(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2013/51 EP B1 (13) (51) T3 Int.Cl. A61K 39/395 ( ) C07K 16/18 ( ) A61K 31/573 ( ) (54) Tytuł wynalazku: Leczenie zaburzeń demielinizacyjnych niskimi dawkami przeciwciała IgM (30) Pierwszeństwo: US P (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2006/17 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 2014/05 (73) Uprawniony z patentu: MAYO FOUNDATION FOR MEDICAL EDUCATION AND RESEARCH, Rochester, US Acorda Therapeutics, Inc., Ardsley, US (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 ELLIOT A. GRUSKIN, Malvern, US ERIC CHOJNICKI, Gainesville, US ARTHUR E. WARRINGTON, Rochester, US ALLAN J. BIEBER, Rochester, US MOSES RODRIGUEZ, Rochester, US (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Aleksandra Twardowska KANCELARIA PATENTOWA KULIKOWSKA & KULIKOWSKI SP.J. SKR. POCZT Warszawa 12 Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 24039/PE/14 EP B1 Opis Dziedzina wynalazku [0001] Wynalazek dotyczy ogólnie dziedziny neurobiologii, a bardziej szczegółowo identyfikacji przeciwciał wytwarzanych technikami rekombinacji, które odgrywają rolę w funkcjonowaniu i terapii ośrodkowego układu nerwowego. Wynalazek dotyczy również materiałów i metod terapeutycznych, obejmujących przykładowo kompozycje farmaceutyczne, metod leczenia chorób związanych z zaburzeniami neurologicznymi, metod regeneracji i przywracania funkcji nerwowych, testów skriningowych oraz szczepionek. Tło wynalazku [0002] Stwardnienie rozsiane (MS) jest przewlekłą, często postępującą, chorobą zapalną ośrodkowego układu nerwowego (CNS) patologicznie charakteryzującą się pierwotną demielinizacją, zazwyczaj bez początkowego uszkadzania aksonów. Etiologia i patogeneza MS nie są znane. Kilka immunologicznych cech MS, oraz jego umiarkowany związek z pewnymi allelami głównego kompleksu zgodności tkankowej, sugerują przypuszczenie, że MS jest chorobą o podłożu immunologicznym. [0003] Hipotezę choroby autoimmunologicznej podtrzymuje model doświadczalny autoimmunologicznego (alergicznego) zapalenia mózgu i rdzenia (EAE), w którym wstrzyknięcie pewnych składników mieliny do genetycznie podatnych zwierząt prowadzi do demielinizacji CNS za pośrednictwem limfocytów T. Jednakże, specyficznych autoantygenów i patogennie

3 2 reaktywnych wobec mieliny limfocytów T nie zidentyfikowano definitywnie w CNS pacjentów z MS, ani MS nie powiązano z innymi chorobami autoimmunologicznymi. Alternatywna hipoteza, oparta na danych epidemiologicznych, jest taka, że czynnik środowiskowy, być może niezidentyfikowany wirus, powoduje szybką odpowiedź zapalną w CNS, która prowadzi bezpośrednio lub pośrednio ("czynnik bierny") do destrukcji mieliny, potencjalnie z indukowaną komponentą autoimmunologiczną. Tę hipotezę podtrzymują dowody, że kilka naturalnie występujących infekcji wirusowych, zarówno u ludzi jak i zwierząt, może powodować demielinizację. Jeden powszechnie wykorzystywany doświadczalny model wirusowy jest indukowany przez mysi wirus zapalenia mózgu i rdzenia Theilera (TMEV) (Dal Canto, M.C., i Lipton, H.L., Am. J. Path., 88: (1977)). [0004] Ograniczona skuteczność terapii w przypadku MS i innych chorób demielinizacyjnych, pobudza zainteresowanie nowymi terapiami łagodzącymi te choroby. Ponadto, ze względu na wyraźnie złożoną etiopatogenezę tych chorób, potencjalnie obejmującą zarówno czynniki środowiskowe, jak i autoimmunologiczne, ciągle istnieje potrzeba skutecznych terapii tych zaburzeń demielinizacyjnych. [0005] rhigm22 jest rekombinowanym ludzkim przeciwciałem IgM, które wiąże się z dojrzałymi oligodendrocytami oraz mieliną zarówno gryzoni, jak i ludzi, oraz pobudza syntezę nowej mieliny w przypadku demielinizacji in vivo. Stosowanie shigm22 (LYM 22) do stymulowania remielinizacji aksonów ośrodkowego układu nerwowego u ssaków potrzebujących takiej terapii opisano w publikacji WO 01/85797, która ujawnia podawanie przeciwciała monoklonalnego w dawce od około 0,5

4 3 mg/kg do około 400 mg/kg. Ukierunkowywanie przeciwciał IgMκ na oligodendrocyty w celu pobudzania remielinizacji CNS omówiono w Asakura, K. i in. (J. Neuroscience, październik 1998, 18(19): ). Asakura, K. i in. opisali jak myszy zainfekowane modelem wirusowym stwardnienia rozsianego otrzymywały dootrzewnowe iniekcje przeciwciała monoklonalnego dwa razy w tygodniu przez 5 tygodni (50 g/iniekcję). Całkowita dawka każdego przeciwciała wynosiła 0,5 mg. Standardowa dawka pobudzających remielinizację przeciwciał monoklonalnych we wcześniejszych badaniach wynosiła 25 mg/kg, podawanych dootrzewnowo. Ta dawka, jeśli ekstrapolować ją dla ludzi, byłaby niepraktyczna. [0006] A zatem, istnieje potrzeba opracowania praktycznego, bezpiecznego i skutecznego schematu leczenia zaburzeń CNS, w szczególności tych obejmujących demielinizację i/lub remielinizację, i stanowi to spełnienie potrzeby, której dotyczy niniejszy wynalazek. [0007] Cytowania w niniejszym opisie jakiejkolwiek pozycji literatury nie należy interpretować jako uznania, że takie pozycje literatury są dostępne jako stan techniki do bieżącego zgłoszenia. Streszczenie wynalazku [0008] Zakres niniejszego wynalazku definiują zastrzeżenia i wszelkie informacje, których nie obejmują zastrzeżenia, podano jedynie w celach informacyjnych. [0009] Zgodnie z niniejszym ujawnieniem, sklonowano i wyizolowano ludzkie przeciwciała, które wykazują aktywność pobudzania, stymulowania, regeneracji i/lub remielinizacji neuronów w ośrodkowym układzie nerwowym, i/lub blokowania

