OCENA BIOAKTYWNOŚCI POCHODNEJ INSULINY LUDZKIEJ. Badania biologiczne w pracach badawczo-rozwojowych produktów leczniczych

Transkrypt

1 Związek z odpowiedzią kliniczną Przydatność do zwalniania serii StatSoft Polska, tel , , info@statsoft.pl, OCENA BIOAKTYWNOŚCI POCHODNEJ INSULINY LUDZKIEJ Monika Pawłowska, Instytut Biotechnologii i Antybiotyków Badania biologiczne w pracach badawczo-rozwojowych produktów leczniczych Leki biologiczne zawierają substancje biologiczną wyprodukowaną lub wyekstrahowaną z materiału biologicznego [1], często powstają na drodze biotechnologicznej, metodami rekombinacji DNA i w przeciwieństwie do leków chemicznych mają złożoną strukturę, którą trudno w pełni scharakteryzować metodami fizyko-chemicznymi. Różnice w strukturze wyższej rzędowości mogą generować różnice w aktywności biologicznej substancji aktywnych o tym samym wzorze chemicznym, a w konsekwencji być przyczyną różnic w skuteczności i bezpieczeństwie produktów leczniczych [2]. W świetle powyższego, znaczenia nabierają techniki badawcze, które uzupełniają metody analityczne (m.in. wysokosprawna chromatografia cieczowa HPLC, elektroforeza IEF, spektrometria mas MS, dychroizm kołowy CD, magnetyczny rezonans jądrowy NMR) w pełnym scharakteryzowaniu aktywności biologicznej cząsteczek. Testy biologiczne, jakie powszechnie wykorzystuje się w pracach badawczo-rozwojowych nad nową cząsteczką potencjalnego produktu leczniczego lub produktem odtwórczym, szczególnie w odniesieniu do leków biologicznych (tzw. leki biopodobne), prowadzone są na zwierzętach, liniach komórkowych lub strukturach komórkowych (np. oddziaływanie receptor-ligand) (rys. 1) [3]. Badania w ocenie aktywności biologicznej Duży Zwierzęta Mała Izolowane komórki Mały Linie komórkowe Wiązanie receptor-ligand Fizyko-chemiczne Duża Rys. 1. Testy in vitro i in vivo w wyznaczaniu mocy substancji aktywnej. Copyright StatSoft Polska

2 Pod pojęciem aktywności biologicznej rozumie się specyficzną możliwość i zdolność produktu do osiągania założonego i zdefiniowanego efektu biologicznego. Moc (podawana w jednostkach aktywności) jest ilościowym wyrażeniem aktywności biologicznej [4] i wynika z cech fizyko-chemicznych produktu w powiązaniu z biologicznymi właściwościami. Ilość substancji aktywnej, wyrażana w jednostkach masy, jest tylko fizykochemicznym oznaczeniem zawartości związku. Korelacja pomiędzy odpowiedzią kliniczną a aktywnością biologiczną powinna być ustalona, o ile jest to wymagane dla danego produktu, w badaniach farmakodynamicznych lub klinicznych. Wyznaczenie specyficznej mocy albo określenie bioidentyczności oparte na funkcjonalnych testach jest wymagane dla większości leków biologicznych (w tym biotechnologicznych) dostępnych na rynku USA. Dla niektórych mniejszych białek/peptydów (wazopresyna, oksytocyna) do wyznaczania mocy akceptowane są testy oparte o HPLC. Dla innych białek (np. insulina, hormon wzrostu, glukagon) wymagane jest przeprowadzenie testów biologicznych na zwierzętach lub liniach komórkowych. Farmakopea Europejska nie wymaga dla tych związków testów biologicznych na materiale zwierzęcym, wyznaczających liczbę jednostek aktywności lub bioidentyczność. Jednak testy te zajmują istotne miejsce w procesie rozwoju nowych (innowacyjnych lub biopodobnych) produktów, również w Europie. Wyznaczanie aktywności biologicznej analogów insuliny ludzkiej Zawarty w Farmakopei Amerykańskiej (USP) test bioaktywności insuliny ludzkiej [5, 6] można zastosować do: określenia mocy insuliny wobec standardu referencyjnego, walidacji stabilności dla nowych preparatów insulinowych, określenia specyficznej aktywności nowych analogów insuliny. Badania na grupie 8 osobników służą do określenia bioidentyczności, dla stwierdzenia której wystarczającym warunkiem jest uzyskanie wartości mocy bezwzględnej powyżej 15 j./mg, i znajdują zastosowanie m.in. w ocenie stabilności. Testy te są niekiedy wymagane dla zwolnienia serii produkcyjnej. Ze względu na dużą zmienność systemów biologicznych oraz związane z tym ryzyko niespełnienia kryterium akceptacji obecnie odstępuje się, w przypadku badań insuliny i jej pochodnych, od badań na zwierzętach, udowadniających bioidentyczność w procesie zwalniania produktów na rynek [7, 8, 9]. Badanie na grupie liczącej co najmniej 24 osobniki umożliwia dokładny pomiar mocy z wyznaczeniem 95% przedziału ufności i może stanowić kluczowy etap w określaniu biologicznej aktywności nowego produktu Copyright StatSoft Polska 2014

