(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/EP03/012191

Transkrypt

1 PL B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/EP03/ (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: , WO04/ (13) B1 (51) Int.Cl. C12N 1/04 ( ) A61K 39/13 ( ) A61K 39/295 ( ) A61P 31/12 ( ) Opis patentowy przedrukowano ze względu na zauważone błędy (54) Sposób konserwacji środka czynnego, ciecz o wysokiej lepkości, immunogenna kompozycja lub szczepionka, oraz sposób wytwarzania szczepionki (30) Pierwszeństwo: , GB, , GB, , GB, , GB, , GB, , GB, (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 02/06 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 11/13 (73) Uprawniony z patentu: GlaxoSmithKline BIOLOGICALS S.A., Rixensart, BE (72) Twórca(y) wynalazku: YVES MAYERESSE, Rixensart, BE (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Katarzyna Rudnicka

2 2 PL B1 Opis wynalazku Wynalazek dotyczy sposobu konserwacji środka czynnego, cieczy o wysokiej lepkości, immunogennej kompozycji lub szczepionki, oraz sposobu wytwarzania szczepionki. Istnieje zapotrzebowanie na wydłużenie trwałości i w ten sposób okresu trwałości nietrwałych próbek, w szczególności próbek biologicznych. Tradycyjnie realizuje się to z użyciem sposobu suszenia sublimacyjnego, w którym sporządza się roztwór substancji i próbkę zamraża się. Podczas pierwotnej fazy suszenia większość wody usuwa się przez sublimację z lodu w warunkach obniżonego ciśnienia i tworzy się porowaty susz". Zazwyczaj następnie odbywa się wtórna faza suszenia, w której zmienia się temperaturę i ciśnienie, a wodę odparowuje się ze stałego suszu". Powstała liofilizowana próbka ma ulepszoną trwałość w porównaniu z preparatem ciekłym. Jednak sposób suszenia sublimacyjnego trwa długo, jest drogi i może stanowić etap ograniczający szybkość procesu produkcji. Suszenie sublimacyjne może również prowadzić do utraty aktywności lub antygenowości pewnych środków aktywnych. Dla pewnych biologicznych materiałów, takich jak żywe wirusy może zachodzić znacząca utrata aktywności w trakcie suszenia sublimacyjnego (Pikal (1994) ACS Symposium 567; ). Wiele suszonych sublimacyjnie substancji jest w dalszym ciągu nietrwałych w temperaturze otoczenia (Carpenter i inni (1994) ACS Symposium 567; ). Uszkodzeniom wywoływanym przez proces zamrażania można do pewnego stopnia zapobiec stosując środki stabilizujące, takie jak poliole. Poczyniono dalsze ulepszenia sposobu liofilizacji przez uniknięcie zamrażania próbki w trakcie realizacji sposobu i usuwanie wody przez gotowanie (WO 96/40077; US ). Ten sposób polega na tym, że wytwarza się mieszaninę materiału tworzącego szklistą matrycę w odpowiednim rozpuszczalniku wraz z konserwowaną próbką, z mieszaniny odparowuje się rozpuszczalnik, w wyniku czego otrzymuje się syrop, wystawia się syrop na działanie ciśnienia i temperatury wystarczające do zagotowania syropu i usunięcie resztek rozpuszczalnika. Sposoby podobne do opisanego można nazywać technikami suszenia spieniającego. Przy stosowaniu takich technik konserwowaną próbkę wystawia się na stres związany z tworzeniem i niszczeniem pęcherzyków w stadium wrzenia". Szczególnie podczas konserwowania nietrwałych substancji może to prowadzić do utraty aktywności. Podobny sposób opisano w US , przy czym sposób ten polega na tym, że częściowo usuwa się wodę z lepkiego płynu a następnie syrop poddaje się działaniu próżni dla zagotowania go a następnie suszy się go w temperaturze zasadniczo niższej od 100 C. Sposób ten w dalszym ciągu obciążony jest pewnymi problemami zwyczajnego suszenia sublimacyjnego. Gdy sposób realizuje się w dużych suszarkach sublimacyjnych, próbki suszą się z różną szybkością w zależności od ich położenia na półce, w efekcie czego różne próbki tracą różną część aktywności w trakcie procesu suszenia. Prowadzi to do braku jednorodności w obrębie jednej partii. Trehaloza stanowi poliol, który jest korzystny ze względu na właściwości stabilizujące. Trehaloza jest naturalnie występującym, obojętnym, nieredukującym i nietoksycznym, tworzącym szkło disacharydem, który, jak początkowo stwierdzono, jest związany z zapobieganiem uszkodzeniu związanym z wysuszeniem niektórych roślin i zwierząt. Trehaloza jest użyteczna w zapobieganiu denaturacji szeregu substancji obejmujących białka, wirusy i pokarmy w trakcie desykacji a następnie częściowo podczas przechowywania, ponieważ ma względnie wysoką temperaturę zeszklenia (ok. 120 C w stanie bezwodnym) (US ; US ; US ). Trehaloza stabilizuje także enzymy (Argall i Smith (1993) Biochem. Mol. Biol. Int. 30; 491). Stwierdzono także, że trehaloza i szereg stabilizujących polioli jest użytecznych pod względem ulepszenia konserwacji suszonych sublimacyjnie próbek, szczególnie w przypadkach, gdy próbka jest podatna na utratę aktywności w trakcie procesu suszenia sublimacyjnego. Inne cukry użyteczne w technikach liofilizacji obejmują sacharozę i laktozę. Wynalazek dotyczy sposobu konserwacji środka czynnego, w którym w następujących etapach: a) wytwarza się konserwowaną próbkę przez rozpuszczenie/przeprowadzanie w stan zawiesiny środka czynnego w roztworze środka stabilizującego; b) poddaje się konserwowaną próbkę działaniu ciśnienia w zakresie 1-3 kpa i temperatury w zakresie 5-37 C, w wyniku czego z konserwowanej próbki usuwa się rozpuszczalnik przez odparowanie, bez zamrażania i powstawania pęcherzyków tworzących pianę, z utworzeniem lepkiej cieczy, przy czym środek stabilizujący stanowi poliol tworzący produkt szklisty, wybrany z grupy obejmującej glukozę, maltulozę, izomaltulozę, laktulozę, sacharozę, maltozę, laktozę, sorbitol, izomaltozę, maltitol, laktitol, palatynit, trehalozę, rafinozę, stachiozę, melezytozę i dekstran, a środek czynny zawiera IPV (inaktywowany wirus polio).

3 PL B1 3 Korzystny jest sposób, w którym w dodatkowym etapie: c) następnie poddaje się konserwowaną próbkę działaniu ciśnienia w zakresie 1-3 kpa i temperatury w zakresie 5-37 C, tak że lepka ciecz wysycha z wytworzeniem cieczy o wysokiej lepkości. Korzystny jest sposób, w którym ciśnienie w etapie b) obniża się do wartości w zakresie 1-2 kpa. Korzystny jest sposób, w którym temperatura na zewnątrz konserwowanej próbki jest wyższa w etapie c) niż w etapie b). Korzystny jest sposób, w którym temperaturę na zewnątrz konserwowanej próbki w etapie c) podwyższa się do wartości powyżej 20 C. Korzystny jest sposób, w którym ciśnienie w etapie c) obniża się w porównaniu do ciśnienia panującego w etapie b). Korzystny jest sposób, w którym ciśnienie w etapie c) obniża się do wartości co najwyżej 0,1 kpa. Korzystny jest sposób, w którym etap b) realizuje się w czasie krótszym niż 4 godziny. Korzystny jest sposób, w którym etapy b) i c) realizuje się w czasie krótszym niż 12 godzin. Korzystny jest sposób, w którym środkiem stabilizującym jest sacharoza. Korzystny jest sposób, w którym stężenie środka stabilizującego jest niższe niż 15%. Korzystny jest sposób, w którym konserwowana próbka zawiera czerwień fenolową. Korzystny jest sposób, w którym konserwowaną próbkę suszy się w pojemniku z wewnętrzną powierzchnią odpychającą rozpuszczalnik. Korzystny jest sposób, w którym środek czynny zawiera cząsteczkę wybraną z grupy obejmującej białko, peptyd, aminokwas, polinukleotyd, oligonukleotyd, polisacharyd, oligosacharyd, koniugat polisacharyd-białko i koniugat oligosacharyd-białko. Korzystny jest sposób, w którym środek czynny zawiera układ biologiczny wybrany z grupy obejmującej komórki, kompozycje wewnątrzkomórkowe, bakterie, wirusy, składniki wirusa i cząstki wirusopodobne. Korzystny jest sposób, w którym środek czynny zawiera polisacharyd lub oligosacharyd Hib (Haemophilus influenzae typu b). Korzystny jest sposób, w którym środek czynny zawiera polisacharyd lub oligosacharyd Neisseria meningitidis C. Wynalazek dotyczy także cieczy o wysokiej lepkości, którą można otrzymać sposobem zdefiniowanym powyżej, przy czym ta ciecz zawiera środek czynny, przy czym zachowana jest antygenowość lub aktywność środka czynnego, przy czym zawiera poliol tworzący produkt szklisty, wybrany z grupy obejmującej glukozę, maltulozę, izomaltulozę, laktulozę, sacharozę, maltozę, laktozę, sorbitol, izomaltozę, maltitol, laktitol, palatynit, trehalozę, rafinozę, stachiozę, melezytozę i dekstran, a środek czynny zawiera IPV (inaktywowany wirus polio). Korzystna jest ciecz, w której poliol tworzący produkt szklisty stanowi sacharoza. Korzystna jest ciecz, w której środek czynny zawiera cząsteczkę wybraną z grupy obejmującej białko, peptyd, aminokwas, polinukleotyd, oligonukleotyd, polisacharyd, oligosacharyd, koniugat polisacharyd-białko, koniugat oligosacharyd-białko. Korzystna jest ciecz, w której środek czynny zawiera układ biologiczny wybrany z grupy obejmującej komórki, kompozycje wewnątrzkomórkowe, bakterie, wirusy, składniki wirusa lub cząstki wirusopodobne. Korzystna jest ciecz, w której środek czynny zawiera polisacharyd lub oligosacharyd bakteryjny, korzystnie sprzężony z białkiem nośnikowym. Korzystna jest ciecz, w której środek czynny zawiera polisacharyd lub oligosacharyd Hib (Haemophilus influenzae typu b), korzystnie sprzężony z białkiem nośnikowym. Korzystna jest ciecz, w której środek czynny zawiera polisacharyd lub oligosacharyd Neisseria meningitidis serotypu C, korzystnie sprzężony z białkiem nośnikowym. Korzystna jest ciecz, w której przetrzymuje się ją w pojemniku z wewnętrzną powierzchnią odpychającą rozpuszczalnik. Wynalazek dotyczy również immunogennej kompozycji lub szczepionki, która zawiera ciecz o wysokiej lepkości zdefiniowaną powyżej i farmaceutycznie dopuszczalną zaróbkę. Wynalazek dotyczy ponadto sposobu wytwarzania szczepionki, który obejmuje etap, w którym roztwarza się ciecz o wysokiej lepkości zdefiniowaną powyżej w wodnym roztworze. Korzystny jest sposób, w którym wodny roztwór zawiera antygen błonicy, antygen tężca i antygeny krztuśca (bezkomórkowe lub z pełnych komórek).