5 4 bądź redukcji demielinizacji w ośrodkowym układzie nerwowym. Szczegółowo, niniejszy wynalazek dotyczy metod stymulowania remielinizacji aksonów ośrodkowego układu nerwowego (CNS) z zastosowaniem rekombinowanych autoprzeciwciał, a w szczególności rekombinowanych ludzkich autoprzeciwciał, obejmujących przeciwciała podtypu IgM i ich monomery, lub mieszaniny i/lub ich fragmenty aktywne, charakteryzujących się zdolnością do wiązania struktur i komórek w ośrodkowym układzie nerwowym, w szczególności obejmujących oligodendrocyty. Wynalazek zapewnia kompozycję farmaceutyczną, zawierającą ludzkie monoklonalne przeciwciało IgM, w której przeciwciało zawiera sekwencję aminokwasową regionu zmiennego łańcucha ciężkiego, jak przedstawiono na Figurze 5 oraz SEQ ID NO: 7 i sekwencję aminokwasową regionu zmiennego łańcucha lekkiego, jak przedstawiono na Figurze 6 oraz SEQ ID NO: 9 oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, podłoże lub rozcieńczalnik, przy czym kompozycja jest przeznaczona do stosowania do leczenia lub zapobiegania chorobie demielinizacyjnej u ludzi, charakteryzującego się tym, że leczenie lub zapobieganie obejmuje podawanie przeciwciała w dziennej dawce pozostającej w zakresie od 1,25 g/kg do 2,5 g/kg masy ciała. Wynalazek zapewnia również ludzkie przeciwciało monoklonalne IgM, przy czym przeciwciało zawiera sekwencję aminokwasową regionu zmiennego łańcucha ciężkiego, jak przedstawiono na Figurze 5 oraz SEQ ID NO: 7 i sekwencję aminokwasową regionu zmiennego łańcucha lekkiego, jak przedstawiono na Figurze 6 oraz SEQ ID NO: 9, do stosowania do leczenia lub zapobiegania chorobie demielinizacyjnej u ludzi, charakteryzującego się tym, że leczenie lub zapobieganie obejmuje podawanie przeciwciała w

6 5 dziennej dawce pozostającej w zakresie od 1,25 g/kg do 2,5 g/kg masy ciała. [0010] W pierwszym wykonaniu wynalazku, przeciwciałem do stosowania według wynalazku jest ludzkie przeciwciało oznaczone rhigm22, a kompozycja zawiera takie przeciwciała w ilości, jak podano w zastrzeżeniu 1, skutecznej do pobudzania remielinizacji w ośrodkowym układzie nerwowym. W aspekcie ujawnienia, przeciwciało i odpowiadającą kompozycję przygotowuje się tak, aby dostarczała dawki pozostające w zakresie od około 500 ng do około 600 g, obliczone na kilogram masy ciała. W szczególnym aspekcie ujawnienia, dawki mogą być rzędu 500 ng, lub mogą być rzędu 600 g. [0011] W szczególnym wykonaniu, leczenie lub zapobieganie obejmuje podawanie samego przeciwciała rhigm22 w kompozycji dopuszczalnej farmaceutycznie. W innym wykonaniu, leczenie lub zapobieganie obejmuje podawanie przeciwciała rhigm22 w kombinacji z metyloprednizolonem. Metyloprednizolon można podawać w dawkach pozostających w zakresie od około 1 do 2 mg raz lub dwa razy w tygodniu. [0012] W kolejnym wykonaniu, leczenie lub zapobieganie obejmuje podawanie przeciwciała rhigm22 z metyloprednizolonem jednocześnie lub sekwencyjnie. [0013] Wynalazek zapewnia kompozycje farmaceutyczne, zawierające terapeutycznie skuteczną ilość przeciwciała rhigm22 oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, jak podano w zastrzeżeniu 1, do stosowania w leczeniu lub zapobieganiu choroby demielinizacyjnej, jak podano w zastrzeżeniu 1. W jednym wykonaniu, kompozycja zawiera samo przeciwciało rhigm22. W kolejnym wykonaniu, kompozycja zwiera przeciwciało rhigm22 w kombinacji z terapeutycznie skuteczną ilością

7 6 metyloprednizolonu. W jeszcze innym wykonaniu, kompozycja przeciwciała rhigm22 może mieć postać jednej kompozycji, a metyloprednizolon może mieć postać oddzielnej kompozycji, i leczenie lub zapobieganie obejmuje dostarczanie każdej z kompozycji osobnikowi, który potrzebuje takiej terapii, sekwencyjnie lub jednoczesnie. W jeszcze innym wykonaniu, terapeutycznie skuteczną ilością przeciwciała rhigm22 jest ilość, która pobudza remielinizację neuronów. W kolejnym wykonaniu, terapeutycznie skuteczną ilością przeciwciała rhigm22 jest ilość, która zapobiega demielinizacji. W jeszcze innym wykonaniu, terapeutycznie skuteczną ilością przeciwciała rhigm22 jest ilość, która obniża demielinizację, jednocześnie pobudzając również remielinizację. Jeśli stosuje się w kombinacji z metyloprednizolonem, przeciwciało rhigm22 może być bardziej skuteczne w zapobieganiu demielinizacji, pobudzaniu remielinizacji lub ich kombinacji. [0014] Inny aspekt ujawnienia zapewnia fragmenty i monomery pochodzące z lub pokrewne z rekombinowanymi przeciwciałami ludzkimi według niniejszego wynalazku. A zatem, ujawnienie w szczególności obejmuje fragmenty, lub monomery pochodzące z lub oparte na shlgm22 (LYM 22). Takie fragmenty i/lub monomery posiadają taką samą aktywność co cząsteczka przeciwciała macierzystego i mogą wykazywać zdolność do remielinizacji neuronów lub do zapobiegania demielinizacji neuronów. [0015] Kolejny aspekt ujawnienia zapewnia test do skriningu innych przeciwciał i pokrewnych partnerów wiążących, obejmujących hapteny i analogi peptydowe, które mogą wykazywać podobną aktywność terapeutyczną. Takie aktywności mogą obejmować leczenie lub zapobieganie uszkodzeniom lub

8 7 dysfunkcjom neurologicznym, takim jak stwardnienie rozsiane, ALS, udar, choroba Parkinsona i choroba Alzheimera. [0016] Kolejny aspekt wynalazku zapewnia kompozycję farmaceutyczną według zastrzeżenia 1, do stosowania w metodach leczenia chorób demielinizacyjnych u ssaków, takich jak stwardnienie rozsiane u ludzi i choroby wirusowe ośrodkowego układu nerwowego ludzi i zwierząt domowych, takie jak poinfekcyjne zapalenie mózgu i rdzenia, lub profilaktycznego hamowania rozpoczęcia lub postępu demielinizacji w przypadku tych stanów chorobowych, wykorzystującą rekombinowane przeciwciało monoklonalne, jak podano w zastrzeżeniu 1. [0017] To ujawnienie dotyczy ponadto metod in vitro wytwarzania i stymulowania proliferacji komórek glejowych, takich jak oligodendrocyty, i stosowania tych komórek glejowych do leczenia chorób demielinizacyjnych. Zgodnie z tym, w jednym aspekcie, neurologicznym stanem lub zaburzeniem demielinizacyjnym, w przypadku którego może być skuteczna taka terapia przeciwciałami, jest stwardnienie rozsiane. W kolejnym aspekcie, neurologicznym stanem lub zaburzeniem demielinizacyjnym, w przypadku którego mogłaby być skuteczna taka terapia przeciwciałami, jest ostre lub przewlekłe uszkodzenie rdzenia kręgowego. Bierze się również pod uwagę stany lub choroby, w których demielinizacja nerwów lub włókien nerwowych jest znaczna. [0018] Niniejsze ujawnienie obejmuje również klonowanie, izolację i stosowanie rekombinowanych ludzkich autoprzeciwciał, które wspomagają remielinizację neuronów lub zapobiegają demielinizacji neuronów, przykładem których jest ludzkie autoprzeciwciało rhigm22. Następujące terminy stosuje