3 Określenie bioaktywności biopodobnego preparatu insuliny lispro Instytut Biotechnologii i Antybiotyków (IBA) od kilku lat prowadzi badania nad analogami insuliny ludzkiej, które poprzez zmiany wprowadzone w łańcuch insuliny mają zmienione właściwości farmakodynamiczne i farmakokinetyczne. Jednym z tych związków jest biopodobna insulina lispro (preparat innowacyjny - Humalog ; pierwszy zarejestrowany analog insuliny (1996 r.)). Dzięki inwersji aminokwasów w pozycjach 28 i 29 łańcucha B insuliny ludzkiej (Lys-Pro zamiast Pro-Lys) uzyskano związek mający mniejszą tendencję do tworzenia heksametrów, przez co wykazujący szybszą absorpcję po podaniu podskórnym i szybki efekt hipoglikemizujący [10, 11]. Prezentowane w tym artykule badania zostały zaplanowane w ramach projektu Centrum biotechnologii produktów leczniczych. Pakiet innowacyjnych biofarmaceutyków dla terapii i profilaktyki ludzi i zwierząt. i były dofinansowane z publicznych środków wspólnotowych pochodzących z Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego (POIG /08-00). Badania przeprowadzono we współpracy Instytutu Biotechnologii i Antybiotyków z Instytutem Medycyny Pracy im. prof. J. Nofera, (Zakład Toksykologii i Kancerogenezy) z Łodzi. Cel badań W pracach badawczo-rozwojowych nad opracowaną w IBA substancją aktywną, krótko działającym analogiem insuliny - insuliną lispro (AN3), jednym z etapów było określenie aktywności związku z wykorzystaniem testu biologicznego. W tym celu zdecydowano o zastosowaniu testu opisanego w Farmakopei Amerykańskiej dla preparatów insuliny ludzkiej (<121> Insulin Assays, USP 32) [5] w modyfikacji wskazanej w monografii Insulin Lispro (USP 32) [12]. Metody The rabbit blood sugar method-quantitative [5] oraz Bioidentity test [5] są wykorzystywane w celu wyznaczenia specyficznych aktywności preparatów insuliny i jej analogów na etapie badawczym oraz do oceny stabilności nowych preparatów insulinowych. Na etapie badawczo-rozwojowym insuliny AN3 przeprowadzono wiele badań bioaktywności w ocenie jakości substancji oraz produktu leczniczego w oparciu o wystandaryzowaną metodę farmakopealną. W omawianej pracy zaprezentowane są wyniki bioaktywność, reprezentacyjne dla całego panelu badań, dla których celem było określenie mocy substancji insuliny lispro AN3 w porównaniu do produktów referencyjnych: standardu USP insuliny lispro i preparatu referencyjnego Humalog. Schemat badań Do oznaczenia mocy analogu insuliny - insuliny lispro AN3 - zastosowano model podwójnego układu krzyżowego, w którym produkt IBA oraz produkty referencyjne były podane w dwóch dawkach w układzie krzyżowym (tabela 1.). Doświadczenie zostało podzielone na dwie fazy badania, rozdzielone w czasie okresem wymywania. Zwierzęta Copyright StatSoft Polska