4 4 PL B1 Korzystny jest sposób, w którym szczepionka DTP jest częściowo adiuwantowana wodorotlenkiem glinu. Proces jest bardzo łagodny i nie wystawia czynnego środka na zamrażanie ani wrzenie i dlatego posiada przewagę nad znanymi technikami suszenia sublimacyjnego i suszenia spieniającego, które mogą poddawać próbkę jednemu lub obu powyższym stresom. Gdy konserwowany jest nietrwały czynny środek, zastosowanie sposobu według wynalazku prowadzi do większego zachowania aktywności i/lub antygenowości. Można je zmierzyć roztwarzając suszony czynny środek w rozpuszczalniku, korzystnie wodzie lub roztworze wodnym, i mierząc aktywność lub antygenowość zwykłym testem (na przykład testem ELISA) i porównując te wyniki z uzyskanymi dla niesuszonej próbki lub próbek suszonych technikami suszenia sublimacyjnego lub suszenia spieniającego, a następnie roztwarzanych. Szczególnie korzystne jest suszenie IPV (inaktywowanego wirusa polio, immunogenu w szczepionce przeciw polio podawanej drogą iniekcji) sposobem według wynalazku. IPV jest znaną szczepionką w postaci ciekłego preparatu (WO 99/48525). Przy próbie zastosowania stałego preparatu IPV w szczepionce pojawiły się problemy, gdyż zwykłe procedury suszenia sublimacyjnego prowadzą do utraty antygenowości IPV. Sposób według wynalazku prowadzi do znacznie większego zachowania antygenów wirusa polio, częściowo dzięki skróceniu czasu wymaganego przez sposób według wynalazku. Sposób według wynalazku posiada przewagę w porównaniu ze zwykłym suszeniem sublimacyjnym, gdyż cykl produkcji jest krótszy i wymaga mniejszego chłodzenia, co czyni go bardziej wydajnym energetycznie. Ponieważ proces suszenia jest często etapem ograniczającym szybkość procesu, zastosowanie sposobu według wynalazku prowadzi do znacznie większej wydajności produkcji przy mniejszych kosztach. Sposób według wynalazku stosuje się do konserwacji czynnego środka i obejmuje on etapy: - wytwarzania konserwowanej próbki drogą przeprowadzania w stan zawiesiny lub rozpuszczania czynnego środka w roztworze środka stabilizującego; - poddawania konserwowanej próbki takim warunkom temperatury i ciśnienia, że z konserwowanej próbki usuwa się rozpuszczalnik przez odparowanie, bez zamrażania i powstawania pęcherzyków z utworzeniem piany, tworząc lepką ciecz; i ewentualnie: - usuwania rozpuszczalnika do momentu, gdy konserwowana próbka wyschnie, tworząc ciecz o wysokiej lepkości. Sposób konserwowania czynnego środka wytwarza postać czynnego środka, która może przetrzymać długie przechowywanie, w trakcie którego zachowuje się aktywność i/lub antygenowość i/lub immunogenność czynnego środka. Korzystnie czynny środek zachowuje co najmniej 40, 50, 60, 70, korzystnie 80, 90, 95% oryginalnej aktywności, antygenowości i/lub immunogenności w okresie wynoszącym co najmniej 3, 6, 9, 12, 24 miesiące przechowywania w temperaturze 4 C. Antygenowość i immunogenność można mierzyć zwykłymi testami opisanymi niżej. Sposób jest szczególnie użyteczny do wydłużenia okresu trwałości niestabilnych produktów, które przechowywane w roztworze lub eksponowane na zamrażanie lub powstawanie pęcherzyków z utworzeniem piany szybko tracą aktywność. Niestabilny produkt jest podatny na utratę aktywności i/lub utratę antygenowości i/lub utratę immunogenności po przechowywaniu w roztworze i/lub zamrażaniu i/lub poddaniu działaniu stresów, takich jak towarzyszące powstawaniu pęcherzyków w trakcie tworzenia piany. Szczególnie użyteczny jest w przypadkach, gdy zaletą jest zastosowanie niższych stężeń (np. 3% - 15% wag./obj.) poliolu tworzącego produkt szklisty i korzystne jest zastosowanie krótszego procesu suszenia (krótszego od 4, 6, 8, 10 lub 12 godzin). Lepką ciecz definiuje się jako produkt pierwotnej fazy usuwania rozpuszczalnika, po zakończeniu której z próbki usunięta została większość rozpuszczalnika. Ten punkt można ustalić, ponieważ szybkość parowania spada, tak że temperatura próbki wraca do temperatury otoczenia, gdyż znika endotermiczny efekt parowania. Ciecz o wysokiej lepkości wytwarza się w efekcie wystawienia lepkiej cieczy, powstałej po zakończeniu pierwotnej fazy suszenia, na obniżone ciśnienie przed dodatkowy czas po zakończeniu pierwotnej fazy suszenia. Ciecz o wysokiej lepkości ma zawartość rozpuszczalnika co najwyżej 15, 12, 10, 8, 5, 4, 3, 2 lub 1% (wag./wag.), korzystnie określoną w kulometrycznym wilgotnościomierzu Karla Fischera (Eur. J. Pharm. Biopharm. (2000) 50; ). Korzystne zakresy zawartości rozpuszczalni-

5 PL B1 5 ka wynoszą 1-3%, 3-5%, 5-10% lub 10-15% (wag./wag.). Ciecz o wysokiej lepkości ma wystarczająco niską zawartość rozpuszczalnika, tak że czynny środek jest zakonserwowany w trwałym stanie przez co najmniej 3, 6, 9, 12 lub 24 miesiące w temperaturze 4 C, umożliwiając czynnemu środkowi zachowanie co najmniej 40, 50, 60, korzystnie 70, 80, 90 lub 95% aktywności i/lub antygenowości i/lub immunogenności w tym okresie. Korzystnie ciecz o wysokiej lepkości ma wygląd ciała stałego, ale stanowi gumę lub szkło, korzystnie szkło, i ma zdolność bardzo wolnego płynięcia w okresie 2, 4 lub 6 dni, korzystniej 1,2,3 lub 4 tygodni, korzystniej 2, 4, 6, 8, 10 lub 12 miesięcy. Bardzo wolne płynięcie można mierzyć przez odwrócenie zbiornika zawierającego ciecz o wysokiej lepkości i pozostawienie w temperaturze pokojowej do zaobserwowania płynięcia cieczy o bardzo wysokiej lepkości. W korzystnej postaci będzie wydawało się, że ciecz o wysokiej lepkości nie płynie po 2, 4 lub 6 dniach, korzystnie 1, 2, 3 lub 4 tygodniach, korzystniej 2, 4, 6, 8, 10 lub 12 miesiącach w odwróconym położeniu. Korzystnie ciecz o wysokiej lepkości jest klarowna, przezroczysta. Wytwarzanie konserwowanej próbki Do zastosowania w pierwszym etapie wynalazku odpowiedni jest każdy środek stabilizujący. Odpowiednie substancje obejmują, lecz nie wyłącznie, wszystkie poliole, także poliole będące węglowodanami i nie będące węglowodanami. Korzystnie stabilizujący poliol umożliwia przechowywanie środka czynnego bez zasadniczej utraty aktywności drogą denaturacji, agregacji ani w inny sposób. Szczególnie odpowiednie substancje obejmują cukry, alkohole cukrów i pochodne węglowodanów. Korzystnie poliol tworzący produkt szklisty stanowi węglowodan lub jego pochodne, obejmujące glukozę, maltulozę, izomaltulozę, laktulozę, sacharozę, maltozę, laktozę, izomaltozę, maltitol, laktitol, palatynit, trehalozę, rafinozę, stachiozę, melezytozę i dekstran, najkorzystniej trehalozę, sacharozę, sorbitol, rafinozę, mannit, laktozę, laktitol i palatynit, najkorzystniej sacharozę, sorbitol, laktozę i trehalozę. Bakteryjne polisacharydy są szczególnie korzystne do zastosowania jako środek stabilizujący w immunogennej kompozycji, gdyż mogą odgrywać podwójną rolę środka stabilizującego i immunogenu. Węglowodany obejmują, lecz nie wyłącznie, monosacharydy, disacharydy, trisacharydy, oligosacharydy i ich odpowiednie alkohole cukrowe, związki polihydroksylowe takie jak pochodne węglowodanów i chemicznie modyfikowane węglowodany, skrobia hydroksyetylowa i kopolimery cukrów. Odpowiednie do użycia są zarówno naturalne, jak i syntetyczne węglowodany. Syntetyczne węglowodany obejmują, lecz nie wyłącznie, węglowodany mające wiązanie glikozydowe zastąpione wiązaniem tiolowym lub węglowym. Mogą być użyte zarówno postacie D, jak i L węglowodanów. Węglowodan może być nieredukujący lub redukujący. Gdy stosuje się węglowodan redukujący, korzystne jest dodanie inhibitorów reakcji Maillarda. Redukujące węglowodany odpowiednie do zastosowania według wynalazku są znane i obejmują, lecz nie wyłącznie, glukozę, maltozę, laktozę, fruktozę, galaktozę, mannozę, maltulozę i laktulozę. Nieredukujące węglowodany obejmują, lecz nie wyłącznie, nieredukujące glikozydy pochodzące od związków polihydroksylowych wybranych spośród alkoholi cukrowych i innych prostołańcuchowych polioli. Inne użyteczne węglowodany obejmują rafinozę, stachiozę, melezytozę, dekstran, sacharozę, cellibiozę, mannobiozę i alkohole cukrowe. Glikozydami pochodzącymi od alkoholi cukrowych są korzystnie monoglikozydy, w szczególności związki otrzymane przez redukcję disacharydów takich jak laktoza, maltoza, laktuloza i maltuloza. Szczególnie korzystnymi węglowodanami są trehaloza, sacharoza, sorbitol, maltitol, laktitol, palatynit i glukopiranozylo-1 >6-mannit. Aminokwasy mogą pełnić funkcję środków stabilizujących i można stosować osobno a korzystnie w połączeniu z poliolem. Korzystne aminokwasy obejmują glicynę, alaninę, argininę, lizynę i glutaminę, jakkolwiek funkcję środka stabilizującego może pełnić każdy aminokwas lub połączenie aminokwasów, peptydu, hydrolizowanego białka lub białka takiego jak albumina surowicy. Stężenie środka stabilizującego stosowanego w procesie według wynalazku może wynosić 1%-50% wag./obj., korzystnie 1-5%, 5-10%, 5-10%, 15-20%, 20-25% lub 25-50%, najkorzystniej co najwyżej 15% lub 10% (wag./obj.). Wymagane ilości środka stabilizującego są proporcjonalne do ilości soli. Dlatego chociaż korzystne są stężenia środka stabilizującego 2%-10%, do suszenia próbek z dużą zawartością soli (powyżej 100 mm, 200 mm, 300 mm, 400 mm lub 500 mm) mogą być wymagane wyższe stężenia: 10%-25%. Korzystnie konserwowana próbka będzie zawierać składnik mogący hamować tworzenie kryształów w cieczy o wysokiej lepkości według wynalazku. Sole i inne cząsteczki obejmujące aminokwasy i czerwień fenolową hamują tworzenie kryształów.

