(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 11/0 EP B1 (13) (1) T3 Int.Cl. A61K 39/09 (06.01) A61K 39/2 (06.01) A61K 39/116 (06.01) (4) Tytuł wynalazku: Kompozycja immunogenna () Pierwszeństwo: GB GB GB GB GB GB (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 08/11 (4) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 12/04 (73) Uprawniony z patentu: GlaxoSmithKline Biologicals s.a., Rixensart, BE (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 RALPH L. BIEMANS, Rixensart, BE DOMINIQUE BOUTRIAU, Rixensart, BE CARINE CAPIAU, Rixensart, BE PHILIPPE DENOEL, Rixensart, BE PIERRE DUVIVIER, Rixensart, BE JAN POOLMAN, Rixensart, BE (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Agnieszka Marszałek SULIMA-GRABOWSKA-SIERZPUTOWSKA BIURO PATENTÓW I ZNAKÓW TOWAROWYCH SP.J. Skr. poczt Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 SGS-26/VAL EP B1 Opis 1 2 [0001] Niniejsze zgłoszenie dotyczy kompozycji immunogennych i szczepionek zawierających koniugat sacharydu Hib i co najmniej jeden dodatkowy koniugat sacharydu bakteryjnego w połączeniu z kolejnym(-i) antygenem(-ami), w tym pełnokomórkowym składnikiem krztuścowym i/lub antygenem powierzchniowym wirusa zapalenia wątroby typu B, sposobów wytwarzania takich kompozycji immunogennych i szczepionek oraz zastosowań i sposobów immunizacji z uŝyciem tej kompozycji immunogennej i szczepionki. [0002] Wykazano, Ŝe bakteryjne polisacharydy są skutecznymi immunogenami do stosowania w szczepionkach, zwłaszcza gdy są sprzęŝone z białkiem nośnikowym. W handlu dostępne są szczepionki koniugatowe przeciw Haemophilus influenzae typu b (Hibtiter Wyeth-Lederie), polisacharydom pneumokoków (Prevnar -Wyeth-Lederie) i polisacharydom meningokoków (Meningitec - Wyeth-Lederie i Menactra - Sanofi). [0003] Opisano takŝe kompozycje immunogenne i szczepionki zawierające koniugat Hib, koniugat sacharydu N. meningitidis, pełnokomórkowy składnik krztuścowy i antygen powierzchniowy wirusa zapalenia wątroby typu B. Przykładowo w WO 02/00249 ujawniono siedmio-waŝną kompozycję immunogenną zawierającą toksoid błoniczy, toksoid tęŝcowy, pełnokomórkowy składnik krztuścowy, antygen powierzchniowy wirusa zapalenia wątroby typu B, koniugat Hib, koniugat MenA i koniugat MenC. Przedstawiono wyniki badania klinicznego w którym stosowano µg dawkę sacharydu kaŝdego z tych koniugatów sacharydów bakteryjnych. Dodatkowo w WO 0/08794 opisano szczepionki skojarzone o niskich dawkach koniugatu Hib. [0004] Niniejszy wynalazek dotyczy zapewnienia szczepionki skojarzonej zawierającej koniugat Hib, dodatkowy koniugat sacharydu bakteryjnego (na przykład koniugat sacharydu N.meningitidis) i kolejne antygeny, w tym jeden lub obydwa spośród pełnokomórkowego składnika krztuścowego i antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B. Zastosowane dawki sacharydów umoŝliwiają wytworzenie dobrej odpowiedzi immunologicznej przeciwko Hib i dodatkowym sacharydom bakteryjnym, jak równieŝ przeciwko składnikowi krztuścowemu i/lub składnikowi w postaci antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B. [000] Wynalazcy nieoczekiwanie stwierdzili, Ŝe przy zmniejszeniu dawki sacharydu z Hib i/lub dodatkowych bakteryjnych koniugatów do poniŝej µg na dawkę, w szczepionce skojarzonej zawierającej pełnokomórkowy składnik krztuścowy i/lub antygen powierzch-

3 niowy wirusa zapalenia wątroby typu B, dobra odpowiedź immunologiczna na koniugaty sacharydów utrzymuje się, a immunogenność pełnokomórkowego składnika krztuścowego i powierzchniowego antygenu wirusa zapalenia wątroby typu B ulega wzmocnieniu (na przykład tak, Ŝe GMC dla Pw i/lub wirusa zapalenia wątroby typu B mierzone w teście ELISA jest wyŝsze niŝ poziom uzyskany po immunizacji kompozycją immunogenną zawierającą µg dawkę sacharydu z kaŝdego spośród koniugatów). [0006] W związku z tym pierwszy aspekt wynalazku dostarcza kompozycję immunogenną zawierającą koniugat sacharydu Hib, co najmniej jeden dodatkowy koniugat sacharydu bakteryjnego i kolejny antygen wybrany z grupy obejmującej pełnokomórkowy składnik krztuścowy i antygen powierzchniowy wirusa zapalenia wątroby typu B, w której dawka sacharydu z koniugatu sacharydu Hib jest niŝsza niŝ µg na dawkę. Szczegółowy opis [0007] Kompozycja immunogenna według wynalazku zawiera koniugat sacharydu Hib i/lub co najmniej lub dokładnie jeden, dwa, trzy lub cztery koniugaty sacharydu bakteryjnego, na przykład koniugat(-y) sacharydu N. meningitidis, i kolejny antygen wybrany z grupy obejmującej pełnokomórkowy składnik krztuścowy i antygen powierzchniowy wirusa zapalenia wątroby typu B, przy czym dawka sacharydu z koniugatu sacharydu Hib jest niŝsza niŝ µg lub niŝsza niŝ 4 µg, albo wynosi między 1-4 µg lub 1-3 µg, lub 2-4 µg lub 2-3 µg, albo około lub dokładnie 2, µg i ewentualnie dawka sacharydu z tego lub kaŝdego spośród co najmniej lub dokładnie jednego, dwóch, trzech lub czterech dodatkowych koniugatów sacharydu bakteryjnego (na przykład koniugatu(-ów) sacharydu N. meningitidis) jest niŝsza niŝ µg, 9 µg, 8 µg, 7 µg, 6 µg, µg lub 4 µg, albo wynosi między 1- µg, 1-8 µg, 1-6 µg, 1- µg, 1-4 µg, 1-3 µg lub 2-4 µg, lub 2-3 µg, albo około lub dokładnie 2, µg. [0008] Określenie sacharyd obejmuje polisacharydy lub oligosacharydy. Polisacharydy są izolowane z bakterii lub izolowane z bakterii i w pewnym stopniu dopasowywane pod względem wielkości znanymi sposobami (patrz na przykład EP49724 i EP4972) lub ewentualnie metodą mikrofluidyzacji. Polisacharydy mogą być dopasowane pod względem wielkości w celu zmniejszenia lepkości w próbkach polisacharydów i/lub poprawienia właściwości filtracyjnych sprzęŝonych produktów. Oligosacharydy zawierają małą liczbę powtarzalnych jednostek (zazwyczaj - powtarzalnych jednostek) i są zazwyczaj zhydrolizowanymi polisacharydami. [0009] Dawkę sacharydu mierzy się w ilości kompozycji immunogennej lub szczepionki, która jest podawana człowiekowi. [00] Sacharyd Hib stanowi otoczkowy polisacharyd lub oligosacharyd z Haemophilus