9 8 się wymiennie w tym zgłoszeniu: RsHIgM22, shigm22, rhigm22 oraz LYM 22. Sekwencje regionów zmiennych ciężkiego i lekkiego łańcucha rekombinowanego przeciwciała rhigm22 przedstawiono na Figurach, odpowiednio, 5 i 6 i, zgodnie z tym, ujawnienie obejmuje przeciwciała i odpowiadające białka przeciwciała oraz małe cząsteczki, takie jak hapteny, które zawierają lub odpowiadają co najmniej częściowo sekwencjom przedstawionym w wymienionych Figurach. Te sekwencje przeciwciała można stosować do klonowania ludzkich rekombinowanych form przeciwciała, lub można stosować jako sondy do celów badawczych bądź diagnostycznych. Ujawnienie obejmuje ponadto możliwość, że nowo zidentyfikowane rekombinowane przeciwciała można wykorzystywać do różnych celów, takich jak pobudzanie remielinizacji, regeneracji uszkodzonych komórek nerwowych, ochrony neuronów, wzrostu neuronów i podobnych. [0019] Ujawnienie w znacznym stopniu dotyczy również peptydów, które wiążą się z autoprzeciwciałami opisywanymi w niniejszym opisie, przy czym te peptydy ze względu na ich sekwencję, strukturę trójwymiarową, lub zmiany konformacyjne wynikające z wiązania przeciwciała, można stosować w lub samodzielnie jako szczepionki peptydowe. W kolejnym aspekcie ujawnienia, peptydy te mogą wykazywać właściwości neuromodulujące i/lub immunomodulujące i mogą zapewniać metodę indukowania proliferacyjnej odpowiedzi komórek neuronalnych i/lub pełnić neuroochronną, neuroregeneracyjną i/lub remielinizacyjną rolę u ssaków potrzebujących takiej terapii. [0020] Podobnie, ujawnienie obejmuje hapteny, które mogą się wiązać z peptydami, przeciwciałami i/lub innymi zbliżonymi

10 9 substratami i, które mogą posiadać immunogenność, tak, że mogą również działać jako składniki aktywne w preparatach leczniczych, obejmujących również szczepionki. W szczególnym aspekcie, jeden lub więcej haptenów można łączyć z innymi peptydami według niniejszego ujawnienia, w preparat szczepionki. [0021] W jeszcze innym aspekcie ujawnienia peptydom tym można nadawać postać kompozycji farmaceutycznej ze stabilizatorami w celu zapobiegania degradacji proteolitycznej, w ten sposób wydłużając ich czas półtrwania przy podawaniu doustnym, podskórnym, dożylnym, donosowym, dooponowym lub nadawać postać preparatów liposomalnych dla ssaków potrzebujących takiej terapii. [0022] W jeszcze innym aspekcie, ujawnienie obejmuje grupę cząsteczek, które będzie się określać w niniejszym opisie jako czynniki neuromodulujące, i które są godne uwagi pod względem ich aktywności terapeutycznej w CNS. A zatem, wynalazek dotyczy czynników neuromodulujących o szczególnej skuteczności w CNS, które to czynniki zawierają materiał wybrany z grupy składającej się z przeciwciała podtypu IgM, analogu peptydu, haptenu, ich aktywnych fragmentów, ich monomerów, ich agonistów, ich mimetyków oraz ich kombinacji. Pod uwagę bierze się także zbliżone przeciwciała różnych podtypów, obejmujące te, które przeszły przełączanie klas (naturalnie lub w wyników zastosowania sposobów rekombinacyji bądź syntezy), przy czym przeciwciała, które przeszły przełączanie klas mają właściwości takie jak czynniki neuromodulujące użyteczne w metodach według niniejszego ujawnienia. Czynniki neuromodulujące mają jedną lub więcej z następujących właściwości: indukują remielinizację i/lub

11 10 proliferację komórkową komórek glejowych; i/lub wywołują przekazywanie sygnałów Ca++ w przypadku oligodendrocytów; i/lub blokują śmierć komórkową, np. śmierć komórkową indukowaną nadtlenkiem wodoru. [0023] Przeciwciała do stosowania w niniejszym wynalazku można stosować w połączeniu z innymi przeciwciałami, które wiążą się z tkanką nerwową, takimi jak przeciwciała poliklonalne, które mogą również indukować remielinizację, w szczególności inne poliklonalne przeciwciała IgM, w szczególności poliklonalne immunoglobuliny IgM i ich preparaty, bardziej szczegółowo spulowane poliklonalne immunoglobuliny IgM oraz spulowane poliklonalne ludzkie immunoglobuliny IgM. Korzystnie, inne przeciwciało jest ludzkim przeciwciałem wytworzonym technikami rekombinacji lub chimerycznym przeciwciałem wytworzonym technikami rekombinacji zdolnym do remielinizacji. Rekombinowanym przeciwciałem do stosowania w wynalazku jest rhigm22 (LYM22). Ujawniono również ich monomery, ich fragmenty aktywne, oraz naturalne lub syntetyczne przeciwciała posiadające właściwości rhigm22. Ujawnienie zapewnia przeciwciała zawierające polipeptyd posiadający sekwencję aminokwasową odpowiadającą co najmniej częściowo sekwencji wybranej z Figur 5 i 6, oraz ich fragmentów aktywnych. [0024] Niniejsze ujawnienie dotyczy również rekombinowanej cząsteczki DNA lub sklonowanego genu, lub jego zdegenerowanego warianta, które kodują klasę cząsteczek, które będzie się również określać w niniejszym opisie jako czynniki neuromodulujące oraz, które obejmują lub mogą być wybierane spośród przeciwciał według wynalazku, a w szczególności przeciwciał posiadających sekwencję

12 11 odpowiadającą co najmniej częściowo, sekwencjom przedstawionym na Figurach 5 i 6; peptydów, które mogą odpowiadać co najmniej częściowo przeciwciałom według niniejszego wynalazku, które będzie się również określać w niniejszym opisie jako peptydy przeciwciał i, na przykład, peptydów posiadających jedną lub więcej sekwencji odpowiadających co najmniej częściowo sekwencjom przedstawionym na Figurach 5 i 6; oraz małych cząsteczek, takich jak hapteny; włącznie z cząsteczkami rekombinowanego DNA lub sklonowanymi genami, które mają takie same lub komplementarne sekwencje. [0025] Niniejsze ujawnienie obejmuje również białka pochodzące z lub odpowiadające przeciwciałom, lub ich fragmentom bądź pochodnym, posiadające aktywności wymienione w niniejszym opisie i posiadające sekwencje aminokwasowe przedstawione i opisane powyżej oraz wybrane co najmniej częściowo z grupy składającej się z Figur 5 i 6. [0026] Niniejsze ujawnienie obejmuje również hapteny, które wykazują takie same aktywności co białka lub peptydy przeciwciał, i które można podawać w celach terapeutycznych w podobny sposób, jak w postaci szczepionki. W jednym aspekcie, można przygotować szczepionkę obejmującą peptydy i hapteny. [0027] W kolejnym aspekcie ujawnienia tak określoną pełną sekwencję DNA rekombinowanej cząsteczki DNA lub sklonowanego genu można połączyć funkcjonalnie z sekwencją kontrolującą ekspresję, którą można wprowadzać do odpowiedniego gospodarza. Zgodnie z tym ujawnienie obejmuje również jednokomórkowych gospodarzy stransformowanych sklonowanym genem lub cząsteczką rekombinowanego DNA zawierającego sekwencję DNA kodującą niniejsze peptydy przeciwciał.