6 6 PL B1 Pojemnik stosowane w niniejszym wynalazku Różne mieszaniny i pojemniki o różnych kształtach i wielkości mogą być przetwarzane jednocześnie. Idealnie wielkość stosowanego pojemnika jest wystarczająca do pomieszczenia wyjściowej mieszaniny i pomieszczenia objętości utworzonego z niej ciała stałego. Typowo jest to determinowane przez masę substancji tworzącej szkło, pole powierzchni pojemnika i warunki tworzenia szkła. Masa substancji tworzącej szkło musi być wystarczająca do dostarczenia lepkiego syropu, co przekłada się praktycznie na minimalną masę na jednostkę pola powierzchni pojemnika. Ten stosunek jest różny dla różnych mieszanin i stosowanych pojemników, ale fachowiec z łatwością określi go empirycznie wykonując procedurę podaną w opisie. Można stosować dowolne takie fiolki, obejmujące formowane fiolki Wheaton i fiolki będące odciętymi rurkami. W sposobach według wynalazku korzystnie stosuje się pojemniki odpychające rozpuszczalnik, korzystnie posiadające wewnętrzną powierzchnię hydrofobową. Osiąga się to przez powlekanie wewnętrznej powierzchni kompozycją hydrofobową, na przykład przez silikonizację. Silikonizację uzyskuje się sposobami, które są dobrze znane fachowcom. W jednym sposobie pojemnik silikonizuje się przez zraszanie wnętrza pojemnika emulsją silikonu, a następnie włożenie do pieca i poddanie działaniu wysokiej temperatury, typowo 350 C. Alternatywnie hydrofobową powierzchnię wewnętrzną uzyskuje się przez wykonanie pojemnika z kompozycji hydrofobowej. Hydrofobowa powierzchnia wewnętrzna pojemnika sprawia, że suszony produkt procesu jest łatwiejszy do roztwarzania, gdyż na bocznych ściankach pojemnika zbiera się mniej wody. Chociaż w wynalazku można stosować pojedyncze postacie, może występować więcej niż jedna substancja tworząca szklistą matrycę, więcej niż jeden dodatek i więcej niż jedna substancja. Fachowiec z łatwością określi skuteczne ilości tych składników. Roztwór Rozpuszczalnik, w którym mieszany jest środek stabilizujący z czynnym środkiem, może być wodny, organiczny lub stanowić mieszaninę obydwu. Można stosować wystarczający wodny rozpuszczalnik dla rozpuszczenia substancji tworzącej szklistą matrycę i wystarczający organiczny rozpuszczalnik dla rozpuszczenia hydrofobowej substancji, umożliwiając tworzenie szkła zawierającego substancję(e) hydrofobową(e). Wybór rozpuszczalnika będzie uzależniony od charakteru substancji wybranej do tworzenia szklistej matrycy oraz charakteru dodawanych wszelkich dodatków i/lub substancji. Rozpuszczalnik powinien mieć taki charakter i objętość by wywołać wystarczające rozpuszczenie substancji tworzącej szklistą matrycę, jak również dowolnego dodatku i/lub substancji. Jeżeli substancja jest hydrofilowa, ciecz będzie korzystnie wodna, aby uniknąć potencjalnej utraty aktywności spowodowanej szkodliwym oddziaływaniem z rozpuszczalnikiem. Korzystnie wodny rozpuszczalnik obejmuje dowolny znany odpowiedni wodny rozpuszczalnik, obejmujący, lecz nie wyłącznie, wodę i roztwory biologicznych buforów. Korzystnie wodny rozpuszczalnik występuje w ilości 5-98% obj., korzystniej 80-98% obj., najkorzystniej 85-98% obj. Objętość rozpuszczalnika może być różna i będzie zależała od substancji tworzącej szklistą matrycę i dodawanej substancji oraz wszystkich dodatków. Minimalną wymaganą objętością jest ilość niezbędna do rozpuszczenia różnych składników. Można jednak stosować także jednorodnie dyspergowane zawiesiny substancji. Fachowcy z łatwością określą odpowiednie ilości składników w konkretnych postaciach w świetle przykładów dostarczonych w opisie. W konserwowanej próbce można umieszczać różne dodatki. Korzystnym dodatkiem jest inhibitor reakcji Maillarda. Korzystnie jeżeli substancja i/lub materiał tworzący szklistą matrycę zawiera grupy karbonylowe i aminowe, iminowe lub guanidynowe, kompozycje dodatkowo zawierają co najmniej jeden fizjologicznie dopuszczalny inhibitor reakcji Maillarda w ilości skutecznej zasadniczo do zapobiegnięcia kondensacji grup aminowych i reaktywnych grup karbonylowych w kompozycji. Inhibitor reakcji Maillarda może stanowić dowolny znany inhibitor. Inhibitor występuje w ilości wystarczającej do zapobieżenia lub zasadniczo zapobieżenia kondensacji grup aminowych i reaktywnych grup karbonylowych. Typowo grupy aminowe występują w substancji a grupy karbonylowe występują w materiale tworzącym szklistą matrycę lub odwrotnie. Jednakże aminokwasy i grupy karbonylowe mogą występować wewnątrz cząsteczek którejkolwiek substancji lub węglowodanu. Wiadomo, że różne grupy związków wywierają hamujące działanie na reakcję Maillarda i dlatego są użyteczne w kompozycjach opisanych w opisie. Związki te są ogólnie albo konkurencyjnymi albo niekonkurencyjnymi inhibitorami reakcji Maillarda. Konkurencyjne inhibitory obejmują, lecz nie wyłącznie, reszty aminokwasowe (zarówno D, jak i L), połączenia reszt aminokwasowych i peptydów.

7 PL B1 7 Szczególnie korzystne są lizyna, arginina, histydyna i tryptofan. Najbardziej skuteczne są lizyna i arginina. Znanych jest wiele niekonkurencyjnych inhibitorów. Obejmują one, lecz nie wyłącznie, aminoguanidynę i pochodne i amfoterycynę B. W opisie patentowym EP-A opisano także odpowiednie inhibitory Maillarda, które obejmują pochodne 4-hydroksy-5,8-dioksochinoliny. Korzystne jest dodanie kolorowego barwnika do konserwowanej próbki dla łatwiejszego uwidocznienia suszonego produktu sposobu według wynalazku. Jest to szczególnie ważne podczas rozpuszczania, aby zagwarantować, że ciecz o wysokiej lepkości jest całkowicie roztworzona przed użyciem. Korzystnie kolorowy barwnik zachowuje kolor w obojętnym ph i nadaje się do iniekcji pacjentowi. Najkorzystniej kolorowym barwnikiem jest czerwień fenolowa. Sposób według wynalazku polega na tym, że konserwowaną próbkę poddaje się działaniu takich warunków ciśnienia i temperatury, że dochodzi do usunięcia rozpuszczalnika z konserwowanej próbki przez odparowanie bez zamrażania próbki i powstawania pęcherzyków z utworzeniem piany. Temperatura w konserwowanej próbce przez pewien czas będzie różna od temperatury na zewnątrz próbki ze względu na endotermiczny charakter procesu parowania. Odniesienia do temperatury dotyczą warunków zewnętrznych wobec konserwowanej próbki, np. gdy stosowana jest duża przemysłowa suszarka sublimacyjna, do temperatury na półce. Ta zazwyczaj odpowiada ustawionej temperaturze suszarki sublimacyjnej. Ewentualnie w sposobie według wynalazku występuje wstępny etap odgazowania konserwowanej próbki. Ciśnienie jest obniżane do wartości co najwyżej 20 kpa (200 mbarów), korzystnie 20-3,5 kpa ( mbarów), na okres trwający co najmniej 5 minut przed dalszym obniżeniem ciśnienia. W korzystnej postaci wynalazku suszenie wyparne uzyskuje się przez obniżenie ciśnienia przy jednoczesnej kontroli warunków temperatury. Ciśnienie modyfikuje się do wartości lub co najwyżej 3; 2,5; 2 korzystnie 1,5; 1,2; najkorzystniej 1,0; 0,8; 0,7; 0,6; 0,5; 0,4; 0,3; 0,2 lub 0,1 kpa (30, 25, 20 korzystnie 15, 12, najkorzystniej 10, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 lub 1 mbara), jednocześnie utrzymując ustawienie temperatury na poziomie powyżej 0 C, korzystnie 5 C-37 C, 4 C-10 C, 10 C-15 C, 15 C-20 C, 20 C-25 C, 25 C-30 C, 30 C-37 C lub 37 C-45 C. Te warunki są utrzymywane przez co najmniej 1, 2, 3, 4, 5, 8, 10, 12, 16 lub 24 godziny, korzystnie przez 2-4 godziny, 4-6 godzin, 6-8 godzin, 8-12 godzin lub godzin. W szczególnie korzystnej postaci ciśnienie utrzymuje się powyżej wartości 0,2 kpa (2 mbarów), podczas gdy temperatura ustawiona jest na 15 C, aby uniknąć zamrożenia próbki. W korzystnej postaci temperaturę utrzymuje się na poziomie 15 C a ciśnienie jest ustawione na 0,5-1 kpa (5-10 mbarów), korzystniej 0,6-0,9 kpa (6-9 mbarów), najkorzystniej około 0,8 kpa (8 mbarów). Gdy stosuje się wyższą temperaturę, można stosować nieco niższe ciśnienie bez zamrażania próbki, a gdy stosuje się niższą temperaturę, aby zapobiec zamrożeniu ciśnienie należy utrzymywać na wyższym poziomie. Korzystnie warunki te utrzymuje się przez okres czasu wystarczający do zmniejszenia szybkości parowania do tego, stopnia, aż temperatura próbki jest w przybliżeniu taka sama, jak temperatura na zewnątrz próbki. Korzystnie konserwowana próbka nie powinna zamarzać ani nie powinny w niej powstawać pęcherzyki/nie powinna wrzeć z utworzeniem piany; usuwa się z niej rozpuszczalnik i powstaje lepka ciecz lub ciecz o wysokiej lepkości. Następny etap sposobu według wynalazku obejmuje usuwanie rozpuszczalnika do momentu, gdy konserwowana próbka wyschnie, tworząc ciecz o wysokiej lepkości. Podczas wtórnej fazy suszenia próbka nie zamarza ani nie powstają w niej pęcherzyki z utworzeniem piany. Ciecz o wysokiej lepkości jest definiowana jako materiał o zawartości rozpuszczalnika co najwyżej 15, 12, 10, korzystniej 8, 5, 4, 3, 2 lub 1% (wag./wag.), korzystnie zmierzonej przy użyciu kulometrycznego wilgotnościomierza Karla Fischera. Ciecz o wysokiej lepkości ma wystarczająco niską zawartość rozpuszczalnika, tak że czynny środek jest zakonserwowany w trwałym stanie przez co najmniej 3, 6, 9, 12 lub 24 miesiące w temperaturze 4 C, co umożliwia czynnemu środkowi zachowanie co najmniej 40, 50, 60, korzystnie 70, 80, 90 lub 95% aktywności i/lub antygenowości i/lub immunogenności w tym okresie. Korzystnie ciecz o wysokiej lepkości ma wygląd ciała stałego i/lub jest klarowna, ale jest szkłem i ma zdolność bardzo wolnego płynięcia w okresie 2, 4 lub 6 dni, korzystnie 2, 3 lub 4 tygodni, korzystniej 2, 4, 6, 8, 10 lub 12 miesięcy. Bardzo wolne płynięcie można mierzyć przez odwrócenie zbiornika zawierającego ciecz o wysokiej lepkości i pozostawienie w temperaturze pokojowej do zaobserwowania płynięcia cieczy o wysokiej lepkości. W korzystnej postaci będzie wydawało się, że ciecz o wysokiej lepkości nie płynie po 2, 4 lub 6 dniach, korzystnie 2, 3 lub 4 tygodniach, korzystniej 2, 4, 6, 8, 10 lub 12 miesiącach w odwróconym położeniu.

8 8 PL B1 W jednej postaci wynalazku osiąga się to utrzymując warunki ciśnienia i temperatury na poziomie stosowanym w pierwszym stadium suszenia wyparnego. Na przykład ciśnienie utrzymywane jest na poziomie lub co najwyżej 3; 2,5; 2 korzystnie 1,5; 1,2; najkorzystniej 1,0; 0,8; 0,7; 0,6; 0,5; 0,4; 0,3; 0,2 lub 0,1 kpa (30, 25, 20 korzystnie 15, 12, najkorzystniej 10, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 lub 1 mbara), przy jednoczesnym utrzymaniu ustawienia temperatury na poziomie powyżej 0 C, korzystnie 5 C-37 C, 5 C-10 C, 10 C-15 C, 15 C-20 C, 20 C-25 C, 25 C-30 C lub 30 C-37 C. W przypadku ustawienia temperatury na 15 C, ciśnienie 0,5-1 kpa (5-10 mbarów), korzystnie 0,6-0,9 kpa (6-9 mbarów), najkorzystniej około 0,8 kpa (8 mbarów) utrzymuje się przez 4-24 godziny, korzystnie 1-4, 4-8, 8-12 lub godzin. Te warunki temperatury i ciśnienia utrzymuje się przez 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 18 godzin lub dłużej w celu uzyskania cieczy o wysokiej lepkości przy zawartości rozpuszczalnika wynoszącej co najwyżej 15, 12, korzystnie 10, 8, 5, 4, 3, 2 lub 1% (wag./wag.), korzystnie mierzonej wilgotnościomierzem kulometrycznym Karla Fischera. Inna postać wynalazku obejmuje wzrost ustawionej temperatury w trakcie usuwania rozpuszczalnika do wyższej temperatury niż utrzymywana na wcześniejszym etapie procesu. To umożliwia szybsze usuwanie rozpuszczalnika z próbki, tak że sposób według wynalazku można ukończyć w krótszym czasie. Na przykład ustawienie temperatury zwiększa się do poziomu powyżej 0 C, korzystniej powyżej 20 C, korzystnie 5 C-37 C, 5 C-10 C, 10 C-20 C lub 20 C-30 C, korzystniej 30 C-40 C, korzystniej 40 C-50 C, najkorzystniej 50 C-60 C, jednocześnie utrzymując ciśnienie na poziomie lub co najwyżej 3; 2,5; 2 korzystnie 1,5; 1,2; najkorzystniej 1,0; 0,8; 0,7; 0,6; 0,5; 0,4; 0,3; 0,2 lub 0,1 kpa (30, 25, 20 korzystnie 15, 12, najkorzystniej 10, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 lub 1 mbara). Te warunki temperatury i ciśnienia utrzymuje się przez 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 18 godzin lub dłużej w celu uzyskania ciała stałego o zawartości rozpuszczalnika co najwyżej 15, 12, 10, 8, 5, 4, 3, 2 lub 1% (wag./wag.), korzystnie mierzoną wilgotnościomierzem kulometrycznym Karla Fischera. Ta postać wymaga, aby czynny środek był stabilny termicznie w stosowanej temperaturze, aby sposób mógł być realizowany z powodzeniem. Korzystna postać wynalazku obejmuje obniżenie ustawienia ciśnienia podczas usuwania rozpuszczalnika (etap c) do wartości ciśnienia niższej, niż stosowana na wcześniejszym etapie procesu (etap b). To umożliwia szybsze usuwanie rozpuszczalnika z próbki, tak że sposób według wynalazku może być ukończony w krótszym czasie. To także umożliwia usunięcie większej części rozpuszczalnika. Na przykład ciśnienie ustawia się na poziomie co najwyżej 0,7; 0,6 korzystnie 0,5; 0,4; 0,3, korzystniej 0,2; 0,15; 0,1; najkorzystniej 0,08, 0,05, 0,02 0,01, 0,005, 0,002, 0,001 lub 0,0005 kpa (7, 6, korzystnie 5, 4, 3, korzystniej 2, 1,5, 1, najkorzystniej 0,8, 0,5, 0,2 0,1, 0,05, 0,02, 0,01 lub 0,005 mbara), jednocześnie utrzymując temperaturę na poziomie co najmniej 0 C, korzystnie 10 C-20 C, 20 C-30 C, 30 C-35 C lub powyżej 40 C. Te warunki temperatury i ciśnienia utrzymuje się przez co najmniej 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 18 godzin lub dłużej dla uzyskania ciała stałego posiadającego zawartość rozpuszczalnika co najwyżej 15, 12 korzystnie 10, 8, 5, 4, 3, 2 lub 1% (wag./wag.), korzystnie określoną wilgotnościomierzem kulometrycznym Karla Fischera (Eur. J. Pharm. Biopharm. (2000) 50; ). Korzystnie etapy b) i c) (lub sam b)) powinno się ukończyć w czasie co najwyżej 18 godzin, korzystniej 16, 12, 10, najkorzystniej 8, 6, 5 lub 4 godzin. Środek czynny Sposób według wynalazku jest użyteczny do konserwacji każdego czynnego środka, ale jest szczególnie użyteczny w przypadku nietrwałych czynnych środków, które tracą aktywność i/lub antygenowość i/lub immunogenność w trakcie innych procesów konserwacji. Czynny środek konserwowany przy użyciu sposobu według wynalazku może zawierać układ biologiczny wybrany z grupy obejmującej komórki, kompozycje wewnątrzkomórkowe, bakterie, preparaty pęcherzyków zewnętrznej błony i wirusy, składniki wirusowe lub cząstki wirusopodobne. Może także zawierać cząsteczki, na przykład białka, peptydy, aminokwasy, kwasy polinukleinowe, oligonukleotydy, polisacharydy, oligosacharydy, koniugaty polisacharyd - białko, koniugaty oligosacharyd - białko. Przykłady czynnych związków, które można konserwować sposobem według wynalazku, obejmują wszystkie substancje biologicznie czynne, takie jak substancje skuteczne farmaceutycznie obejmujące, lecz nie wyłącznie, leki przeciwzapalne, leki przeciwbólowe, leki uspokajające, leki przeciwlękowe, rozkurczowe, przeciwdepresyjne, przeciwpsychotyczne, uspokajające, leki przeciwlękowe, antagoniści narkotyków, środki przeciwparkinsonowskie, agoniści cholinergiczni, leki chemioterapeutyczne, środki immunosupresyjne, środki przeciwwirusowe, środki przeciwdrobnoustrojowe, środki hamujące łaknienie, środki antycholinergiczne, środki przeciwwymiotne, środki przeciwhistaminowe, środki przeciwmigrenowe, środki rozkurczające naczynia wieńcowe, mózgowe lub obwodowe, środki

9 PL B1 9 hormonalne, środki antykoncepcyjne, środki przeciwzakrzepowe, środki moczopędne, środki hipotensyjne, leki sercowo-naczyniowe, opioidy i tym podobne. Odpowiednie środki obejmują także środki lecznicze i profilaktyczne. Należą do nich, lecz nie wyłącznie, wszystkie terapeutycznie skuteczne biologiczne środki modyfikujące. Takie substancje obejmują, lecz nie wyłącznie, kompozycje wewnątrzkomórkowe, komórki, bakterie, preparaty pęcherzyków zewnętrznej błony, wirusy i cząsteczki obejmujące, lecz nie wyłącznie, lipidy, cząsteczki organiczne, białka i peptydy (syntetyczne i naturalne), mimetyki peptydów, hormony (peptydowe, steroidowe i kortykosteroidy), polimery aminokwasów D i L, oligosacharydy, polisacharydy, nukleotydy, oligonukleotydy i kwasy nukleinowe obejmujące DNA i RNA, hybrydy białko kwas nukleinowy, małe cząsteczki i ich fizjologicznie czynne analogi. Ponadto substancje modyfikujące mogą być pochodzenia naturalnego lub być wytwarzane technikami rekombinacji lub syntetycznymi i obejmują analogi, agonistów i homologi. Stosowane w opisie określenie białko" dotyczy także peptydów i polipeptydów. Takie białka obejmują, lecz nie wyłącznie, enzymy, biofarmaceutyki, hormony wzrostu, czynniki wzrostu, insulinę, przeciwciała zarówno monoklonalne, jak i poliklonalne oraz ich fragmenty, interleukiny i cytokiny. Wynalazek obejmuje także środki lecznicze oparte na kwasach nukleinowych wytwarzane sposobami opisanymi w opisie. Stosowane w opisie określenie kwasy nukleinowe" obejmuje terapeutycznie skuteczne znane kwasy nukleinowe obejmujące, lecz nie wyłącznie, DNA, RNA i ich fizjologicznie czynne analogi. Nukleotydy mogą kodować geny lub mogą stanowić dowolny wektor znany w dziedzinie rekombinacji DNA obejmujący, lecz nie wyłącznie, plazmidy, retrowirusy i wirusy związane z adenowirusami. Wynalazek obejmuje ponadto konserwację substancji, które są profilaktycznie czynne i ich nośników. Korzystne substancje obejmują immunogeny takie jak szczepionki. Szczepionki mogą być przeznaczone do podawania doustnego lub do iniekcji po roztworzeniu. Odpowiednie szczepionki zawierają, lecz nie wyłącznie, żywe i atenuowane wirusy, wektory nukleotydowe kodujące antygeny, żywe i atenuowane bakterie, antygeny białkowe, polisacharydowe, oligosacharydowe i/lub lipopolisacharydowe, antygeny plus adiuwanty i antygeny i/lub hapteny sprzężone z nośnikami. Szczególnie korzystne są szczepionki skuteczne przeciw błonicy, tężcowi, krztuścowi, bakterii jadu kiełbasianego, cholerze, dendze, wirusowemu zapaleniu wątroby typu A, B, C i E, Haemophilus influenzae b, Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, paciorkowcowi z grupy B, paciorkowcowi z grupy A, wirusowi opryszczki, Helicobacter pylori, grypie, japońskiemu zapaleniu mózgu, meningokokom A, B, C, Y, W, odrze, śwince, wirusowi brodawczaka, pneumokokom, wirusowi polio, inaktywowanemu wirusowi polio (IPV - korzystnie obejmujący typy 1, 2 i 3, co jest standardem w dziedzinie szczepionek, najkorzystniej szczepionka przeciw polio Salk), różyczce, rotawirusowi, wirusowi oddechowemu, Shigella, gruźlicy, wirusowi ospy wietrznej, żółtej gorączce i ich połączenia. Antygenowy składnik szczepionek może także być wytwarzany technikami biologii molekularnej dla wytworzenia rekombinowanych peptydów lub białek fuzyjnych zawierających jedną lub większą liczbę części białka pochodzącego od patogenu. Przykładowo wykazano, że białka fuzyjne zawierające antygen i podjednostkę B toksyny cholery indukują odpowiedź odpornościową na antygen. Sanches i inni (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: Szczepionki są szczególnie odpowiednie do umieszczania w kompozycjach jednodawkowych. W warunkach otoczenia zachowują trwałość nieskończenie długo i można je rozpuszczać w jałowym rozpuszczalniku bezpośrednio przed szczepieniem. W korzystnej postaci immunogenna kompozycja może zawierać polisacharydy otoczki pochodzące z jednej lub większej liczby grup serologicznych A, C, W-135 i Y Neisseria meningitidis. Dalsza korzystna postać może obejmować polisacharydy otoczki pochodzące z Streptococcus pneumoniae. Antygeny polisacharydu otoczki pneumokoków są korzystnie wybrane spośród serotypów 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F i 33F (najkorzystniej z serotypów 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F i 23 F). Dalsza korzystna postać może zawierać polisacharydy PRP otoczki Haemophilus influenzae typu b. Dalsza korzystna postać może zawierać Typ 5, Typ 8, 336 lub PNAG polisacharydów otoczki Staphycoloccus aureus. Dalsza korzystna postać może obejmować Typ I, Typ II, Typ III lub PIA polisacharydów otoczki Staphylococcus epidermidis. Dalsza korzystna postać może obejmować Typ la, Typ Ic, Typ II lub Typ III polisacharydów otoczki paciorkowców z Grupy B. Dalsza korzystna postać może obejmować polisacharydy otoczki paciorkowców z Grupy A, korzystnie dodatkowo zawierające co najmniej jedno białko M a korzystniej wiele typów białka M.

10 10 PL B1 Bakteryjne polisacharydy stosowane w niniejszym wynalazku są pełnej długości oczyszczonymi naturalnymi polisacharydami. W alternatywnej postaci wynalazku wielkość polisacharydów wynosi 2-20 powtarzalnych jednostek, korzystnie 2-5 powtarzalnych jednostek, 5-10 powtarzalnych jednostek, powtarzalnych jednostek lub powtarzalnych jednostek, tak że polisacharydy są mniejsze dla ułatwienia posługiwania się nimi. W korzystnej postaci stosuje się oligosacharydy. Oligosacharydy typowo zawierają 2-20 powtarzalnych jednostek. Polisacharyd i oligosacharydy mogą być niesprzężone lub sprzężone, jak opisano niżej. Przy użyciu sposobu konserwacji według wynalazku można konserwować połączenia dwóch lub większej liczby powyższych czynnych środków. Można konserwować część lub całą szczepionkę sposobem konserwacji według wynalazku. Korzystny czynny środek konserwowany sposobem według wynalazku zawiera IPV (inaktywowaną mieszaninę szczepów wirusa polio). IPV, w szczególności składnik typu 3, jest wrażliwy na znane techniki suszenia sublimacyjnego i suszenia spieniającego, co pokazuje utrata antygenów po suszeniu sublimacyjnym lub suszeniu spieniającym a następnie roztworzeniu. IPV definiuje się jako inaktywowany wirus polio (korzystnie zawierający typy 1, 2 i 3, co jest standardem w szczepionkach, najkorzystniej szczepionkę Salk przeciwko polio). Dawka szczepionki IPV zawiera 20-80, korzystnie 40 lub 80 jednostek D-antygenu typu 1 (Mahoney), 4-16, korzystnie 8 lub 16 jednostek D-antygenu typu 2 (MEF-1) i 20-64, korzystnie 32 lub 64 jednostek D-antygenu typu 3 (Saukett). Przy suszeniu sposobem według wynalazku korzystnie zachowuje się antygenowość typu 1, 2 lub wszystkich 3 typów 1, 2 i 3 wirusa polio; korzystniej zachowuje się co najmniej 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% lub 98% antygenowości typu 1, typu 2, typu 3, typu 1 i typu 2, typu 1 i typu 3, typu 2 i typu 3 lub typu 1, typu 2 i typu 3, w porównaniu z próbką wzorcową, której nie poddawano procesowi suszenia. Można ją zmierzyć po roztworzeniu cieczy o wysokiej lepkości w roztworze wodnym, dowolnym odpowiednim sposobem, obejmującym test ELISA przy użyciu przeciwciał poliklonalnych i/lub monoklonalnych przeciw wirusowi polio typu 1, 2 i/lub 3. Przy suszeniu sposobem według wynalazku korzystnie zachowuje się immunogenność typu 1, 2 lub wszystkich 3 typów 1, 2 i 3 wirusa polio; korzystniej zachowuje się co najmniej 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% lub 98% immunogenności typu 1, typu 2, typu 3, typu 1 i typu 2, typu 1 i typu 3, typu 2 i typu 3 lub typu 1, typu 2 i typu 3, w porównaniu z próbką wzorcową, której nie poddawano procesowi suszenia. Można ją zmierzyć po roztworzeniu cieczy o wysokiej lepkości w roztworze wodnym, dowolnym odpowiednim sposobem. W korzystnym sposobie ciecz o wysokiej lepkości roztwarza się w wodnym roztworze i szczepi się nią zwierzę, korzystnie szczura. Po upływie odpowiedniego czasu od szczepionych zwierząt pobiera się surowicę i bada się serokonwersję. Korzystnie uzyskuje się względną siłę działania wynoszącą co najmniej 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8 lub 0,9 niesuszonej próbki wzorcowej. Korzystnie IPV łączy się z jednym lub większą liczbą: polisacharydów lub oligosacharydów PRP Hib (Haemophilus influenzae typu b) i/lub polisacharydów lub oligosacharydów meningokokowych A, C, W i/lub Y i/lub polisacharydów lub oligosacharydów pneumokokowych. Najkorzystniej czynne środki zawierają IPV i Hib, IPV i MenC, IPV, Hib i MenC, Hib i MenC, Hib i MenC, IPV i MenA i C, Hib i MenA i C, IPV, Hib i MenA i C, Hib, MenC i Y lub IPV, Hib, MenC i Y. Powyższe wyszczególnione środki czynne mogą także zawierać jeden lub większą liczbę opisanych poniżej pneumokokowych polisacharydów otoczki. W powyższych kompozycjach, tam gdzie stosuje się polisacharydy, można także wykorzystywać oligosacharydy (jak zdefiniowano niżej). Chociaż kompozycje te mogą być adiuwantowane (jak opisano niżej), korzystnie są nie adiuwantowane lub korzystnie nie zawierają soli glinu. Korzystnie polisacharydy lub oligosacharydy są sprzężone z peptydem lub białkiem nośnikowym zawierającym epitopy limfocytu T pomocniczego (jak opisano poniżej). Dodatkowe składniki Korzystne połączenia, suszone sposobem według wynalazku, można łączyć z innymi antygenami w szczepionkę złożoną, która jest desykowana lub jest korzystnie preparatem ciekłym, który można stosować do roztwarzania suszonych składników. Korzystne antygeny łączone z czynnymi środkami wymienionymi w powyższych akapitach, obejmują jeden lub większą liczbę z grupy obejmującej toksoid błoniczy, toksoid tężcowy, całe komórki krztuśca (Pw), acelularny krztusiec (Pa) (jak opisano poniżej), antygen powierzchniowy wirusa zapalenia wątroby typu B, wirus zapalenia wątroby

11 PL B1 11 typu A, polisacharydy Haemophilus influenzae b, polisacharydy Neisseria, białka N. Meningitidis serotypu B, polisacharydy pneumokokowe, białka pneumokokowe i każdy z antygenów wymienionych niżej. Polisacharydy bakteryjne można sprzęgać z białkiem nośnikowym takim jak toksoid tężcowy, fragment C toksoidu tężcowego, toksoid błoniczy, CRM197, pneumolizyna, Białko D (US ), jak opisano niżej. Czynne środki konserwowane sposobem według wynalazku można formułować z polisacharydami otoczki pochodzącymi od jednej lub od większej liczby spośród Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae b, Streptococcus pneumoniae, paciorkowce z grupy A, paciorkowce z grupy B, Staphycoloccus aureus lub Staphylococcus epidermidis. W korzystnej postaci immunogenna kompozycja może zawierać polisacharydy otoczki pochodzące z jednej lub większej liczby grup serologicznych A, C, W-135 i Y Neisseria meningitidis. Dalsza korzystna postać może obejmować polisacharydy otoczki pochodzące z Streptococcus pneumoniae. Antygeny polisacharydu otoczki pneumokoków są korzystnie wybrane z serotypów 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12 F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F i 33F (najkorzystniej z serotypów I, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F i 23 F). Dalsza korzystna postać może zawierać polisacharydy PRP otoczki Haemophilus influenzae typu b. Dalsza korzystna postać może zawierać Typ 5, Typ 8, 336 lub PNAG polisacharydów otoczki Staphycoloccus aureus. Dalsza korzystna postać może obejmować Typ I, Typ II, Typ III lub PIA polisacharydów otoczki Staphylococcus epidermidis. Dalsza korzystna postać może obejmować Typ la, Typ Ic, Typ II lub Typ III polisacharydów otoczki paciorkowców z grupy B. Dalsza korzystna postać może obejmować polisacharydy otoczki paciorkowców z grupy A, korzystnie dodatkowo zawierające co najmniej jedno białko M a korzystniej wiele typów białka M. W jednej postaci wynalazku bakteryjne polisacharydy stanowią pełnej długości oczyszczone naturalne polisacharydy. W alternatywnej postaci wynalazku wielkość polisacharydów wynosi 2-20 powtarzalnych jednostek, korzystnie 2-5 powtarzalnych jednostek, 5-10 powtarzalnych jednostek, powtarzalnych jednostek lub powtarzalnych jednostek, tak że polisacharydy są mniejsze dla ułatwienia posługiwania się nimi. W korzystnej postaci stosuje się oligosacharydy. Oligosacharydy typowo zawierają 2-20 powtarzalnych jednostek. Takie polisacharydy otoczki mogą być nie sprzężone lub sprzężone z białkiem nośnikowym takim jak toksoid tężcowy, fragment C toksoidu tężcowego, toksoid błoniczy, CRM197, pneumolizyna, Białko D (US ). Toksyna tężca, toksyna błonicy i pneumolizyna są detoksyfikowane za pomocą mutacji genetycznej i/lub korzystnie traktowania chemicznego. Koniugat polisacharydu można wytwarzać dowolną znaną techniką sprzęgania. Na przykład polisacharyd można połączyć wiązaniem tioeterowym. Ten sposób sprzęgania opiera się na aktywacji polisacharydu tetrafluoroboranem 1-cyjano-4-dimetyloaminopirydyny (CDAP), z utworzeniem estru cyjanianowego. Dlatego aktywowany polisacharyd może być sprzężony bezpośrednio lub przez grupę łącznikową z grupą aminową białka nośnikowego. Korzystnie ester cyjanianowy jest sprzężony z heksanodiaminą i amino pochodna polisacharydu sprzęga się z białkiem nośnikowym przy użyciu chemii heteroligacji obejmującej tworzenie wiązania tioeterowego. Takie koniugaty są opisane w opublikowanym zgłoszeniu PCT WO 93/15760 Uniformed Services University. Koniugaty można także wytwarzać sposobami bezpośredniego aminowania redukcyjnego, opisanymi w US (Jennings) i US (Anderson). Inne sposoby opisano w EP , EP i EP Kolejny sposób polega na tym, że sprzęga się aktywowane bromkiem cyjanu pochodne polisacharydu z hydrazydem kwasu adypinowego (ADH) z białkiem nośnikowym przez kondensację z karbodiimidem (Chu C. i in., Infect. Immunity, ). Korzystnymi antygenami białek pneumokokowych są białka pneumokokowe, które są obecne na zewnętrznej powierzchni pneumokoków (mogą być rozpoznawane przez układ odpornościowy gospodarza w trakcie co najmniej części cyklu życiowego pneumokoka) lub są białkami, które są wydzielane lub uwalniane przez pneumokoki. Najkorzystniej białko stanowi toksyna, adhezyna, 2-składnikowy przekaźnik sygnałów lub lipoproteina Streptococcus pneumoniae lub ich fragmenty. Szczególnie korzystne białka obejmują, lecz nie wyłącznie, pneumolizynę (korzystnie detoksyfikowaną przez traktowanie chemiczne lub mutację) [Mitchell i in., Nucleic Acids Res. 11 lipca 1990; 18(13): 4010 Comparison of pneumolysin genes and proteins from Streptococcus pneumoniae types 1 and 2", Mitchell i in., Biochim Biophys Acta 23 stycznia 1989; 1007(1): Expression of the pneumolysin gene in Escherichia coli: rapid purification and biological properties.", WO 96/05859 (A. Cyanamid), WO 90/06951 (Paton i in.), WO 99/03884 (NAVA)]; PspA i jej odmiany z delecją fragmentu przezbło-

12 12 PL B1 nowego (US Briles i in.); PspC i jej odmiany z delecją fragmentu przezbłonowego (WO 97/ Briles i in.); PsaA i jej odmiany delecją fragmentu przezbłonowego (Berry & Paton, Infect Immun grudzień 1996; 64(12): Sequence heterogeneity of PsaA, a 37-kilodalton putative adhesin essential for virulence of Streptococcus pneumoniae"); białka pneumokoków wiążące cholinę i ich odmiany delecją fragmentu przezbłonowego; CbpA i jej odmiany z delecją fragmentu przezbłonowego (WO 97/41151; WO 99/51266); Dehydrogenaza gliceraldehydo-3-fosforanu (Infect. Immun : 3544); HSP70 (WO 96/40928); PcpA (Sanchez-Beato i in., FEMS Microbiol Lett 1998, 164: ); Białko M-podobne, (EP ) i adhezyna 18627, (EP ). Dodatkowe korzystne antygeny białek pneumokoków ujawniono w WO 98/18931, w szczególności te wybrane w 98/18930 i PCT/US99/ Korzystne białka Neisseria formułowane z immunogenną kompozycją według wynalazku obejmują TbpA (WO93/06861; EP586266; WO92/03467; US ), TbpB (WO93/06861; EP586266), Hsf (WO99/31132), NspA (WO96/29412), Hap (PCT/EP99/027 66), PorA, PorB, OMP85 (występujące także pod nazwą D15) (WO00/23595), PilQ (PCT/EP99/03603), PldA (PCT/EP99/06718), FrpB (WO96/31618 patrz SEQ ID NR: 38), FrpA lub FrpC lub zachowana część wspólna dla obu o długości co najmniej 30, 50, 100, 500, 750 aminokwasów (WO92/01460), LbpA i/lub LbpB (PCT/EP98/05117; Schryvers i in. Med. Microbiol : 1117), FhaB (WO98/02547), HasR (PCT/EP99/05989), Iiρο02 (PCT/EP99/08315), MltA (WO99/57280) i ctra (PCT/EP00/00135). Białka Neisseria są korzystnie dodawane jako oczyszczone białka lub jako część preparatu zewnętrznej błony. Szczepionkę korzystnie formułuje się z antygenami dostarczającymi ochronę przed jednym lub większą liczbą zakażeń z grupy obejmującej błonicę, tężec i Bordatella pertussis. Składnik krztuśca może stanowić uśmiercona cała komórka B. pertussis (Pw) lub acelularny krztusiec (Pa), który zawiera co najmniej jeden antygen (korzystnie dwa lub trzy) wybrany spośród PT, FHA i 69 kda pertaktyny. Pewne inne szczepionki acelularne zawierają także aglutynogeny, takie jak Fim 2 i Fim 3 i wynalazek obejmuje także zastosowanie tych szczepionek. Typowo antygenami dostarczającymi ochronę przed błonicą i tężcem są toksoid błoniczy i toksoid tężcowy. Toksoidy stanowią chemicznie inaktywowane toksyny (na przykład w efekcie traktowania formaldehydem) lub toksynami inaktywowanymi wprowadzeniem jednej lub większej liczby mutacji punktowych. Alternatywnie ciecz o wysokiej lepkości według wynalazku można dostarczać w postaci zestawu zawierającego w jednym pojemniku ciekłe szkło o wysokiej lepkości a w drugim pojemniku ciekłe DTPa lub DTPw. Takie zestawy mogą zawierać np. dwukomorową strzykawkę, przy czym składniki suszony i ciekły są zawarte w tej samej strzykawce, ale w różnych komorach. Suszony składnik następnie roztwarza się z użyciem ciekłej szczepionki bezpośrednio przed iniekcją pojedynczej szczepionki. Dlatego na przykład suszoną ciecz o wysokiej lepkości według wynalazku roztwarza się z użyciem ciekłej szczepionki DTPa lub DTPw (korzystnie poza organizmem) i podawana w postaci pojedynczej szczepionki. Szczepionka DTPa lub DTPw typowo jest adiuwantowana przynajmniej częściowo wodorotlenkiem glinu (na przykład szczepionki Infanrix i Tritanrix GlaxoSmithKline Biological s.a.). Szczepionka może także ewentualnie zawierać jeden lub większą liczbę antygenów, które mogą chronić gospodarza przed nietypowanym Haemophilus influenzae, RSV i/lub jeden lub większą liczbę antygenów, które mogą chronić gospodarza przed wirusem grypy. Korzystne antygeny białka nietypowanych H. influenzae obejmują białko fimbrynę (US ) i białka fuzyjne zawierające jego peptydy (np. białko fuzyjne LB1) (US Ohio State Research Foundation), OMP26, P6, białko D, TbpA, TbpB, Hia, Hmw1, Hmw2, Hap i D15. Korzystne antygeny wirusa grypy obejmują całego, żywego lub inaktywowanego wirusa, rozszczepionego wirusa grypy hodowanego na jajach lub komórkach MDCK lub komórkach Vero lub całe wirosomy grypy (opisane przez R. Glucka, Vaccine, 1992, 10, ) lub oczyszczone lub rekombinowane ich białka, takie jak HA, NP, NA lub białka M lub ich połączenia. Korzystne antygeny RSV (wirusa oddechowego) obejmują glikoproteinę F, glikoproteinę G, białko HN, białko M lub ich pochodne. Należy zauważyć, że kompozycje antygenowe według wynalazku mogą zawierać jeden lub większą liczbę polisacharydów otoczki z pojedynczego gatunku bakterii. Kompozycje antygenowe mogą także zawierać polisacharydy otoczki pochodzące z jednego lub większej liczby gatunków bakterii.

13 PL B1 13 Immunogenne kompozycje i szczepionki Dalszy aspekt wynalazku obejmuje immunogenne kompozycje lub szczepionki zawierające ciecz o wysokiej lepkości według wynalazku i farmaceutycznie dopuszczalną zaróbkę. Korzystnie immunogenna kompozycja lub szczepionka zawiera ilość adiuwantu wystarczającą do wzmożenia odpowiedzi odpornościowej na immunogen. Odpowiednie adiuwanty obejmują, lecz nie wyłącznie, sole glinu, mieszaniny skwalenu (SAF-1), peptyd muramylowy, pochodne saponiny, preparaty ścian komórkowych prątków, monofosforylolipid A, pochodne kwasu mykolowego, substancje powierzchniowo czynne będące niejonowymi kopolimerami blokowymi, Quil A, podjednostkę B toksyny cholery, polfosfazen i pochodne oraz immunostymulujące kompleksy (ISCOM) takie jak opisane przez Takahashi i in., (1990) Nature 344: W zastosowaniu weterynaryjnym i do wytwarzania przeciwciał u zwierząt można stosować mitogenne składniki adiuwantu Freunda. Tak jak w przypadku wszystkich immunogennych kompozycji lub szczepionek, imm unologicznie skuteczne ilości immunogenów trzeba określić empirycznie. Czynniki, które należy wziąć pod uwagę, obejmują immunogenność, to, czy immunogen tworzy kompleks czy jest kowalencyjnie związany z adiuwantem lub białkiem nośnikowym lub innym nośnikiem, drogę podawania i liczbę podawanych immunizujących dawek. Takie czynniki są znane w dziedzinie produkcji szczepionek i w zakresie umiejętności immunologów leży wykonanie takich określeń bez zbędnych eksperymentów. Czynny środek może występować w różnych stężeniach w cieczy o wysokiej lepkości lub szczepionce według wynalazku. Typowo minimalne stężenie substancji oznacza ilość niezbędną do uzyskania zamierzonego zastosowania, natomiast maksymalne stężenie oznacza ilość, która pozostanie w roztworze lub przeprowadzona w stan jednorodnej zawiesiny w wyjściowej mieszaninie. Na przykład korzystnie minimalną ilością środka terapeutycznego jest ilość, która dostarczy pojedynczą terapeutycznie skuteczną dawkę. W przypadku substancji biologicznie czynnych minimalne stężenie oznacza ilość niezbędną do uzyskania działania biologicznego po roztworzeniu, a maksymalne stężenie oznacza stężenie, po przekroczeniu którego nie można utrzymać jednorodnej zawiesiny. W przypadku jednostek jednodawkowych ilość oznacza ilość w pojedynczym zastosowaniu terapeutycznym. Ogólnie oczekuje się, że każda dawka będzie zawierała g antygenu białkowego, korzystnie 5-50 g, a najkorzystniej 5-25 g. Korzystne dawki bakteryjnych polisacharydów wynoszą g, 10-5 g, 5-2,5 g lub 2,5-1 g. Korzystna ilość substancji zmienia się w zależności od substancji, ale fachowiec z łatwością ją określi. Ciecz o wysokiej lepkości zawierająca czynny środek Innym aspektem wynalazku jest ciecz o wysokiej lepkości zawierająca czynny środek, który korzystnie można uzyskać lub uzyskuje się z użyciem sposobu według wynalazku. Czynny środek korzystnie zachowuje aktywność i/lub antygenowość i/lub immunogenność po suszeniu przy użyciu sposobu według wynalazku, a następnie roztworzeniu. Korzystnie zachowuje się co najmniej 40, 50, 60, 70, 80, 90 lub 95% aktywności, antygenowości lub immunogenności czynnego środka. Można je określić dowolnym odpowiednim sposobem, np. opisanym wyżej. Korzystnie ciecze o wysokiej lepkości według wynalazku zawierają poliol tworzący produkt szklisty, wybrany z grupy obejmującej glukozę, maltulozę, izomaltulozę, laktulozę, sacharozę, maltozę, laktozę, sorbitol, izomaltozę, maltitol, laktitol, palatynit, trehalozę, rafinozę, stachiozę, melezytozę i dekstran. Ciecz o wysokiej lepkości według wynalazku może zawierać którykolwiek z czynnych środków opisanych wyżej. Czynny środek konserwowany przez ciecz o wysokiej lepkości może stanowić układ biologiczny, np. komórki, kompozycje wewnątrzkomórkowe, bakterie, preparaty pęcherzyków zewnętrznej błony i wirusy. Może alternatywnie lub dodatkowo zawierać cząsteczki, na przykład białka, peptydy, aminokwasy, kwasy polinukleinowe, oligonukleotydy, polisacharydy, oligosacharydy, koniugaty polisacharyd - białko, koniugaty oligosacharyd - białko. Może także zawierać połączenia zawierające dwa lub większą liczbę powyższych czynnych środków. Korzystne postacie obejmują ciecz o wysokiej lepkości korzystnie uzyskaną lub taką, którą można uzyskać sposobem według wynalazku, w której czynnym środkiem jest lub czynny środek zawiera szczepionkę lub składnik szczepionki. Korzystne składniki szczepionki są opisane wyżej i obejmują IPV, korzystniej IPV i polisacharydy bakteryjne, korzystnie polisacharydy lub oligosacharydy z Haemophilus influenzae b i Neisseria meningitidis A, C, W i Y.

14 14 PL B1 Korzystne składniki szczepionki zawierają IPV (inaktywowaną mieszaninę szczepów wirusa polio). Korzystnie IPV jest łączony z jednym lub większą liczbą polisacharydów z grupy obejmującej: polisacharyd PRP Hib i/lub polisacharydy meningokokowe A, C, W i/lub Y i/lub polisacharydy pneumokokowe (jak opisano wyżej), korzystniej IPV i Hib, IPV i MenC, IPV, Hib i MenC, Hib i MenC, IPV i MenA i C, Hib i MenA i C, IPV, Hib i MenA i C, Hib, MenC i Y lub IPV, Hib, MenC i Y. W powyższych kompozycjach, tam gdzie stosuje się polisacharydy, można także wykorzystywać oligosacharydy (jak zdefiniowano wyżej). Chociaż kompozycje te mogą być adiuwantowane (jak opisano wyżej), korzystnie są nieadiuwantowane lub korzystnie nie zawierają soli glinu. Korzystnie polisacharydy lub oligosacharydy są sprzężone z peptydem lub białkiem nośnikowym zawierającym epitopy limfocytu T pomocniczego (jak opisano wyżej). Korzystne ciecz o wysokiej lepkości według wynalazku łączy się z innymi antygenami w szczepionkę złożoną, która jest ewentualnie desykowana lub stanowi korzystnie preparaty ciekłe, które można stosować do roztworzenia suszonych składników. Korzystne antygeny łączone z zawartością pojemnika według wynalazku obejmują jeden lub większą liczbę z grupy obejmującej toksoid błoniczy, toksoid tężcowy, całe komórki krztuśca (Pw), acelularny krztusiec (Pa) (jak opisano wyżej), antygen powierzchniowy wirusa zapalenia wątroby typu B, polisacharydy pneumokokowe, białka pneumokokowe, polisacharydy Neisseria, białka Neisseria. Polisacharydy bakteryjne można sprzęgać z białkiem nośnikowym, takim jak toksoid tężcowy, fragment C toksoidu tężcowego, toksoid błoniczy, CRM197, pneumolizyna, Białko D (US ), jak opisano wyżej. Dalszym aspektem wynalazku jest sposób wytwarzania szczepionki obejmujący etap roztwarzania cieczy o wysokiej lepkości w wodnym roztworze. W korzystnej postaci wodny roztwór zawiera toksoid błoniczy, toksoid tężcowy i antygeny krztuśca (acelularny lub całe komórki) i ewentualnie dodatkowo zawiera antygen powierzchniowy wirusowego zapalenia wątroby typu B. Szczepionka DTP jest co najmniej częściowo adiuwantowana solą glinu, korzystnie wodorotlenkiem glinu lub fosforanem glinu. Wynalazek umożliwia stosowanie zestawu zawierającego ciecz o wysokiej lepkości według wynalazku w pierwszym pojemniku i szczepionkę zawierającą ciekłą DTP (acelularną lub komórkową) w drugim pojemniku. Dwukomorową strzykawkę można stosować, jak opisano wyżej Opis figur Fig. 1 - Zdjęcie cieczy o wysokiej lepkości w odwróconych fiolkach. Poniższe przykłady wykonuje się przy użyciu zwykłych technik, które są dobrze znane i rutynowe dla fachowca, poza przypadkami, które szczegółowo opisano. Przykłady są ilustracyjne. P r z y k ł a d 1. Ustalenie warunków zamrażania Sporządzono próbki przez rozpuszczenie sacharozy w wodzie, uzyskując roztwory 1%, 5%, 10% i 20%. Próbki umieszczono w suszarce sublimacyjnej Heto Drywinner 8-85, w której temperaturę na półce można regulować z dokładnością 1 C, końcowa temperatura kondensatora wynosi -85 C, ciśnienie jest regulowane za pomocą zaworu upustowego, a 6 termoelementów mierzy temperaturę produktu. Podczas całego procesu utrzymywano temperaturę na półkach na stałym poziomie 15 C. Ciśnienie początkowo obniżono do 20 kpa (200 mbarów) i utrzymano na tym poziomie przez 10 minut przed jego dalszym obniżeniem do 5 kpa, 0,5 kpa, 0,25 kpa, 0, 075 kpa, 0,04 kpa i 0,02 kpa (odpowiednio 50 mbarów, 5 mbarów, 2,5 mbara, 0,75 mbara, 0,4 mbara i 0,2 mbara). Każdą wartość ciśnienia utrzymywano przez 20 minut, aby umożliwić wyrównanie temperatur i temperaturę próbki odczytywano przy użyciu termoelementu. Termoelementy były połączone z próbkami o różnych stężeniach sacharozy i temperatury podane w tabeli 1 są wartościami średnimi temperatur. Wyniki Wszystkie próbki zamarzły przy ciśnieniu 0,166-0,111 kpa (1,66-1,11 mbara), bez względu na stężenie obecnej sacharozy. Temperatury zmierzone przy różnych ciśnieniach były bardzo zbliżone do przewidywanych wartości z krzywej trzypunktowej. Dlatego wydaje się, że obecność sacharozy nie wywiera dużego wpływu na temperaturę próbek przy różnych ciśnieniach. Aby uniknąć zamrożenia próbki ciśnienie powinno być utrzymywane powyżej 0,2 kpa (2 mbarów) przy zastosowaniu temperatury na półce 15 C. Przy niższych temperaturach ciśnienie należy utrzymywać na wyższym poziomie, natomiast zastosowanie wyższej temperatury może umożliwić dalsze obniżenie ciśnienia bez zamrożenia próbek.

15 PL B1 15 Ciśnienie T a b e l a 1 Zmierzona temperatura Teoretyczna temperatura Ciekła/zamrożona 100 kpa (1000 mbarów) 15 C ciekła 5 kpa (50 mbarów) 15 C ciekła 0,5 kpa (5 mbarów) 1 C 1 C ciekła 0,25 kpa (2,5 mbara) -5 C -7 C ciekła 0,075 kpa (0,75 mbara) -21 C -21 C zamrożona 0,04 kpa (0,4 mbara) -22 C -27 C zamrożona 0,02 kpa (0,2 mbara) -27 C -32 C zamrożona P r z y k ł a d 2. Sposób suszenia bez zamrażania i tworzenia piany Sporządzono konserwowane próbki zawierające 5%, 10%, 15% i 25% sacharozy i dodano do fiolek. Próbki umieszczono w suszarce sublimacyjnej przy temperaturze ustawionej na 15 C w czasie całego procesu. Ciśnienie początkowo obniżono do 20 kpa (200 mbarów) i utrzymano na tym poziomie przez 10 minut przed jego dalszym obniżeniem, aby umożliwić odgazowanie próbek. Ciśnienie dalej obniżano do 0,8 kpa (8 mbarów) na dwie do trzech godzin; w tym czasie termoelementy wewnątrz próbek pokazały, że temperatura próbki spadła do 4 C ze względu na chłodzenie wyparne. Po 2-3 godzinach temperatura próbek powróciła do 15 C, co wskazywało, że parowanie w tych warunkach temperatury i ciśnienia było bliskie zakończenia. W tym stadium procesu próbki nie wrzały i nie tworzyły piany ani nie zamarzały, tak że czynny środek w próbce był wystawiony na możliwie najmniejszy stres. Próbki miały wygląd lepkiej cieczy. Dalsze suszenie próbek uzyskiwano przez dalsze obniżenie ciśnienia do 0,01 kpa (0,1 mbara), przy jednoczesnym utrzymywania ustawienia temperatury na półce na poziomie 15 C. Te warunki utrzymywano przez dalsze godzin. Podczas tej fazy temperatura próbki utrzymywała się na poziomie 15 C, gdyż szybkość parowania była niewielka. Zachodziło dalsze suszenie i powstała próbka miała wygląd ciała stałego. Jeżeli próbkę umieszczano na boku, zawartość próbki płynęła bardzo wolno, w okresie dni, co wskazywało, że próbka jest ciekłym szkłem o wysokiej lepkości. Figura 1 pokazuje wygląd cieczy o wysokiej lepkości. P r z y k ł a d 3. Zachowanie immunogenności IPV po suszeniu bez zamrażania i tworzenia piany Takich próbek nie wystawiano na stresy związane z powstawaniem pęcherzyków, co towarzyszy tworzeniu piany i zamrażaniu. Eksperymenty wykonano w celu określenia, czy ten sposób, stosowany do suszenia IPV, prowadzi do wysokiego stopnia zachowania antygenu. Wykonano trzy odrębne eksperymenty, w których IPV przeprowadzono w stan zawiesiny w wodnym roztworze z 10% sacharozą lub 10% trehalozą jako środkiem stabilizującym. Próbki umieszczano w silikonizowanych fiolkach, które umieszczano w suszarce sublimacyjnej Heto Drywinner 8-85 i temperaturę ustawiano na 15 C. Początkowo, aby odgazować próbkę, ciśnienie obniżano do 3,5 kpa (35 mbarów). Po 10 minutach ciśnienie dalej obniżano do 0,8 kpa (8 mbarów) i utrzymywano na tym poziomie przez dwie godziny. W tym okresie utrzymywano ustawienie temperatury na 15 C i monitorowano temperaturę wewnątrz próbki. W czasie, gdy woda parowała z próbki, temperatura spadła do 4 C, ale pod koniec drugiej godziny, gdy szybkość parowania spadła, temperatura powróciła do 15 C. W tych warunkach nie powstawały pęcherzyki i nie doszło do tworzenia piany. Następnie ciśnienie obniżono dalej do 0,01 kpa (0,1 mbara) i te warunki utrzymano przez 16 dodatkowych godzin w pierwszych dwóch eksperymentach i przez 10 dodatkowych godzin w trzecim eksperymencie. Próbki roztworzono w wodzie, a do oceny zachowania antygenowości trzech szczepów wirusa polio stosowano test ELISA. W teście ELISA stosowano przeciwciało monoklonalne przeciw wirusowi IPV typu 3 dla oceny stopnia zachowania antygenu w roztworzonej próbce, suszonej sublimacyjnie, w porównaniu z próbką wzorcową, która nie była zamrożona. Wyniki przedstawiono w postaci odsetka odczytu uzyskanego dla próbki, której nie poddano procedurze suszenia. Wyniki Suszone próbki miały wygląd ciała stałego, jednakże wydawały się mieć postać cieczy o wysokiej lepkości/szkła, gdyż w okresie dni suszona próbka mogła płynąć, jeżeli pojemnik odwrócono w temperaturze pokojowej.

16 16 PL B1 T a b e l a 2 Zachowanie antygenu IPV typu 3, określane testem ELISA przy użyciu przeciwciała monoklonalnego (suszenie bez tworzenia piany i zamrażania) Preparat 1 eksperyment (cykl 18 godzinny) Brak cukru 0% 2,5% sacharoza 0% 2 eksperyment (cykl 18 godzinny) 3 eksperyment (cykl 12 godzinny) 10% sacharoza 75% 78% 91% 10% trehaloza 82% 79% 93% Trzy poziomy zachowania antygenu IPV typu 3 wyglądają korzystnie w porównaniu z pokazanymi niżej wynikami suszenia sublimacyjnego, gdzie zazwyczaj stwierdzano bardzo niskie wartości w tym samym formacie ELISA, gdy zastosowano przeciwciało monoklonalne przeciw typowi 3. T a b e l a 3 Zachowanie antygenów IPV typu 1, 2 i 3, określane testem ELISA przy użyciu przeciwciał monoklonalnych i poliklonalnych (suszenie sublimacyjne) Sposób suszenia Zawartości poliolu ELISA-typ 1/2/3% Poliklonalne Monoklonalne Suszenie sublimacyjne 3,15% sacharoza 46/49/58* 19/25/0 Suszenie sublimacyjne 10% trehaloza 47/43/58 25/0/0 *Eksperyment suszenia sublimacyjnego w obecności 3,15% sacharozy powtórzono pięciokrotnie, a przedstawione wyniki pochodzą z jednego reprezentatywnego eksperymentu. P r z y k ł a d 4. Trwałość suszonego IPV przechowywanego w postaci cieczy o wysokiej lepkości/szkła przy długotrwałym przechowywaniu IPV suszony sposobem opisanym w przykładzie 3 przechowywano w temperaturze 4 C przez 9 miesięcy. Próbki roztwarzano w wodzie zawierającej 150 mm NaCl i stosowano test ELISA do oceny zachowania antygenowości trzech szczepów wirusa polio. Do oceny stopnia zachowania antygenu w roztworzonej przechowywanej próbce, w oddzielnych testach ELISA stosowano trzy przeciwciała monoklonalne, jedno przeciw każdemu szczepowi. Roztworzone próbki z tej samej serii przed przechowywaniem zbadano podobnymi testami ELISA. Wszystkie wyniki porównano z próbką wzorcową, której nie suszono. Wyniki przedstawiono w postaci odsetka odczytu uzyskanego dla próbki, której nie poddano procedurze suszenia. Wyniki T a b e l a 4 Zachowanie antygenów IPV po przechowywaniu w postaci cieczy o wysokiej lepkości przez 9 miesięcy Traktowanie ELISA typ 1 ELISA typ 2 ELISA typ 3 Suszona/roztworzona Nie przechowywana Suszona/roztworzona 9 miesięcy w temperaturze 4 C 72% 75% 88% 70% 94% 90% Z tego powodu IPV suszony sposobem opisanym w przykładzie 3 można przechowywać w temperaturze 4 C przez co najmniej 9 miesięcy bez utraty antygenowości. P r z y k ł a d 5. Porównanie immunogenności IPV in vivo po wysuszeniu z utworzeniem cieczy o wysokiej lepkości i roztworzeniu, w porównaniu z niesuszonym IPV Grupę 10 szczurów Wistar szczepiono rozcieńczonymi w różnym stopniu IPV, który wysuszono w obecności 10% sacharozy z utworzeniem cieczy o wysokiej lepkości przy użyciu sposobu ujawnionego w przykładzie 2 i roztworzono. Dalsze grupy 10 szczurów Wistar szczepiono wzorcowymi próbkami IPV, które wytwarzano w ten sam sposób, ale których nie suszono.

17 PL B1 17 Po 21 dniach od wszystkich szczurów pobrano surowicę i surowice badano w oddzielnych testach immunoprecypitacji przy użyciu wirusa polio Typu 1, Typu 2 i Typu 3. Wyniki pokazano w tabeli 5, która zawiera: a) liczbę odpowiadających szczurów na każde rozcieńczenie IPV, b) ED50, która stanowi dawkę wymaganą do zagwarantowania, że u 50% szczurów dojdzie do serokonwersji, ocenianej testem immunoprecypitacji i c) względną siłę działania suszonego i roztworzonego IPV w porównaniu z niesuszonym wzorcowym IPV. T a b e l a 5 Immunogenność IPV po suszeniu z utworzeniem cieczy o wysokiej lepkości (JLE017/05) i roztworzeniu w porównaniu z niesuszonym wzorcowym IPV (JLE097) Próbka Liczba odpowiadających ED50 JLEO17/05 RP względna Nie rozcieńczone 1/1,25 1/3,125 1/7,81 siła Typu ,37 0,956 Typu ,14 0,825 Typu ,18 1,051 JLE097 Typu ,33 1,120 Typu ,12 0,951 Typu ,91 1,172 Wzorcowa Typu ,37 Typu ,93 Typu ,57 JLEO17/05 stanowi serię IPV, którą wysuszono z utworzeniem cieczy o wysokiej lepkości a następnie roztworzono. JLE097 stanowi niesuszoną serię wzorcową. Tabela 5 pokazuje, że liczba zwierząt odpowiadających, zaszczepionych każdym rozcieńczeniem IPV jest podobna dla obu serii suszonego i roztworzonego IPV i niesuszonej próbki wzorcowej. Ogólnie Typ 1 IPV wywoływał najlepszą odpowiedź odpornościową, natomiast Typ 2 wywoływał odpowiedź odpornościową u nieznacznie mniejszej liczby szczurów. Typ 3 wywoływał najsłabszą odpowiedź odpornościową. Proces suszenia dla utworzenia cieczy o wysokiej lepkości nie zmniejsza zdolności IPV do wywołania immunoprecypitujących przeciwciał in vivo. Względna siła (RP) 1,0 wskazuje, że próbka wywołuje równoważną odpowiedź na próbkę wzorcową. Obie suszone próbki mają odczyt RP zbliżone do 1,0 dla wszystkich trzech typów wirusa polio, wskazując, że proces suszenia nie wpływa na zdolność próbki do wywołania odpowiedzi odpornościowej. P r z y k ł a d 6. Wpływ suszenia w celu utworzenia cieczy o wysokiej lepkości przy użyciu sacharozy lub trehalozy jako środka stabilizującego, na zdolność IPV do wywołania immunoprecypitującej odpowiedzi odpornościowej in vivo Grupy 10 szczurów Wistar szczepiono IPV, który wysuszono w obecności 10% sacharozy lub 10% trehalozy, jak opisano w przykładzie 2, a następnie roztworzono. Kolejne grupy 10 szczurów Wistar szczepiono równoważną ilością IPV, które nie były suszone, jako próbkami wzorcowymi. Po 21 dniach od wszystkich szczurów pobierano surowice i do oceny immunoneutralizujących przeciwciał wyprodukowanych przeciw każdemu z Typu 1, Typu 2 i Typu 3 wirusa polio, stosowano test immunoneutralizacji, jak opisano w przykładzie 5. Względne siły działania obliczono dla każdej próbki przez porównanie odpowiedzi odpornościowej z wywoływaną przez niesuszoną próbkę wzorcową. Wyniki pokazano w Tabeli 6.

18 18 PL B1 Numer partii T a b e l a 6 Porównanie suszenia w sacharozie i trehalozie Występujący cukier Względna siła działania in vivo Typ 1/Typ 2/Typ 3 Wilgotność % Karl Fischer Czas trwania (godziny) Jle017 10% trehalozy 0,95/0,82/1,05 n.o. 7 31CO3/01 10% sacharozy 0,69/1,20/0,97 4,6% 18 31CO3/02 10% trehalozy 0,60/0,94/0,9 11,5% 18 03D02/01 10% sacharozy 0,74/1,05/0,96 5,9% 12 03D02/02 10% trehalozy 0,58/0,98/1,06 10,6% 12 Ilość wody pozostającej w próbkach była niższa przy zastosowaniu sacharozy jako środka stabilizującego: pozostało około 5% wilgotności w porównaniu z około 10%, gdy jako środek stabilizujący 'zastosowano trehalozę, mierzoną wilgotnościomierzem kulometrycznym Karla Fischera. Zarówno sacharoza, jak i trehaloza były skuteczne pod względem stabilizacji IPV podczas procesu suszenia, tak że dla większości różnych typów wirusa polio odczyt względnej siły roztworzonego IPV był bliski 1,0. Względne siły działania były szczególnie dobre dla wirusa polio Typu 3, który względnie łatwo traci immunogenność. P r z y k ł a d 7: Pomiar wilgotności sposobem Karla Fischera Analizę przeprowadzono w titrometrze Karla Fischera (Aqua 30,00 - Elektrochemie Halle). Próbkę ważono i umieszczano w piecu z ustawioną temperaturą 80 C. Próbkę płukano gazowym azotem, a następnie dodawano do odczynnika hydranal (Riedel de Hahn) w celu wykonania analizy kulometrycznej. Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób konserwacji środka czynnego, znamienny tym, że w następujących etapach: a) wytwarza się konserwowaną próbkę przez rozpuszczenie/przeprowadzanie w stan zawiesiny środka czynnego w roztworze środka stabilizującego; b) poddaje się konserwowaną próbkę działaniu ciśnienia w zakresie 1-3 kpa i temperatury w zakresie 5-37 C, w wyniku czego z konserwowanej próbki usuwa się rozpuszczalnik przez odparowanie, bez zamrażania i powstawania pęcherzyków tworzących pianę, z utworzeniem lepkiej cieczy, przy czym środek stabilizujący stanowi poliol tworzący produkt szklisty, wybrany z grupy obejmującej glukozę, maltulozę, izomaltulozę, laktulozę, sacharozę, maltozę, laktozę, sorbitol, izomaltozę, maltitol, laktitol, palatynit, trehalozę, rafinozę, stachiozę, melezytozę i dekstran, a środek czynny zawiera IPV (inaktywowany wirus polio). 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w dodatkowym etapie: c) następnie poddaje się konserwowaną próbkę działaniu ciśnienia w zakresie 1-3 kpa i temperatury w zakresie 5-37 C, tak że lepka ciecz wysycha z wytworzeniem cieczy o wysokiej lepkości. 3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że ciśnienie w etapie b) obniża się do wartości w zakresie 1-2 kpa. 4. Sposób według zastrz. 2-3, znamienny tym, że temperatura na zewnątrz konserwowanej próbki jest wyższa w etapie c) niż w etapie b). 5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że temperaturę na zewnątrz konserwowanej próbki w etapie c) podwyższa się do wartości powyżej 20 C. 6. Sposób według zastrz. 2-5, znamienny tym, że ciśnienie w etapie c) obniża się w porównaniu do ciśnienia panującego w etapie b). 7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że ciśnienie w etapie c) obniża się do wartości co najwyżej 0,1 kpa. 8. Sposób według zastrz. 1-7, znamienny tym, że etap b) realizuje się w czasie krótszym niż 4 godziny. 9. Sposób według zastrz. 2-8, znamienny tym, że etapy b) i c) realizuje się w czasie krótszym niż 12 godzin.

19 PL B Sposób według zastrz. 1-9, znamienny tym, że środkiem stabilizującym jest sacharoza. 11. Sposób według zastrz. 1-10, znamienny tym, że stężenie środka stabilizującego jest niższe niż 15%. 12. Sposób według zastrz. 1-11, znamienny tym, że konserwowana próbka zawiera czerwień fenolową. 13. Sposób według zastrz. 1-12, znamienny tym, że konserwowaną próbkę suszy się w pojemniku z wewnętrzną powierzchnią odpychającą rozpuszczalnik. 14. Sposób według zastrz. 1-13, znamienny tym, że środek czynny zawiera cząsteczkę wybraną z grupy obejmującej białko, peptyd, aminokwas, polinukleotyd, oligonukleotyd, polisacharyd, oligosacharyd, koniugat polisacharyd-białko i koniugat oligosacharyd-białko. 15. Sposób według zastrz. 1-13, znamienny tym, że środek czynny zawiera układ biologiczny wybrany z grupy obejmującej komórki, kompozycje wewnątrzkomórkowe, bakterie, wirusy, składniki wirusa i cząstki wirusopodobne. 16. Sposób według zastrz. 1-15, znamienny tym, że środek czynny zawiera polisacharyd lub oligosacharyd Hib (Haemophilus influenzae typu b). 17. Sposób według zastrz. 1-16, znamienny tym, że środek czynny zawiera polisacharyd lub oligosacharyd Neisseria meningitidis C. 18. Ciecz o wysokiej lepkości, którą można otrzymać sposobem jak określono w zastrz. 1-17, znamienna tym, że zawiera środek czynny, przy czym zachowana jest antygenowość lub aktywność środka czynnego, przy czym zawiera poliol tworzący produkt szklisty, wybrany z grupy obejmującej glukozę, maltulozę, izomaltulozę, laktulozę, sacharozę, maltozę, laktozę, sorbitol, izomaltozę, maltitol, laktitol, palatynit, trehalozę, rafinozę, stachiozę, melezytozę i dekstran, a środek czynny zawiera IPV (inaktywowany wirus polio). 19. Ciecz o wysokiej lepkości według zastrz. 18, znamienna tym, że poliol tworzący produkt szklisty stanowi sacharoza. 20. Ciecz o wysokiej lepkości według zastrz , znamienna tym, że środek czynny zawiera cząsteczkę wybraną z grupy obejmującej białko, peptyd, aminokwas, polinukleotyd, oligonukleotyd, polisacharyd, oligosacharyd, koniugat polisacharyd-białko, koniugat oligosacharyd-białko. 21. Ciecz o wysokiej lepkości według zastrz , znamienna tym, że środek czynny zawiera układ biologiczny wybrany z grupy obejmującej komórki, kompozycje wewnątrzkomórkowe, bakterie, wirusy, składniki wirusa lub cząstki wiruso-podobne. 22. Ciecz o wysokiej lepkości według zastrz , znamienna tym, że środek czynny zawiera polisacharyd lub oligosacharyd bakteryjny, korzystnie sprzężony z białkiem nośnikowym. 23. Ciecz o wysokiej lepkości według zastrz. 22, znamienna tym, że środek czynny zawiera polisacharyd lub oligosacharyd Hib (Haemophilus influenzae typu b), korzystnie sprzężony z białkiem nośnikowym. 24. Ciecz o wysokiej lepkości według zastrz , znamienna tym, że środek czynny zawiera polisacharyd lub oligosacharyd Neisseria meningitidis serotypu C, korzystnie sprzężony z białkiem nośnikowym. 25. Ciecz o wysokiej lepkości według zastrz , znamienna tym, że przetrzymuje się ją w pojemniku z wewnętrzną powierzchnią odpychającą rozpuszczalnik. 26. Immunogenna kompozycja lub szczepionka, znamienna tym, że zawiera ciecz o wysokiej lepkości zdefiniowaną w zastrz. 18 i farmaceutycznie dopuszczalną zaróbkę. 27. Sposób wytwarzania szczepionki, znamienny tym, że obejmuje etap, w którym roztwarza się ciecz o wysokiej lepkości zdefiniowaną w zastrz w wodnym roztworze. 28. Sposób według zastrz. 27, znamienny tym, że wodny roztwór zawiera antygen błonicy, antygen tężca i antygeny krztuśca (bezkomórkowe lub z pełnych komórek). 29. Sposób według zastrz. 29, znamienny tym, że szczepionka DTP jest częściowo adiuwantowana wodorotlenkiem glinu.

20 20 PL B1 Rysunek Departament Wydawnictw UPRP Cena 4,92 zł (w tym 23% VAT)