4 influenzae typu b w postaci fosforanu polirybozylu (PRP) [0011] Określenie co najmniej jeden dodatkowy koniugat sacharydu bakteryjnego odnosi się do koniugatu dowolnego sacharydu bakteryjnego połączonego z białkiem nośnikowym. Sacharyd bakteryjny stanowi ewentualnie sacharyd otoczkowy pochodzący ze szczepu N. meningitidis, szczepu S. pneumoniae, szczepu S. typhi lub dowolny z opisanych tu sacharydów bakteryjnych. [0012] Określenie co najmniej jeden koniugat sacharydu N. meningitidis odnosi się do sacharydu otoczkowego N. meningitidis serogrupy A (MenA), sacharydu otoczkowego N. meningitidis serogrupy C (MenC), sacharydu otoczkowego N. meningitidis serogrupy W13 (MenW), sacharydu otoczkowego N. meningitidis serogrupy Y (MenY), sacharydu otoczkowego N. meningitidis serogrupy B (MenB), sacharydów otoczkowych serogrup C i Y (MenCY), sacharydów otoczkowych serogrup C i A (MenAC), sacharydów otoczkowych serogrup C i W13 (MenCW), sacharydów otoczkowych serogrup A i Y (MenAY), sacharydów otoczkowych serogrup A i W13 (MenAW), sacharydów otoczkowych serogrup W13 i Y (MenWY), sacharydów otoczkowych serogrup A, C i W13 (MenACW), sacharydów otoczkowych serogrup A, C i Y (MenACY): sacharydów otoczkowych serogrup A, W13 i Y (MenAWY), sacharydów otoczkowych serogrup C, W13 i Y (Men- CWY); lub sacharydów otoczkowych serogrup A, C, W13 i Y (MenACWY), sacharydów otoczkowych serogrup B i C (MenBC), sacharydów otoczkowych serogrup B, C i Y (MenBCY), sacharydów otoczkowych serogrup B, C i A (MenABC), sacharydów otoczkowych serogrup B, C i W (MenBCW), sacharydów otoczkowych serogrup A, B i Y (MenABY), sacharydów otoczkowych serogrup A, B i W (MenABW), sacharydów otoczkowych serogrup B, W13 i Y (MenBWY), sacharydów otoczkowych serogrup A, B, C i W13 (MenABCW), sacharydów otoczkowych serogrup A, B, C i Y (MenABCY); sacharydów otoczkowych serogrup A, B, W13 i Y (MenABWY), sacharydów otoczkowych serogrup B, C, W13 i Y (MenBCWY) lub sacharydów otoczkowych serogrup A, B, C, W13 i Y (MenABCWY). [0013] Przykładowo dowolna z wymienionych powyŝej kombinacji koniugatów sacharydów N. meningitidis z dodatkiem lub bez koniugatu sacharydu Hib moŝe być obecna w dawce sacharydu wynoszącej poniŝej µg lub poniŝej 4 µg, lub 1-4 µg lub 1-3 µg, lub 2-4 µg lub 2-3 µg albo około lub dokładnie 2, µg. [0014] Określenia około lub w przybliŝeniu definiuje się dla celów wynalazku jako wartości w zakresie % poniŝej lub powyŝej podanej liczby. [001] W pewnej postaci dawka sacharydu Hib moŝe być taka sama jak, wyŝsza lub niŝsza niŝ dawka sacharydu z koniugatu sacharydu N. meningitidis. Dawka sacharydu z koniugatu

5 sacharydu Hib wynosi na przykład 0% lub mniej niŝ 90%, 80%, 7%, 70%, 60%, 0%, 40%, %, % lub % średniej lub najniŝszej dawki sacharydu z co najmniej jednego dodatkowego koniugatu sacharydu bakteryjnego (na przykład N. meningitidis). Dawka sacharydu dla sacharydu Hib wynosi na przykład między % i 60%, % i 60%, 40% i 60% albo około lub dokładnie 0% średniej lub najniŝszej dawki sacharydu z co najmniej jednego dodatkowego koniugatu sacharydu bakteryjnego (na przykład N. meningitidis). [0016] W pewnej postaci wynalazku dawka tego lub kaŝdego spośród co najmniej jednego dodatkowego sacharydu bakteryjnego (na przykład N. meningitidis) jest taka sama lub w przybliŝeniu taka sama. [0017] Przykładami kompozycji immunogennych według wynalazku są kompozycje składające się z lub obejmujące: Przykładami kompozycji immunogennych według wynalazku są kompozycje składające się z lub obejmujące: koniugat Hib i koniugat MenA i koniugat MenC, ewentualnie w stosunkach dawek sacharydów równych 1:2:2, 1:2:1, 1:4:2, 1:6:3, 1:3:3, 1:4:4, 1::, 1:6:6 (wag./wag.). Dawka sacharydu MenA moŝe być ewentualnie wyŝsza niŝ dawka sacharydu MenC. koniugat Hib i koniugat MenC i koniugat MenY, ewentualnie w stosunkach dawek sacharydów równych 1:2:2, 1:2:1, 1:4:2, 1:4:1, 1:8:4, 1:6:3, 1:3:3, 1:4:4, 1::, 1:6:6 (wag./wag.). Dawka sacharydu MenC moŝe być ewentualnie wyŝsza niŝ dawka sacharydu MenY. koniugat Hib i koniugat MenC i koniugat MenW, ewentualnie w stosunkach dawek sacharydów równych 1:2:2, 1:2:1, 1:4:2, 1:4:1, 1:8:4, 1:6:3, 1:3:3, 1:4:4, 1::, 1:6:6 (wag./wag.). Dawka sacharydu MenC moŝe być ewentualnie wyŝsza niŝ dawka sacharydu MenW. koniugat Hib i koniugat MenA i koniugat MenW, ewentualnie w stosunkach dawek sacharydów równych 1:2:2, 1:2:1, 1:4:2, 1:4:1, 1:8:4, 1:6:3, 1:3:3, 1:4:4, 1::, 1:6:6 (wag./wag.). Dawka sacharydu MenA moŝe być ewentualnie wyŝsza niŝ dawka sacharydu MenW. koniugat Hib i koniugat MenA i koniugat MenY, ewentualnie w stosunkach dawek sacharydów równych 1:2:2, 1:2:1, 1:4:2, 1:4:1, 1:8:4, 1:6:3, 1:3:3, 1:4:4, 1::, 1:6:6 (wag./wag.). Dawka sacharydu MenA moŝe być ewentualnie wyŝsza niŝ dawka sacharydu MenY. koniugat Hib i koniugat MenW i koniugat MenY, ewentualnie w stosunkach dawek sacharydów równych 1:2:2, 1:2:1, 1:1:2, 1:4:2, 1:2:4, 1:4:1, 1:1:4, 1:3:6, 1:1:3, 1:6:3, 1:3:3, 1:4:4, 1::, 1:6:6 (wag./wag.). Dawka sacharydu MenY moŝe być