13 12 [0028] W szczególnym aspekcie region zmienny sekwencji DNA przeciwciała według niniejszego ujawnienia można wykorzystywać do tworzenia syntetycznego(nych) przeciwciała (przeciwciał). W szczególności, sekwencję regionu zmiennego można łączyć z jej naturalną lub genetycznie uzyskaną sekwencją regionu stałego, otrzymując syntetyczne przeciwciało. Niniejsze ujawnienie zapewnia wektory do wytwarzania syntetycznych przeciwciał pochodzących od i zawierających sekwencje DNA, w szczególności sekwencje regionu zmiennego, przeciwciał według niniejszego ujawnienia. [0029] Zgodnie z inną korzystną cechą pewnego korzystnego aspektu niniejszego wynalazku, zapewnia się rekombinowany układ ekspresyjny do wytwarzania biologicznie aktywnych zwierzęcych lub w szczególności ludzkich peptydów przeciwciał. [0030] Niniejsze ujawnienie obejmuje kilka sposobów przygotowywania klonów autoprzeciwciał, peptydów, odpowiadających haptenów, lub ich innych małocząsteczkowych analogów, obejmujących jak przedstawiono przykładowo w niniejszym opisie znane techniki rekombinacji, i w zakres ujawnienia wchodzą zatem w zamierzeniu takie syntetyczne preparaty. Izolacja cdna i sekwencji aminokwasowych ujawnionych w niniejszym opisie ułatwia reprodukcję niniejszych przeciwciał lub ich analogów za pomocą takich technik rekombinacji i, zgodnie z tym, ujawnienie obejmuje wektory ekspresyjne przygotowane z ujawnionych sekwencji DNA, do ekspresji w układach gospodarza za pomocą technik rekombinacji DNA, oraz otrzymanych stransformowanych gospodarzy.

14 13 [0031] Ujawnienie obejmuje układ testowy do skriningu potencjalnych leków skutecznych w modulowaniu aktywności neurologicznej docelowych ssaczych komórek nerwowych przez, na przykład, wzmacnianie aktywności niniejszych autoprzeciwciał lub ich analogów. W jednym przykładzie, testowany lek można podawać do próbki komórkowej z ligandem, który powstrzymuje lub hamuje aktywność autoprzeciwciał, bądź ekstraktu zawierającego zahamowane przeciwciała, w celu określenia wpływu na aktywność wiązania autoprzeciwciał z dowolną próbką chemiczną (obejmującą DNA), lub testowanym lekiem w porównaniu z kontrolą. [0032] Niniejsze ujawnienie obejmuje układ testowy, który można przygotować w postaci zestawu testowego do analizy ilościowej obecności czynników neuromodulujących lub do identyfikowania leków bądź innych czynników, które mogą naśladować lub blokować ich aktywność. Układ lub zestaw testowy może zawierać wyznakowany składnik przygotowany za pomocą jednej z omawianych w niniejszym opisie promieniotwórczych i/lub enzymatycznych technik, sprzęgania znacznika z czynnikami neuromodulującymi, ich agonistami i/lub antagonistami, oraz jeden lub więcej dodatkowych odczynników immunochemicznych, z których co najmniej jeden jest wolnym lub immobilizowanym ligandem, zdolnym do wiązania wyznakowanego składnika, jego partnera wiążącego, jednego z oznaczanych składników lub ich partnera(rów) wiążącego(cych). [0033] W szczególnym i kolejnym aspekcie, niniejsze ujawnienie obejmuje wykorzystanie i zastosowanie przeciwciał według niniejszego ujawnienia, zwłaszcza autoprzeciwciał, obejmujących przeciwciała podtypu IgM i ich monomery, lub ich mieszaniny i/lub fragmenty aktywne, charakteryzujące się

15 14 zdolnością wiązania do struktur i komórek ośrodkowego układu nerwowego, w szczególności obejmujących oligodendrocyty, do obrazowania i zastosowań diagnostycznych in vivo. A zatem, przeciwciała, dzięki ich zdolności do wiązania się ze strukturami i komórkami ośrodkowego układu nerwowego, w szczególności obejmujących oligodendrocyty, można wykorzystywać przez immunofluorescencyjne, promieniotwórcze i inne diagnostycznie odpowiednie znaczniki jako czynniki obrazujące lub cząsteczki obrazujące do charakterystyki układu nerwowego, obejmującego ośrodkowy układ nerwowy oraz diagnostyki, monitorowania i oceny chorób układu nerwowego, w szczególności obejmujących stwardnienie rozsiane. Przeciwciała mogą być ponadto wykorzystywane jako czynniki obrazujące lub cząsteczki obrazujące do diagnostyki, monitorowania i oceny udaru, uszkodzenia rdzenia kręgowego i różnych demencji, obejmujących chorobę Alzheimera. [0034] W kolejnym aspekcie, niniejsze ujawnienie dotyczy pewnych metod terapeutycznych, które będą opierać się na aktywności czynników neuromodulujących, ich podjednostek, lub ich fragmentów aktywnych, ich odpowiedników peptydowych, ich analogów lub na czynnikach bądź innych lekach co do których określono, że posiadają taką samą aktywność. Pierwsza metoda terapeutyczna jest związana z zapobieganiem objawów stanów przyczynowo związanych lub wynikających z aktywności wiązania przeciwciał lub ich podjednostek, i obejmuje podawanie czynnika zdolnego do stymulacji wytwarzania i/lub aktywności czynników neuromodulujących, odpowiadających autoprzeciwciał, peptydów przeciwciał, ich fragmentów aktywnych bądź podjednostek, albo pojedynczo albo w mieszaninie ze sobą w ilości skutecznej do zapobiegania lub leczenia rozwoju tych

16 15 stanów u gospodarza. Na przykład, leki lub inni partnerzy wiążący przeciwciał bądź ich fragmentów, lub podobne, można podawać w celu wzmacniania aktywności neuroregeneracyjnej i/lub aktywności neuroochronnej, bądź w celu stymulowania remielinizacji, jak w leczeniu stwardnienia rozsianego. [0035] Bardziej szczegółowo, metody terapeutyczne ogólnie określane w niniejszym opisie, mogą obejmować metodę leczenia różnych patologii lub innych dysfunkcji i zaburzeń komórkowych przez podawanie kompozycji farmaceutycznych, które mogą zawierać skuteczne inhibitory lub substancje wzmacniające aktywację czynników neuromodulujących, lub inne równie skuteczne leki uzyskane, na przykład, za pomocą testu do skriningu leków przygotowanego i stosowanego zgodnie z aspektem niniejszego ujawnienia omówionym powyżej. Na przykład, w celu hamowania lub wzmacniania neuroregeneracji, neuroochrony lub remielinizacji, jak w przypadku leczenia choroby Parkinsona lub stwardnienia rozsianego można podawać leki lub innych partnerów wiążących czynniki neuromodulujące lub podobne białka, posiadających sekwencje odpowiadające co najmniej częściowo sekwencjom przedstawionym na Figurach 5 i 6. W szczególności, białka shigm22 (LYM22), których sekwencję przedstawiono na Figurach 5 i 6 można stosować zgodnie z wynalazkiem, jak podano w zastrzeżeniach 1 i 10 w kombinacji z ich agonistami, antagonistami, monomerami lub ich fragmentami aktywnymi, obejmującymi mieszaniny i ich kombinacje oraz można przygotowywać w postaci preparatów farmaceutycznych obejmujących szczepionki do podawania w przypadkach, w których właściwa jest terapia neuroregeneracyjna i/lub neuroochronna lub remielinizacja, tak jak w przypadku leczenia choroby Alzheimera, ALS, choroby