4 biorące udział w doświadczeniu podzielono na 4 równoliczne grupy. Osobniki, które otrzymały preparat referencyjny w pierwszej fazie, w drugiej fazie otrzymały preparat badany, i na odwrót. Jednocześnie zwierzęta, które w pierwszej fazie otrzymały mniejszą dawkę produktu, w drugiej fazie otrzymały większą dawkę. Tabela 1. Schemat badania. Faza badania Grupa badania I - pierwsze podanie preparatu (preparat/dawka) R/1 j. R/2 j. T/1 j. T/2 j. Okres wymywania (dni) II- drugie podanie preparatu (preparat/dawka) T/2 j. T/1 j. T/2 j. T/1 j. R preparat referencyjny (stężenie roztworu w j./ml). T preparat badany (stężenie roztworu w j.r./ml). Metodyka badawcza W omawianej pracy wyniki pochodzą z dwóch badań bioaktywności: I badanie substancji insuliny lispro AN3 (IBA) w porównaniu ze wzorcem USP insuliny lispro; II badanie substancji insuliny lispro AN3 (IBA) w porównaniu z preparatem referencyjnym Humalog (Eli Lilly); Badania uzyskały zgodę Lokalnej Komisji Etycznej do spraw doświadczeń na zwierzętach w Łodzi. Zwierzęta Oba badania przeprowadzono na 24 zdrowych królikach albinotycznych obu płci, w wieku 2,5 3 miesiące, o masie ciała przekraczającej 1800 g. Paszę i wodę zwierzęta otrzymywały ad libitum przez cały okres adaptacji oraz po pobraniu krwi w czasie 2,5 h po podaniu badanych roztworów. Na czas 24 godzin przed podskórnym podaniem analogów insuliny królikom ograniczano porcje paszy podając im ilość odpowiadającą 25% dobowego spożycia wyznaczonego dla każdego osobnika. Bez dostępu do paszy zwierzęta pozostawały przez cały okres próbkowania. Zwierzęta były obserwowane pod kątem oceny stanu zdrowia i zachowania. Preparaty badane Roztwory robocze (40 j./ml) zostały przygotowane w oparciu o moc podaną dla produktów referencyjnych (standard USP insuliny lispro i Humalog ) oraz moc zakładaną dla nowego związku (insuliny AN3) Copyright StatSoft Polska 2014

5 Z roztworów roboczych o stężeniu 40 j./ml (lub j.r./ml) przez odpowiednie rozcieńczenie, z użyciem rozcieńczalnika powstałego z oparciu o przepis USP 32 [5], przygotowano roztwory do badań o stężeniach 1 j./ml oraz 2 j./ml (lub j.r./ml). Tabela 2. Dane o produktach porównywanych w badaniach bioaktywności analogu insuliny ludzkiej AN3. Badanie I II AN3 substancja USP RS Insulin AN3 substancja Preparaty porównywane (T) Lispro (R) (T) Zawartość substancji aktywnej Stężenie końcowe roztworu roboczego Masa/Objętość substancji/roztworu wyjściowego w 1 ml roztworu roboczego 26,16 [j.r./mg] 40 [j.r./ml] 1,529 [mg] 166 [j.usp insulin lispro/5,76 mg] 40 [j./ml] 1,338 [mg] 26,89 [j.r./mg] 40 [j.r./ml] 1,487 [mg] Humalog (R) 100,00 [j./ml] 40 [j./ml] 0,4 [ml] Droga podania Roztwory preparatu badanego i referencyjnych o stężeniach 1 j./ml oraz 2 j./ml (lub j.r./ml) podawano zwierzętom podskórnie w fałd skóry na udzie w objętości nieprzekraczającej 0,50 ml. W każdym przypadku objętość roztworów była taka sama. Pomiar stężenia glukozy Krew do oznaczeń stężeń glukozy pobierano z żyły brzeżnej ucha królika po upływie 45 min. i 2,5 h od podania preparatów. Do pobrań używano zestawów Multivette 600 (firmysarstedt), zawierających EDTA jako antykoagulant i fluorek sodu hamujący proces glikolizy. Pomiar dokonywano w osoczu metodą oksydazową, wykorzystując zestaw Glukoza OxyDst G (Alpha Diagnostics). Metoda ta opiera się na utlenianiu glukozy przez oksydazę glukozową do kwasu glukonowego i nadtlenku wodoru, który w obecności peroksydazy reaguje z kwasem 4-hydroksybenzoesowym i 4-aminoantypiryną, tworząc czerwony barwnik chinonoiminę. Intensywność zabarwienia tego związku jest wprost proporcjonalna do stężenia glukozy w próbie. Absorbancję prób badanych oraz wzorca i surowic kontrolnych względem próby ślepej odczytywano przy długości fali λ=520 nm (spektrofotometr UV-VIS). Metoda umożliwiała pomiar absorbancji w zakresie 0-2,0 A. Stężenie glukozy obliczano wg poniższego wzoru: Glukoza (mg/dl) = (A próbybad. : A wz ) stężenie wzorca (mg/dl) Wyznaczanie mocy i analiza statystyczna Suma stężeń glukozy oznaczona u danego osobnika w próbkach pobranych po 45 min. i 2,5 h od podania insuliny była odpowiedzią całkowitą po podaniu produktu referencyjnego (R) lub badanego (T) i została uwzględniona w zasadniczej analizie statystycznej. Copyright StatSoft Polska

6 Z uwagi na przyjęty schemat badawczy przeprowadzano analizę dla podwójnego układu krzyżowego, tzw. ANOVA twin cross-over. W analizie wariancji dla tego typu doświadczenia składowa sumy kwadratów powiązana z równoległością nie jest niezależną od składowej dla różnic pomiędzy królikami. Analiza równoległości linii regresji włącza dodatkowy średni kwadrat błędu otrzymany przez wyodrębnienie składowej równoległości i dwóch składowych interakcji ze składowej wynikającej z różnic odpowiedzi pomiędzy królikami. W analizie wariancji obecne są zatem 3 składowe interakcji wynikające z powtórzeń wewnątrz każdej grupy: dzień x preparat, dzień x regresja liniowa, dzień x nierównoległość. Te interakcje wskazują na tendencje do zmian składników (preparaty, regresja, nierównoległość) między dniami doświadczenia. Odpowiadające tym interakcjom wartości F służą do sprawdzenia ważności badania. Jeśli otrzymane wartości F są istotne, interpretacja wyników badania nie jest jednoznaczna i wymaga ostrożności. W analizie testowano istotność regresji, liniowości i równoległości. Wyniki badania uznawano za statystycznie ważne po uzyskaniu następujących rezultatów analizy wariancji: składnik regresji liniowej istotny (p<0,05), składnik nierównoległości nie jest istotny (p>0,05), składnik nieliniowości nie jest istotny (p>0,05). Jeżeli spełniony był warunek o istotności regresji liniowej i dodatkowo dwa pozostałe warunki dotyczące ważności badania, moc bezwzględna, względna i granice ufności mogły być oszacowane przy zastosowaniu wzorów z USP 32 [5, 13]. Analizę statystyczną oraz wnioskowanie przeprowadzono zgodnie z założeniami podanymi w USP 32 [5, 13]. W tym celu wykorzystano dostosowane do schematu badania makro dla programu STATISTICA: ANOVA twin cross-over. Dla wnioskowania o bioidentyczności wartość mocy bezwzględnej wyznaczonej w warunkach opisywanych badań powinna być nie mniejsza niż 15 jednostek USP na 1 mg. Zakres 95% przedziału ufności (CI) dla wartości mocy względnej nie powinien przekraczać 0,082, co odpowiada ± 10% wartości średniej obliczonej mocy. Jeśli przedział byłby szerszy, badanie należałoby powtórzyć i analizę przeprowadzić jako kombinację dwóch lub więcej serii oznaczeń dla uzyskania akceptowanego CI. Wyniki Analiza danych przeprowadzona w programie STATISTICA daje wyniki prezentowane w postaci: wykresu przedstawiającego rozkład indywidualnych wartości (suma stężeń glukozy w dwóch punktach pomiarowych) po podaniu substancji badanej i referencyjnej jako Copyright StatSoft Polska 2014

7 roztworów o stężeniach 1 j./ml lub 2 j/ml (lub j.r./ml); wykres stanowi graficzne zobrazowanie istnienia równoległości odpowiedzi farmakologicznej po podaniu dwóch badanych substancji lub jej braku; tabeli z wynikami analizy wariancji dla wskazanego modelu, w której wymienione są źródła wariancji i obliczone dla nich wartości prawdopodobieństwa świadczące o istotności statystycznej (p<0,05) lub jej braku; tabeli z wartościami stosunku mocy i odpowiadającego 95% przedziału ufności; Szczegółowe wyniki badań, przeprowadzonych na populacji liczącej 24 zwierzęta (4 grupy po 6 osobników), zaprezentowane są na wykresie 2 i w tabelach 3 i 4 (w przypadku porównań substancji AN3 ze wzorcem USP insuliny lispro) oraz wykresie 3 i w tabelach 5 i 6 (dla porównań substancji AN3 z preparatem referencyjnym Humalog ) odpowiedź [mg/100 ml] lek/treatment: T - AN3 dawka (1 j. lub 2j.) 1 2 lek/treatment: S - ins.lispro Rys. 2. Rozkład wyników źródłowych obrazujących odpowiedź farmakologiczną (suma stężeń glukozy w surowicy w czasie 45 min. i 2,5 h) po podaniu roztworu badanej substancji (AN3) i roztworu referencyjnej substancji (standard USP insuliny lispro) w dawkach 1 j./ml i 2 j./ml (lub j.r./ml) (N=24). Wyniki ANOVA twin corss-over potwierdzają, że proste obrazujące odpowiedź farmakologiczną (jak na rys. 2.) przebiegają równolegle (p>0,05 dla nierównoległości). Odpowiedź nie zmienia się inaczej w czasie w zależności od badanej substancji oraz zależność pomiędzy dawkami nie zależy od czasu podania (czynnik czas x preparat oraz czas x regresja nie wykazują istotności statystycznej). Wyniki nie dowodzą istotnych różnic pomiędzy badanymi substancjami i okresami, w których one były podane. Odpowiedź nie zmienia się inaczej w czasie zależnie od sekwencji podania badanych substancji. Copyright StatSoft Polska

8 Tabela 3. Wyniki analizy wariancji w badaniu oceniającym moc substancji insuliny lispro AN3 wobec standardu USP insuliny lispro (N=24). regresja liniowa - istotna statystycznie odchylenie od równoległości - nie jest istotne statystycznie składnik interakcji (czas x preparat) - nie jest istotny statystycznie składnik interakcji (czas x regresja) - nie jest istotny statystycznie składnik interakcji (czas x nierównoległość) - nie jest istotny statystycznie 1 Źródło wariancji 2 df 3 Suma kwadratów 4 Średni kwadrat 1 Nierównoległość 1 267, ,199 0,351 0,560 2 Czas x preparat , ,321 2,138 0,159 3 Czas x regresja , ,535 2,571 0,125 4 Błąd resztowy między grupami , ,719 5 Obiekty badań , ,932 6 Preparat 1 221, ,407 3,551 0,074 7 Regresja , ,785 88,951 0,000 8 Czas 1 233, ,598 3,746 0,067 9 Czas x nierównoległość 1 79,696 79,696 1,278 0, Błąd resztowy wewnatrz grup ,152 62, Błąd całkowity ,079 5 F 6 p O ważności badania świadczy przede wszystkim czynnik regresji, który jeśli jest istotny, jak w przypadku omawianego badania, dowodzi istnienia statystycznych różnic pomiędzy analizowanymi dawkami i zróżnicowania odpowiedzi farmakologicznej po podaniu roztworu o stężeniu 1 j./ml i 2 j./ml (lub j.r./ml). Tabela 4. Wartość stosunku mocy względnej substancji insuliny lispro AN3 wyznaczona wobec standardu USP insuliny lispro wraz z 95% przedziałem ufności (N=24). 1 Rodzaj wyniku 2 Wartość 1 stosunek mocy 1,157 2 dolny kraniec 95% przedziału ufności 0,985 3 górny kraniec 95% przedziału ufności 1,358 Stosunek mocy względnej insuliny lispro AN3 do standardu USP insuliny lispro wynosi 1,157 z granicami 95% przedziału ufności 0,985-1,358. Mnożąc te wartości przez stałą 40, odpowiadającą założonej mocy 40 jednostek w 1 mililitrze roztworu roboczego, otrzymujemy wartość mocy względnej 46,28 j. USP insuliny lispro/ml i CI: 39,40-54,32. Uwzględniając zawartość substancji aktywnej AN3 w roztworze roboczym o deklarowanej mocy 40 j.r./ml, i mocy obliczonej w badaniu (46,28 j. USP insuliny lispro/ml), moc bezwzględna insuliny lispro AN3 wynosi 30,27 j./mg (vs. USP insulina lispro) Copyright StatSoft Polska 2014

9 wartość/measuremet lek/treatment: S - Humalog dawka/dosage 1 2 lek/treatment: T - AN3 Rys. 3. Rozkład wyników źródłowych obrazujących odpowiedź farmakologiczną (suma stężeń glukozy w surowicy w czasie 45 min. i 2,5 h po podaniu roztworu badanej substancji (AN3) i roztworu preparatu referencyjnego (Humalog ) w dawkach 1 j./ml i 2 j./ml (lub j.r./ml) (N=24). Tabela 5. Wyniki analizy wariancji w badaniu oceniającym moc substancji insuliny lispro AN3 wobec preparatu referencyjnego Humalog (N=24). regresja liniowa - istotna statystycznie odchylenie od równoległości - nie jest istotne statystycznie składnik interakcji (czas x preparat) - nie jest istotny statystycznie składnik interakcji (czas x regresja) - nie jest istotny statystycznie składnik interakcji (czas x nierównoległość) - nie jest istotny statystycznie 1 Źródło wariancji 2 df 3 Suma kwadratów 4 Średni kwadrat 1 Nierównoległość 1 878, ,171 1,107 0,305 2 Czas x preparat , ,075 3,794 0,066 3 Czas x regresja , ,066 2,223 0,152 4 Błąd resztowy między grupami , ,434 5 Obiekty badań , ,696 6 Preparat 1 396, ,233 1,126 0,301 7 Regresja , ,235 19,299 0,000 8 Czas , ,676 3,780 0,066 9 Czas x nierównoległość 1 151, ,550 0,431 0, Błąd resztowy wewnatrz grup , , Błąd całkowity ,646 5 F 6 p Wnioskowanie w oparciu o wyniki ANOVA w porównawczym badaniu krzyżowym insuliny AN3 i preparatu Humalog jest analogiczne jak w badaniu porównującym AN3 ze Copyright StatSoft Polska

10 wzorcem USP insuliny lispro. Zostały spełnione warunki konieczne do wiarygodnego wyznaczenia mocy bezwzględnej, względnej oraz granic ufności. Tabela 6. Wartość stosunku mocy względnej substancji insuliny lispro AN3 wyznaczona wobec preparatu referencyjnego Humalog wraz z 95% przedziałem ufności (N=24). 1 Rodzaj wyniku 2 Wartość 1 stosunek mocy 0,806 2 dolny kraniec 95% przedziału ufności 0,547 3 górny kraniec 95% przedziału ufności 1,187 Stosunek mocy względnej insuliny lispro AN3 wobec preparatu referencyjnego Humalog wynosi 0,806 (95% CI: 0,547-1,187). Po uwzględnieniu ilości jednostek substancji czynnej w mililitrze roztworu roboczego otrzymujemy wartość mocy względnej równą 32,24 j. Humalog/ml i CI: 21,88-47,48. Moc bezwzględna insuliny lispro AN3 wynosi 21,68 j./mg (vs. Humalog), z uwzględnieniem w obliczeniach zawartości substancji aktywnej AN3 w roztworze roboczym (40 j.r./ml) i moc obliczoną w badaniu (32,24 j. Humalog/ml). Wnioski z przeprowadzonych badań Obserwowana w obu doświadczeniach duża zmienność odpowiedzi osobniczych uzasadnia konieczność zastosowania układu krzyżowego. Analiza wariancji potwierdziła, że dane spełniają wszystkie warunki konieczne dla uznania ważności wyników z obu badaniach, tj. stwierdzono istotną regresję, nieistotne odstępstwa od równoległości oraz brak istotnych interakcji. Doświadczenia potwierdziły aktywność farmakologiczną insuliny lispro AN3, opracowanej w Instytucie Biotechnologii i Antybiotyków, zbliżoną do aktywności standardu USP insuliny lispro oraz preparatu referencyjnego Humalog. Podobna aktywność wyraża się w wartości mocy względnej (46,28 j. USP insuliny lispro/ml i 32,24 j. Humalog/ml) oraz mocy bezwzględnej (30,27 j./mg (vs. USP insuliny lispro), 21,68 j./mg (vs. Humalog)). Obliczony zakres przedziału ufności dla wartości mocy przekracza w obu badaniach ± 10% wartości średniej, dlatego zasadne byłoby zwiększenie liczebności grupy badanej i przeprowadzenie analizy jako kombinacji dwóch lub więcej serii oznaczeń do osiągnięcia zadowalającego CI. Podsumowanie Wyznaczenie aktywności biologicznej odgrywa istotną rolę w procesie rozwojowym oraz w kontroli jakości biotechnologicznych produktów leczniczych. Dla substancji i produktów farmaceutycznych insuliny ludzkiej i jej analogów jedną z metod określenia bioaktywności jest wyznaczenie mocy substancji aktywnej lub preparatu oraz stopnia podobieństwa Copyright StatSoft Polska 2014

11 produktu badanego względem referencyjnego na modelu zwierzęcym w układzie podwójnie krzyżowym. Statystyczna analiza danych adekwatna dla przyjętego schematu badania oraz poprawna interpretacja wyników stanowią kluczowy element badania, wpływający na wnioskowanie i powodzenie w przyszłym procesie rejestracyjnym. Analiza statystyczna ANOVA twin cross-over, wykonana przy użyciu pakietu STATISTICA uwzględniała warunki istotne dla ważności badania oraz wnioskowania o podobieństwie testowanych związków. Badania bioaktywności wykonane na etapie rozwojowym biopodobnego analogu insuliny ludzkiej o przyspieszonym działaniu (insuliny lispro), opracowanego w Instytucie Biotechnologii i Antybiotyków (IBA), wskazują, że substancja aktywna ma porównywalną moc względem testowanych produktów, tj. standardu USP insuliny lispro oraz preparatu referencyjnego Humalog. Interpretacja wyników w obu prezentowanych badaniach pozwala na sformułowanie wniosku o bioidentyczności substancji z porównywanymi w danym badaniu produktami referencyjnymi. W każdym przypadku moc bezwzględna insuliny AN3 przekracza wartość 15 j./mg wymaganą przez USP 32 dla wnioskowania o bioidentyczności. Dalsze prace rozwojowe nad produktem insuliny AN3 prowadzone przez Instytut Biotechnologii i Antybiotyków potwierdzają bioidentyczność preparatu IBA z lekiem oryginalnym. Literatura 1. Commission Directive 2003/63/EC of 25 June 2003 amending Directive 2001/83/EC of the European Parliament and Council on the Community code relating to medicinal products for human use. 2. Bogiel M., Marzec A.; Leki biopodobne pełnowartościowe, nowoczesne preparaty biotechnologiczne; Terapia i Leki, 35/57/2, (2008). 3. Rieder N., Gazzano-Santoro H., Schenerman M., Strause R., Fuchs C.., Mire-Sluis A., McLeod L.D.; The role of bioactivity assays in lot release and stability testing; BioProcsss International, June 2010, (2010). 4. ICH Q6B Note for guidance on specifications: test procedures and acceptance criteria for biotechnological/biological products (CPMP/ICH/365/96). 5. United States Pharmacopeia 32, rozdział Biological Tests / <121> Insulin Assays; str (2009). 6. United States Pharmacopeia 36 (2013). 7. Hauck W.W., Singer R., Callahan L.N.; Summary of planned revision to design and analysis of biological assays <111>; Pharmacopeial Forum 33(3), May-June (2007). 8. Holm P.K., Hansen K.B., Nilsson P., Danielsen G.M., Modvig K., Jessen K.D., Hassager C.U.; Replacement of the in vivo Rabbit Blood Sugar Bioidentity test with Copyright StatSoft Polska

12 a Cell-based Bioidentity Test for Control of Insulin Human and Insulin Aspart Drug Substance. ( _the_in_vivo_rabbit_blood_sugar_bioidentity_test_with_a_cell_based_bioidentity _Test_for_Control_of_Insulin_Human_and_Insulin_Aspart_Drug_Substance.pdf). 9. Morris T.S., Singer R., Ambrose M.R., Hauck W.W.; Biological potency assays are key to assessing product consistency; BioPharm International, June 1 (2009). 10. Gualandi-Signorini A.M., Giorgi G.; Insulin formulations a review; European Review for Medicinal and Pharmacological Sciences; 5:73-83 (2001). 11. Werner H., Chantelau E.A.; Differences in bioactivity between human insulin and insulin analogues approved for therapeutic use compilation of reports from the past 20 years; Diabetology and Metabolic syndrome 3:13, 2-10 (2011). 12. United States Pharmacopeia 32, rozdział Official Monographs / Insulin: Insulin Lispro; str (2009). 13. United States Pharmacopeia 32, rozdział Biological Tests / <111> Design and Analysis of Biological Assays; str (2009) Copyright StatSoft Polska 2014