6 1 2 3 ewentualnie wyŝsza niŝ dawka sacharydu MenW. [0018] Kolejny antygen obejmuje jeden lub obydwa spośród pełnokomórkowego składnika krztuścowego (Pw) i antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B (HepB). W pewnej postaci kolejny antygen obejmuje ponadto toksoid błoniczy (DT), toksoid tęŝcowy (TT), bezkomórkowy składnik krztuścowy (Pa) i/lub wirus polio (IPV). W pewnej postaci, kolejny antygen obejmuje lub składa się z DT, TT i Pw. W pewnej postaci, kolejny antygen obejmuje lub składa się z DT, TT, antygenu krztuścowego (Pa lub Pw) i HepB. W pewnej postaci kolejny antygen obejmuje lub składa się z DT, TT, antygenu krztuścowego (Pa lub Pw), HepB i IPV. [0019] Sacharyd(-y) Hib i/lub N. meningitidis zawarte w kompozycjach immunogennych według wynalazku są sprzęŝone z białkiem nośnikowym, takim jak toksoid tęŝcowy, fragment C toksoidu tęŝcowego, nietoksyczne mutanty toksyny tęŝcowej, toksoid błoniczy, CRM197, inne nietoksyczne mutanty toksyny błoniczej [takie jak CRM176, CRM 197, CRM228, CRM 4 (Uchida i in. J. Biol. Chem. 218; , 1973); CRM 9, CRM 4, CRM2, CRM 3 i CRM7 i inne mutacje opisane przez Nicholls i Youle w Genetically Engineered Toxins, Red: Frankel, Maecel Dekker Inc, 1992; delecja lub mutacja Glu- 148 do Asp, Gln lub Ser i/lub Ala 18 do Gly i inne mutacje ujawnione w US lub US ; mutacja co najmniej jednej lub większej liczby reszt Lys 16, Lys 26, Phe i/lub Lys 34 i inne mutacje ujawnione w US lub US 64673; lub fragment ujawniony w US ], pneumolizyna pneumokokowa, OMPC (meningokokowe białko błony zewnętrznej zazwyczaj ekstrahowane z N. meningitidis serogrupy B EP0371), syntetyczne peptydy (EP , EP ), białka szoku cieplnego (WO 93/17712, WO 94/038), białka krztuścowe (WO 98/8668, EP ), cytokiny, limfokiny, czynniki wzrostu lub hormony (WO 91/01146), sztuczne białka zawierające wiele epitopów dla ludzkich komórek T CD4+ z róŝnych antygenów pochodzących z patogenów (Falugi i in. (01) Eur J Immunol 31; ), takie jak białko N19 (Baraldoi i in. (04) Infect Immun 72; ), pneumokokowe białko powierzchniowe PspA (WO 02/091998), pneumolizyna (Kuo i in. (199) Infect Immun 63; ), białka wychwytujące Ŝelazo (WO 01/72337), toksyna A lub B C. difficile (WO 00/61761) lub białko D (EP946 i WO 00/6360). [00] W pewnej postaci w kompozycji immunogennej według wynalazku stosuje się takie samo białko nośnikowe (wybrane niezaleŝnie) w koniugacie Hib i co najmniej jednym koniugacie sacharydu N. meningitidis, ewentualnie w koniugacie Hib i kaŝdym spośród koniugatów sacharydów N. meningitidis (ewentualnie we wszystkich koniugatach sacharydów obecnych w kompozycji immunogennej).

7 [0021] W pewnej postaci kompozycja immunogenna ewentualnie zawiera koniugat sacharydu Hib i koniugat polisacharydu MenA, koniugat sacharydu Hib i koniugat sacharydu MenC, koniugat sacharydu Hib i koniugat sacharydu MenW, koniugat sacharydu Hib i koniugat sacharydu MenY, koniugat sacharydu Hib i koniugaty sacharydów MenA i MenC, koniugat sacharydu Hib i koniugaty sacharydów MenA i MenW, koniugat sacharydu Hib i koniugaty sacharydów MenA i MenY, koniugat sacharydu Hib i koniugaty sacharydów MenC i MenW, koniugat sacharydu Hib i koniugaty sacharydów MenC i MenY, koniugat sacharydu Hib i koniugaty sacharydów MenW i MenY, koniugat sacharydu Hib i koniugaty sacharydów MenA, MenC i MenW, koniugat sacharydu Hib i koniugaty sacharydów MenA, MenC i MenY, koniugat sacharydu Hib i koniugaty sacharydów MenA, MenW i MenY, koniugat sacharydu Hib i koniugaty sacharydów MenC, MenW i MenY, koniugat sacharydu Hib i koniugaty sacharydów MenA, MenC, MenW i MenY. [0022] W pewnej postaci pojedyncze białko nośnikowe moŝe nieść więcej niŝ jeden antygen sacharydowy (WO 04/08321). Przykładowo pojedyncze białko moŝe być sprzęŝone z Hib i MenA, Hib i MenC, Hib i MenW, Hib i MenY, MenA i MenC, MenA i MenW, MenA i MenY, MenC i MenW, MenC i MenY lub MenW i MenY. [0023] W pewnej postaci kompozycja immunogenna według wynalazku zawiera sacharyd Hib sprzęŝony z białkiem nośnikowym wybranym z grupy obejmującej TT, DT, CRM197, fragment C z TT i białko D. [0024] Gdy białkiem nośnikowym jest TT lub jego fragment dla Hib i co najmniej jednego sacharydu N. meningitidis, całkowita dawka nośnika wynosi między 2,-2 µg, 3- µg, 4-1 µg, -12, µg, 1- µg, µg lub µg. [002] W pewnej postaci kompozycja immunogenna według wynalazku zawiera co najmniej jeden, dwa, trzy lub cztery sacharydy bakteryjne N. meningitidis sprzęŝone z białkiem nośnikowym wybranym z grupy obejmującej TT, DT, CRM197, fragment C z TT i białko D. [0026] Kompozycja immunogenna według wynalazku zawiera ewentualnie koniugat sacharydu Hib o stosunku Hib do białka nośnikowego między 1: i :1; 1:2 i 2:1; 1:1 i 1:4; 1:2 i 1:3,; albo około lub dokładnie 1:2, lub 1:3 (wag./wag.). [0027] Kompozycja immunogenna według wynalazku zawiera ewentualnie co najmniej jeden koniugat sacharydu meningokokowego (przykładowo MenA i/lub MenC i/lub MenW i/lub MenY) o stosunku sacharydu Men do białka nośnikowego między 1: i :1, między 1:2 i :1, między 1:0, i 1:2, lub między 1:1,2 i 1:2, (wag./wag.). [0028] Stosunek sacharydu do białka nośnikowego (wag./wag.) w koniugacie moŝna wyznaczyć z zastosowaniem jałowego koniugatu. Ilość białka określa się z uŝyciem testu

8 Lowry ego (na przykład Lowry i in. (191) J. Biol. Chem. 193, lub Peterson i in. Analytical Biochemistry 0, 1-2 (1979)), a ilość sacharydu określa się z zastosowaniem ICP-OES (emisyjna spektroskopia optyczna ze wzbudzeniem w plazmie sprzęŝonej indukcyjnie) dla MenA, testu DMAP MenC i testu rezorcynolowego dla MenW i MenY (Monsigny i in. (1988) Anal. Biochem. 17, 2-). [0029] W pewnej postaci w kompozycji immunogennej według wynalazku sacharyd Hib jest sprzęŝony z białkiem nośnikowym przez łącznik, na przykład łącznik bifunkcyjny. Łącznik moŝe być ewentualnie heterobifunkcyjny lub homobifunkcyjny i posiadać na przykład reaktywną grupę aminową i reaktywną grupę kwasu karboksylowego, 2 reaktywne grupy aminowe lub dwie reaktywne grupy kwasu karboksylowego. Łącznik zawiera na przykład między 4 i, 4 i 12, i atomów węgla. MoŜliwym łącznikiem jest ADH. Do innych łączników naleŝą ugrupowanie B-propionoamidu (WO 00/99), nitrofenyloetyloamina (Gever i in. (1979) Med. Microbiol. Immunol. 16; ), halogenki fluorowcoalkilu (US40768), wiązania glikozydowe (US467374, US ) i kwas 6- aminokapronowy (US449286). [00] Koniugaty sacharydów obecne w kompozycjach immunogennych według wynalazku moŝna wytworzyć dowolną ze znanych technik sprzęgania. Przykładowo sacharyd moŝna sprzęgać przez wiązanie tioeterowe. Sposób sprzęgania moŝe zaleŝeć od aktywacji sacharydu tetrafluoroboranem 1-cyjano-4-dimetyloaminopirydyny (CDAP) z wytworzeniem estru cyjanianowego. Aktywowany sacharyd moŝe być w ten sposób sprzęgany bezpośrednio lub przez grupę rozdzielającą (łącznik) z grupą aminową na białku nośnikowym. Ester cyjanianowy ewentualnie sprzęga się z heksanodiaminą lub ADH, a sacharyd zderywatyzowany grupą aminową sprzęga się z białkiem nośnikowym z zastosowaniem metody heteroligacji obejmującej wytworzenie wiązania tioeterowego lub sprzęga sie z białkiem nośnikowym z zastosowaniem metody karbodiimidowej (np. EDAC lub EDC). Takie koniugaty opisano w opublikowanym zgłoszeniu PCT WO 93/1760 Uniformed Services University oraz WO 9/08348 i WO 96/ [0031] W innych odpowiednich technikach stosuje się karboimidy, hydrazydy, aktywne estry, norboran, kwas p-nitrobenzoesowy, N-hydroksysukcynimid, S-NHS, EDC, TSTU. Wiele z nich opisano w WO 98/ Sprzęganie moŝe obejmować łącznik karbonylowy, który moŝe powstać w reakcji wolnej grupy hydroksylowej sacharydu z CDI (Bethell i in. J. Biol. Chem. 1979, 24; 272-4, Heam i in. J. Chromatogr ; 09-18), i następującej po niej reakcji z białkiem z wytworzeniem wiązania karbaminianowego. MoŜe to obejmować redukcję anomerycznego końca do pierwszorzędowej grupy hydroksylowej, ewentualne zabezpieczenie/odbezpieczenie pierwszorzędowej grupy hydroksylowej, reak-