17 16 Parkinsona lub uszkodzeń rdzenia kręgowego. Niniejszy wynalazek obejmuje kompozycję farmaceutyczną, jak zdefiniowano w zastrzeżeniu 1, zawierającą kombinację przeciwciał ujawnionych w niniejszym opisie, przy czym przeciwciała, w szczególności ludzkie przeciwciała można przygotowywać w postaci farmaceutycznych i terapeutycznych kompozycji lub preparatów, do stosowania jak opisano w zastrzeżeniu 1. Zapewnia się również kombinacje lub mieszaniny różnych ludzkich przeciwciał, mysich przeciwciał, lub monomerów, fragmentów, pochodzących od nich lub opartych na nich rekombinowanych bądź syntetycznych przeciwciał i mogą być one zawarte w kompozycjach według niniejszego wynalazku. Przeciwciała ludzkie (obejmujące monomery, fragmenty, pochodzące od nich rekombinowane lub syntetyczne przeciwciała), które mogą być zawarte w kompozycjach według wynalazku, w szczególności, wybiera się z grupy obejmującej shigm46, MSI19E10, CB2bG8, AKJR4, CB2iE12, CB2iE7, MSI1985, oraz MSI10E10. Przeciwciała mysie (obejmujące monomery, fragmenty, pochodzące od nich rekombinowane lub syntetyczne przeciwciała oraz pochodzące od nich humanizowane przeciwciała) w szczególności wybiera się z grupy obejmującej SCH 94.03, SCH79.08, 01, 04, 09, A2B5 oraz HNK-1. Ponadto, wynalazek zapewnia dalej kombinacje przeciwciała(przeciwciał) ze związkami leczniczymi, lekami lub czynnikami użytecznymi w dowolnej takiej terapii neuroregeneracyjnej i/lub neuroochronnej bądź remielinizacji. Na przykład, preparat lub kompozycję przeciwciała według niniejszego wynalazku można łączyć ze związkami terapeutycznymi do leczenia stwardnienia rozsianego, obejmującymi, ale nie ograniczającymi się do preparatów interferonu beta (Betaseron, itd.) oraz kopolimeru

18 17 1 (Copaxone). Ponadto, przeciwciała według niniejszego wynalazku można łączyć z innymi czynnikami, które mogą działać hamując zapalenie w miejscu uszkodzenia. Jednym z takich czynników może być metyloprednizolon. Stosowanie metyloprednizolonu do leczenia stwardnienia rozsianego opisano w Van Oosten, B. W. i in. (Drugs, 1998, 56(4): ). [0036] Zgodnie z tym, głównym celem niniejszego ujawnienia jest zapewnienie czynników neuromodulujących, obejmujących ludzkie autoprzeciwciała i odpowiadające peptydy przeciwciał, hapteny, ich analogi i fragmenty aktywne w oczyszczonej postaci, które wykazują pewne właściwości i aktywności związane z pobudzaniem aktywności neuroregeneracyjnej i/lub neuroochronnej. [0037] Kolejnym celem niniejszego ujawnienia jest zapewnienie metody wykrywania obecności, ilości i aktywności autoprzeciwciał u ssaków, u których spodziewana jest obecność inwazyjnych, spontanicznych lub idiopatycznych stanów patologicznych. [0038] Kolejnym celem niniejszego ujawnienia jest zapewnienie metody i związanego układu oznaczeń do przeszukiwania substancji, takich jak leki, czynniki i podobne, potencjalnie skuteczne w albo naśladowaniu aktywności, albo w zwalczaniu wszelkich skutków ubocznych autoprzeciwciał i/lub ich fragmentów, podjednostek lub podobnych, u ssaków. Krótki opis rysunków [0039] Figura 1 jest wykresem wyników uzyskanych w badaniu porównawczym zakresu dawki, przy zmiennym stężeniu rhigm22,

19 18 placebo, samego metyloprednizolonu oraz w kombinacji z rhigm22. [0040] Figura 2 jest wykresem średnich wyników testowanych grup w badaniu zakresu dawki. [0041] Figura 3 jest wykresem przedstawiającym, że rhigm22 w połączeniu z metyloprednizolonem pobudza remielinizację i zmniejsza ilość uszkodzeń. [0042] Figura 4 jest wykresem wyników uzyskanych w badaniu porównawczym zakresu dawki, przy różnych stężeniach rhigm22. [0043] Figura 5 przedstawia sekwencje regionu zmiennego łańcucha ciężkiego shigm22. Sekwencję przyporządkowano zgodnie z układem numerowania ludzkim sekwencjom V H w publikacji: Sequences of Proteins of Immunological Interest, tom I, wydanie piąte (1991), Kabat E. A., Wu, T. T., Perry, H. M. Gottesman, K. S. i Foeller, C., NIH Publication. V H shigm22 należy do podgrupy III V H. Podkreślone aminokwasy potwierdzono przez sekwencjonowanie białka. Sekwencja aminokwasowa odpowiada sekwencji nukleotydowej shigm22. Sekwencje V H typu A i B SHIgM22 są reprezentowane tylko przez nukleotydy, które różnią się od sekwencji linii zarodkowych IGHV3-30/ *01, IGHJ4*02 oraz IGHD2-21*02. Dwa postawienia aminokwasowe w sekwencji białka V H typu B shigm22 wydrukowano pogrubioną czcionką. Sekwencje V H obu typów, A i B, shigm22 najbardziej pasują do sekwencji linii zarodkowej IGHV3-30/3-30-5*01 (96% homologia). Odnośnik do sekwencji linii zarodkowych: IMGT, międzynarodowa baza danych ImMunoGeneTics [ (Inicjator i koordynator: Marie-Paule Lefranc, Montpellier, Francja). [0044] Figura 6 przedstawia sekwencje regionu zmiennego łańcucha lekkiego shigm22. Sekwencję przyporządkowano zgodnie

20 19 z układem numerowania ludzkim sekwencjom V H w publikacji: Sequences of Proteins of Immunological Interest, tom I, wydanie piąte (1991), Kabat E. A., Wu, T. T., Perry, H. M. Gottesman, K. S. i Foeller, C., NIH Publication. V λ shigm22 należy do podgrupy I lambda. Podkreślone aminokwasy potwierdzono przez sekwencjonowanie białka. Sekwencja aminokwasowa odpowiada sekwencji nukleotydowej shigm22. Sekwencje V λ typu I i II SHIgM22 są reprezentowane tylko przez nukleotydy, które różnią się od sekwencji linii zarodkowych IGLV1-51*01 oraz IGLJ3*01. Dwa postawienia aminokwasowe w sekwencji białka V λ shigm22; typ II wydrukowano pogrubioną czcionką. Sekwencje V λ SHIgM22 najbardziej pasują do sekwencji linii zarodkowej IGLV-51*01 (97% homologia). Dwa geny różnią się od ich wspólnego przodka pojedynczą zmianą nukleotydową. Odnośnik do sekwencji linii zarodkowych: IMGT, międzynarodowa baza danych ImMunoGeneTics [ (Inicjator i koordynator: Marie- Paule Lefranc, Montpellier, Francja). Szczegółowy opis wynalazku [0045] Zakres niniejszego wynalazku definiują zastrzeżenia i wszelkie informacje, których nie obejmują zastrzeżenia, podano jedynie w celach informacyjnych. [0046] Jak stosuje się w tym opisie i załączonych zastrzeżeniach, formy liczby pojedynczej obejmują też formy odniesienia do liczby mnogiej, o ile z kontekstu jasno nie wynika inaczej. Tak więc, na przykład, odniesienie do "metody" obejmuje jedną lub kilka metod, i lub etapów typu opisanego w niniejszym opisie i/lub które staną się oczywiste

