja i oczyszczanie dla wytworzenia dwóch oddzielnie uŝytecznych białek. Białko hybrydowe zawarte w kompozycji według wynalazku moŝe zawierać dwa lub więcej (tj. 2, 3, 4 lub 5) z pięciu antygenów wymienionych powyŝej. Preferowane są hybrydy zawierające dwa z pięciu antygenów. [0071] W obrębie kombinacji pięciu podstawowych antygenów (NadA, 741, 953, 936 i 287), antygen moŝe być obecny w więcej niŝ jednym białku hybrydowym i/lub moŝe występować jako niehybrydowe białko. Korzystne jest jednakŝe, aby antygen występował albo jako hybryda albo w postaci niehybrydowej, ale nie w obydwu postaciach, chociaŝ uŝyteczne moŝe być włączenie białka 741 zarówno jako antygenu hybrydowego, jak i niehybrydowy (korzystnie lipoproteiny), szczególnie jeśli stosuje się więcej niŝ jeden wariant 741. [0072] Białka hybrydowe mogą posiadać wzór NH 2 -A-[-X-L-] n -B- COOH, w którym: X jest sekwencją aminokwasową jednego z pięciu podstawowych aminokwasów; L jest ewentualną łącznikową sekwencją aminokwasową; A jest ewentualną N-końcową sekwencją aminokwasową; B jest ewentualną C-końcową sekwencją aminokwasową; a n wynosi 2,3,4 lub 5. [0073] Najkorzystniej, n wynosi 2. Hybrydy dwu-antygenowe do stosowania według wynalazku zawierają: NadA i 741; NadA i 936; NadA i 953; NadA i 287; 741 i 936; 741 i 953; 741 i 287; 936 i 953; 936 i 287; 953 i 287. Dwoma korzystnym białkami są: X 1 jest 936 oraz X 2 jest 741; X 1 jest 287 oraz X 2 jest 953. [0074] Jeśli reszta -X- posiada sekwencję peptydu liderowego w swojej formie typu dzikiego, to moŝe ona być obecna lub

32 31 pominięta w białku hybrydowym. W niektórych rozwiązaniach, peptydy liderowe będą usuwane wyłącznie dlatego, Ŝe reszta -XpołoŜona jest w końcu N białka hybrydowego, tj. peptyd liderowy X 1 będzie zachowany, ale peptydy liderowe X 2...X n będą pominięte. Jest to równowaŝne do wydeletowania wszystkich peptydów liderowych i stosowania peptydu liderowego X 1 jako reszty -A-. [0075] Dla kaŝdych n przykładów [-X-L-], sekwencja aminokwasowa łącznika -L- moŝe być obecna lub nie. Na przykład, jeśli n = 2, hybrydą moŝe być NH 2 -X 1 -L 1 -X 2 -L 2 -COOH, NH 2 -X 1 -X 2 -COOH, NH 2 -X 1 -L 1 - X 2 -COOH, NH 2 -X 1 -X 2 -L 2 -COOH, itd. Łącznikowa(e) sekwencja(e) aminokwasowa(e) -L- będzie zazwyczaj krótka (np. 20 lub mniej aminokwasów, tj. 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Przykłady obejmują sekwencje krótkich peptydów, które ułatwiają klonowanie, łączniki poliglicynowe (tj. zawierające Gly n, gdzie n = 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 lub więcej), i znaczniki histydynowe (tj. His n gdzie n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 lub więcej). Inne odpowiednie łącznikowe sekwencje aminokwasowe będą oczywiste dla specjalistów w tej dziedzinie. UŜytecznym łącznikiem jest GSGGGG (SEQ ID: 9), z dipeptydem Gly-Ser utworzonym z miejsca restrykcyjnego BamHI, w ten sposób ułatwiającym klonowanie i manipulacje, oraz tetrapeptyd (Gly) 4 będący typowym łącznikiem poliglicynowym. Jeśli X n+1 jest białkiem G i L n jest łącznikiem glicynowym, to moŝe to odpowiadać X n+1 nie będącemu białkiem G i L n który jest nieobecny. [0076] -A- jest ewentualną N-końcową sekwencją aminokwasową. Będzie ona zazwyczaj krótka (np. 40 lub mniej aminokwasów, tj.

33 32 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Przykłady obejmują sekwencje liderowe do bezpośredniego kierowania białkiem lub sekwencje krótkich peptydów, które ułatwiają klonowanie lub oczyszczanie (np. znaczniki histydynowe tj. His n gdzie n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 lub więcej). Inne odpowiednie N-końcowe sekwencje aminokwasowe będą oczywiste dla specjalistów w tej dziedzinie. Jeśli X 1 pozbawiona jest swojej własnej N-końcowej metioniny, - A- jest korzystnie oligopeptydem (np. z 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 lub 8 aminokwasami), który dostarcza N-końcową metioninę. [0077] -B- jest ewentualną C-końcową sekwencją aminokwasową. Będzie ona zazwyczaj krótka (np. 40 lub mniej aminokwasów, tj. 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Przykłady obejmują sekwencje liderowe do bezpośredniego kierowania białkiem lub sekwencje krótkich peptydów, które ułatwiają klonowanie lub oczyszczanie (np. znaczniki histydynowe tj. His n gdzie n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 lub więcej) lub sekwencje, które wzmacniają stabilność białka. Inne odpowiednie C-końcowe sekwencje aminokwasowe będą oczywiste dla specjalistów w tej dziedzinie. [0078] Dwa szczególnie korzystne białka hybrydowe według wynalazku są następujące: n A X 1 L 1 X 2 L 2 B nr identyfikacyjny sekwencji 2 MA G287 GSGGGG 953 (NL) M 936 (NL) GSGGGG G

34 33 [0079] Te dwa białka moŝna stosować w kombinacji z NadA (szczególnie z SEQ ID NO: 2). A zatem, korzystna kompozycja antygenów MenB do stosowania według wynalazku moŝe obejmować pierwszy polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 2, drugi polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 7 i trzeci polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 8. Jest to preferowana grupa antygenów MenB do stosowania według wynalazku. [0080] Jak wspomniano powyŝej, kompozycje według wynalazku mogą indukować bakteriobójczą humoralną odpowiedź surowicy, która jest skuteczna przeciw dwóm lub trzem hiperwirulentnym liniom MenB: A4, ET-5 i linii 3. Mogą one dodatkowo indukować odpowiedź bakteriobójczą przeciw jednej lub więcej hiperwirulentnych linii podgrupy I, podgrupy III, podgrupy IV-1 lub kompleksu ET-37, oraz przeciw innym liniom np. liniom hiperinwazyjnym. Te odpowiedzi przeciwciał mierzy się dogodnie w myszach i stanowi to standardowy wskaźnik skuteczności szczepionki [np. patrz przypis końcowy 14 pozycji literaturowej 77]. Aktywność bakteriobójcza surowicy (SBA) mierzy zabijanie bakterii za pośrednictwem dopełniacza, i moŝna ją oznaczać stosując dopełniacz ludzki lub niemowląt króliczych. Standardy WHO wymagają, aby szczepionka indukowała co najmniej 4-krotny wzrost SBA u więcej niŝ 90% biorców. [0081] Kompozycje nie muszą indukować bakteriobójczych przeciwciał przeciw kaŝdemu i wszystkim szczepom MenB w obrębie tych hiperwirulentnych linii; raczej, dla kaŝdej danej grupy czterech lub więcej szczepów grupy serologicznej B meningokoków w obrębie konkretnej hiperwirulentnej linii, przeciwciała

35 34 indukowane przez kompozycję są bakteriobójcze w stosunku do co najmniej 50% (np. 60%, 70%, 80%, 90% lub więcej) grupy. Korzystne grupy szczepów będą obejmować szczepy wyizolowane w co najmniej czterech z poniŝszych państw: GB, AU, CA, NO, IT, US, NZ, NL, BR oraz CU. Surowica posiada miano bakteriobójcze wynoszące korzystnie co najmniej 1024 (np. 2 10, 2 11, 2 12, 2 13, 2 14, 2 15, 2 16, 2 17, 2 18 lub wyŝsze, korzystnie co najmniej 2 14 ), tj. surowica jest zdolna do zabicia co najmniej 50% testowanych bakterii konkretnego szczepu, jeśli rozcieńczy się ją 1/1024, jak opisano w pozycji literaturowej 77. [0082] Korzystne kompozycje mogą indukować odpowiedzi bakteriobójcze przeciw poniŝszym szczepom meningokoków z grupy serologicznej B: (i) z grupy A4, szczep (B:2b:P1.21,16) i/lub szczep G2136 (B:-); (ii) z kompleksu ET- 5, szczep MC58 (B:15:PI.7,16b) i/lub szczep 44/76 (B:15:P1.7,16); (iii) z linii 3, szczep 394/98 (B:4:P1.4) i/lub szczep BZ198 (B:NT:-). Korzystniejsze kompozycje mogą indukować odpowiedzi bakteriobójcze wobec szczepów , 44/76 oraz 394/98. Obydwa szczepy, i G2136, są szczepami referencyjnymi Neisseria MLST [numer identyfikacyjny 638 i 1002 w pozycji literaturowej 102]. Szczep MC58 jest szeroko dostępny (np. ATCC BAA-335) i zsekwencjonowano go w pozycji literaturowej 75. Szczep 44/76 jest szeroko stosowany oraz scharakteryzowany (np. pozycja literaturowa 103) i jest jednym ze szczepów referencyjnych Neisseria MLST [numer identyfikacyjny 237 w pozycji literaturowej 102; wiersz 32 w Tabeli 2 w pozycji literaturowej 104]. Szczep 394/98 wyizolowano oryginalnie w Nowej Zelandii w 1998 roku, i

36 35 istnieje kilka publikowanych badań z wykorzystaniem tego szczepu (np. pozycje literaturowe 105 i 106). Szczep BZ198 jest kolejnym szczepem referencyjnym MLST [numer identyfikacyjny 409 w pozycji literaturowej 102; wiersz 41 w Tabeli 2 w pozycji literaturowej 104]. Kompozycja moŝe dodatkowo indukować odpowiedź bakteriobójczą przeciw szczepowi LNP17592 z grupy serologicznej W135 (W135:2a:P1.5,2), z kompleksu ET-37. jest to szczep Haji wyizolowany we Francji w 2000 roku. [0083] Inne antygeny polipeptydowe MenB, które mogą znajdować się w kompozycjach według wynalazku obejmują te zawierające jedną z poniŝszych sekwencji aminokwasowych: SEQ ID NO: 650 z pozycji literaturowej 78; SEQ ID NO: 878 z pozycji literaturowej 78; SEQ ID NO: 884 z pozycji literaturowej 78; SEQ ID NO: 878 z pozycji literaturowej 78; SEQ ID NO: 884 z pozycji literaturowej 78; SEQ ID NO: 4 z pozycji literaturowej 79; SEQ ID NO: 598 z pozycji literaturowej 80; SEQ ID NO: 818 z pozycji literaturowej 80; SEQ ID NO: 864 z pozycji literaturowej 80; SEQ ID NO: 866 z pozycji literaturowej 80; SEQ ID NO: 1196 z pozycji literaturowej 80; SEQ ID NO: 1272 z pozycji literaturowej 80; SEQ ID NO: 1274 z pozycji literaturowej 80; SEQ ID NO: 1640 z pozycji literaturowej 80; SEQ ID NO: 1788 z pozycji literaturowej 80; SEQ ID NO: 2288 z pozycji literaturowej 80; SEQ ID NO: 2466 z pozycji literaturowej 80; SEQ ID NO: 2554 z pozycji literaturowej 80; SEQ ID NO: 2576 z pozycji literaturowej 80; SEQ ID NO: 2606 z pozycji literaturowej 80; SEQ ID NO: 2608 z pozycji literaturowej 80; SEQ ID NO: 2616 z pozycji literaturowej 80; SEQ ID NO: 2668 z pozycji literaturowej 80; SEQ ID NO: 2780 z

37 36 pozycji literaturowej 80; SEQ ID NO: 2932 z pozycji literaturowej 80; SEQ ID NO: 2958 z pozycji literaturowej 80; SEQ ID NO: 2970 z pozycji literaturowej 80; SEQ ID NO: 2988 z pozycji literaturowej 80, lub polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową, która: (a) wykazuje 50% lub większą identyczność (np. 60%, 70%. 80%, 90%, 95%, 99% lub większą) z wymienionymi sekwencjami; i/lub (b) zawiera fragment co najmniej n kolejnych aminokwasów z wymienionych sekwencji, gdzie n wynosi 7 lub więcej (np. 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 lub więcej). Korzystne fragmenty w przypadku (b) zawierają epitop ze zbliŝonych sekwencji. Dołączony moŝe być więcej niŝ jeden (np. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 lub więcej) takich polipeptydów. Kolejne składniki antygenowe [0084] Antygeny nie-meningokokowe i nie-neisseria, korzystnie takie, które nie zmniejszają odpowiedzi immunologicznej przeciw składnikom meningokokowym, mogą być równieŝ włączone do kompozycji według wynalazku. Pozycja literaturowa 107, na przykład, ujawnia kombinacje oligosacharydów z grup serologicznych B i C N.meningitidis razem z sacharydami Hib. Szczególnie korzystne antygeny nie-meningokokowe obejmują: - antygen błoniczy, taki jak anatoksyna błonicza [np. rozdział 3 pozycji literaturowej 108]. - antygen tęŝcowy, taki jak anatoksyna tęŝcowa [np. rozdział 4 pozycji literaturowej 108]. - holotoksyna krztuścowa (PT) i hemaglutynina filamentowa (FHA) z B.pertussis, ewentualnie równieŝ w kombinacji z pertaktyną

38 37 i/lub aglutynogenami 2 i 3 [np. pozycje literaturowe 109 i 110]. - komórkowy antygen krztuścowy - antygen z wirusa zapalenia wątroby typu A, taki jak inaktywowany wirus [np. 111, 112]. - antygen z wirusa zapalenia wątroby typu B, taki jak antygeny powierzchniowe i/lub rdzeniowe [np. 112,113], przy czym antygen powierzchniowy jest korzystnie zadsorbowany na fosforanie glinowym [114]. - antygen(y) wirusa polio [np. 115, 116] taki jak IPV. [0085] Mieszanina moŝe zawierać jeden lub więcej takich dodatkowych antygenów, które w razie potrzeby moŝna poddawać detoksykacji (np. detoksykacja toksyny krztuścowej sposobami chemicznymi i/lub genetycznymi). [0086] Jeśli mieszanina zawiera antygen błoniczy, to korzystne jest aby zawierała równieŝ antygen tęŝcowy i antygeny krztuścowe. Podobnie, jeśli mieszanina zawiera antygen tęŝcowy, to korzystne jest aby zawierała równieŝ antygeny błonicze i krztuścowe. Podobnie, jeśli mieszanina zawiera antygen krztuścowy, to korzystne jest aby zawierała równieŝ antygeny błonicze i tęŝcowe. [0087] Antygeny w mieszaninie będą zazwyczaj obecne w ilości co najmniej 1 µg/ml kaŝdy. Ogólnie rzecz biorąc, stęŝenie kaŝdego danego antygenu będzie wystarczające do wywołania odpowiedzi immunologicznej przeciw temu antygenowi. Korzystne jest, aby skuteczność ochronna pojedynczych antygenów sacharydowych nie zanikała w wyniku ich łączenia, chociaŝ rzeczywista immunogenność (np. miana w ELISA) moŝe być zmniejszona.

39 38 [0088] Jako alternatywę do stosowania antygenów białkowych w mieszaninie, moŝna stosować kwas nukleinowy kodujący antygen. Składniki białkowe mieszaniny moŝna zatem zastąpić kwasem nukleinowym (korzystnie DNA np. w postaci plazmidu), który koduje białko. Podobnie, kompozycje według wynalazku mogą zawierać białka, które naśladują antygeny sacharydowe np. mimotopy [117] lub przeciwciała antyidiotypowe. Mogą one zastępować indywidualne składniki sacharydowe lub mogą je uzupełniać. Jako przykład, szczepionka moŝe zawierać peptyd naśladujący polisacharyd otoczkowy MenC [118] lub MenA [119] w miejscu samego sacharydu. [0089] Dwoma preferowanymi antygenami nie-meningokokowymi do włączenia do kompozycji według wynalazku są te, które chronią przed H.influenzae typu B (Hib) oraz przed Streptococcus pneumoniae. Haemophilus influenzae typ B (Hib) [0090] Jeśli kompozycja zawiera antygen H.influenzae typu B, to będzie to zazwyczaj sacharydowy antygenem otoczkowy Hib. Antygeny sacharydowe z H.influenzae b są bardzo dobrze znane. [0091] Korzystnie, sacharyd Hib jest kowalencyjnie skoniugowany z białkiem nośnikowym, w celu wzmocnienia jego immunogenności, zwłaszcza u dzieci. Przygotowywanie koniugatów polisacharydowych ogólnie, a polisacharydów otoczkowych Hib w szczególności, jest dobrze udokumentowane [np. pozycje literaturowe 21-29, itd.]. Wynalazek moŝe wykorzystywać dowolne odpowiednie koniugaty Hib. Odpowiednie białka nośnikowe opisano powyŝej, a preferowanymi nośnikami dla sacharydów Hib są CRM 197

40 39 ( HbOC ), anatoksyna tęŝcowa ( PRP-T ) i kompleks błony zewnętrznej N.meningitidis ( PRP-OMP ). [0092] Reszty sacharydowe koniugatu mogą być polisacharydami (np. pełnej długości fosforanem polirybozylorybitolowym (PRP)), ale korzystne jest, aby hydrolizować polisacharydy do formy oligosacharydów (np. MW od -1 do -5 kda). [0093] Korzystny koniugat zawiera oligosacharyd Hib kowalencyjnie związany z CRM 197 przez łącznik, kwas adypinowy [120, 121]. Korzystnym nośnikiem jest równieŝ anatoksyna tęŝcowa. [0094] Korzystnie, podawanie antygenu Hib daje w wyniku stęŝenie przeciwciał skierowanych przeciw PRP 0,15 µg/ml, a korzystniej 1 µg/ml. [0095] Jeśli w kompozycji znajduje się antygen sacharydowy Hib, korzystne jest, aby nie wprowadzać jako adiuwanta wodorotlenku glinu. Jeśli kompozycja zawiera jako adiuwant fosforan glinu, to antygen Hib moŝe być zadsorbowany do adiuwanta [122] lub moŝe być niezadsorbowany [123]. Ochronę adsorpcji moŝna uzyskać wybierając właściwe ph podczas mieszania antygenu/adiuwanta, adiuwant z odpowiednim punktem ładunku zerowego, i odpowiednią kolejność mieszania dla róŝnych antygenów w kompozycji [124]. [0096] Kompozycje według wynalazku mogą zawierać więcej niŝ jeden antygen Hib. Antygeny Hib mogą być liofilizowane np. do rekonstytucji za pomocą meningokokowych kompozycji według wynalazku. Streptococcus pneumoniae [0097] Jeśli kompozycja zawiera antygen S.pneumoniae, to będzie to zazwyczaj sacharydowy antygen otoczkowy, który jest

41 40 korzystnie skoniugowany z białkiem nośnikowym [np. pozycje literaturowe 125 do 127]. Korzystne jest, aby włączone były sacharydy z więcej niŝ jednego serotypu S.pneumoniae. Na przykład, szeroko stosowana jest mieszanina polisacharydów z 23 róŝnych serotypów, jak szczepionki skoniugowane z polisacharydami z pomiędzy 5 a 11 róŝnych serotypów [128]. Na przykład, PrevNar [1] zawiera antygeny z siedmiu serotypów (4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, oraz 23F), przy czym kaŝdy sacharyd jest indywidualnie koniugowany z CRM 197 przez redukcyjną aminację, w ilości 2 µg kaŝdego sacharydu na 0,5 ml dawkę (4 µg serotypu 6B), i koniugaty są zadsorbowane na fosforanie glinu jako adiuwancie. Kompozycje według wynalazku zawierają korzystnie co najmniej serotypy 6B, 14, 19F i 23F. Koniugaty moŝna adsorbować na fosforanie glinu. [0098] Jako alternatywa do stosowania antygenów sacharydowych z pneumokoków, kompozycja moŝe zawierać jeden lub więcej antygenów polipeptydowych. Dostępne są sekwencje genomowe dla kilku szczepów pneumokoków [129,130] i moŝna poddać je wakcynologii odwrotnej [ ] w celu zidentyfikowania odpowiednich antygenów polipeptydowych [135,136]. Na przykład, kompozycja moŝe obejmować jeden lub więcej z następujących antygenów: PhtA, PhtD, PhtB, PhtE, SpsA, LytB, LytC, LytA, Sp125, Sp101, Sp128, Sp130 i Sp130, jak zdefiniowano w pozycji literaturowej 137. Kompozycja moŝe zawierać więcej niŝ jeden (np. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 10, 11, 12, 13 lub 14) takich antygenów. [0099] W niektórych rozwiązaniach, kompozycja moŝe zawierać zarówno antygeny sacharydowe, jak i polipeptydowe z

42 41 pneumokoków. MoŜna je stosować w prostej domieszce, lub sacharydowy antygen pneumokokowy moŝna skoniugować z białkiem pneumokokowym. Odpowiednie nośniki białkowe do takich rozwiązań obejmują antygeny wymienione w poprzednim akapicie [137]. [0100] Antygeny pneumokokowe mogą być liofilizowane np. razem z antygenem Hib. Kompozycje farmaceutyczne [0101] Kompozycje według wynalazku będą zazwyczaj, w dodatku do składników wymienionych powyŝej, zawierać jeden lub więcej farmaceutycznie dopuszczalnych nośników, które obejmują dowolny nośnik, który sam z siebie nie indukuje wytwarzania przeciwciał szkodliwych dla osoby przyjmującej kompozycję. Odpowiednie nośniki są zazwyczaj duŝymi, wolno metabolizowalnymi makrocząsteczkami, takimi jak białka, polisacharydy, kwasy polimlekowe, kwasy poliglikolowe, polimeryczne aminokwasy, kopolimery aminokwasowe, sacharoza [138], trehaloza [139], laktoza, i agregatami lipidowymi (takie jak krople oleju lub liposomy). Takie nośniki są dobrze znane specjalistom w tej dziedzinie. Szczepionki, mogą równieŝ zawierać rozcieńczalniki, takie jak woda, sól fizjologiczna, glicerol, itp. Dodatkowo mogą być obecne substancje pomocnicze, takie jak czynniki zwilŝające lub emulgujące, substancje buforujące ph i tym podobne. Typowym nośnikiem jest jałowa, wolna od pirogenów, buforowana fosforanami sól fizjologiczna. Dokładne omówienie farmaceutycznie dopuszczalnych zaróbek jest dostępne w pozycji literaturowej 140. [0102] Kompozycje według wynalazku mają postać wodną tj. roztworów lub zawiesin. Płynna postać tego typu umoŝliwia

43 42 podawanie kompozycji bezpośrednio z ich opakowania, bez konieczności rekonstytucji w płynnym podłoŝu i dzięki temu są idealne do iniekcji. Kompozycje mogą być umieszczane w fiolkach, lub moŝna nimi napełniać gotowe do uŝycia strzykawki. Strzykawki mogą być dostarczane z igłami lub bez igieł. Strzykawka będzie zawierać pojedynczą dawkę, podczas gdy fiolki mogą zawierać pojedynczą dawkę lub wiele dawek. [0103] Płynne kompozycje według wynalazku są równieŝ odpowiednie do rekonstutuowania z formy liofilizowanej innych szczepionek np. rekonstytuowania liofilizowanych antygenów Hib lub DTP. Jeśli kompozycję według wynalazku stosuje się do takiej doraźnej rekonstytucji, wynalazek zapewnia zestaw, który moŝe zawierać dwie fiolki, lub moŝe zawierać gotową do uŝycia napełnioną strzykawkę i jedną fiolkę, przy czym zawartość strzykawki wykorzystuje się do reaktywacji zawartości fiolki przed iniekcją. [0104] Kompozycje według wynalazku moŝe być pakowana w postacie jednostkowego dawkowania i postacie wielokrotnego dawkowania. W przypadku postaci wielokrotnego dawkowania, korzystniejsze są fiolki niŝ wcześniej napełnione strzykawki. Efektywne objętości dawkowania moŝna ustalić w rutynowy sposób, ale zazwyczaj dla ludzi, dawki kompozycji do iniekcji mają objętość 0,5 ml. [0105] ph kompozycji wynosi korzystnie między 6 a 8, korzystnie około 7. Stabilne ph moŝna utrzymywać stosując bufor. Jeśli kompozycja zawiera sól wodorotlenku glinu, to korzystne jest stosowanie buforu histydynowego [141]. Kompozycja moŝe być jałowa i/lub wolna od pirogenów. Kompozycje według wynalazku mogą być izotoniczne w odniesieniu do ludzi.

44 43 [0106] Kompozycje według wynalazku są immunogenne, i korzystniej są kompozycjami szczepionek. Szczepionki według wynalazku mogą być albo profilaktyczne (tj. do zapobiegania infekcji) albo terapeutyczne (tj. do leczenia infekcji), ale zazwyczaj będą profilaktyczne. Kompozycje immunogenne stosowane jako szczepionki zawierają immunologicznie skuteczną ilość antygenu(nów), jak równieŝ inne składniki, o ile jest taka potrzeba. Przez immunologicznie skuteczną ilość, rozumie się, Ŝe podanie takiej ilości osobnikowi, albo jako pojedynczą dawkę, albo jako część serii, jest skuteczne w leczeniu lub zapobieganiu. Ilość ta róŝni się w zaleŝności od zdrowia i kondycji fizycznej leczonego osobnika, wieku, grupy taksonomicznej leczonego osobnika (np. naczelne inne niŝ człowiek, naczelne, itd.), moŝliwości układu immunologicznego osobnika do syntezy przeciwciał, stopnia poŝądanej ochrony, postaci szczepionki, oceny sytuacji medycznej przez lekarza prowadzącego i innych związanych czynników. Oczekuje się, Ŝe ilość będzie pozostawać w stosunkowo szerokim zakresie, który moŝna określić przeprowadzając rutynowe próby. [0107] W obrębie kaŝdej dawki, ilość pojedynczego antygenu sacharydowego będzie na ogół wynosić pomiędzy 1-50 µg (mierzona jako masa sacharydu) np. około 1 µg, około 2,5 µg, około 4 µg, około 5 µg, lub około 10 µg. [0108] KaŜdy sacharyd moŝe być obecny w zasadniczo takiej samej ilości na dawkę. JednakŜe, stosunek (w/w) sacharydu MenY:sacharydu MenW135 będzie większy niŝ 1 (np. 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 10:1 lub wyŝszy) i/lub stosunek (w/w) sacharydu

45 44 MenY:sacharydu MenC moŝe być mniejszy niŝ 1 (np. 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, lub niŝszy). [0109] Korzystne stosunki (w/w) dla sacharydów z grup serologicznych A:C:W135:Y wynoszą: 1:1:1:1; 1:1:1:2; 2:1:1:1; 4:2:1:1; 8:4:2:1; 4:2:1:2; 8:4:1:2; 4:2:2:1; 2:2:1:1; 4:4:2:1; 2:2:1:2; 4:4:1:2; oraz 2:2:2:1. Korzystne stosunki (w/w) dla sacharydów z grup serologicznych C:W135:Y wynoszą: 1:1:1; 1:1:2; 1:1:1; 2:1:1; 4:2:1; 2:1:2; 4:1:2; 2:2:1; oraz 2:1:1. Korzystne jest stosowanie zasadniczo równowaŝnej masy kaŝdego sacharydu. [0110] Korzystne kompozycje według wynalazku zawierają mniej niŝ 50 µg sacharydu meningokokowego na dawkę. Inne korzystne kompozycje zawierają 40 µg meningokokowego sacharydu na dawkę. Inne korzystne kompozycje zawierają 30 µg meningokokowego sacharydu na dawkę. Inne korzystne kompozycje zawierają 25 µg meningokokowego sacharydu na dawkę. Inne korzystne kompozycje zawierają 20 µg meningokokowego sacharydu na dawkę. Inne korzystne kompozycje zawierają 10 µg meningokokowego sacharydu na dawkę ale, idealnie, kompozycje według wynalazku zawierają co najmniej 10 µg całkowitego meningokokowego sacharydu na dawkę. [0111] Kompozycje według wynalazku mogą obejmować czynnik przeciwdrobnoustrojowy, szczególnie kiedy pakowane są w postacie do wielokrotnego dawkowania. [0112] Kompozycje według wynalazku mogą zawierać czynnik powierzchniowo czynny np. Tween (polisorbat), taki jak Tween 80. Czynniki powierzchniowo czynne są obecne na ogół w niewielkich ilościach np. <0,01%.

46 45 [0113] Kompozycje według wynalazku mogą obejmować sole sodowe (np. chlorek sodu) dla zapewniania toniczności. Typowe stęŝenie wynosi 10 ± 2 mg/ml NaCl. [0114] Kompozycje według wynalazku będą na ogół zawierać bufor. Typowym buforem jest bufor fosforanowy. [0115] Kompozycje według wynalazku będą na ogół podawane w połączeniu z innymi czynnikami immunoregulatorowymi. W szczególności, kompozycje będą zazwyczaj zawierać jeden lub więcej adiuwantów. Takie adiuwanty obejmują, ale bez ograniczeń: A. Kompozycje zawierające związki mineralne [0116] Kompozycje zawierające związki mineralne odpowiednie do stosowania jako adiuwanty w wynalazku obejmują sole mineralne, takie jak sole glinu i sole wapnia. Wynalazek obejmuje sole mineralne, takie jak wodorotlenki (np. tlenowodorotlenki), fosforany (np. hydroksyfosforany, ortofosforany), siarczany, itd. [np. patrz rozdziały 8 i 9 pozycji literaturowej 142], lub mieszaniny róŝnych związków mineralnych, ze związkami przyjmującymi dowolne odpowiednie formy (np. Ŝel, postać krystaliczna, amorficzna, itd.), przy czym preferowana jest adsorpcja. Kompozycjom zawierającym związki mineralne moŝna równieŝ nadawać postać cząstek soli metalu [143]. B. Emulsje olejowe [0117] Kompozycje emulsji olejowych odpowiednie do stosowania jako adiuwanty w wynalazku obejmują emulsje skwalen-woda, takie jak MF59 [Rozdział 10 z pozycji literaturowej 142; patrz równieŝ pozycja literaturowa 144] (5% skwalen, 0,5% Tween 80,

47 46 oraz 0,5% Span 85, którym nadano postać submikronowych cząstek z zastosowaniem mikrofluidyzera). MoŜna równieŝ stosować kompletny adiuwant Freunda (CFA) i niekompletny adiuwant Freunda (IFA). C. Preparaty saponiny [rozdział 22 pozycji literaturowej 142] [0118] Preparaty saponiny moŝna równieŝ stosować jako adiuwanty w wynalazku. Saponiny są heterologiczną grupą glikozydów sterolowych i glikozydów triterpenoidowych, które moŝna znaleźć w korze, liściach, łodygach, korzeniach, a nawet kwiatach wielu gatunków roślin. Saponiny z kory drzewa Quillaia saponaria Molina były szeroko badane jako adiuwanty. Saponiny moŝna równieŝ otrzymywać komercyjnie z Smilax ornata (sarsaprilla), Gypsophilla paniculata (łyszczec wiechowaty), oraz Saponaria officianalis (mydlnica lekarska). Preparaty adiuwantów saponiny obejmują oczyszczone preparaty, takie jak QS21, jak równieŝ preparaty lipidowe, takie jak ISCOM. QS21 jest sprzedawany jako Stimulon. [0119] Kompozycje saponiny oczyszcza się stosując HPLC i RP- HPLC. Stosując te techniki zidentyfikowano specyficzne oczyszczone frakcje, obejmujące QS7, QS17, QS18, QS21, QH-A, QH-B i QH-C. Korzystnie, saponiną jest QS21. Sposób wytwarzania QS21 ujawniono w pozycji literaturowej 145. Preparaty saponiny mogą równieŝ zawierać sterol, taki jak cholesterol [146]. [0120] Kombinacje saponin i cholesteroli moŝna stosować do tworzenia unikalnych cząstek zwanych kompleksami immunostymulującymi (ISCOM) [rozdział 23 pozycji literaturowej 142]. ISCOM zazwyczaj obejmują równieŝ fosfolipid, taki jak fosfatydyloetanoloamina lub fosfatydylocholina. Wszystkie znane

48 47 saponiny moŝna stosować w ISCOM. Korzystnie, ISCOM obejmuje jeden lub więcej QuilA, QHA i QHC. ISCOM opisano ponadto w pozycjach literaturowych Opcjonalnie, ISCOMS moŝe być pozbawiony dodatkowych środków powierzchniowo czynnych [149]. [0121] Przegląd rozwoju adiuwantów opartych na saponinach moŝna znaleźć w pozycjach literaturowych 150 i 151. D. Wirosomy i cząstki podobne do wirusów [0122] Wirosomy i cząstki podobne do wirusów (VLP) moŝna równieŝ stosować jako adiuwanty w wynalazku. Struktury te zawierają na ogół jedno lub więcej białek z wirusa, ewentualnie połączonych lub w preparacie z fosfolipidem. Są one na ogół niepatogenne, niereplikujące i ogólnie nie zawierają natywnego genomu wirusowego. Białka wirusowe mogą być wytwarzane rekombinacyjnie lub izolowane z całych wirusów. Te białka wirusowe odpowiednie do stosowania w wirosomach lub VLP obejmują białka pochodzące z wirusa grypy (takie jak HA lub NA), wirusa zapalenia wątroby typu B (takie jak białka rdzenia lub kapsydu), wirusa zapalenia wątroby typu E, wirusa odry, wirusa Sindbis, rotawirusa, wirusa pryszczycy, retrowirusa, wirusa Norwalk, ludzkiego wirusa brodawczaka, HIV, fagów RNA, faga Qβ (takie jak białka otoczki), faga GA, faga fr, faga AP205 i Ty (takie jak białko pl retrotranspozonu Ty). VLP omówiono szerzej w pozycjach literaturowych Wirosomy omówiono szerzej, na przykład w pozycji literaturowej 158. E. Pochodne bakteryjne lub drobnoustrojowe [0123] Adiuwanty odpowiednie do stosowania w wynalazku obejmują bakteryjne lub drobnoustrojowe pochodne, takie jak nietoksyczne

49 48 pochodne lipopolisacharydu (LPS) bakterii jelitowych, pochodne lipidu A, immunostymulujące oligonukleotydy i ADP-rybozylujące toksyny oraz ich pozbawione toksyczności pochodne. [0124] Nietoksyczne pochodne LPS obejmują monofosforylolipid A (MPL) i 3-O-deacylowany MPL (3dMPL). 3dMPL jest mieszaniną 3 de-o-acylowanego monofosforylolipidu A z 4, 5 lub 6 acylowanymi łańcuchami. Korzystne "małe cząstki" tworzone przez 3 de-oacylowany monofosforylolipid A ujawniono w pozycji literaturowej 159. Takie " małe cząstki" 3dMPL są wystarczająco małe, aby moŝna było uzyskać ich sterylność przez filtrację przez sączek o wielkości porów 0,22 µm [159]. Inne nietoksyczne pochodne LPS obejmują związki naśladujące monofosforylolipid A, takie jak pochodne fosforanu aminoalkiloglukozoaminidowego np. RC-529 [160,161]. [0125] Pochodne lipidu A obejmują pochodne lipidu A z Escherichia coli, takie jak OM-174. OM-174 opisano na przykład w pozycjach literaturowych 162 i 163. [0126] Immunostymulujące oligonukleotydy odpowiednie do stosowania jako adiuwanty w wynalazku obejmują sekwencje nukleotydowe zawierające motyw CpG (sekwencję dinukleotydową zawierającą niemetylowaną cytozynę połączona wiązaniem fosforanowym z guanozyną). Wykazano równieŝ, Ŝe dwuniciowe RNA oraz oligonukleotydy zawierające sekwencje palindromowe lub poli(dg) wykazują działanie immunostymulujące. [0127] CpG mogą obejmować modyfikacje nukleotydów/analogi, takie jak modyfikacje fosforotionianowe, i mogą być dwuniciowe lub jednoniciowe. Pozycje literaturowe 164, 165 i 166 ujawniają moŝliwe podstawienia analogów np. zastąpienie guanozyny 2 -

50 49 deoksy-7-deazaguanozyną. Skuteczność oligonukleotydów CpG jako adiuwantów omówiono szerzej w pozycjach literaturowych [0128] Sekwencja CpG moŝe być ukierunkowana wobec TLR9, tak jak motyw GTCGTT lub TTCGTT [173]. Sekwencja CpG moŝe być specyficzna do indukowania odpowiedzi immunologicznej Th 1, tak jak ODN CpG-A, lub moŝe być bardziej specyficzna do indukowania odpowiedzi komórek B, tak jak ODN CpG-B. ODN CpG-A i ODN CpG-B omówiono w pozycjach literaturowych Korzystnie, CpG jest ODN CpG-A. [0129] Korzystnie, oligonukleotyd CpG jest skonstruowany tak, aby koniec 5 był dostępny do rozpoznawania receptora. Ewentualnie, dwie sekwencje nukleotydowe CpG mogą być związane przy swoich końcach 3, tworząc "immunomery". Patrz, na przykład, pozycje literaturowe 173 i [0130] Bakteryjne toksyny ADP-rybozylujące oraz ich pozbawione toksyczności pochodne moŝna stosować jako adiuwanty w wynalazku. Korzystnie, białko pochodzi z E.coli (ciepłolabilna enterotoksyna E.coli "LT"), przecinkowca cholery ("CT"), lub pałeczki krztuśca ("PT"). Stosowanie pozbawionych toksyczności ADP-rybozylujących toksyn jako adiuwantów śluzówkowych opisano w pozycji literaturowej 180 i jako adiuwantów parenteralnych w pozycji literaturowej 181. Toksyny lub anatoksyny występują korzystnie w postaci holotoksyny, zawierającej dwie podjednostki, A i B. Korzystnie, podjednostka A zawiera mutację powodującą utratę toksyczności; korzystnie podjednostka B nie jest zmutowana. Korzystnie, adiuwant jest pozbawionym toksyczności mutantem LT, takim jak LT-K63, LT-R72, oraz LT- G192. Zastosowanie toksyn ADP-rybozylujących oraz ich

51 50 pozbawionych toksyczności pochodnych, szczególnie LT-K63 i LT- R72, jako adiuwantów moŝna znaleźć w pozycjach literaturowych Numeryczne odniesienia do podstawień aminokwasowych opierające się korzystnie na przyporządkowaniu podjednostek A i B toksyn ADP-rybozylujących przedstawiono w pozycji literaturowej 190., włączonej do tego opisu w całości poprzez odnośnik literaturowy. F. Immunomodulatory ludzkie [0131] Immunomodulatory ludzkie odpowiednie do stosowania jako adiuwanty w wynalazku obejmują cytokiny, takie jak interleukiny (np. IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 [191], itd.) [192], interferony (np. interferon-y), czynnik stymulujący kolonizację makrofagów i czynnik martwiczy nowotworów. G. Substancje bioadhezyjne i mukoadhezyjne [0132] Substancje bioadhezyjne i mukoadhezyjne moŝna równieŝ stosować jako adiuwanty w wynalazku. Odpowiednie substancje bioadhezyjne obejmują mikrokuleczki esteryfikowanego kwasu hialuronowego [193] lub substancje mukoadhezyjne, takie jak usieciowane pochodne poli(kwasu akrylowego), alkoholu poliwinylowego, poliwinylopirolidonu, polisacharydy i karboksymetyloceluloza. Jako adiuwanty w wynalazku moŝna równieŝ stosować chitosan i jego pochodne [194]. H. Mikrocząstki [0133] Mikrocząstki moŝna równieŝ stosować jako adiuwanty w wynalazku. Mikrocząstki (tj. cząstki o średnicy ~100 m do ~150 µm, korzystniej o średnicy ~200 nm do ~30 µm, i najkorzystniej o średnicy -500 nm do ~10 µm) są utworzone z materiałów, które

52 51 są biodegradowalne i nietoksyczne (np. poli(α-hydroksykwasu), kwasu polihydroksymasłowego, poliortoestru, polibezwodnika, polikaprolaktonu, itd.), przy czym preferowane są te z poli(laktydo-ko-glikolidu), ewentualnie traktowane tak, aby posiadały ujemnie naładowaną powierzchnię (np. przy uŝyciu SDS) lub pozytywnie naładowaną powierzchnię (np. przy uŝyciu kationowych środków powierzchniowo czynnych, takich jak CTAB). I. Liposomy rozdziały 13 i 14 w pozycji literaturowej 142) [0134] Przykłady preparatów liposomowych odpowiednich do stosowania jako adiuwanty opisano w pozycjach literaturowych J. Preparaty eteru polioksyetylenowego i estrów polioksyetylenowych [0135] Adiuwanty odpowiednie do stosowania w wynalazku obejmują etery polioksyetylenowe lub estry polioksyetylenowe [198]. Takie preparaty zawierają ponadto środki powierzchniowo czynne polioksyetylenowych estrów sorbitanu w połączeniu z oktoksynolem [199], jak równieŝ środki powierzchniowo czynne eterów lub estrów polioksyetylenoalkilowych w połączeniu z co najmniej jednym niejonowym związkiem powierzchniowo czynnym, takim jak oktoksynol [200]. Korzystne etery polioksyetylenowe wybiera się z następującej grupy: eter polioksyetyleno-9- laurylowy (laureth 9), eter polioksyetyleno-9-steorylowy, eter polioksyetyleno-8-steorylowy, eter polioksyetyleno-4-laurylowy, eter polioksyetyleno-35-laurylowy, i eter polioksyetyleno-23- laurylowy. K. Polifosfazen (PCPP)

53 52 [0136] Preparaty PCPP opisano, na przykład, w pozycjach literaturowych 201 i 202. L. Peptydy muramylowe [0137] Przykłady peptydów muramylowych odpowiednich do stosowania jako adiuwanty w wynalazku obejmują N-acetylomuramylo-L-treonylo-D-izoglutaminę (thr-mdp), N-acetylonormuramylo-L-alanylo-D-izoglutaminę (nor-mdp), oraz N- acetylomuramylo-l-alanylo-d-izoglutaminylo-l-alanino-2-(1-2 - dipalmitoilo-sn-glicero-3-hydroksyfosforyloksyy)-etyloaminę MTP-PE). M. Związki imidazochinolonowe. [0138] Przykłady związków imidazochinolonowych odpowiednich do stosowania jako adiuwanty w wynalazku obejmują Imiquamod i jego homologi (np. "Resiquimod 3M"), opisane szerzej w pozycjach literaturowych 203 i 204. [0139] Wynalazek moŝe równieŝ zawierać kombinacje aspektów jednego lub więcej adiuwantów zidentyfikowanych powyŝej. Na przykład, w wynalazku moŝna stosować następujące kompozycje adiuwantów: (1) saponina i emulsja typu olej w wodzie [205]; (2) saponina (np. QS21) + nietoksyczna pochodna LPS (np. 3dMPL) [206]; (3) saponina (np. QS21) + nietoksyczna pochodna LPS (np. 3dMPL) + cholesterol; (4) saponina (np. QS21) + 3dMPL + IL-12 (ewentualnie + sterol) [207]; (5) kombinacje 3dMPL z, na przykład, QS21 i/lub emulsje typu olej w wodzie [208]; (6) SAF, zawierający 10% skwalen, 0,4% Tween 80, 5% polimer blokowy pluronic L121, i thr-mdp, albo poddany mikrofluidyzacji do uzyskania submikronowej emulsji, albo wytrząsany na worteksie w

54 53 celu wytworzenia emulsji z większymi cząstkami; (7) układ adiuwantów Ribi (RAS), (Ribi Immunochem), zawierający 2% skwalen, 0,2% Tween 80, oraz jeden lub więcej składników bakteryjnej ściany komórkowej z grupy składającej się z monofosforylipidu A (MPL), dimikolanu trehalozy (TDM), szkieletu ściany komórkowej (CWS), korzystnie MPL + CWS (Detox ); oraz (8) jednej lub więcej soli mineralnych (takich jak sole glinu) + nietoksyczna pochodna LPS (taka jak 3dMPL). [0140] Inne substancje, które działają jako czynniki immunostymulujące ujawniono w rozdziale 7 pozycji literaturowej 142. [0141] Stosowanie jako adiuwantów soli glinu jest szczególnie korzystne i antygeny są na ogół adsorbowane do takich soli. Koniugaty MenC Menjugate i NeisVac wykorzystują adiuwanty wodorotlenkowe, podczas gdy Meningitec wykorzystuje fosforany. W kompozycji według wynalazku moŝliwa jest adsorbcja niektórych antygenów do wodorotlenku glinu, a innych antygenów do fosforanu glinu. Na ogół, jednakŝe, korzystne jest uŝycie tylko jednej soli np. wodorotlenku lub fosforanu, ale nie obydwu. Wodorotlenku glinu korzystnie unika się jako adiuwantu, szczególnie jeśli kompozycja obejmuje antygen Hib. Kompozycje, które nie zawierają wodorotlenku glinu są zatem preferowane. Raczej, moŝna stosować fosforany glinu i zazwyczaj adiuwant jest amorficznym hydroksyfosforanem glinu, ze stosunkiem molarnym PO 4 /Al wynoszącym pomiędzy 0,84 a 0,92, wprowadzane przy 0,6 mg Al 3+ /ml. MoŜna stosować adsorpcję przy niskiej dawce fosforanu glinu np. pomiędzy 50 a 100 µg Al 3+, na koniugat na dawkę. Jeśli stosuje się fosforan glinu i jest

55 54 poŝądane, aby nie adsorbować antygenu do adiuwanta, to korzystne jest wprowadzenie wolnych jonów fosforanowych do roztworu (np. przez zastosowanie buforu fosforanowego). [0142] Nie wszystkie koniugaty wymagają adsorbcji tj. niektóre lub wszystkie mogą być wolne w roztworze. [0143] Fosforan wapnia jest innym korzystnym adiuwantem. Metody leczenia [0144] Wynalazek zapewnia równieŝ metodę wywoływania odpowiedzi przeciwciał u ssaka, obejmującą podawanie ssakowi kompozycji farmaceutycznej według wynalazku. [0145] Wynalazek zapewnia równieŝ metodę wywoływania odpowiedzi immunologicznej u ssaka, obejmującą etap podawania skutecznej ilości kompozycji według wynalazku. Odpowiedź immunologiczna ma korzystnie ochronny charakter i korzystnie obejmuje przeciwciała. Metoda moŝe wywołać wzmocnioną odpowiedź. [0146] Ssak jest korzystnie człowiekiem. Jeśli szczepionka jest do stosowania profilaktycznego, człowiekiem jest korzystnie dziecko (np. małe dziecko lub niemowlę) bądź nastolatek; jeśli szczepionka jest do stosowania terapeutycznego, człowiekiem jest korzystnie dorosły. Szczepionkę przeznaczoną dla dzieci moŝna równieŝ podawać dorosłym np. do oceny bezpieczeństwa, dawkowania, immunogenności, itd. [0147] Wynalazek zapewnia równieŝ kompozycję według wynalazku do stosowania jako lek. Korzystnie lek jest zdolny do wywołania odpowiedzi immunologicznej u ssaka (tj. jest on kompozycją immunogenną) i jeszcze korzystniej jest szczepionką.

56 55 [0148] Wynalazek zapewnia równieŝ stosowanie (i) skoniugowanego sacharydowego antygenu otoczkowego grupy serologicznej C,; (ii) skoniugowanego sacharydowego antygenu otoczkowego grupy serologicznej W135, (iii) skoniugowanego sacharydowego antygenu otoczkowego grupy serologicznej Y; (iv) białka NadA w oligomerycznej formie, białka 741, białka 936, białka 953 oraz białka 287 ; oraz, ewentualnie, (v) skoniugowanego sacharydowego antygenu otoczkowego grupy serologicznej A, do wytwarzania leku przeznaczonego do wywoływania odpowiedzi immunologicznej u ssaka. [0149] Te zastosowania i metody przeznaczone są korzystnie do zapobiegania i/lub leczenia choroby powodowanej przez Neisseria (np. zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych, posocznicy, bakteriemii, rzeŝączki, itd.). Preferowana jest ochrona i/lub leczenie bakteryjnego i/lub meningokokowego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych. [0150] Jeden ze sposobów sprawdzania skuteczności działania terapeutycznego obejmuje monitorowanie infekcji Neisseria po podaniu kompozycji według wynalazku. Jeden ze sposobów sprawdzania skuteczności działania profilaktycznego obejmuje monitorowanie odpowiedzi immunologicznej przeciw pięciu podstawowym antygenom po podaniu kompozycji. Immunogenność kompozycji wedłu wynalazku moŝna określać podając je testowanym osobnikom (np. dzieciom w wieku miesięcy lub modelowym zwierzętom [209]) i określając standardowe parametry obejmujące bakteriobójcze przeciwciała w surowicy (SBA) i miana ELISA (GMT) całkowitych i o wysokiej zachłanności IgG skierowanym przeciw otoczkom. Te odpowiedzi immunologiczne będzie się na

57 56 ogół określać około 4 tygodnie po podaniu kompozycji, i porównywać z wartościami uzyskanymi przed podaniem kompozycji. Korzystne jest, aby SBA wzrosło co najmniej 4-krotnie lub 8- krotnie. Jeśli podaje się więcej niŝ jedną dawkę kompozycji, to wykonuje się więcej niŝ jedno sprawdzenia po podawaniu. [0151] Korzystne kompozycje według wynalazku mogą powodować powstanie u pacjenta miana przeciwciał, które jest lepsze niŝ kryterium ochrony serologicznej dla kaŝdego składnika antygenowego w przypadku akceptowalnego procentu ludzi. Antygeny wraz z mianami skierowanych przeciw nim przeciwciał, powyŝej których uwaŝa się, Ŝe gospodarz przeszedł serokonwersję skierowaną przeciw antygenowi, są dobrze znane i takie miana są publikowane przez organizacje, takie jak WHO. Korzystnie, więcej niŝ 80% statystycznie istotnych próbek osobników przeszło serokonwersję, korzystniej, więcej niŝ 90%, jeszcze korzystniej więcej niŝ 93%, a najkorzystniej %. [0152] Kompozycje według wynalazku będą na ogół podawane bezpośrednio pacjentowi. Bezpośrednie podawanie moŝna przeprowadzać przez iniekcję pozajelitową (np. podskórnie, dootrzewnowo, doŝylnie, domięśniowo, lub do przestrzeni śródmiąŝszowych tkanki), lub przez podawanie doodbytnicze, doustne, dopochwowe, miejscowe, przezskórne, donosowe, do oczu, do uszu, do płuc lub inne podawanie dośluzówkowe. Preferowane jest podawanie domięśniowe w udo lub ramię. Iniekcje moŝna przeprowadzać przez igłę (np. igłę podskórną), ale alternatywnie moŝna stosować iniekcje bez igły. Typowa domięśniowa dawka wynosi0,5 ml.

58 57 [0153] Wynalazek moŝe być stosowany do wywoływania odporności ogólnoustrojowej i/lub śluzówkowej. [0154] Dawkowanie moŝe być w schemacie pojedynczej dawki lub w schemacie wielokrotnych dawek. Wielokrotne dawki mogą być stosowane w schemacie immunizacji pierwotnej i/lub w schemacie immunizacji przypominającej. Po schemacie dawkowania pierwotnego, moŝe następować schemat dawkowania przypominającego. Odpowiednie odstępy pomiędzy dawkami pierwotnymi (np. miedzy 4-16 tygodni), i pomiędzy dawkami pierwotnymi i przypominającymi moŝna określić w rutynowy sposób. [0155] Infekcje powodowane przez Neisseria dotyczą róŝnych obszarów organizmu, a więc kompozycje według wynalazku moŝna przygotowywać w róŝnych postaciach. Na przykład, kompozycje moŝna przygotowywać w postaci iniekcyjnej, zarówno jako płynnych roztworów, jak i zawiesin. Kompozycję moŝna przygotować do podawania dopłucnego np. jako preparat wziewny, z wykorzystując drobny proszek lub spray. Kompozycja moŝe być przygotowana jako czopek lub krąŝek domaciczny. Kompozycja moŝe być przygotowana do podawania donosowego, do uszu lub do oczu np, jako spray, krople, Ŝel lub proszek [np. pozycje literaturowe 210 i 211]. Donoszono o powodzeniu przy podawaniu donosowym sacharydów pneumokokowych [212,213], polipeptydów pneumokokowych [214], sacharydów Hib [215], sacharydów MenC [216], oraz mieszanin koniugatów sacharydów Hib i MenC [217].

59 58 Stabilność przechowywania [0156] Kompozycja według wynalazku oferuje ulepszoną stabilność, szczególnie dla komponentu sacharydowego grupy serologicznej A. Wynalazek zapewnia sposób przygotowywania kompozycji szczepionki, obejmujący etapy: (1) mieszania (i) skoniugowanego sacharydowego antygenu otoczkowego grupy serologicznej C, (ii) skoniugowanego sacharydowego antygenu otoczkowego grupy serologicznej W135, (iii) skoniugowanego sacharydowego antygenu otoczkowego grupy serologicznej Y, oraz (iv) białka NadA w oligomerycznej formie, białka 741, białka 936, białka 953 oraz białka 287 ; (2) przechowywania kompozycji otrzymanej w etapie (1) przez co najmniej 1 tydzień; (3) przygotowywania strzykawki zawierającej przechowywaną kompozycję z etapu (2), gotowej do iniekcji u pacjenta; oraz, ewentualnie (4) wstrzyknięcie kompozycji pacjentowi. [0157] Etap (I) moŝe równieŝ obejmować mieszanie (v) skoniugowanego sacharydowego antygenu otoczkowego grupy serologicznej A. MoŜe on równieŝ obejmować mieszanie (vi) skoniugowanego antygenu Hib. MoŜe on równieŝ obejmować mieszanie (vii) antygenu pneumokokowego. Etap (2) obejmuje korzystnie co najmniej 2-tygodniowe, 4-tygodniowe, 6- tygodniowe, 8-tygodniowe, 10-tygodniowe, 12- tygodniowe lub dłuŝsze przechowywanie. Etap przechowywania (2) moŝe być przeprowadzany w temperaturze poniŝej temperatury pokojowej lub nie (np. w temperaturze 10±10 C). [0158] Wynalazek zapewnia równieŝ sposób przygotowywania kompozycji szczepionki, obejmującej etapy: (1) mieszania (i) skoniugowanego sacharydowego antygenu otoczkowego grupy

60 59 serologicznej C, (ii) skoniugowanego sacharydowego antygenu otoczkowego grupy serologicznej W135, (iii) skoniugowanego sacharydowego antygenu otoczkowego grupy serologicznej Y, oraz (iv) białka NadA w oligomerycznej formie, białka 741, białka 936, białka 953 oraz białka 287 ; i (2) pobieranie objętości dawki jednostkowej ze zmieszanych antygenów; oraz (c) pakowania pobranej dawki jednostkowej do hermetycznie zamykanego pojemnika. [0159] Etap (1) moŝe równieŝ obejmować mieszanie (v) skoniugowanego sacharydowego antygenu otoczkowego grupy serologicznej A. MoŜe on równieŝ obejmować mieszanie (vi) skoniugowanego sacharydowego antygenu otoczkowego Hib. MoŜe on równieŝ obejmować mieszanie (vii) antygenu pneumokokowego. Hermetycznie zamykanym pojemnikiem moŝe być fiolka lub strzykawka. [0160] Wynalazek zapewnia hermetycznie zamykany pojemnik, zawierający kompozycję według wynalazku. Informacje ogólne [0161] Termin "zawierający" oznacza "obejmujący" jak równieŝ "składający się z" np. kompozycja "zawierająca" X moŝe składać się wyłącznie z X lub moŝe obejmować coś dodatkowego np. X + Y. [0162] Termin "około" w odniesieniu do wartości liczbowej x oznacza, na przykład, x ± 10%. [0163] Słowo "zasadniczo" nie wyklucza "całkowicie" np. kompozycja, które jest "zasadniczo wolna" od Y moŝe być całkowicie wolna od Y. Jeśli konieczne, słowo "zasadniczo" moŝe być pomięte z definicji wynalazku.

61 60 [0164] Odniesienia do procentowej identyczności sekwencji pomiędzy dwoma sekwencjami aminokwasowymi oznaczają, Ŝe kiedy dokonana się przyporządkowania, to procent aminokwasów jest taki sam przy porównywaniu dwóch sekwencji. To przyporządkowanie i homologię procentową czy identyczność sekwencji moŝna określać stosując znane w nauce oprogramowania, na przykład te opisane w części pozycji literaturowej 218. Korzystnie, przyporządkowanie określa się stosując algorytm poszukiwania homologii Smith-Watermana wykorzystujący poszukiwanie niezgodności afinicznych, z karą za przerwę wynoszącą 12 i karą za wydłuŝenie przerwy wynoszącą 2, BLOSUM matriks 62. Algorytm poszukiwania homologii Smith-Watermana wyjaśniono w pozycji literaturowej 219. [0165] Termin "alkil" odnosi się do grup alkilowych w obydwu formach, prostej i rozgałęzionej. Grupa alkilowa moŝe być przerwana 1, 2 lub 3 heteroatomami wybranymi spośród -O-, -NHbądź -S-. Grupa alkilowa moŝe być równieŝ przerwana 1, 2 lub 3 podwójnymi i/lub potrójnymi wiązaniami. JednakŜe, termin "alkil" zazwyczaj odnosi się do grup alkilowych nie posiadających podstawień w postaci heteroatomu lub podwójnego bądź potrójnego wiązania. Jeśli robi się odniesienie do C 1-12 alkilu, to oznacza, Ŝe grupa alkilowa moŝe zawierać liczbę atomów węgla pomiędzy 1 a 12 (np. C 1, C 2, C 3, C 4, C 5, C 6, C 7, C 8, C 9, C 10, C 11, C 12 ). Podobnie, jeśli robi się odniesienie do C 1-6 alkilu, to oznacza, Ŝe grupa alkilowa moŝe zawierać liczbę atomów węgla pomiędzy 1 a 6 (np. C 1, C 2, C 3, C 4, C 5, C 6 ). [0166] Termin "cykloalkil" obejmuje grupy cykloalkilowe, policykloalkilowe i cykloalkenylowe, jak równieŝ kombinacje

62 61 tych grup z grupami alkilowymi, takie jak grupy cykloalkiloalkilowe. Grupa cykloalkilowa moŝe być przerwana 1, 2 lub 3 heteroatomami wybranymi spośród -O-, -NH- bądź -S. JednakŜe, termin "cykloalkil" odnosi się zazwyczaj do grupy cykloalkilowych nie posiadającej wtrąceń w postaci heteroatomu. Przykłady grup cykloalkilowych obejmują grupy cyklopentylowe, cykloheksylowe, cykloheksenylowe, cykloheksylometylowe oraz adamantylowe. Jeśli robi się odniesienie do C 3-12 cykloalkilu, to oznacza, Ŝe grupa cykloalkilowa moŝe zawierać liczbę atomów węgla pomiędzy 3 a 12 (np. C 3, C 4, C 5, C 6, C 7, C 8, C 9, C 10, C 11, C 12 ). [0167] Termin "aryl" odnosi się do grupy aromatycznej, takiej jak grupa fenylowa lub naftylowa. Jeśli robi się odniesienie do C 5-12 arylu, to oznacza, Ŝe grupa arylowa moŝe zawierać liczbę atomów węgla pomiędzy 5 a 12 (np. C 5, C 6, C 7, C 8, C 9, C 10, C 11, C 12 ). [0168] Termin "C 5-12 arylo-c 1-6 alkil" odnosi się do grup, takich jako grupa benzylowa, fenyloetylowa i naftylometylowa. [0169] Azotowe grupy ochronne obejmują grupy sililowe (takie jak TMS, TES, TBS, TIPS), pochodne acylowe (takie jak, ftalimidy, trifluoroacetamidy, metoksykarbonyl, etoksykarbonyl, t-butoksykarbonyl (Boc), benzyloksykarbonyl (Z lub Cbz), 9- fluorenylometoksykarbonyl (Fmoc), 2-(trimetylosililo)etoksykarbonyl, 2,2,2-trichloroetoksykarbonyl (Troc)), pochodne sulfonylowe (takie jak β-trimetylosililoetanosulfonyl (SES)), pochodne sulfenylowe, grupy C 1-12 alkilowe, benzylowe, benzhydrylowe, tritylowe, 9-fenylofluorenylowe itd. Preferowaną azotową grupą blokującą jest Fmoc.

63 62 [0170] Sekwencje włączone dla ułatwienia klonowania lub oczyszczania, itd. niekoniecznie wchodzą w zakres wynalazku i mogą być pominięte lub usunięte. [0171] Powinno być oczywiste, Ŝe pierścienie cukrowe mogą występować w otwartej oraz zamkniętej postaci i jeśli na wzorach strukturalnych w niniejszym opisie przedstawia się postać zamkniętą, to postacie otwarte równieŝ wchodzą w zakres wynalazku. [0172] Polipeptydy według wynalazku moŝna przygotowywać róŝnymi sposobami (np. przez ekspresję rekombinacyjną, oczyszczanie z hodowli komórkowych, syntezę chemiczną (co najmniej częściowo), itd.) i w róŝnych postaciach (np. natywnej, fuzji, nieglikozylowanej, zmodyfikowanej grupami lipidowymi, itd.). Korzystnie przygotowuje się je w zasadniczo czystej postaci (tj. zasadniczo wolnej od innych białek N.meningitidis lub białek komórki gospodarza). ChociaŜ ekspresja polipeptydu moŝe mieć miejsce w Neisseria, korzystny jest gospodarz heterologiczny. Heterologiczny gospodarz moŝe być prokariotyczny (np. bakteria) lub eukariotyczny. Korzystnie jest to E.coli, ale inni odpowiedni gospodarze obejmują Bacillus subtilis, Vibrio cholerae, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Neisseria lactamica, Neisseria cinerea, Mycobacterium (np. M.turberculosis), droŝdŝe, itd. [0173] Kwas nukleinowy według wynalazku moŝna przygotować wieloma sposobami (np. przez syntezę chemiczną (co najmniej częściowo), z bibliotek genomowych lub cdna, z samego organizmu, itd.) i moŝe on przybierać róŝne postacie (np. jednoniciową, dwuniciową, wektorów, sond, itd.). Korzystnie,

64 63 przygotowuje się go zasadniczo w czystej postaci (tj. zasadniczo wolnej od kwasów nukleinowych N.meningitidis lub komórki gospodarza). Termin "kwas nukleinowy" obejmuje DNA oraz RNA, jak równieŝ ich analogi, takie jak te zawierające zmodyfikowane szkielety (np. fosforotionianowe, itd.), jak równieŝ kwasy peptydonukleinowe (PNA) itd. Wynalazek obejmuje sekwencje kwasu nukleinowego zawierające sekwencje komplementarne do tych opisanych powyŝej (np. dla celów antysensu lub sondowania). [0174] Po ustaleniu grupy serologicznej, klasyfikacja meningokoków obejmuje ustalenie serotypu, seropodtypu a następnie immunotypu, i standardowa nomenklatura wymienia grupę serologiczną, serotyp, seropodtyp i immunotyp, rozdzielone dwukropkiem np. B:4:P1.15:L3,7,9. W obrębie grupy serologicznej B, niektóre linie powodują choroby często (hiperinwazyjne), niektóre linie powodują cięŝsze postacie choroby niŝ inne (hiperwirulentne), a inne w ogóle rzadko powodują choroby. Rozpoznano siedem hiperwirulentnych linii, a mianowicie podgrupy I, III oraz IV-1, kompleks ET-5, kompleks ET-37, grupa A4 i linia 3. Zdefiniowano je stosując elektroforetyczną analizę izoenzymów (multilocus enzyme electrophoresis (MLEE)), ale stosowano równieŝ do klasyfikacji meningokoków typowanie z ustaleniem sekwencji wybranych loci (multilocus sequence typing (MLST)) [pozycja literaturowa 104].

65 64 SPOSOBY PRZEPROWADZANIA WYNALAZKU Białko hybrydowe G [0175] DNA kodujący białko 287 z meningokokowego szczepu 394/98 z grupy serologicznej B i białko 953 z meningokokowego szczepu 2996 z grupy serologicznej B trawiono i ligowano, razem z krótką sekwencją łącznikową, otrzymując plazmid kodujący sekwencję aminokwasową SEQ ID 7. Plazmid transfekowano do E.coli i bakterię namnaŝano w celu ekspresji białka. Po uzyskaniu odpowiedniego wzrostu, bakterie zbierano i białko oczyszczano. Z hodowli, bakterie wirowano i osad homogenizowano w obecności 50 mm buforu octanowego (ph 5), przy stosunku objętości osad:bufor wynoszącym 1:8. Lizę przeprowadzano stosując wysokociśnieniowy homogenizer (AVESTIN, 4 cykle przy psi). Po lizie, dodawano mocznik do stęŝenia końcowego 5M, a następnie mieszano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. ph obniŝano z 6 do 5 stosując 200 mm bufor octanowy (ph 4) + 5 M mocznik. Mieszaninę wirowano przy g przez 60 minute w temperaturze 2-8 C. Zbierano supernatant i sączono przez SARTOBRAN P (0,45-0,22 µm SARTORIUS). Białka w przesączonym supernatancie były stabilne przez co najmniej 30 dni w temperaturze -20 C i przez co najmniej 15 dni w temperaturze 2-8 C. [0176] Białko oczyszczano dalej na kolumnie kationowymiennej (SPFF, Amersham Biosciences) stosując elucję wykorzystującą 350 mm NaCl + 50 mm octan + 5 M mocznik ph 5,00. Większość zanieczyszczeń była obecna w wypływie. Płukanie przed elucją niŝszymi stęŝeniami NaCl (180 mm) korzystnie eliminowało dwa zanieczyszczające białka E.coli.

66 65 [0177] Wyeluowany materiał doprowadzano do ph 8 (stosując 200 mm TRIS/HCl + 5 M mocznik ph 9) i dalej oczyszczano na kolumnie Q Sepharose HP (Amersham) stosując elucję wykorzystującą 150 mm NaCl + 20 mm TRIS/HCl ph 8,00 w 5 M moczniku. I znów, płukanie przed elucją niŝszymi stęŝeniami soli (90 mm) było uŝyteczne do eliminacji zanieczyszczeń. [0178] Przesączony wyeluowany materiał z kolumny Q HP rozcieńczano 1:2 stosując PBS ph 7,00 (150 mm NaCl + 10 mm fosforan potasu, ph 7,00), a następnie poddawano diafiltracji wobec 10 objętości PBS ph 7,00 przez ultrafiltrację styczną. W końcu diafiltrowany materiał zatęŝano 1,6 razy do około 1,2 mg/ml całkowitego białka. Przy wykorzystaniu membrany o punkcie odcięcia (membrana Regenerated Cellulose 50 cm 2, Millipore PLCTK 30) moŝliwe było dializowanie materiału z wydajnością około 90%. Białko hybrydowe 936- G741 [0179] DNA kodujący białko 936 z meningokokowego szczepu 2996 z grupy serologicznej B i białko 741 z meningokokowego szczepu MC58 z grupy serologicznej B trawiono i ligowano, razem z krótką sekwencją łącznikową, otrzymując plazmid kodujący sekwencję aminokwasową SEQ ID 8. Plazmid transfekowano do E.coli i bakterię namnaŝano w celu ekspresji białka. Rekombinowane białko nie ulegało sekrecji, ale pozostawało w postaci rozpuszczonej w bakteriach. [0180] Po uzyskaniu odpowiedniego wzrostu, bakterie wirowano w celu uzyskania wilgotnej pasty i poddawano następującym działaniom:

67 66 - Homogenizacji przy zastosowaniu układu wysokociśnieniowego w obecności 20 mm fosforanu sodu ph 7,00. - Wirowaniu i klarowaniu przez filtrację ortogonalną. - Kationowej chromatografii kolumnowej (SP Sepharose Fast Flow), z elucją 150 mm NaCl w 20 mm fosforanie sodowym ph 7,00. - Anionowej chromatografii kolumnowej (Q Sepharose XL) ze zbieraniem wypływu. - Hydrofobowej chromatografii kolumnowej (Phenyl Sepharose 6 Fast Flow High Sub) z elucją 20 mm fosforanem sodu, ph 7,00. - Diafiltracji wobec PBS ph 7,4 z punktem odcięcia 10 Kd. - Końcowej filtracji sterylizującej i przechowywaniu w temperaturze -20 C. [0181] Białko w końcowym materiale było stabilne przez co najmniej 3 miesiące w obydwu temperaturach, -20 C i 2-8 C. Białko NadA (NL)(C) [0182] DNA kodujący białko NadA z meningokokowego szczepu 2996 z grupy serologicznej B trawiono w celu usunięcia sekwencji kodującej jego koniec C, otrzymując plazmid kodujący sekwencję aminokwasową SEQ ID 1. Plazmid transfekowano do E.coli i bakterię namnaŝano w celu ekspresji białka. Rekombinowane białko ulegało sekrecji do podłoŝa hodowlanego, a peptyd liderowy był nieobecny w wydzielanym białku (SEQ ID 2). Supernatant poddawano następującym działaniom: - ZatęŜaniu 7X i diafiltracji wobec buforu 20 mm TRIS/HCI ph 7,6 przez UF przepływową (punkt odcięcia 30 Kd). - Anionowej chromatografii kolumnowej (Q Sepharose XL), z elucją 400 mm NaCl w 20 mm TRIS/HCl ph 7,6.

68 67 - Etapowi hydrofobowej chromatografii kolumnowej (Phenyl Sepharose 6 Fast Flow High Sub), z elucją 50 mm NaCl w TRIS/HCl ph 7,6. - Chromatografii na kolumnie ceramicznej z hydroksyloapatytem (HA Macro. Prep) z elucją 200 mm fosforanem sodu ph 7,4. - Diafiltracji (punkt odcięcia 30 Kd) wobec PBS ph 7,4 - Końcowej filtracji sterylizującej i przechowywaniu w temperaturze -20 C. [0183] Białko w końcowym materiale było stabilne przez co najmniej 6 miesięcy w obydwu temperaturach, -20 C i 2-8 C. [0184] Białko NadA jest wraŝliwe na degradację i skrócone postacie NadA moŝna wykryć przez Western blotting lub spektrometrię masową (np. przez MALDI-TOF) wykazując aŝ do 10 kda utraty masy cząsteczkowej. Produkty degradacji moŝna oddzielić od natywnego NadA przez filtrację Ŝelową (np. stosując kolumnę TSK 300SWXL, wstępną kolumnę TSKSWXL, TOSOHAAS). Taka filtracja daje trzy piki: (i) pierwszy pik z czasem retencji 12,637 minut i pozorną masą cząsteczkową 885,036 Da; (ii) czas retencji 13,871 minut i pozorna masa cząsteczkowa 530,388 Da; (iii) czas retencji 13,871 minut i pozorna masa cząsteczkowa 530,388 Da. Analiza rozpraszania światła trzech pików wykazała rzeczywiste masy cząsteczkowe (i) Da, (ii) Da, (iii) Da. A zatem, pierwszy pik zawiera agregaty NadA, a trzeci pik zawiera produkty degradacji. [0185] PoniewaŜ przewidywana masa cząsteczkowa NadA (NL)(C) wynosi 34,113 Da, pik (ii) zawiera trimeryczne białko, które jest poŝądanym antygenem.

69 68 Kombinacje antygenów [0186] Myszy immunizowano kompozycją zawierającą trzy białka oraz, dla porównania, te trzy białka testowano równieŝ pojedynczo. Na grupę stosowano dziesięć myszy. Mieszanina była zdolna do indukowania wysokich mian bakteriobójczych przeciw róŝnym szczepom: (grupa serologiczna) Szczep meningokokowy 2996 (B) MC58 (B) NGH38 394/98 (B) H44/76 (B) F6124 (A) BZ133 (C) C11 (C) (1) (2) <4 (3) Mix > wskazuje, Ŝe ten szczep nie zawiera genu NadA [0187] Przyglądając się pojedynczym myszom, potrójna mieszanina indukuje wysokie i zgodne miana bakteriobójcze przeciw trzem szczepom z grupy serologicznej, z których pochodzą pojedyncze antygeny: # MC / Kombinacja i porównanie z OMV [0188] W dalszych doświadczeniach, antygeny (20 µg kaŝdego antygenu na dawkę) podawano w kombinacji z 10 µg OMV przygotowanych albo ze szczepu H44/76 (Norwegia) albo ze szczepu 394/98 (Nowa Zelandia). Jako kontrole pozytywne stosowano, dla grupy serologicznej B, przeciwciało monoklonalne

70 69 skierowane przeciw otoczce SEAM-3 lub, dla innych szczepów, sacharydy otoczkowe skoniugowane z CRM 197. Mieszanina prawie zawsze dawała lepsze miana niŝ same OMV, i dodanie mieszaniny do OMV prawie zawsze znacząco wzmacniało skuteczność OMV. W wielu przypadkach, mieszanina antygenów dawała taką samą lub lepszą odpowiedź niŝ to obserwowano dla kontroli pozytywnej. Testowanie linii hiperwirulentnych [0189] PoniŜej wymienione antygeny testowano wobec szeregu szczepów z grupy serologicznej B z linii hiperwirulentnych: (a) NadA (NL)(C) (b) G (c) 936- G741 (d) mieszanina (a), (b) i (c) (e) OMV przygotowane ze szczepu H44/76 (Norwegia) (f) OMV przygotowane ze szczepu 394/98 (Nowa Zelandia) (g) mieszanina G287 i (e) (h) mieszanina (d) i (e) (i) mieszanina (d) i (f) [0190] SEAM-3 stosowano jako kontrolę pozytywną. [0191] Wyniki były takie jak przedstawiono poniŝej, wyraŝone jako procent szczepów we wskazanej hiperwirulentnej linii, w których miano bakteriobójcze surowicy przewyŝszało 1024:

71 70 # (a) (b) (c) (d) (e) (f) (g) (h) (i) S-3 szczepów A ET Linia ET [0192] Przeciw konkretnym szczepom referencyjnym, miana bakteriobójcze były takie jak przedstawiono poniŝej:

72 71 Szczep (a) (b) (c) (d) (e) (f) (g) (h) (i) S-3 A < ET-5 44/76 < Linia 3 394/98 < < ET-37 LPN <8 <

73 72 [0193] A więc, kompozycje (d), (h) oraz (i) indukują bakteriobójczą odpowiedź przeciwciał skierowaną przeciw wielu róŝnym szczepom meningokoków grupy serologicznej B z hiperwirulentnych linii A4, ET-5 i linii 3. Miana uzyskane przy zastosowaniu kompozycji (h) oraz (i) były na ogół wyŝsze niŝ dla (d), ale zakres działania na szczepy w obrębie hiperwirulentnych linii A4, ET-5 i linii 3 nie był lepszy. [0194] Zakres działania na szczepy o nieokreślonym typie był równieŝ wysoki przy zastosowaniu kompozycji (d), (h) oraz (i). Kombinacja z koniugatami meningokokowymi i/lub Hib [0195] Potrójną kompozycję MenB połączono z mieszaniną koniugatów oligosacharydowych dla grup serologicznych C, W135 i Y, otrzymując szczepionkę zawierającą następujące antygeny: Składnik Ilość na dawkę 0,5 ml Koniugat grupy serologicznej C 10 µg sacharydu+12,5 25 µg CRM 197 Koniugat grupy serologicznej W µg sacharydu+6,6 20 µg CRM 197 Koniugat grupy serologicznej Y 10 µg sacharydu+6,6 20 µg CRM 197 G µg polipeptydu 936- G µg polipeptydu NadA 20 µg polipeptydu [0196] Przygotowano podobną szczepionkę, obejmującą koniugat MenA (10 µg sacharydu + 12,5-33 µg CRM 197 ) i/lub koniugat HbOC Hib (10 µg sacharydu µg CRM 197 ). [0197] W jednej serii testów, koniugaty grup serologicznych C, W135 i Y połączono, przy czym kaŝdy koniugat obecny był w ilości 40 µg/ml (mierzony jako sacharyd). W celu przechowywania przed uŝyciem połączone koniugaty antygenów MenB liofilizowano

74 73 [-45 C przez 3 godziny, -35 C przez 20 godzin pod zmniejszonym ciśnieniem wynoszącym 50 mtor, 30 C przez 10 godzin pod zmniejszonym ciśnieniem wynoszącym 50 mtor, 30 C przez 9 godzin pod zmniejszonym ciśnieniem wynoszącym 125 mtor] w obecności 15 mg sacharozy, 10 mm buforu fosforanowego (ph 7,2). Końcowa objętość przed liofilizacją wynosiła 0,3 ml. Stąd, po ponownym zawieszeniu w 0,6 ml roztworu wodnego, sacharydy obecne były w ilości 12 µg na grupę serologiczną. Liofilizację zastosowano jedynie dla wygody i ani skuteczność, ani stabilność podczas normalnego przechowywania produktu końcowego nie wymaga liofilizacji. [0198] Drugą szarŝę materiału przygotowano w taki sam sposób, ale włączając równieŝ koniugat grupy serologicznej A, w takiej samej dawce sacharydu jak dla grup serologicznych C, W135 i Y. [0199] Trzecią szarŝę materiału przygotowano w taki sam sposób (grupy serologiczne A, C, W135 i Y), ale włączając równieŝ koniugat Hib-CRM 197, w takiej samej dawce sacharydu jak dla meningokoków. [0200] Dla porównania, przygotowano liofilizowane preparaty koniugatów grup serologicznych A i C. Materiał MenA liofilizowano z 15 mg sacharozy, otrzymując 12 µg dawkę sacharydu po rekonstytucji, jak opisano powyŝej. Materiał MenC liofilizowano z 9 mg mannitolu, otrzymując 12 µg dawkę sacharydu po rekonstytucji. [0201] Materiały te łączono z 600 µl mieszaniny grup serologicznych (d) (lub, jako kontrola, tj. grupy 2 i 3, w identycznej kompozycji, ale pozbawionej antygenów), otrzymując osiem kompozycji:

75 74 Składniki NadA (NL)(C) µg/dawkę µg/dawkę µg/dawkę MenA-CRM 2,4 2,4 2,4 2,4 2,4 µg/dawkę* MenC-CRM 2,4 2,4 2,4 2,4 2,4 2,4 µg/dawkę* MenW-CRM 2,4 2,4 2,4 2,4 2,4 µg/dawkę* MenY-CRM 2,4 2,4 2,4 2,4 2,4 µg/dawkę* Hib-CRM µg/dawkę* wodorotlenek glinu mg/dawkę 2,4 2,4 0,15 0,15 0,15 0,15 0,15 0,15 0,15 0,15 Histydyna mm Sacharoza mg/dawkę mg/dawkę Mannitol mg/dawkę Fosforan potasu ph 7,2 mm Fosforan sodu ph 7,2 mm 1,

76 75 Chlorek sodu 1,8 1,8 1,8 1,8 1,8 1,8 1,8 1,8 mg/dawkę * Podana ilość odnosi się do sacharydu [0202] Kompozycje te podaje się dootrzewnowo w objętości 200 µl do CD/l myszom (8 na grupę) w dniach 0, 21 i 35, i na koniec pobiera się krew w dniu 49. Surowice z 49 dnia testuje się stosując róŝne szczepy meningokoków z grup serologicznych A, B, C, W135 i Y. Wyniki były następujące:

77 76 Grupa B A C W135 Y 2996 MC58 394/98 44/76 F6124 C C4678 M1569 LPN <16* 64* 128* <4 <4 128 < <4 <4 <4 < >8192 >8192 > >8192 > >8192 > >8192 >

78 [0203] A zatem, białkowe antygeny meningokokowe pozostają skuteczne nawet po dodaniu skoniugowanych antygenów sacharydowych, meningokoków i Hib. Podobnie, koniugaty meningokokowe zachowują skuteczność nawet po dodaniu antygenów białkowych. Dane wręcz sugerują, Ŝe dodanie antygenów białkowych do koniugatów wzmacnia skuteczność skierowaną przeciw MenW135 (porównaj grupy 2 i 7). Ponadto, istnieje poziom reaktywności krzyŝowej, w szczególności dla grupy serologicznej Y, poniewaŝ same antygeny białkowe dają dobre miano skierowane przeciw MenY [porównaj pozycja literaturowa 220], jak grupy 4 i 5. [0204] Dane wskazują równieŝ, Ŝe dodatek koniugatu Hib do koniugatów meningokokowych (porównaj grupy 2 i 3) wzmacniają aktywność skierowaną przeciw W135. Zastosowanie zmodyfikowanego sacharydu MenA [0205] Polisacharyd otoczkowy oczyszczono z MenA i hydrolizowano otrzymując oligosacharydy MenA. Polisacharyd (2 g) hydrolizowano w temperaturze 50 C w 50 mm buforze octanu sodowego, ph 4.75, przy stęŝeniu polisacharydu wynoszącym 10 mg/ml przez około 4 godziny [73]. Po hydrolizie, roztwór suszono wyparce obrotowej. [0206] Oligosacharyd aktywowano stosując następujący schemat reakcji:

79 78 Sacc = reszta sacharydowa [0207] Oligosacharyd rozpuszczano w DMSO do uzyskania stęŝenia sacharydu wynoszącego 10 mg/ml. Zgodnie ze stosunkiem molarnym oligosacharyd:cdi wynoszącym 1:20, dodano następnie 21,262 g CDI i mieszaninę reakcyjną mieszano przez 16 godzin w temperaturze pokojowej. Otrzymany związek MenA- CDI oczyszczano przez selektywną precypitację w mieszaninie 80:20 (obj./obj.) aceton:dmso, a następnie wirowanie. Skuteczność reakcji aktywacji wynosiła około 67,9%, jak obliczono określenie stosunku wolnego do związanego imidazolu. [0208] W drugim etapie reakcji, oligosacharyd MenA-CDI solubilizowano w DMSO przy stęŝeniu sacharydu wynoszącym około 10 mg/ml. Zgodnie ze stosunkiem molarnym jednostka MenA-CDI:DMA wynoszącym 1:100, dodano 36,288 g 99% wodorochlorku dimetyloaminy (tj. R 1 i R 2 = Me) i mieszaninę reakcyjną mieszano przez 16 godzin w temperaturze pokojowej. Produkt reakcji liofilizowano i ponownie solubilizowano w stęŝeniu 10 mg/ml roztworu wodnego. [0209] W celu usunięcia niskocząsteczkowych odczynników reakcji (w szczególności dimetyloaminy (DMA)) z preparatu oligosacharydu, przeprowadzano etap dializy z zastosowaniem

80 79 membrany MWCO 3,5 kda (Spectra/Por ). Przeprowadzono cztery etapy dializy: (i) 16 godzin wobec 2 litrów 1 M chlorku sodu (wskaźnik dializy 1:20), (ii) 16 godzin wobec 2 litrów 0,5 M chlorku sodu (wskaźnik dializy 1:20), (iii) i (iv) 16 godzin wobec 2 litrów WFI (wskaźnik dializy 1:20). W celu poprawy oczyszczenia przeprowadzono etap diafiltracji przez membranę MWCO 1 kda (Centricon ). [0210] Oczyszczony produkt MenA-CDI-DMA buforowano przy ph 6,5 w 25 mm L-histydynie (Fluka ). [0211] Dla przygotowywania koniugatów zmodyfikowanego sacharydu MenA (MenA-CDI-DMA), całkowity proces był następujący: - hydroliza polisacharydu do uzyskania fragmentów oligosacharydowych, - sortowanie według wielkości fragmentów oligosacharydowych, - redukcyjna aminacja terminalnych grup aldehydowych na posortowanych według wielkości oligosacharydach, - blokowanie terminalnych grup -NH 2 grupami Fmoc przed reakcją CDI, - wewnętrzne odblokowywanie grup -NH 2 podczas reakcji DMA, - aktywacja terminalnych grup -NH 2 przez SIDEA (Nhydroksysukcynimid kwasu adypinowego), - kowalencyjne przyłączenie do białka CRM 197. [0212] Koniugat zmodyfikowanego oligosacharydu MenA był bardziej oporny na hydrolizę niŝ jego naturalny odpowiednik przy podwyŝszonych temperaturach. Po 28 dniach w temperaturze 37 C, na przykład, procent uwolnionego sacharydu wynosił 6,4% dla zmodyfikowanego oligosacharydu w stosunku do 23,5% dla naturalnego antygenu. Ponadto, miana indukowane przez

81 80 modyfikowane oligosacharydy nie były znacząco niŝsze od tych uzyskanych z wykorzystaniem natywnych struktur cukrowych. [0213] Zmodyfikowany koniugat MenA łączy się z koniugatami MenC, MenW135 i MenY jako substytutem koniugatu niezmodyfikowanego oligosacharydu. Tę tetrawalentną mieszaninę miesza się z trzema polipeptydami MenB w celu uzyskania szczepionki skutecznej wobec grupom serologicznym A, B, C, W135 i Y N.meningitidis w pojedynczej dawce. Kombinacje pneumokokowe [0214] Trzy połączone białka MenB zmieszano z pneumokokowymi koniugatami sacharydowymi do uzyskania końcowego stęŝenia 2 µg/dawkę kaŝdego z serotypów pneumokokowych (podwójnie dla serotypu 6B). A zatem rekonstytuowana szczepionka zawiera następujące antygeny: Składnik Ilość na 0,5 ml dawkę Koniugat grupy serologicznej A 5 µg sacharydu+6,25-16,5 µg CRM 197 Koniugat grupy serologicznej C 5 µg sacharydu+6,25-12,5 µg CRM 197 Koniugat grupy serologicznej W135 5 µg sacharydu+3,3-10 µg CRM 197 Koniugat grupy serologicznej Y 5 µg sacharydu+3,3-10 µg CRM 197 Koniugat serotypu 4 Pneumococcus 2 µg sacharydu+2,5 µg CRM 197 Koniugat serotypu 9V Pneumococcus 2 µg sacharydu+2,5 µg CRM 197 Koniugat serotypu 14 Pneumococcus 2 µg sacharydu+2,5 µg CRM 197 Koniugat serotypu 18C Pneumococcus 2 µg sacharydu+2,5 µg CRM 197 Koniugat serotypu 19F Pneumococcus 2 µg sacharydu+2,5 µg CRM 197 Koniugat serotypu 23F Pneumococcus 2 µg sacharydu+2,5 µg CRM 197 Koniugat serotypu 6B Pneumococcus 4 µg sacharydu+5 µg CRM 197

82 NZ:22851/PE/13 EP Lista sekwencji: [0216] SEQ ID 1 - NadA ze szczepu 2996 z C-końcową delecją SEQ ID 2 - NadA ze szczepu 2996 z C-końcową delecją i przetworzonym peptydem liderowym SEQ ID 3 - G741 ze szczepu MC58 SEQ ID ze szczepu MC58 z przetworzonym peptydem liderowym SEQ ID ze szczepu MC58 z przetworzonym peptydem liderowym SEQ ID 6 - G287 ze szczepu MC58

83 82 SEQ ID 7 hybryda SEQ ID 8 hybryda SEQ ID 9 linker SEQ ID 10 sekwencja 741 SEQ ID 11 sekwencja 741 SEQ ID 12 sekwencja 741