9 cję pierwszorzędowej grupy hydroksylowej z CDI z wytworzeniem karbaminianowego produktu pośredniego CDI i sprzęganie karbaminianowego produktu pośredniego CDI z grupą aminową na białku. [0032] Koniugaty moŝna teŝ wytwarzać drogą bezpośredniego aminowania redukcyjnego, jak opisano w US (Jennings) i US (Anderson). Inne metody są opisane w EP , EP-837 i EP [0033] Kolejna metoda obejmuje sprzęganie sacharydu aktywowanego bromocyjanem (lub CDAP) derywatyzowanego hydrazydem kwasu adypinowego (ADH) z nośnikiem białkowym drogą kondensacji karbodiimidowej (Chu C. i in. Infect. Immunity, ), na przykład z zastosowaniem EDAC. [0034] W pewnej postaci grupę hydroksylową sacharydu łączy się z grupą aminową lub karboksylową białka bezpośrednio lub pośrednio (przez łącznik). Gdy jest obecny łącznik, grupę hydroksylową sacharydu ewentualnie łączy się z grupą aminową łącznika, na przykład z zastosowaniem sprzęgania CDAP. Kolejną grupę aminową z łącznika (na przykład ADH) moŝna sprzęgać z grupą kwasu karboksylowego z białka, na przykład z zastosowaniem metody karbodiimidowej, na przykład z zastosowaniem EDAC. W pewnej postaci Hib lub co najmniej jeden sacharyd N. meningitidis sprzęga się najpierw z łącznikiem, przed sprzęŝeniem łącznika z białkiem nośnikowym. [003] W pewnej postaci sacharyd Hib, jeśli jest obecny, sprzęga się z białkiem nośnikowym z zastosowaniem CNBr lub CDAP, lub kombinacji CDAP i metody karbodiimidowej (takiej jak z EDAC), lub kombinacji CNBr i metody karbodiimidowej (takiej jak z zastosowaniem EDAC). Ewentualnie Hib sprzęga się z zastosowaniem CNBr i metody karbodiimidowej (ewentualnie z zastosowaniem EDAC). Przykładowo CNBr stosuje się do połączenia sacharydu i łącznika, a następnie metodę karbodiimidową stosuje się do połączenia łącznika z nośnikiem białkowym. [0036] W pewnej postaci co najmniej jeden spośród co najmniej jednego sacharydu N. meningitidis jest bezpośrednio sprzęŝony z białkiem nośnikowym, ewentualnie sacharyd(-y) MenW i/lub MenY i/lub MenC i/lub MenA jest/są bezpośrednio sprzęŝony(-e) z białkiem nośnikowym. Przykładowo MenW; MenY; MenC; MenA; MenW i MenY; MenW i MenC; MenY i MenC; lub MenW, MenY i MenC są bezpośrednio sprzęŝone z białkiem nośnikowym. Ewentualnie co najmniej jeden spośród co najmniej jednego sacharydu N. meningitidis jest bezpośrednio sprzęŝony poprzez CDAP. Przykładowo MenW; MenY; MenC; MenW i MenY; MenW i MenC; MenY i MenC; lub MenW, MenY lub MenC są bezpośrednio połączone z białkiem nośnikowym poprzez CDAP (patrz WO 9/08348 i WO 96/29094).

10 [0037] Stosunek sacharydu Men W i/lub Y do białka nośnikowego wynosi ewentualnie między 1:0, i 1:2 (wag./wag.) lub stosunek sacharydu MenC do białka nośnikowego wynosi między 1:0,8 i 1:2 lub 1:1,2 i 1:1, lub 1:0, i 1:1 (wag./wag.), zwłaszcza gdy te sacharydy są bezpośrednio połączone z białkiem, ewentualnie z zastosowaniem CDAP. [0038] W pewnej postaci co najmniej jeden sacharyd N. meningitidis jest sprzęŝony z białkiem nośnikowym poprzez łącznik, na przykład łącznik bifunkcyjny. Łącznik moŝe być ewentualnie heterobifunkcyjny lub homobifunkcyjny, i zawiera na przykład reaktywną grupę aminową i reaktywną grupę kwasu karboksylowego, 2 reaktywne grupy aminowe lub dwie reaktywne grupy kwasu karboksylowego. Łącznik zawiera przykładowo między 4 i, 4 i 12, i atomów węgla. MoŜliwym łącznikiem jest ADH. [0039] W pewnej postaci MenA; MenC; lub MenA i MenC jest sprzęŝony z białkiem nośnikowym poprzez łącznik. [0040] W pewnej postaci sacharyd N. meningitidis jest sprzęŝony z białkiem nośnikowym poprzez łącznik z zastosowaniem CDAP i EDAC. Przykładowo MenA; MenC; lub MenA i MenC są sprzęŝone z białkiem nośnikowym poprzez łącznik (na przykład takie, które zawierają na swoich końcach dwie grupy aminowe, takie jak ADH) z zastosowaniem CDAP i EDAC jak opisano powyŝej. Przykładowo CDAP stosuje się do sprzęŝenia sacharydu z łącznikiem, a EDAC stosuje się do sprzęŝenia łącznika z białkiem. Ewentualnie sprzęganie przez łącznik prowadzi do stosunku sacharydu do białka nośnikowego między 1:0, i 1:6; 1:1 i 1: lub 1:2 i 1:4, dla MenA; MenC; lub MenA i MenC. [0041] W pewnej postaci wynalazku kompozycja immunogenna zawiera polisacharydy otoczkowe N. meningitidis z co najmniej jednej, dwóch, trzech lub czterech serogrup A, C, W i Y sprzęŝone z białkiem nośnikowym, przy czym co najmniej jeden, dwa, trzy lub cztery lub kaŝdy z polisacharydów N. meningitidis jest albo natywnym polisacharydem albo jest dopasowany pod względem wielkości o współczynnik do x1,, x2, x3, x4, x, x6, x7, x8, x9, x lub x. Przykładowo średnia wielkość co najmniej jednego, dwóch, trzech lub czterech lub kaŝdego z polisacharydów N. meningitidis wynosi powyŝej 0 kda, 60 kda, 7 kda, 0 kda, 1 kda, 1 kda lub 1 kda. [0042] Określenie natywny polisacharyd dotyczy polisacharydu, który nie został poddany obróbce, która ma na celu zmniejszenie wielkości polisacharydu. [0043] Określenie dopasowany pod względem wielkości o współczynnik do x2 oznacza, Ŝe polisacharyd jest poddany obróbce, która ma na celu zmniejszenie wielkości polisacharydu, ale zachowuje wielkość powyŝej połowy wielkości natywnego polisacharydu. X3, x4 itd. maja być interpretowane w taki sam sposób tj. polisacharyd jest poddany obróbce, która ma na celu zmniejszenie wielkości polisacharydu, ale zachowuje wielkość powyŝej od-

11 1 2 3 powiednio jednej trzeciej, jednej czwartej itd. wielkości natywnego polisacharydu. [0044] W pewnym aspekcie wynalazku kompozycja immunogenna zawiera polisacharydy otoczkowe N. meningitidis z co najmniej jednej, dwóch, trzech lub czterech serogrup A, C, W i Y sprzęŝone z białkiem nośnikowym, przy czym co najmniej jeden, dwa, trzy lub cztery lub kaŝdy z polisacharydów N. meningitidis jest natywnym polisacharydem. [004] W pewnym aspekcie wynalazku, kompozycja immunogenna zawiera polisacharydy otoczkowe N. meningitidis z co najmniej jednej, dwóch, trzech lub czterech serogrup A, C, W i Y sprzęŝone z białkiem nośnikowym, przy czym co najmniej jeden, dwa, trzy lub cztery lub kaŝdy z polisacharydów N. meningitidis jest dopasowany pod względem wielkości o współczynnik do x1,, x2, x3, x4, x, x6, x7, x8, x9 lub x. [0046] W pewnej postaci średnia wielkość co najmniej jednego, dwóch, trzech, czterech lub kaŝdego z polisacharydów N. meningitidis wynosi między 0 kda i 0 kda, 0 kda i 00 kda, 0 kda i 0 kda, 1 kda i 0 kda, 1 kda i 00 kda, 1 kda i 0 kda, wyznaczona metodą MALLS. [0047] W pewnej postaci sacharyd MenA, jeśli jest obecny, ma masę cząsteczkową 0-00 kda, 0-0 kda, 0-00 kda, -90 kda, kda lub kda lub kda, wyznaczoną metodą MALLS. [0048] W pewnej postaci sacharyd MenC, jeśli jest obecny, ma masę cząsteczkową 0-0 kda, 0-0 kda, 0- kda, 1-1 kda, -2 kda lub kda, wyznaczoną metodą MALLS. [0049] W pewnej postaci sacharyd MenY, jeśli jest obecny, ma masę cząsteczkową kda, kda, kda, kda, 0- kda lub kda, 0-0 kda, kda, kda lub -160 kda, wyznaczoną metodą MALLS. [000] W pewnej postaci sacharyd MenW, jeśli jest obecny, ma masę cząsteczkową kda, kda, kda, kda, 0- kda, kda, 0-0 kda lub kda, wyznaczoną metodą MALLS. [001] Masy cząsteczkowe sacharydu dotyczą masy cząsteczkowej polisacharydu zmierzonej przed sprzęganiem i są mierzone metodą MALLS. [002] W pewnej postaci sacharydy N. meningitidis są natywnymi polisacharydami lub natywnymi polisacharydami o wielkości zmniejszonej podczas zwykłego procesu ekstrakcji. [003] W pewnej postaci sacharydy N. meningitidis są dopasowane pod względem wielkości poprzez mechaniczne rozszczepianie, na przykład metodą mikrofluidyzacji lub sonifikacji. Zaletę mikrofluidyzacji i sonifikacji stanowi zmniejszenie wielkości większych natywnych polisacharydów w wystarczającym stopniu, aby dostarczyć koniugat, który nadaje

12 się do przefiltrowania. [004] W pewnej postaci polidyspersyjność sacharydu wynosi 1-1,, 1-1,3, 1-1,2, 1-1,1 lub 1-1,0, a po sprzęŝeniu z białkiem nośnikowym polidyspersyjność koniugatu wynosi 1,0-2,, 1,0-2,0, 1,0-1,, 1,0-1,2, 1,-2,, 1,7-2,2 lub 1,-2,0. Wszystkie pomiary polidyspersyjności wykonuje się metodą MALLS. [00] W celu analizy sacharydów meningokokowych metodą MALLS moŝna zastosować połączenie dwóch kolumn (TSKG6000 i 000PWxl TOSOH Bioscience), a sacharydy eluuje się wodą. Sacharydy wykrywa się z uŝyciem detektora fotodyspersyjnego (na przykład Wyatt Dawn DSP wyposaŝonego w mw laser argonowy przy 488 nm) i refraktometru interferometrycznego (na przykład Wyatt Otilab DSP wyposaŝonego w celkę P0 z czerwonym filtrem przy 498 nm). [006] W pewnej postaci sacharyd MenA, jeśli jest obecny, jest co najmniej częściowo O-acetylowany, tak Ŝe co najmniej 0%, 60%, 70%, 80%, 90%, 9% lub 98% powtórzonych jednostek jest O-acetylowanych w co najmniej jednej pozycji. O-acetylowanie występuje na przykład co najmniej w pozycji O-3. [007] W pewnej postaci sacharyd MenC, jeśli jest obecny, jest co najmniej częściowo O-acetylowany, tak Ŝe co najmniej %, 40%, 0%, 60%, 70%, 80%, 90%, 9% lub 98% (α2 9)-połączonych powtórzonych jednostek NeuNAc jest O-acetylowanych w co najmniej jednej lub dwóch pozycjach. O-Acetylowanie występuje na przykład co najmniej w pozycji O-7 i/lub O-8. [008] W pewnej postaci sacharyd MenW, jeśli jest obecny, jest co najmniej częściowo O-acetylowany, tak Ŝe co najmniej %, 40%, 0%, 60%, 70%, 80%, 90%, 9% lub 98% powtórzonych jednostek jest O-acetylowanych w co najmniej jednej lub dwóch pozycjach. O-acetylowanie występuje na przykład w pozycji O-7 i/lub O-9. [009] W pewnej postaci sacharyd MenY, jeśli jest obecny, jest co najmniej częściowo O-acetylowany, tak Ŝe co najmniej 40%, 0%, 60%, 70%, 80%, 90%, 9% lub 98% powtórzonych jednostek jest O-acetylowanych w co najmniej jednej lub dwóch pozycjach. O-acetylowanie występuje na przykład w pozycji 7 i/lub 9. [0060] Procent O-acetylowania dotyczy procentu powtórzonych jednostek zawierających O-acetylowanie. MoŜna to mierzyć w sacharydzie przed sprzęganiem i/lub po sprzęganiu. [0061] Kolejnym aspektem wynalazku jest szczepionka zawierająca kompozycję immunogenną według wynalazku i farmaceutycznie dopuszczalną zaróbkę. [0062] Ewentualnie kompozycja immunogenna lub szczepionka zawiera adiuwant w ilości wystarczającej do wzmocnienia odpowiedzi immunologicznej na immunogen. Do odpowiednich adiuwantów naleŝą, lecz nie wyłącznie, sole glinu (fosforan glinu lub wodorotle-

13 nek glinu), mieszaniny skwalenu (SAF-1), peptyd muramylowy, pochodne saponiny, preparaty ściany komórkowej mykobakterii, monofosforylowany lipid A, pochodne kwasu mykolowego, środki powierzchniowo czynne typu niejonowych kopolimerów blokowych, Quit A, podjednostka B toksyny cholery, polifosfazen i pochodne, oraz kompleksy immunostymulujące (ISCOM), takie jak te opisane przez Takahashi i in. (1990) Nature 344: [0063] Dla omówionych powyŝej kombinacji HibMen, korzystne moŝe być aby koniugaty sacharydów Hib i Men nie były adsorbowane na adiuwancie typu soli glinu albo w ogóle na Ŝadnym adiuwancie. [0064] W pewnej postaci kompozycja immunogenna nie zawiera adiuwanta. Dla celów wynalazku, nie zawiera adiuwanta oznacza, Ŝe składnik adiuwantowy, który sam w sobie nie jest składnikiem antygenowym nie jest obecny w kompozycji immunogennej. [006] W pewnej postaci wynalazku HepB jest zaadsorbowany na fosforanie glinu (WO 93/24148). [0066] W pewnej postaci kompozycja immunogenna zawiera sacharyd Hib sprzęŝony z toksoidem tęŝcowym poprzez łącznik i sacharyd MenC sprzęŝony z toksoidem tęŝcowym bezpośrednio lub poprzez łącznik i sacharyd MenA sprzęŝony z toksoidem tęŝcowym bezpośrednio lub poprzez łącznik. [0067] W pewnej postaci kompozycja immunogenna według wynalazku jest buforowana lub doprowadzona do ph między 7,0 i 8,0, ph 7,2 i 7,6 lub ph około lub dokładnie 7,4. [0068] Kompozycja immunogenna lub szczepionki według wynalazku są ewentualnie liofilizowane w obecności środka stabilizującego, na przykład poliolu, takiego jak sacharoza lub trehaloza. [0069] Tak jak w przypadku wszystkich kompozycji immunogennych lub szczepionek, immunologicznie skuteczne ilości immunogenów trzeba wyznaczyć empirycznie. Do czynników, które naleŝy uwzględnić naleŝą immunogenność, to czy immunogen będzie czy nie będzie skompleksowany lub kowalencyjnie związany z adiuwantem lub białkiem nośnikowym lub innym nośnikiem, droga podawania i liczba dawek immunizacyjnych, które mają być podane. Takie czynniki są znane w dziedzinie szczepionek i w zakresie umiejętności immunologów leŝy przeprowadzenie takich oznaczeń bez zbędnego eksperymentowania. [0070] Środek czynny moŝe być obecny w róŝnych stęŝeniach w kompozycji farmaceutycznej lub szczepionce według wynalazku. Zazwyczaj minimalne stęŝenie substancji jest ilością wymaganą do uzyskania jej zamierzonego zastosowania, podczas gdy stęŝeniem maksymalnym jest maksymalna ilość, która pozostanie w roztworze lub zostanie przepro-

14 wadzona w homogenną zawiesinę w początkowej mieszaninie. Przykładowo minimalna ilość środka terapeutycznego jest ewentualnie taka, która dostarczy pojedynczą terapeutycznie skuteczną dawkę. Dla substancji biologicznie czynnych, minimalne stęŝenie jest ilością niezbędną dla aktywności biologicznej po roztworzeniu, a stęŝenie maksymalne jest w punkcie, w którym nie moŝna utrzymać homogennej zawiesiny. W przypadku jednostek jednodawkowych ilość jest taka, jak dla pojedynczego zastosowania terapeutycznego. Ogólnie oczekuje się, Ŝe kaŝda dawka będzie zawierać 1-0 µg antygenu białkowego, ewentualnie -0 µg lub -2 µg. Preparaty szczepionek według niniejszego wynalazku moŝna stosować w celu profilaktyki lub leczenia ssaka (na przykład pacjenta będącego człowiekiem) podatnego na zakaŝenie przez podawanie tej szczepionki drogą ogólnoustrojową lub śluzówkową. Pacjentem będącym człowiekiem jest ewentualnie niemowlę (poni- Ŝej 12 miesięcy), dziecko uczące się chodzić (12-24, lub miesięcy), dziecko (2-, 3-8 lub 3- lat), nastolatek (12-2, lub 1-19 lat) lub osoba dorosła (w dowolnym wieku powyŝej 12, 1, 18 lub 21). To podawanie moŝe obejmować wstrzyknięcie drogą domięśniową, dootrzewnową, śródskórną lub podskórną; lub podawanie śluzówkowe doustnie/do układu pokarmowego, oddechowego, moczowo-płciowego. Korzystne jest podawanie donosowe szczepionek do leczenia zapalenia płuc lub zapalenia ucha środkowego (poniewaŝ moŝe ono skuteczniej zapobiegać nosowo-gardłowemu przenoszeniu pneumokoków, co tłumi zakaŝenie na jego najwcześniejszym etapie). Pomimo Ŝe szczepionka według wynalazku moŝe być podawana w postaci pojedynczej dawki, jej składniki moŝna teŝ współpodawać razem w tym samym punkcie czasowym lub w róŝnych punktach czasowych (na przykład jeŝeli sacharydy są obecne w szczepionce, moŝna je podawać osobno w tym samym punkcie czasowym lub 1-2 tygodnie po podaniu szczepionki z białkiem bakteryjnym, w celu optymalnej koordynacji odpowiedzi immunologicznych względem siebie). Oprócz pojedynczej drogi podawania moŝna zastosować 2 róŝne drogi podawania. Przykładowo antygeny wirusowe moŝna podawać ID (śródskórnie), podczas gdy białka bakteryjne moŝna podawać IM (domięśniowo) lub IN (donosowo). JeŜeli obecne są sacharydy, moŝna je podawać IM (lub ID), a białka bakteryjne moŝna podawać IN (lub ID). Dodatkowo szczepionki według wynalazku moŝna podawać IM przy dawkach początkowych i IN przy dawkach przypominających. [0071] Wytwarzanie szczepionek jest ogólnie opisane w Vaccine Design ( The subunit and adjuvant approach (red. Powell M.F. i Newman M.J.) (199) Plenum Press Nowy Jork). Zamykanie w liposomach jest opisane przez Fullerton, Patent US [0072] Kolejnym aspektem wynalazku jest zestaw szczepionkowy do jednoczesnego lub sekwencyjnego podawania zawierający dwie wielowaŝne kompozycje immunogenne do

15 nadawania gospodarzowi ochrony przeciw chorobie wywołanej przez Bordetella pertussis, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheriae, Haemophilus influenzae i Neisseria meningitidis. Przykładowo zestaw ewentualnie zawiera pierwszy pojemnik zawierający jeden lub większą liczbę składników spośród: toksoidu tęŝcowego (TT), toksoidu błoniczego (DT), oraz pełnokomórkowych składników krztuścowych oraz ewentualnie zawierający ponadto antygen powierzchniowy wirusa zapalenia wątroby typu B i drugi pojemnik zawierający: koniugat sacharydu Hib oraz co najmniej jeden, dwa, trzy lub cztery koniugaty sacharydu N. meningitidis, przy czym dawka sacharydu z koniugatu Hib wynosi poniŝej µg lub 4 µg, lub 1-4 µg lub 1-3 µg, lub 2-4 µg lub 2-3 µg albo około lub dokładnie 2, µg i ewentualnie dawka sacharydu z tego lub co najmniej lub dokładnie jednego, dwóch, trzech lub czterech dodatkowych koniugatów sacharydów bakteryjnych (na przykład koniugatów sacharydów N. meningitidis) wynosi poniŝej µg, 9 µg, 8 µg, 7 µg, 6 µg, µg lub 4 µg, albo między 1- µg, 1-8 µg, 1-6 µg, 1- µg, 1-4 µg, 1-3 µg, lub 2-4 µg lub 2-3 µg albo około lub dokładnie 2, µg. [0073] Przykłady koniugatu Hib oraz co najmniej jednego dodatkowego koniugatu sacharydu bakteryjnego (na przykład sacharydu N. meningitidis) opisano powyŝej. Którakolwiek z właściwości opisanych powyŝej koniugatów moŝe być obecna w zestawie szczepionkowym. [0074] Ewentualnie zestawy szczepionkowe według wynalazku zawierają trzeci składnik. Przykładowo zestaw zawiera ewentualnie pierwszy pojemnik zawierający jeden lub większą liczbę spośród: toksoidu tęŝcowego (TT), toksoidu błoniczego (DT), oraz pełnokomórkowych składników krztuścowych oraz ewentualnie zawierający ponadto antygen powierzchniowy wirusa zapalenia wątroby typu B; i drugi pojemnik zawierający: jeden lub większą liczbę koniugatów białka nośnikowego i sacharydu otoczkowego ze Streptococcus pneumoniae [przy czym sacharyd otoczkowy jest ewentualnie z serotypu pneumokokowego wybranego z grupy obejmującej 1, 2, 3, 4,, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V,

16 A, 11A, 12F, 14, 1B, 17F, 18C, 19A, 19F,, 22F, 23F i 33F]. i trzeci pojemnik zawierający: koniugat sacharydu Hib oraz co najmniej jeden koniugat sacharydu N. meningitidis, przy czym dawka sacharydu z koniugatu Hib wynosi poniŝej µg lub 4 µg, lub 1-4 µg lub 1-3 µg, lub 2-4 µg lub 2-3 µg albo około lub dokładnie 2, µg i ewentualnie dawka sacharydu z wszystkich lub co najmniej lub dokładnie jednego, dwóch, trzech lub czterech dodatkowych koniugatów sacharydów bakteryjnych (na przykład koniugatów sacharydów N. meningitidis) wynosi poniŝej µg, 9 µg, 8 µg, 7 µg, 6 µg, µg lub 4 µg, albo między 1- µg, 1-8 µg, 1-6 µg, 1- µg, 1-4 µg, 1-3 µg, lub 2-4 µg lub 2-3 µg albo około lub dokładnie 2, µg. [007] Kompozycje immunogenne zawierające koniugaty meningokokowe, na przykład HibMenC, HibMenAC, HibMenAW, HibMenAY, HibMenCW, HibMenCY, HibMenWY, MenAC, MenAW, MenAY, MenCW, MenCY, MenWY lub MenACWY, w tym zestawy o podobnym składzie do tych opisanych powyŝej, zawierają ewentualnie antygeny odry i/lub świnki i/lub róŝyczki i/lub ospy wietrznej. Przykładowo meningokokowa kompozycja immunogenna zawiera antygeny odry, świnki i róŝyczki lub odry, świnki, róŝyczki i ospy wietrznej. W pewnej postaci, te antygeny wirusowe są ewentualnie obecne w tym samym pojemniku, co koniugat(-y) meningokokowy(-e) i/lub sacharydu Hib. W pewnej postaci te wirusowe antygeny są liofilizowane. [0076] Kolejny aspekt wynalazku stanowi sposób wytwarzania kompozycji immunogennej według wynalazku, obejmujący etap mieszania koniugatu sacharydu Hib z co najmniej jednym dodatkowym koniugatem sacharydu bakteryjnego (na przykład N. meningitidis) i kolejnym antygenem wybranym z grupy obejmującej pełnokomórkowy składnik krztuścowy i antygen powierzchniowy wirusa zapalenia wątroby typu B z wytworzeniem kompozycji, w której dawka sacharydu z koniugatu Hib wynosi poniŝej µg lub 4 µg, lub 1-4 µg lub 1-3 µg, lub 2-4 µg lub 2-3 µg albo około lub dokładnie 2, µg i ewentualnie dawka sacharydu z wszystkich lub co najmniej lub dokładnie jednego, dwóch, trzech lub czterech dodatkowych koniugatów sacharydów bakteryjnych (na przykład N. meningitidis) wynosi poniŝej µg, 9 µg, 8 µg, 7 µg, 6 µg, µg lub 4 µg, albo między 1- µg, 1-8 µg, 1-6 µg, 1- µg, 1-4 µg, 1-3 µg lub 2-4 µg lub 2-3 µg albo około lub dokładnie 2, µg. [0077] Kolejny aspekt ujawnienia stanowi sposób immunizacji ludzkiego gospodarza przeciw chorobie wywołanej zakaŝeniem Naemophilus influenzae i ewentualnie N. meningitidis, obejmujący podawanie gospodarzowi immunoochronnej dawki kompozycji immunogennej lub szczepionki lub zestawu według wynalazku.

17 [0078] Kolejny aspekt wynalazku stanowi kompozycja immunogenna według wynalazku do stosowania w leczeniu lub profilaktyce choroby wywołanej przez Haemophilus influenzae i/lub N. meningitidis. [0079] Kolejny aspekt wynalazku stanowi zastosowanie kompozycji immunogennej lub szczepionki lub zestawu według wynalazku do wytwarzania leku do leczenia lub profilaktyki chorób wywołanych przez Haemophilus influenzae i/lub N. meningitidis. [0080] W zamierzeniu twórców wynalazku określenia zawierający, zawierać i zawiera w kaŝdym przypadku są ewentualnie zamienne z określeniami odpowiednio składający się z, składać się z i składa się z. [0081] Wynalazek jest zilustrowany przez dołączone przykłady. PoniŜsze przykłady wykonano z zastosowaniem standardowych technik, które są dobrze znane i rutynowo stosowane przez specjalistów w dziedzinie, z wyjątkiem przypadków, gdy opisano je szczegółowo. Przykłady mają na celu zilustrowanie wynalazku, ale nie ograniczają jego zakresu. Przykłady Przykład 1. Wytwarzanie koniugatów polisacharydu [0082] Kowalencyjne wiązanie polisacharydu Haemophilus influenzae (Hib) w postaci PRP z TT przeprowadzono metodą sprzęgania opracowaną przez Chu i in. (Infection and Immunity 1983, 40 (1); 24-26). Polisacharyd Hib w postaci PRP aktywowano przez dodanie CNBr i inkubację przy ph, przez 6 minut. ph obniŝono do ph 8,7 i dodano dihydrazyd kwasu adypinowego (ADH) i kontynuowano inkubację przez kolejne 90 minut. Aktywowany PRP sprzęŝono z oczyszczonym toksoidem tęŝcowym na drodze kondensacji karbodiimidowej z uŝyciem 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodiimidu (EDAC). EDAC dodano do aktywowanego PRP do uzyskania końcowego stosunku 0,6 mg EDAC/mg aktywowanego PRP. ph doprowadzono do,0 i dodano oczyszczony toksoid tęŝcowy do uzyskania 2 mg TT/mg aktywowanego PRP. Uzyskany roztwór pozostawiono na 3 dni w trakcie łagodnego mieszania. Po przesączeniu przez membranę 0,4 µm, koniugat oczyszczono na kolumnie sephacryl S00HR (Pharmacia, Szwecja) zrównowaŝonej 0,2M NaCl. [0083] Koniugaty MenC-TT wytworzono z zastosowaniem natywnych polisacharydów (o masie powyŝej kda mierzonej metodą MALLS) lub w niewielkim stopniu je mikrofluidyzowano. Koniugaty MenA-TT wytworzono z zastosowaniem natywnego polisacharydu lub polisacharydu w niewielkim stopniu mikrofluidyzowanego, o masie powyŝej 60 kda mierzonej metodą MALLS z przykładu 2. Koniugaty MenW i MenY-TT wytworzono z wykorzystaniem polisacharydów o dopasowanej wielkości około 0-0 kda mierzonej metodą MALLS (patrz przykład 2). Dopasowywanie wielkości przeprowadzono poprzez

18 mikrofluidyzację z uŝyciem jako homogenizatora aparatu Emulsiflex C-0. Polisacharydy przesączono następnie przez filtr 0,2 µm. [0084] Aktywację i sprzęganie przeprowadzono tak jak opisano w WO96/29094 i WO 00/6360. W skrócie polisacharyd w stęŝeniu - mg/ml w 2M NaCl ph,-6,0 wymieszano z roztworem CDAP (0 mg/ml świeŝo przygotowany w acetonitrylu/wfi, 0/0) do końcowego stosunku CDAP/polisacharyd 0,7/1 lub 1,/1. Po 1, minutach ph podwyŝszono wodorotlenkiem sodu do ph,0. Po trzech minutach dodano toksoid tęŝcowy do uzyskania stosunku białko/polisacharyd 1,/1 dla MenW, 1,2/1 dla MenY, 1,/1 dla MenA lub 1,/1 dla MenC. Reakcję kontynuowano przez jedną do dwóch godzin. [008] Po etapie sprzęgania dodano glicynę do końcowego stosunku glicyna/ps (wag./wag.) 7,/1 i ph doprowadzono do ph 9,0. Mieszaninę pozostawiono na minut. Koniugat sklarowano z zastosowaniem filtru µm Kleenpak, a następnie naniesiono na kolumnę Sephacryl S400HR z zastosowaniem buforu do elucji mm NaCl, mm lub mm Tris ph7,. Serie kliniczne przesączono przez membranę jałowiącą Opticap 4. Otrzymane koniugaty miały średni stosunek polisacharyd:białko równy 1:1-1: (wag./wag.). [0086] W celu sprzęŝenia polisacharydu otoczkowego MenA z toksoidem tęŝcowym poprzez grupę rozdzielającą, zastosowano następującą metodę. Kowalencyjne wiązanie polisacharydu i grupy rozdzielającej (ADH) przeprowadzono metodą sprzęgania, w której polisacharyd jest aktywowany w kontrolowanych warunkach środkiem cyjanylującym, tetrafluoroboranem 1-cyjano-4-dimetyloaminopirydyny (CDAP). Grupa rozdzielająca reaguje z cyjanylowanym PS przez swoje grupy hydrazynowe z wytworzeniem stabilnego wiązania izomocznikowego między grupą rozdzielającą i polisacharydem. [0087] Na mg/ml roztwór MenA podziałano świeŝo przygotowanym 0 mg/ml roztworem CDAP w acetonitrylu/wodzie (0/0 (obj./obj.)) do uzyskania stosunku CDAP/MenA 0,7 (wag./wag.). Po 1, minuty ph podwyŝszono do ph,0. Trzy minuty później dodano ADH do uzyskania stosunku ADH/MenA 8,9. ph roztworu obniŝono do 8,7 i reakcję prowadzono przez kolejne 2 godziny. [0088] Przed reakcją sprzęgania, roztwór oczyszczonego TT i roztwór PSA AH rozcieńczono do uzyskania stęŝenia mg/ml dla PSA AH i mg/ml dla TT. Do roztworu PS AH dodano EDAC w celu osiągnięcia końcowego stosunku 0,9 mg EDAC/mg PSA AH. ph doprowadzono do,0. Dodano oczyszczony toksoid tęŝcowy z uŝyciem pompy perystaltycznej (przez 60 minut) do uzyskania 2 mg TT/mg PSA AH - Otrzymany roztwór pozostawiono na 60 minut w +2 C w trakcie mieszania do osiągnięcia końcowego czasu sprzęgania 1 minut. Koniugat sklarowano z zastosowaniem filtra

19 18 µm i oczyszczono z uŝyciem kolumny Sephacryl S400HR. Przykład 2. Wyznaczanie masy cząsteczkowej metodą MALLS [0089] Detektory połączono z kolumną HPLC do chromatografii wykluczenia względem wielkości, z której eluowano próbki. Z jednej strony laserowy detektor fotodyspersyjny mierzył natęŝenia światła rozpraszanego pod 16 kątami przez roztwór makrocząsteczek, a z drugiej strony refraktometr interferometryczny umieszczony szeregowo umoŝliwiał wyznaczenie ilości wyeluowanej próbki. Na podstawie tych natęŝeń moŝna wyznaczyć wielkość i kształt makrocząsteczek w roztworze. [0090] Wagowo średnia masa cząsteczkowa (M w ) jest zdefiniowana jako suma mas wszystkich rodzajów cząsteczek, pomnoŝona przez ich odpowiednie masy cząsteczkowe i podzielona przez sumę mas wszystkich rodzajów cząsteczek. a) Wagowo średnia masa cząsteczkowa: -Mw- b) Liczbowo średnia masa cząsteczkowa: -Mn- 1 c) Średnia kwadratowa wartość promienia: -Rw-, a R 2 w oznacza kwadrat promienia zdefiniowany jako: R 2 w lub 2 (-m i - oznacza masę centrum rozpraszającego i, a -r i - oznacza odległość między centrum rozpraszającym i oraz środkiem cięŝkości makrocząsteczki). d) Polidyspersyjność jest zdefiniowana jako stosunek -Mw / Mn-. [0091] Polisacharydy meningokokowe analizowano metodą MALLS przez naniesienie na dwie kolumny HPLC (TSKG6000 i 000PWxl TOSOH Bioscience) stosowane w połączeniu. 2 µl polisacharydu naniesiono na kolumnę i wymyto 0,7 ml przefiltrowanej wody. Polisacharydy wykrywa się z uŝyciem laserowego detektora fotodyspersyjnego (Wyatt Dawn DSP wyposaŝonego w mw laser argonowy przy 488 nm) i refraktometru interferometrycznego (Wyatt Otilab DSP wyposaŝonego w celkę P0 i czerwony filtr przy 498 nm). [0092] Polidyspersyjności masy cząsteczkowej i odzyski wszystkich próbek wyliczono metodą Debye a z zastosowaniem dopasowania przy pomocy wielomianu rzędu 1 w opro-

20 19 1 gramowaniu Astra Przykład 3. Faza II badań klinicznych konigatowej szczepionki HibMenAC-TT wymieszanej z DTPwHepB [0093] Projekt badania: otwarte, zrandomizowane (1:1:1:1:1) badanie w jednym ośrodku z pięcioma grupami. Te pięć grup otrzymywało szczepienia zgodnie z następującym schematem, odpowiednio w wieku 6, i 14 tygodni. Tritanrix -HepB/Hib-MenAC 2,/2,/2,: nazywana odtąd 2,/2,/2, Tritanrix -HepB/Hib-MenAC 2,//: nazywana odtąd 2,// Tritanrix -HepB/Hib-MenAC //: nazywana odtąd // Tritanrix -HepB + Hiberix : nazywana odtąd Hiberix Tritanrix -HepB/Hiberix + Meningitec : nazywana odtąd Meningitec Próbki krwi pobrano w momencie podania pierwszej dawki szczepionki (Pre) i jeden miesiąc po trzeciej dawce szczepionki (Post-dose 3). [0094] Tritanrix jest szczepionką DTPw wprowadzoną na rynek przez GlaxoSmithKline Biologicals S.A. KaŜda z pięciu grup obejmowała osobników, co dało w sumie 2 osobników w badaniu. Tabela 1 Składniki na dawkę (0, ml) 2,/2,/2,* 2,// // Otoczkowy polisacharyd Hib w postaci PRP sprzęŝony z toksoidem tęŝcowym (TT) Otoczkowy polisacharyd A Neisseria meningitidis (PSA) sprzęŝony z TT Otoczkowy polisacharyd C Neisseria meningitidis (PSC) sprzęŝony z TT 2, µg 2, µg µg 2, µg µg µg 2, µg µg µg * Szczepionka 2,/2,/2, stanowiła rozcieńczenie dawki szczepionki Hib-MenAC // GSK Biologicals zawierające po 2, µg kaŝdego z PRP-TT, MenA-TT i MenC-TT. 2 [009] Preparaty szczepionki Hib-MenAC wymieszano bezpośrednio przed uŝyciem z Tritanirix-HepB. Skojarzona szczepionka GSK Biologicals błonica-tęŝec-całe komórki pałeczek krztuśca-wirus zapalenia wątroby typu B (DTPw-HB) (Tritanrix-HepB) zawiera nie mniej niŝ międzynarodowych jednostek (IU) toksoidu błoniczego, nie mniej niŝ 60 IU toksoidu tęŝcowego, nie mniej niŝ 4 IU uśmierconych pałeczek krztuśca i µg rekombinowanego antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B. Terapia odniesienia, dawka, tryb podawania, nr serii: [0096] Schemat/miejsce szczepienia: Jedna grupa otrzymała szczepionkę Tritanrix.-HepB

21 domięśniowo w lewe udo i Hiberix domięśniowo w prawe udo w wieku 6, i 14 tygodni. Inna grupa otrzymała szczepionkę Tritanrix -HepB/Hiberix domięśniowo w lewe udo i szczepionkę Meningitec domięśniowo w prawe udo w wieku 6, i 14 tygodni. Szczepionka/skład/dawka/numer serii: zastosowana szczepionka Tritanrix -HepB była taka jak opisano powyŝej. Jedna dawka (0, ml) konigatowej szczepionki GSK Biologicals przeciw Haemophilus influenzae typu b: Hiberix zawierała µg PRP sprzęŝonego z toksoidem tęŝcowym. W grupie Hiberix wymieszano ją z jałowym rozcieńczalnikiem, a w grupie Meningitec wymieszano ją z Tritanrix-HepB. Jedna dawka (0, ml) szczepionki MENINGITEC Wyeth Lederle zawierała: µg otoczkowego polisacharydu meningokokowej grupy C sprzęŝonego z 1 µg białka CRM197 Corynebacterium diphtheria i glin w postaci soli. Wyniki - odpowiedzi immunologiczne wytworzone przeciwko Hib, MenA i MenC [0097]