21 20 dla specjalistów w tej dziedzinie po przeczytaniu niniejszego ujawnienia, i tak dalej. [0047] O ile nie zdefiniowano inaczej, wszystkie terminy techniczne i naukowe stosowane w niniejszym opisie mają takie samo znaczenie, jak jest to powszechnie rozumiane przez zwykłego specjalistę w dziedzinie, do której należy wynalazek. Chociaż wszelkie metody i materiały podobne lub równoważne do tych opisanych w niniejszym opisie mogą być używane w praktyce lub testowaniu niniejszego wynalazku, korzystne sposoby i materiały opisano poniżej. Definicje [0048] W znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie, terminy "rhigm" i "rshigm", "shigm22" i "LYM22", dotyczące przeciwciał według wynalazku, uważa się za równoważne w niniejszym opisie. [0049] "Osobnik" obejmuje ludzi. Terminy "człowiek", "pacjent" i "osobnik" są stosowane wymiennie w niniejszym opisie. [0050] "Terapeutycznie skuteczna ilość" oznacza ilość związku, która po podaniu osobnikowi w celu leczenia choroby, jest wystarczająca do osiągnięcia takiego leczenia choroby. "Terapeutycznie skuteczna ilość" może się różnić w zależności od związku, choroby i jej ciężkości oraz wieku, wagi, itp., leczonego osobnika. [0051] "Leczenie" lub "terapia" dowolnej choroby lub zaburzenia odnosi się, w jednym wykonaniu, do łagodzenia choroby lub zaburzenia (tj. zatrzymania lub zmniejszenia rozwoju choroby lub co najmniej jednego z jej objawów klinicznych). W kolejnym wykonaniu "leczenie" lub "terapia"

22 21 odnosi się do łagodzenia co najmniej jednego parametru fizycznego, który może być niezauważalny dla osobnika. W jeszcze innym wykonaniu, "leczenie" lub "terapia" odnoszą się do modulowania choroby lub zaburzenia, albo fizycznie, (na przykład stabilizacja dostrzegalnego objawu), albo fizjologicznie, (na przykład stabilizacja parametru fizycznego), albo na obydwa sposoby. W jeszcze innym wykonaniu, "leczenie" lub "terapia" odnosi się do opóźniania początku choroby lub zaburzenia. [0052] Termin "czynnik(i) neuromodulujący(ne)", jak stosuje się tu pojedynczo w niniejszym zgłoszeniu, w zamierzeniu ma odnosić się do szerokiej klasy materiałów, które działają w celu pobudzania wzrostu neurytów, regeneracji i remielinizacji, ze szczególną korzyścią i skutkiem w CNS, a zatem obejmuje przeciwciała podtypu IgM, a szczególnie ludzkie przeciwciała, takie jak te, do których odwołuje się szczególnie w niniejszym opisie, jak shigm22 (LYM 22), ebvhigm MSI19D10, shigm46 (LYM46), CB2bG8, AKJR4, CB2iE12, CB2iE7 i MSI19E5, analogi peptydowe, hapteny, ich fragmenty aktywne, ich monomery, agoniści, mimetyki i podobne. Czynnik(i) neuromodulujący(-e) obejmuje(ją) również kombinacje lub mieszaniny więcej niż jednego przeciwciała zapewnionego w niniejszym opisie, włącznie z ich monomerami i fragmentami aktywnymi. [0053] Ponadto, terminy "czynnik neuromodulujący", "autoprzeciwciało", "peptyd przeciwciała", "peptyd", "hapten" i wszelkie warianty nie wymienione szczegółowo, można stosować w niniejszym opisie wymiennie, w tym zakresie, że wszystkie mogą się odnosić i obejmować materiał białkowy, obejmujący pojedyncze białka lub wiele białek, oraz obejmują

23 22 te białka, które posiadają sekwencję aminokwasową opisaną w niniejszym opisie i przedstawioną na Figurach 5-6, oraz profil aktywności przedstawiony w niniejszym opisie oraz w Zastrzeżeniach. Zgodnie z tym, podobnie bierze się pod uwagę białka wykazujące zasadniczo równoważną lub zmienioną aktywność. Te modyfikacje mogą być zamierzone, na przykład, takie jak modyfikacje uzyskane w wyniku mutagenezy ukierunkowanej wobec miejsca lub mogą być przypadkowe, takie jak te uzyskane w wyniku mutacji w gospodarzach, którzy są producentami kompleksu lub jego wymienionych podjednostek. Ponadto, terminy "czynnik neuromodulujący", "autoprzeciwciało", "peptyd przeciwciała", "peptyd", "hapten" w zamierzeniu, jeśli jest to odpowiednie, obejmują w swoim zakresie białka konkretnie wymieniane w niniejszym opisie, jak również wszystkie zasadniczo homologiczne analogi i warianty alleliczne. [0054] Korzystne jest, aby reszty aminokwasowe opisane w niniejszym opisie występowały w postaci izomerycznej "L". Jednakże, reszty w postaci izomerycznej "D" można podstawiać w miejsce reszt L-aminokwasów, tak długo jak zachowane są przez polipeptyd pożądane właściwości funkcjonalne wiązania immunoglobulin. NH 2 odnosi się do wolnej grupy aminowej obecnej w końcu aminowym polipeptydu. COOH odnosi się do wolnej grupy karboksylowej w końcu karboksylowym polipeptydu. Zgodnie ze standardową nomenklaturą polipeptydów, J. Biol. Chem., 243: (1969), skróty reszt aminokwasowych przedstawiono w poniższej Tabeli Zgodności:

24 23 TABELA ZGODNOŚCI SYMBOL AMINOKWAS 1-LITEROWY 3-LITEROWY Y Tyr tyrozyna G Gly glicyna F Phe fenyloalanina M Met metionina A Ala alanina S Ser seryna I Ile izoleucyna L Leu leucyna T Thr treonina V Val walina P Pro prolina K Lys lizyna H His histydyna Q Gln glutamina E Gln kwas glutaminowy W Trp tryptofan R Arg arginina D Asp kwas asparaginowy N Asn asparagina C Cys cysteina [0055] Należy zauważyć, że sekwencje wszystkich reszt aminokwasowych są przedstawione w niniejszym opisie wzorami, w których lewa i prawa orientacja jest konwencjonalnym kierunkiem od końca aminowego do końca karboksylowego. Ponadto, należy zauważyć, że myślnik na początku lub końcu sekwencji reszt aminokwasowych wskazuje wiązanie peptydowe z kolejną sekwencją jednej lub więcej reszt aminokwasowych.

25 24 Powyższa Tabela przedstawia korelację oznaczeń trzyliterowych i jednoliterowych, które mogą być tu stosowane naprzemiennie. [0056] "Replikon" jest dowolnym elementem genetycznym (np., plazmidem, chromosomem, wirusem), który działa jako autonomiczna jednostka replikacji DNA in vivo; tj., zdolna do replikacji pod swoją własną kontrolą. [0057] "Wektor" jest replikonem, takim jak plazmid, fag lub kosmid, do którego może być przyłączony inny segment DNA w taki sposób, aby doprowadzić do replikacji przyłączonego segmentu. "Cząsteczka DNA" odnosi się do polimerycznej formy deoksyrybonukleotydów (adenina, guanina, tymina, lub cytozyna) albo w formie jednoniciowej, albo dwuniciowego heliksu. Termin ten odnosi się jedynie do pierwszorzędowej i drugorzędowej struktury cząsteczki i nie ogranicza jej do jakiejkolwiek formy trzeciorzędowej. A więc, termin ten obejmuje dwuniciowy DNA obecny, między innymi, w liniowych cząsteczkach DNA (np., fragmentach restrykcyjnych), wirusach, plazmidach, oraz chromosomach. Omawiając struktury poszczególnych dwuniciowych cząsteczek DNA, sekwencje mogą być opisane w niniejszym opisie zgodnie ze standardową konwencją uwzględniającą jedynie sekwencję w kierunku 5 do 3 wzdłuż nici nieulegającego transkrypcji DNA (tj., nici posiadającej sekwencję homologiczną do mrna). [0058] Miejsce początku replikacji" odnosi się do tych sekwencji DNA, które biorą udział w syntezie DNA. [0059] Sekwencja kodująca DNA jest sekwencją dwuniciowego DNA, która ulega transkrypcji i translacji do polipeptydu in vivo, jeśli umieści się ją pod kontrolą odpowiednich sekwencji regulatorowych. Granice sekwencji kodującej określają kodon startu przy końcu 5 (aminowym) i kodon stop

26 25 translacji przy końcu 3 (karboksylowym). Sekwencja kodująca może obejmować, ale bez ograniczeń, sekwencje prokariotyczne, cdna z eukariotycznego mrna, sekwencje genomowego DNA z eukariotycznego (np., ssaczego) DNA, a nawet syntetyczne sekwencje DNA. Sekwencje sygnałowe poliadenylacji i sekwencje terminacji transkrypcji będą zazwyczaj położone 3 w stosunku do sekwencji kodującej. [0060] Transkrypcyjne i translacyjne sekwencje kontrolne są regulatorowymi sekwencjami DNA, takimi jak promotory, sekwencje wzmacniające, sygnały poliadenylacji, sekwencje terminacji i podobne, które zapewniają ekspresję sekwencji kodującej w komórce gospodarza. [0061] "Sekwencja promotorowa" jest regionem regulatorowym DNA zdolnym do wiązania polimerazy RNA w komórce i inicjowania transkrypcji w kierunku (3 ) sekwencji kodującej znajdującej się poniżej promotora. W celu zdefiniowania niniejszego wynalazku, sekwencja promotorowa jest ograniczona na jej końcu 3 przez miejsce inicjacji transkrypcji i rozciąga się powyżej (w kierunku 5 ), obejmując minimalną liczbę par zasad lub elementów niezbędnych do zainicjowania transkrypcji na wykrywalnych poziomach powyżej poziomu tła. W obrębie sekwencji promotorowej znajduje się miejsce inicjacji transkrypcji (korzystnie zdefiniowane przez mapowanie za pomocą nukleazy S1), jak również domeny wiążące białko (sekwencje konsensusowe) odpowiedzialne za wiązanie polimerazy RNA. Promotory eukariotyczne będą często, ale nie zawsze, zawierać sekwencje "TATA" oraz sekwencje "CAT". Promotory prokariotyczne zawierają sekwencje Shine-Dalgarno w dodatku do sekwencji konsensusowych -10 i -35.

27 26 [0062] "Sekwencja kontrolująca ekspresję" jest sekwencją DNA, która kontroluje i reguluje transkrypcję i translację innej sekwencji DNA. Sekwencja kodująca jest pod kontrolą" sekwencji kontrolujących transkrypcję i translację w komórce, kiedy polimeraza RNA przeprowadza transkrypcję sekwencji kodującej do mrna, który następnie ulega translacji do białka kodowanego przez sekwencję kodującą. [0063] "Sekwencja sygnałowa" może być zawarta przed sekwencją kodującą. Ta sekwencja koduje peptyd sygnałowy, N-końcowy w stosunku do polipeptydu, który informuje komórkę gospodarza, aby kierowała polipeptyd do powierzchni komórkowej lub do wydzielania polipeptydu do podłoża, i ten peptyd sygnałowy jest odcinany przez komórkę gospodarza zanim białko opuści komórkę. Sekwencje sygnałowe można znaleźć z wieloma białkami natywnymi dla prokariontów i eukariontów. [0064] Termin "oligonukleotyd" jak stosuje się w niniejszym opisie w odniesieniu do sond według niniejszego wynalazku, definiuje się jako cząsteczkę składającą się z dwóch lub więcej rybonukleotydów, korzystnie więcej niż trzech. Ich dokładna wielkość będzie zależeć od wielu czynników, które z kolei zależą od ostatecznej funkcji i stosowania oligonukleotydu. [0065] Termin "primer", jak stosuje się w niniejszym opisie, odnosi się do oligonukleotydu, niezależnie od tego czy występuje on naturalnie, jak w oczyszczonym produkcie trawienia enzymami restrykcyjnymi, czy wytworzony jest syntetycznie, który jest zdolny do działania jako punkt inicjacji syntezy, jeśli umieści się go w warunkach, w których synteza produktu wydłużania primera, który jest komplementarny do nici kwasu nukleinowego, jest indukowana,

28 27 tj., w obecności nukleotydów oraz czynnika indukującego, takiego jak polimeraza DNA i w odpowiedniej temperaturze oraz ph. Primer może być albo jednoniciowy albo dwuniciowy i musi być wystarczająco długi aby rozpocząć syntezę pożądanego produktu wydłużania w obecności czynnika indukującego. Dokładna długość primera będzie zależeć od wielu czynników, obejmujących temperaturę, źródło primera oraz stosowanej metody. Na przykład, do zastosowań diagnostycznych, w zależności od złożoności sekwencji docelowej, primer oligonukleotydowy zazwyczaj zawiera lub więcej nukleotydów, chociaż może zawierać mniej nukleotydów. [0066] Primery w niniejszym opisie wybiera się tak, aby były "zasadniczo" komplementarne do różnych nici określonej docelowej sekwencji DNA. Oznacza to, że primery muszą być wystarczająco komplementarne, aby hybrydyzować z ich odpowiadającymi niciami. Dlatego też, sekwencja primera nie musi odzwierciedlać dokładnej sekwencji matrycy. Na przykład, niekomplementarny fragment nukleotydowy można przyłączać do końca 5 primera wraz z pozostałą sekwencją primera, która jest komplementarna do nici. Alternatywnie, niekomplementarne zasady lub dłuższe sekwencje mogą być wplecione w primer, pod warunkiem, że sekwencja primera wykazuje wystarczającą komplementarność z sekwencją nici, aby z nią hybrydyzować w w ten sposób utworzyć matrycę do syntezy produktu wydłużenia. [0067] Jak stosuje się w tym opisie, terminy "endonukleazy restrykcyjne" i "enzymy restrykcyjne" odnoszą się do enzymów bakteryjnych, z których każdy tnie dwuniciowy DNA w lub w pobliżu konkretnych sekwencji nukleotydowych. [0068] Komórka jest "stransformowana" egzogennym lub heterologicznym DNA, kiedy taki DNA jest wprowadzony do

29 28 wnętrza komórki. Transformujący DNA może lub nie być zintegrowany (kowalencyjnie związany) do chromosomalnego DNA tworzącego genom komórki. U prokariontów, drożdży i komórek ssaczych, na przykład, transformujący DNA może być utrzymywany na elemencie episomalnym, takim jak plazmid. W odniesieniu do komórek eukariotycznych, stabilnie stransformowana komórka jest komórką, w której transformujący DNA zintegrował się z chromosomem tak, że jest dziedziczony przez komórki potomne w wyniku replikacji chromosomu. Taką stabilność wykazuje się przez zdolność komórki eukariotycznej do ustalenia linii komórkowych lub klonów złożonych z populacji komórek potomnych zawierających transformujący DNA. "Klon" jest populacją komórek pochodzących z mitozy pojedynczej komórki lub wspólnego przodka. Linia komórkowa" jest klonem komórki pierwotnej, który jest zdolny do stabilnego wzrostu in vitro przez wiele pokoleń. [0069] Dwie sekwencje są zasadniczo homologiczne" jeśli co najmniej 75% (korzystnie co najmniej 80%, a najkorzystniej co najmniej 90 lub 95%) nukleotydów jest dopasowanych na zdefiniowanej długości sekwencji DNA. Sekwencje, które są zasadniczo homologiczne można zidentyfikować przez porównywanie sekwencji przy wykorzystaniu standardowego oprogramowania dostępnego w bankach danych sekwencji, lub na podstawie eksperymentów hybrydyzacji Southern w, na przykład, surowych warunkach, jak zdefiniowano dla konkretnego układu. Określenie odpowiednich warunków hybrydyzacji pozostaje w zakresie umiejętności specjalisty w tej dziedzinie. Patrz, np., Maniatis i in., supra; DNA Cloning, tomy I i II, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra. W szczególności, sekwencje regionów zmiennych łańcucha ciężkiego i lekkiego przeciwciał

30 29 według niniejszego ujawnienia są zasadniczo homologiczne z odpowiadającą sekwencją genu linii zarodkowej, wykazując co najmniej około 90% homologię z odpowiadającą sekwencją genu linii zarodkowej. [0070] Powinno być oczywiste, że również w zakresie niniejszego ujawnienia znajdują się sekwencje DNA kodujące przeciwciało według ujawnienia, lub ich analog peptydowy, hapten, bądź fragment aktywny, które kodują peptyd definiujący co najmniej jego część lub posiadający taką samą sekwencję aminokwasową jak przedstawiono na Figurach 5-6, ale które są zdegenerowane wobec tych samych SEQ ID NO. Przez "zdegenerowane wobec" rozumie się, że różne kodony trzyliterowe stosuje się do określenia konkretnego aminokwasu. W nauce jest dobrze wiadomo, że następujące kodony można stosować wymiennie dla kodowania każdego konkretnego aminokwasu: Fenyloalanina (Phe lub F) UUU lub UUC Leucyna (Leu lub L) UUA lub UUG lub CUU lub CUC lub CUA lub CUG Izoleucyna (Ile lub I) AUU lub AUC lub AUA Metionina (Met lub M) AUG Walina (Val lub V) GUU lub GUC lub GUA lub GUG Seryna (Ser lub S) UCU lub UCC lub UCA lub UCG lub AGU lub AGC Prolina (Pro lub P) CCU lub CCC lub CCA lub CCG Treonina (Thr lub T) ACU lub ACC lub ACA lub ACG Alanina (Ala lub A) GCU lub GCG lub GCA lub GCG Tyrozyna (Tyr lub Y) UAU lub UAC Histydyna (His lub H) CAU lub CAC Glutamina (Gln lub Q) CAA lub CAG

31 30 Asparagina (Asn lub N) AAU lub AAC Lizyna (Lys lub K) AAA lub AAG Kwas asparaginowy (Asp lub D) GAU lub GAC Kwas glutaminowy (Glu lub E) GAA lub GAG Cysteina (Cys lub C) UGU lub UGC Arginina (Arg lub R) CGU lub CGC lub CGA lub CGG lub AGA lub AGG Glicyna (Gly lub G) GGU lub GGC lub GGA lub GGG Tryptofan (Trp lub W) UGG Kodon terminacji UAA (ochre) lub UAG (amber) lub UGA (opal) [0071] Powinno być zrozumiałe, że kodony wymienione powyżej są kodonami dla sekwencji RNA. Odpowiadające kodony dla DNA mają T podstawioną w miejsce U. [0072] W konkretnej sekwencji lub cząsteczce DNA można wprowadzać mutacje takie, że konkretny kodon zmienia się na kodon, który koduje inny aminokwas. Takie mutacje na ogół przeprowadza się dokonując możliwie najmniejszych zmian nukleotydów. Tego typu mutacje polegające na podstawieniu można wykonywać w celu zmiany aminokwasu w otrzymanym białku w sposób niekonserwatywny (tj., przez zmianę kodonu z aminokwasu należącego do grupy aminokwasów posiadających określoną wielkość lub właściwości do aminokwasu należącego do innej grupy) lub w sposób konserwatywny (tj., przez zmianę kodonu z aminokwasu należącego do grupy aminokwasów posiadających określoną wielkość lub właściwości do aminokwasu należącego do takiej samej grupy). Taka konserwatywna zmiana prowadzi generalnie do mniejszej zmiany w strukturze i funkcji otrzymanego białka. Istnieje większe prawdopodobieństwo, że zmiana niekonserwatywna zmieni

32 31 strukturę, aktywność lub działanie otrzymanego białka. Niniejszy wynalazek należy uważać jako obejmujący sekwencje zawierające zmiany konserwatywne, które nieznacząco zmieniają aktywność lub charakterystykę wiązania otrzymanego białka. [0073] Poniżej znajduje się jeden przykład różnych grup aminokwasów: [0074] Aminokwasy z niepolarnymi grupami R alanina walina leucyna izoleucyna prolina fenyloalanina tryptofan metionina [0075] Aminokwasy z nienaładowanymi polarnymi grupami R glicyna seryna treonina cysteina tyrozyna asparagina glutamina [0076] Aminokwasy z naładowanymi polarnymi grupami R (naładowanymi ujemnie przy ph 6,0) kwas asparaginowy kwas glutaminowy [0077] Aminokwasy zasadowe (dodatnio naładowane przy ph 6,0) lizyna arginina

33 32 histydyna (przy ph 6,0) [0078] Kolejną grupę mogą stanowić te aminokwasy, które posiadają grupy fenylowe: fenyloalanina tryptofan tyrozyna [0079] Inny podział na grupy może opierać się na masie cząsteczkowej (tj., wielkości grup R): glicyna 75 alanina 89 seryna 105 prolina 115 walina 117 treonina 119 cysteina 121 leucyna 131 izoleucyna 131 asparagina 132 kwas asparaginowy 133 glutamina 146 lizyna 146 kwas glutaminowy 147 metionina 149 histydyna (przy ph 6,0) 155 fenyloalanina 165 arginina 174 tyrozyna 181 tryptofan 204 [0080] Szczególnie korzystnymi podstawieniami są: