ZASTOSOWANIE METOD MAGNETYCZNEGO REZONANSU JĄDROWEGO ORAZ MODELOWANIA MOLEKULARNEGO W ANALIZIE STRUKTURALNEJ RNA.

Transkrypt

1 Mariusz Popenda ZASTSWAIE METD MAGETYCZEG REZASU JĄDRWEG RAZ MDELWAIA MLEKULAREG W AALIZIE STRUKTURALEJ RA. Pracę wykonano w Instytucie Chemii Bioorganicznej Polskiej Akademii auk w Poznaniu. Promotor pracy: Prof. dr hab. Ryszard W. Adamiak Praca została przedstawiona Radzie Instytutu Chemii Bioorganicznej Polskiej Akademii auk w Poznaniu celem uzyskania stopnia doktora nauk chemicznych. Poznań, czerwiec 1998

2 Panu Prof. dr hab. Ryszardowi W. Adamiakowi serdecznie dziękuję za wskazanie interesującego tematu niniejszej pracy, wszechstronną pomoc i okazaną życzliwość w trakcie jej realizacji. Składam serdeczne podziękowania Panu dr P. Sowińskiemu za współpracę w eksperymentach MR, oraz Pani dr E. Białej i Panu dr J. Mileckiemu za syntezę związków, które były przedmiotem moich badań. Pragnę podziękować koleżankom z Pracowni MR za pomoc podczas wykonywania niniejszej pracy.

3 SPIS TREŚCI I. CEL PRACY II. CZĘŚĆ LITERATURWA II.1. Wprowadzenie II.2. Budowa RA II.3. Metody spektroskopii MR w analizie strukturalnej RA II.4. Analiza elementów strukturalnych RA metodami MR II.4.1. Konformacja rybozy II.4.2. Konformacja syn i anti II.4.3. Kąty rotacji łańcucha fosforocukrowego i ich analiza metodami MR II.5. Metody przypisań sygnałów rezonansowych MR fragmentów RA II.6. Generowanie i udokładnianie struktur II.6.1. Metody chemii kwantowej II.6.2. Metody dynamiki molekularnej i generowania więzów strukturalnych II.6.3. Kryteria precyzji i dokładności wyznaczonych struktur II.7. Geometria dupleksów RA - parametry helikalne II.7.1. Lokalny układ współrzędnych II.7.2. Lokalne parametry helikalne między parami zasad (Inter - Base Pair Parameters) II.7.3. Globalne parametry helikalne dla pary zasad względem osi 48 dupleksu (Global Base Pair - Axis Parameters).... II.7.4. Lokalne parametry helikalne między zasadami (Base - Base Parameters) II.7.5. Program CURVES II.7.6. Struktura dupleksów III. MÓWIEIE WYIKÓW BADAŃ WŁASYC III.1. Część eksperymentalna III.1.1. pis próbek r(cgcgcg) 2 i 2'--Me(CGCGCG) III.1.2. Stosowane techniki spektroskopii 1, 13 C, 31 P oraz 29 Si MR III.1.2.A. Widma MR blokowanych monomerów III.1.2.B. Widma MR dupleksów r(cgcgcg) 2 i 2'-- Me(CGCGCG) III.1.3. Metody stosowane w analizie fragmentów strukturalnych dupleksów r(cgcgcg) 2 i 2'--Me(CGCGCG) III.1.4. Metody stosowane przy generowaniu i udokładnianiu struktur dupleksów III.2. Analiza MR substratów i półproduktów w syntezie chemicznej RA.. 59 III.3. Analiza widm 1 MR dupleksów r(cgcgcg) 2 i 2'-- Me(CGCGCG) 2 w D III.3.1. Analiza widm jednowymiarowych 1 MR

4 III.3.2. Analiza widm dwuwymiarowych 1 MR III.3.3. Stereospecyficzne przypisania sygnałów 5' i 5'' III.4. Analiza sygnałów 1 MR wymienialnych protonów dupleksów r(cgcgcg) 2 i 2'--Me(CGCGCG) 2 w 2 /D III.4.1. Metodyka III.4.2. Identyfikacja sygnałów rezonansowych wymienialnych protonów dupleksów r(cgcgcg) 2 i 2'--Me(CGCGCG) III.5. Pomiary temperaturowe dupleksów r(cgcgcg) 2 i 2'-- Me(CGCGCG) III.5.1. Analiza temperaturowa sygnałów MR niewymienialnych protonów III.5.2. Analiza temperaturowa sygnałów MR wymienialnych protonów III.6. Analiza widm 31 P MR dupleksów r(cgcgcg) 2 i 2'-- Me(CGCGCG) III.7. Analiza widm 13 C MR dupleksów r(cgcgcg) 2 i 2'-- Me(CGCGCG) III.8. Analiza konformacji r(cgcgcg) 2 i 2'--Me(CGCGCG) 2 w oparciu o wartości wicynalnych sprzężeń skalarnych i wielkości E III.8.1. Pomiar wartości stałych sprzężeń skalarnych III.8.2. Pomiar wielkości efektów verhausera (E) III.8.3. Analiza konformacji pierścieni cukrowych III.8.3.A. Analiza konformacyjna w oparciu o wartości sprzężeń skalarnych III.8.3.B. Analiza w oparciu o wartości E III.8.4. Analiza kątów torsyjnych wokół wiązań -glikozydowych reszt nukleotydowych r(cgcgcg) 2 i 2'--Me(CGCGCG) III.8.5. Analiza kątów torsyjnych w łańcuchach fosforoestrowych III.9. Udokładnione struktury dupleksów r(cgcgcg) 2 i 2'-- Me(CGCGCG) III.9.1. pis metody udokładniania struktur III.9.2. Struktury początkowe III.9.3. Uściślenie więzów odległościowych metodą IRMA (I etap udokładniania struktur) III.9.4. Restryktywna dynamika molekularna (II etap udokładniania struktur) III.9.5. Analiza struktur przestrzeni konformacyjnej i końcowych struktur dupleksów r(cgcgcg) 2 i 2'--Me(CGCGCG) III.9.6. Efekt 2'--metylacji III.10. Porównanie struktur 2'--Me(CGCGCG) 2 w roztworze i w krysztale IV. PDSUMWAIE V. LITERATURA Aneks 1 Aneks 2 Aneks 3 znaczenie skrótów. Spis publikacji i komunikatów. dbitki prac, związanych z przedstawioną dysertacją.

5 I. CEL PRACY. Poznanie struktury funkcjonalnie ważnych cząsteczek kwasów rybonukleinowych (RA) jest istotne dla wyjaśnienia procesu zawijania się łańcuchów RA, ich właściwości katalitycznych i specyficznych oddziaływań z białkami 1. Spektroskopia jądrowego rezonansu magnetycznego (MR) jest jedyną metodą spektralną, która umożliwia pełne poznanie przestrzennej struktury i dynamiki domen RA i ich kompleksów z białkami w roztworze. Metody MR uzupełniają w ten sposób krystalografię rentgenowską. W wyniku wprowadzenia dwu- i wielowymiarowych technik MR 2-4, nowych metod obliczeniowych oraz nowoczesnych metod chemicznej 5,6 i enzymatycznej syntezy RA 4,7 wraz z izotopowym znakowaniem 8, dokładność obecnie uzyskiwanych struktur jest porównywalna do wyników otrzymywanych na drodze badań rentgenowskich w krysztale. Pomimo szybkiego rozwoju badań strukturalnych RA metodami MR, struktury krótkich dupleksów RA zawierających alternatywne pary zasad CG, które są częstym motywem natywnych cząsteczek RA, nie zostały do tej pory ustalone. Przeprowadzone w 9, roku badania porównawcze pomiędzy strukturami r(cgcgcg) 2 i d(cgcgcg) 2 metodami wysokorozdzielczej spektroskopii MR wykazały istotne różnice spektralne pomiędzy dwiema formami prawoskrętnych dupleksów, które cząsteczki te tworzą w roztworach wodnych przy małym stężeniu soli. Jednakże w przypadku r(cgcgcg) 2, pełnego określenia struktury nie dokonano. Z powodu silnego, typowego dla cząsteczek RA, nakładania się pasm rezonansowych rybozy 2,3,11 w widmach protonowych MR, które dodatkowo spotęgowane jest przez występowanie powtarzającego się motywu CG, nie zidentyfikowano większości sygnałów rezonansowych (3', 4', 5' i 5'') tego dupleksu. Badania prowadzone przez Pracownię Chemii Strukturalnej Kwasów ukleinowych Instytutu Chemii Bioorganicznej PA, kierowaną przez prof. dr hab. Ryszarda W. Adamiaka związane są z interesującymi właściwościami strukturalnymi dupleksów RA zawierających alternatywne pary CG. Przy dużych stężeniach soli, dupleksy poli[r(cg)] 12 oraz r(cgcgcg) 13 2 przechodzą w nietypową, lewoskrętną strukturę tzw. Z-RA. Wolna kinetyka przejść z A- do Z-RA, w obecności 6 M stężenia nadchloranu sodu, obserwowana metodami MR, pozwoliła dokładnie opisać właściwości spektralne lewoskrętnej formy 14. Prowadzone obecnie badania r(cgcgcg) 2 wykazały, że przejścia z A- do Z-RA są również wymuszane w warunkach wysokich ciśnień 15. Przejście nie jest natomiast obserwowane w przypadku modyfikowanego dupleksu 2'--Me(CGCGCG) Różnice te skłoniły naszą Pracownię do przeprowadzenia szczegółowych badań MR dla form prawoskrętnych obu dupleksów RA Jednocześnie rozwiązano z rozdzielczością 1.3 Å, największą z odnotowanych w polu badań RA, strukturę dupleksu 2'--Me(CGCGCG) 2 w krysztale 20. Głównym celem moich badań było wyznaczenie struktur dupleksów: r(cgcgcg) 2 i 2'--Me(CGCGCG) 2 w roztworze, o małym stężeniu soli, a więc w warunkach istnienia form prawoskrętnych typu A-RA, metodami MR oraz komputerowego modelowania molekularnego. Istotnym celem było porównanie struktur dupleksu 2'-- Me(CGCGCG) 2 w roztworze i krysztale oraz określenie wpływu 2'--metylowania na strukturę i hydratację RA. Ponadto celem mojej pracy było także adaptowanie i rozwinięcie w naszej Pracowni nowych metod eksperymentalnych 1, 13 C, 31 P MR, analizy widm i protokołu udokładniania struktur. 1

6 Wyniki moich badań znalazły odzwierciedlenie w poniżej cytowanych publikacjach (odbitki - Aneks 3.). Spis wszystkich komunikatów oraz publikacji, których jestem współautorem zamieszczony jest na końcu pracy (Aneks 2.) 1. E.Biała, J.Milecki, A.Kowalewski, M.Popenda, W.Z.Antkowiak, R.W.Adamiak, "Z-RA. The synthesis of 2'--[ 13 C]methyl- and 5-methyl-analogs of ribo-cgcgcg", Acta Biochim. Pol., 40 (4), (1993). 2. J.Milecki, M.Popenda, R.W.Adamiak, " 1 MR analysis of isomeric 2' (3')-trialkylsilyl and 2' (3')--methyl ribonucleosides", Pol.J.Chem. 68, (1994). 3. M.Popenda, J.Milecki, E.Biała, R.W.Adamiak, "The solution MR structure of 2'-methyl-CGCGCG RA duplex", ucleosides&ucleotides 14 (3-5), (1995). 4. M.Popenda, E.Biała, J.Milecki, R.W.Adamiak, "Solution structure of RA duplexes containg alternating CG base pairs: MR study of r(cgcgcg) 2 and 2'-- Me(CGCGCG) 2 under low salt conditions", ucl.acids.res. 25 (22), (1997). 5. D.A.Adamiak, J.Milecki, M.Popenda, R.W.Adamiak, Z.Dauter, W.R.Rypniewski "Crystal structure of 2'--Me(CGCGCG) 2, an RA duplex at 1.30 Å resolution. ydration pattern of 2'--methylated RA", ucl.acids.res. 25 (22), (1997). 2

7 II. CZĘŚĆ LITERATURWA. II.1. Wprowadzenie. Cząsteczki kwasów rybonukleinowych (RA) są biopolimerami, które w komórce pełnią różnorodne funkcje biologiczne. Jedną z nich jest udział w biosyntezie białek. W złożonym procesie ekspresji genów, ze względu na funkcje biologiczne, wyodrębniono trzy podstawowe rodzaje kwasów rybonukleinowych: * informacyjny (matrycowy) RA - mra, * transportujący (transferowy) RA - tra, * rybosomalny RA - rra. ajliczniejszą i najbardziej heterogenną grupę stanowią cząsteczki mra o znacznie zróżnicowanej wielkości. Masa największych z nich dochodzi do 1000 kd, a ich struktury stabilizowane są drogą kompleksowania z białkami. Informacyjne RA są syntetyzowane na matrycach kwasów dezoksyrybonukleinowych (DA) w procesie transkrypcji według komplementarności zasad i przenoszą informację genetyczną do rybosomów, gdzie następnie, na podstawie ich sekwencji syntetyzowane są białka w procesie zwanym translacją. Badania strukturalne wykazują, że cząsteczki mra są długimi łańcuchami, które w wielu miejscach ulegają zagięciu tworząc różnorodne formy przestrzenne. Dokładna ich struktura na poziomie atomowym jest mało znana. Cząsteczki mra ulegają szybkiej degradacji i stanowią zaledwie 5% całkowitej masy kwasów rybonukleinowych zawartych w komórkach różnych organizmów. Rys.1. Trzeciorzędowa struktura fenyloalaninowego tra w dwóch wzajemnie prostopadłych rzutach. 3

8 Struktury transferowych RA są najlepiej poznane. Cząsteczki tra po modyfikacjach pierwotnego transkryptu, tzw. dojrzałe cząsteczki tra, zawierają ok. 75 reszt nukleozydowych (25 kd). Charakterystyczną cechą ich budowy jest duża zawartość modyfikowanych i hipermodyfikowanych nukleozydów. Wszystkie znane sekwencje tra można przedstawić w formie "liścia koniczyny" 233, gdzie ponad połowa nukleozydów jest zaangażowana w tworzeniu regionów dwuniciowych. Badania rentgenowskie określiły dokładnie kształt cząsteczek tra, który zbliżony jest do litery L. Trzeciorzędowa struktura fenyloalaninowego tra z drożdży przedstawiona jest na rysunku (rys. 1). Występujące w cytoplazmie transferowe tra przyłączają na 3' końcu charakterystyczne dla siebie aminokwasy. Aktywowane w ten sposób cząsteczki aminoacylo-tra migrują do rybosomów, gdzie rozpoznają komplementarne do swoich trzech zasad pętli antykodonowej sekwencje informacyjnego RA. Po przekazaniu aminokwasu do syntetyzowanego białka, cząsteczki tra uwalniają się od rybosomu i mogą być ponownie aktywowane. Rybosomalne RA są aktywnymi składnikami budowy rybosomów. Ze względu na ich właściwości sedymentacyjne wyróżnia się trzy (w komórkach prokariotycznych) lub cztery (w komórkach eukariotycznych) rodzaje rra. ajmniejsze jednostki zwane 5S rra zawierają ok. 120 reszt nukleotydowych (30 kd). Większe, np. 23S rra i 28S rra zawierają tysiące reszt nukleotydowych. Dokładna struktura rra oraz ich rola w tworzeniu rybosomów i w syntezie białek jest intensywnie badana. iewielka część cząsteczek RA znajduje się jądrach komórkowych. Są to przeważnie pierwotne transkrypty syntetyzowane przez polimerazę RA zależną od DA, które po modyfikacjach, jako dojrzałe cząsteczki przechodzą do cytoplazmy. Pewna grupa RA występująca w jądrach komórkowych inicjuje syntezę potomnych cząsteczek DA tworząc chwilowe struktury hybrydowe DA:RA zwane od nazwiska odkrywcy fragmentami kazaki. becność RA stwierdzona została także w mitochondriach, gdzie łańcuchy RA wbudowane są do DA i pełnią funkcje swoistego materiału genetycznego. W związku z walką z chorobami nowotworowymi i AIDS (ang. acquired immunodeficency syndrome), obiektami szczególnie zintensyfikowanych badań stały się genomowe RA wirusów i retrowirusów. Duże znaczenie mają badania nad możliwością wykorzystania tzw. technologii "antysensowej", w której stosuje się zmodyfikowane łańcuchy kwasów nukleinowych specyficznie oddziaływujące z wirusowym RA lub z mra niepożądanego genu, uniemożliwiając tym samym jego translację do szkodliwych dla organizmu białek. Badania konformacyjne RA i ich oddziaływań z białkami i innymi związkami w różnych środowiskach chemicznych mają istotne znaczenie w wyjaśnieniu ich biologicznych funkcji oraz przy tzw. racjonalnym projektowaniu leków. a podstawie badań rentgenowskich, dokładnie poznane zostały struktury krystaliczne kilku cząsteczek tra 21-28, krótkich dupleksów RA 29-41, dupleksów hybrydowych, fragmentów kazaki i struktur chimerycznych RA-DA 42-55, rybozymów 56-61, oraz kompleksów RA z białkami Głównym ograniczeniem tych badań są trudności wynikające z otrzymania monokryształów o odpowiednich właściwościach dyfrakcyjnych. graniczenia te, z oczywistych względów, nie występują w przypadku badań strukturalnych w roztworze metodami spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (MR). Ponadto, stosując odpowiednio buforowane roztwory wodne, można zapewnić in vitro środowisko najbardziej zbliżone do warunków natywnych w komórce. W porównaniu do innych metod spektralnych (UV-VIS, fluorescencja, spektroskopia IR i Ramana, EPR), które dają cząstkowe informacje strukturalne, metody MR są jedynymi, które umożliwiają pełne i precyzyjne określenie struktury z dokładnością na poziomie atomowym. Wspomagane metodami modelowania 4

9 komputerowego, pozwalają wyznaczyć współrzędne x, y, z atomów oraz określić dynamikę badanych RA w roztworze. W analizie strukturalnej MR bazuje się głównie na informacjach uzyskanych z następujących pomiarów: * czasów relaksacji T 1 (spin-sieć) i T 2 (spin-spin), * przesunięć chemicznych 1/13C/15/31P, * homo i heteronuklearnych sprzężeń skalarnych ( 3 J, n J C, n J P ), * homonuklearnych efektów verhausera (E) między protonami, * kształtu i wielkości sygnałów rezonansowych. Relacje pomiędzy danymi eksperymentalnymi, a elementami strukturalnymi są wykorzystywane przy określaniu tzw. więzów strukturalnych (ang. restraints, constraints), na podstawie których generowane są modele rzeczywistych struktur. Wartości kątów torsyjnych wyprowadza się ze stałych sprzężeń, odległości między protonami (w Å) z ilościowej analizy E. Zastosowanie metod komputerowej symulacji dynamiki molekularnej rmd (ang. restrain molecular dynamics) z wykorzystaniem dostępnych z eksperymentów MR więzów, pozwalają dodatkowo określić stabilność poszczególnych fragmentów badanej cząsteczki. W celu otrzymania udokładnionych struktur (ang. refined structures) RA w roztworze, w pierwszym etapie identyfikowane są sygnały rezonansowe protonów, a także innych jąder magnetycznych jak 13 C, 15, 31 P. W tym celu stosowane są różne, specyficzne techniki spektroskopii MR 76-83, w oparciu o które dokonywane są przypisania sygnałów rezonansowych Ważną rolę odgrywają metody związane z matematyczną obróbką sygnałów swobodnej precesji (FID) 94, które uzyskujemy w trakcie eksperymentów MR oraz metody analityczne stosowane przy wyznaczaniu sprzężeń spinowo-spinowych i wielkości efektów verhausera. Parametry te odgrywają istotną rolę przy wyznaczaniu więzów strukturalnych. Programy symulujące widma dwuwymiarowe 95 przy określonych parametrach eksperymentalnych zwiększają dokładność pomiarów. W końcowym etapie badań generowane są struktury, które najlepiej odpowiadają danym eksperymentalnym. becnie stosowane są różne algorytmy oparte na analizie macierzy odległości międzyprotonowych (Distance Geometry) lub dynamice molekularnej Dokładność struktur krótkich RA (do 40 nukleozydów), szczególnie sztywnych fragmentów RA jest porównywalna do wyników otrzymywanych z analizy rentgenowskiej w krysztale. Wybór strategii badań metodami MR zależy w dużym stopniu od wielkości, sekwencji, struktur i trwałości badanych cząsteczek RA. Badania krótkich oligomerów RA (do kilkunastu nukleozydów) oparte są głównie na homonuklearnych, dwuwymiarowych widmach protonowych ( 1 MR) wykonanych na próbkach o naturalnym składzie izotopowym. Do określenia większych struktur wykonywane są dodatkowe widma, w tym również wielowymiarowe widma 3D- i 4D-MR, których technika otrzymywania oparta jest na heteronuklearne sprzężenia skalarne protonów z jądrami 13 C i 15. Wymaga to stosowania odpowiednio znakowanych cząsteczek, które otrzymywane są na drodze enzymatycznej i chemicznej syntezy 4, Głównym ograniczeniem metod spektroskopii MR wysokiej zdolności rozdzielczej w badaniach strukturalnych jest wielkość cząsteczek RA. ajwiększe rozwiązane struktury RA metodami MR i modelowania komputerowego mają masę ok. 15 kd i zawierają do 40 reszt nukleotydowych. Wzrost wielkości badanych cząsteczek powoduje zwiększenie liczby nachodzących na siebie sygnałów rezonansowych. Drugim niekorzystnym czynnikiem jest skrócenie czasów relaksacji T 2, co powoduje znaczne poszerzenie sygnałów rezonansowych. aturalna szerokość protonowych linii rezonansowych dużych w znaczeniu spektroskopii MR cząsteczek (spełniających warunek c >> 1) wynosi od kilku do kilkunastu z. Wraz ze wzrostem masy, szerokość linii rezonansowych wzrasta, co powoduje zanik subtelnej 5

10 struktury sygnałów i zmniejszenie ich intensywności. Zastosowanie wzbogaconych próbek RA izotopami 13 C i 15, znacznie ułatwia analizę złożonych widm MR. Tabela 1. Struktury dupleksów i kwadrupleksów zawierające sekwencje RA otrzymane metodami MR, znajdujące się w bazie danych Protein Data Bank (PDB) (stan do 31. XII. 1997). Identyfikator Sekwencja, opis Ilość Sruktur D [r(cgcg)-d(tatacgcg)] 2. Wzajemnie komplementarna, chimeryczna struktura 1 hybrydowa. Centralny fragment DA ma formę typu B-DA. Regiony hybrydowe posiadają formę bardziej zbliżoną do typu A-RA niż do B-DA D d(gtcacatg):r(caupgugac). ybrydowy dupleks DA:RA o strukturze typu 1, która jest pośrednia pomiędzy formą A-RA i B-DA D r(cgcgaauuagcg) 2 Dupleks A-RA zawierający parę G:A D r(gcg)-d(tataccc):d(gggtatacgc). Dupleks DA zawierający hybrydowy 1 fragment RA:DA. Region hybrydowy RA:DA ma strukturę typu, natomiast region DA:DA strukturę zbliżoną do formy B-DA 103, D 2 -P-(GP-AP-AP-CP-TP-CP)-C:r(GAGUUC). Kompleks PA z 1 RA o strukturze prawoskrętnej helisy zbliżonej do A-RA AC3 d(cgcgt-tsp-tcp-tcgcg):r(gcgcaaaacgcg). ybrydowy dupleks 8 DA:RA zawierający 3'-tio-tymidynę-5'-fosforan (TSP) i 5'-metylotymidynę (TCP). Pośrednia struktura typu pomiędzy formą A-RA a B-DA AL5 r(cgcaaauuugcg) 2. Wzajemnie komplementarny 12-mer o strukturze A- 12 RA 110, D d(gg)-r(agau)-d(gac):d(gtcatctcc). Dupleks DA zawierający wewnętrzny 1 region hybrydowy RA:DA DR d(ggaga)-r(ugac):d(gtcatctcc). Dupleks DA zawierający region 1 hybrydowy RA:DA o strukturze łączącej formę B-DA z formą hybrydową 112, EL r(uugccuggcggc):r(aacugccaggcau). Struktura helisy I 5S rra E. Coli 6 zawierająca pary G:U i wolne zasady na końcach dupleksu GTC r(gcca)-d(ctgc):d(gcagtggc). Dupleks DA zawierający region hybrydowy 11 RA:DA z przejściem strukturalnym między formą hybrydową a formą B- DA 104, GUC r(gaggucuc) 2. Dupleks zawierający tandem nietypowych par G:U MIS r(gcggacgc) 2. Dupleks zawierający tandem nietypowych par G:A MWG r(ggcaggcc) 2. Dupleks zawierający tandem nietypowych par G:A A r(ggagaugac):2'--me(guc)-d(atct)-2'--me(cc). Struktura dupleksu RA z 1 2'--metylowanym RA. W części centralnej występuje hybrydowy segment RA:DA XR r(gaggacug):d(cagtcctc). ybryd RA:DA o strukturze pośredniej między 18 formą A-RA i B-DA KA r(ccca)-d(aatga):d(tcatttggg). Fragment struktury kazaki zawierający 7 hybrydowy region RA:DA. Struktura z przejściem pomiędzy helisą typu hybrydowego a helisą B-DA PBL 2'-Me-(CGCGCG) 2. Wzajemnie komplementarny dupleks z naprzemiennymi 1 parami CG. [Aneks 3] PBM r(cgcgcg) 2. Wzajemnie komplementarny dupleks RA z naprzemiennymi 1 parami CG. [Aneks 3] QES r(ggaugucc) 2. Dupleks zawierający tandem nietypowych par G:U QET r(ggaguucc) 2. Dupleks zawierający tandem nietypowych par G:U RAU [r(uggggu)] 4. Kwadrupleks zawierający kwartety guanozynowe i urydynowe YFV r(ggcgagcc) 2. Dupleks zawierający tandem nietypowych par G:A D d(gctata-aps-tgg):r(ccauuuauaga). Modyfikowany hybryd DA:RA o strukturze pośredniej między formą A-RA i B-DA. W łańcuchu DA pomiędzy A6 i T7 grupa fosforowa zastąpiona jest grupą fosforotiolową (APS) 122,

11 1 1 Tabela 2. Struktury RA zawierające jednoniciowe fragmenty (pętle, wybrzuszenia) otrzymane metodami MR, znajdujące się w bazie danych Protein Data Bank (PDB) (stan do 31. XII. 1997). Identyfikator Sekwencja, opis Ilość Sruktur 1. 1AFX r(ggugugaacacc), Struktura RA z pętlą UGAA AJF r(gacaggggaaacuuuguc). Struktura typu szpilki do włosów zawierająca pętlę 1 GAAA i dwie nietypowe pary G:U AJL r(gguaauaagcuc):r(gaguacc). Dwuniciowa struktura intronu grupy I 1 1AJT zawierająca pięcionukleotydowe wybrzuszenie 126, AR r(ggcagaucugagccugggagcucucugcc), Struktura elementu regulatorowego 20 IV 1 TAR rozpoznawanego przez białko TAT AQ r(ggagugcuucaacagugcuuggacgcucc), Struktura elementu regulatorowego 15 IR AT r(ggcaccuccucgcggugcc). Struktura typu szpilki do włosów centralnej pętli 10 DV antygenomowego rybozymu ATV r(gggaccagaaggucccg). Struktura typu szpilki do włosów z pętlą AGAA ATW. r(gcuccagauggagcg). Struktura typu szpilki do włosów z pętlą AGAU EBQ 1EBR 1EBS r(ggugggcgcagcuucggcugcgguaccac) Struktura zmutowanego elementu IV 1 TAR LX r(gggauaacuucgguuguccc). Struktura intronu RA grupy I typu szpilki do 20 włosów z pętlą UUCG i nietypową parą U:G 133, IKD r(ggggcucuucggagcuccacca). Struktura RA z pętlą UUCG, nietypową 30 parą U:G i akceptorowym, jednoniciowym łańcuchem ACCA KAJ r(ggcgcagugggcuagcgccacucaaaagcccg), Struktura pseudowęzła RA 136, KIS r(gagcccugggaggcuc):r(gcuguucccagacagc). Fragment RA ludzkiego wirusa IV-2 TAR 178, o strukturach typu dwóch szpilek do włosów. połączonych ze sobą poprzez wiązania wodorowe pomiędzy zasadami znajdującymi się w pętlach KPD r(ggcgcagugggcuagcgccacucaaaggcccg), Struktura pseudowęzła RA 136, RT r(gggacugacgaucacgcagucuau). Struktura RA typu szpilki do włosów 1 zawierająca pętlę AUCA, adeninowe wybrzuszenie i nietypową parę G:U RG r(ggcgcuugcguc). Struktura zawierająca pętlę CUUG i nietypową parę G:U 140, RK r(ggcgcagugggcuagcgccacucaaaaggcccau), Struktura pseudowęzła 1 RA 137, SCL r(gggugcucaguacgagaggaaccgcaccc), Struktura fragmentu rra zawierająca pary puryna:puryna, oraz parę A:U o nietypowym schemacie wiązań wodorowych, czteronukleotydową pętlę GAGA i guanozynowe wybrzuszenie SL r(uuacccaaguuugagguaa). Struktura RA typu szpilki do włosów 1 1SLP zawierająca pętlę AGUU i adeninowe wybrzuszenie 144, TF r(gggacugacgaucacgcagucuau). Struktura RA typu szpilki do włosów 1 zawierająca pętlę AUCA i adeninowe wybrzuszenie TLR r(ggccuaagacuucgguuauggcc). Struktura typu szpilki do włosów 20 zawierająca pętlę GAAA U2A 2U2A r(ggucaguguaacaacugacc). Struktura pętli IIA snra UUU r(ggcguacguuucguacgcc). Struktura pętli CGUUUCG VP r(gacuggggcgguc). Struktura fragmentu 23S rra zawierająca siedmionukleotydową 33 pętlę UGGGGCG ZIF r(gggcgaaagccu). Struktura z pętlą GAAA i z nietypową parą G:U 148, ZIG r(gggcgagagccu). Struktura z pętlą GAGA i z nietypową parą G:U ZI r(gggcgcaagccu). Struktura z pętlą GCAA i z nietypową parą G:U

12 Szybki rozwój metod syntezy RA, ich oczyszczania oraz technik MR i programów obliczeniowych wpływa na coraz większą liczbę identyfikowanych struktur. Pierwsze struktury RA w roztworze otrzymane metodami MR w latach 80-tych opierały się głównie na analizie sygnałów korelacyjnych dwuwymiarowych widm typu CSY i ESY. Metody modelowania komputerowego w badaniach strukturalnych powszechnie wprowadzone zostały dopiero w ostatnich latach. becnie znanych jest ponad 50 struktur RA (dupleksy RA, hybrydy RA/DA, struktury typu szpilka do włosów, kompleksy z białkami), których współrzędne atomów otrzymane zostały drogą modelowania molekularnego na podstawie analizy widm MR (Tabela 1-3). Tabela 3. Struktury kompleksów RA otrzymane metodami MR, znajdujące się w bazie danych Protein Data Bank (PDB) (stan do 31. XII. 1997). Identyfikator Sekwencja, opis Ilość Sruktur 1. 1AJU r(ggccagauugagccugggagcucucuggcc). Struktura fragmentu ludzkiego 20 wirusa IV-2 TAR w kompleksie z argininą 128,130, AKX r(ggccagauugagccugggagcucucuggcc). Struktura fragmentu ludzkiego 1 wirusa IV-2 TAR w kompleksie z argininą 128,130, AM r(ggguugggaagaaacuguggcacuucggugccagcaaccc). Aptamer w 8 kompleksie z monofosforanem adenozyny 176,173, ARJ r(ggcagaucugagccugggagcucucugcc). Struktura elementu IV-1 TAR 20 w kompleksie z argininą ,153, BIV r(ggcucguguagcucauuagcuccgagcc). Struktura elementu IV-1 TAR w 5 kompleksie z białkiem TAT (17 aminokwasów) ET r(ggcgauaccagccgaaaggcccuuggcagcguc). Struktura aptameru z 10 pętlą GAAA w kompleksie z theofiliną 156, ETF r(uugccuggcggc):r(aacugccaggcau). Struktura fragmentu ludzkiego 1 wirusa IV-1 w kompleksie z peptydem REV (23 aminokwasów) ETG r(ggucugggcgcagcgcaagcugacgguacaggcc. Struktura elementu REV 19 (PRE) RA z peptydem regulatorowym REV (23 aminokwasów) FM r(ggcguguaggauaugcuucggcagaaggacacgcc). Struktura aptameru 5 w kompleksie z mononukleotydem flawiny 162, KC r(agaaggagugu):r(acgguuaggucgcu). Struktura aptameru w kompleksie z 1 argininą 164, KD r(agaaggagugu):r(acgguuaggucgcu). Struktura aptameru w kompleksie z 1 cirtulliną 164, MB r(ggcucguguagcucauuagcuccgagcc). Kompleks fragmentu białka TAT 1 (14 aminokwasów) z BIV TAR RA UM r(ggcagaguccuucgggacauugcaccugcc). Kompleks regulatorowego 25 elementu ludzkiego U1A pre-mra z białkiem U1A (101 aminokwasów) PBR r(ggcgucacaccuucgggugaagucgcc). Struktura fragmentu 16S rra w 1 kompleksie z paromomycyną RAW r(gggaagggaagaaacugcggcuucggccggcuuccc). Struktura aptameru 10 w kompleksie z monofosforanem adenozyny 172, TB r(ggcacgagguuuagcuacacucgugcc). Struktura aptameru w kompleksie z 7 tobramycyną ULL r(ggcuggacucguacuucgguacuggagaaacagcc). Struktura kompleksu aptameru RA z białkiem IV-1 REV

13 II.2. Budowa RA. Kwas rybonukleinowy (RA) jest polimerem zbudowanym z jednostek rybonukleotydowych, które są ufosforylowanymi nukleozydami. Każdy nukleozyd składa się z zasady organicznej (pochodnej puryny albo pirymidyny) oraz z D-rybofuranozy. Podstawowymi zasadami organicznymi w cząsteczkach RA są: adenina, guanina, cytozyna i uracyl. Wzory strukturalne tych zasad oraz sposób ich numeracji przedstawiono poniżej Adenina Guanina Cytozyna Uracyl Rys. 2. Wzory strukturalne: adeniny (Ade), guaniny (Gua), cytozyny (Cyt), uracylu (Ura). W każdej jednostce nukleozydowej zasada połączona jest z D-rybofuranozą wiązaniem -glikozydowym. W wiązaniu tym, anomeryczny węgiel C1' pierścienia rybozy przyjmuje zawsze konfigurację, co schematycznie uwidoczniają wzory strukturalne guanozyny i cytydyny (rys. 3.). 2 2 Rys. 3. Wzory strukturalne guanozyny i cytydyny. W łańcuchu RA rybonukleozydy połączone są ze sobą przez wiązania 5',3'-fosforodiestrowe. Każda grupa fosforodiestrowa niesie ładunek ujemny, który może być zobojętniony różnymi kationami. Przykład kwasu rybonukleinowego o sekwencji AGUC przedstawiono na rysunku 4. Zgodnie z konwencją, kolejność zasad w łańcuchach polinukleotydowych zapisywana jest w kierunku 5' => 3'. W tej konwencji, pierwszy nukleotyd (A) ma wolną grupę 5'-, natomiast ostatni (C) posiada wolny system 2',3'-cis diolowy. Struktura pierwszorzędowa kwasów nukleinowych (sekwencja) określa kolejność występowania zasad w łańcuchu polinukleotydowym. Zwykle jest ustalana w procesie zwanym sekwencjonowaniem w oparciu o specyficzne trawienie enzymami, chromatografię i elektroforezę analityczną oraz na podstawie badań fizycznych np. techniką spektrometrii masowej. Wyznaczenie sekwencji zasad jest pierwszym etapem badań strukturalnych kwasów nukleinowych. W wyniku zwijania się łańcuchów RA (ang. folding), jego fragmenty mogą oddziaływać między sobą tworząc struktury dwuniciowe. Wiązania wodorowe pomiędzy guanozyną i cytydyną (para G:C) oraz między adeniną i urydyną (para A:U) wg. propozycji Watsona- Cricka (rys. 5.) są głównymi czynnikami powstawania podwójnego heliksu. Charakterystyczne ułożenie zasad w parach typu Watsona-Cricka nie jest jednak jedynym, 9

14 jakie może występować między oddziaływującymi zasadami A i U oraz G i C. Jednym z nieklasycznych oddziaływań jest oddziaływanie typu oogsteena, które występuje w strukturze 29-nukleotydowego fragmentu 28S rra 143 pomiędzy zasadami A i U. Ponadto, w strukturze tej zaobserwowano kilka nietypowych oddziaływań wodorowych pomiędzy zasadami purynowymi. Występowanie pojedynczych par zasad typu G:A 116,117,121 i G:U 115,119, ,148,149 stwierdzono w kilkunastu strukturach RA otrzymanych przy pomocy metod spektroskopii MR. koniec 5' koniec 3' P P 2 P Rys. 4. Wzór strukturalny r(aguc). Ryboza Ryboza Ryboza Ryboza Rys. 5. Schemat wiązań wodorowych typu Watsona-Cricka w parach zasad A:U i G:C.. 10

15 Występowanie dwuniciowych odcinków oraz sposób zawijania się łańcucha polirybonukleotydowego determinuje strukturę drugorzędową. Różne motywy struktury drugorzędowej RA przedstawiono poniżej (rys. 6). Rys. 6. Motywy drugorzędowej struktury RA 90 : [A.] dupleks, [B.] pętla typu szpilki do włosów (ang. hairpin loop), [C.] jednonukleotydowe wybrzuszenie (ang. single-base bulge), [D.] wielonukleotydowe wybrzuszenie (ang. multiple-base bulge), [E.] symetryczna pętla wewnętrzna 2:2, [F.] asymetryczna pętla wewnętrzna 3:2, [G.] pętla z nietypową parą zasad, w której nie występują wiązania wodorowe (ang. mismatch loop) [.] trójczłonowy styk (ang. three-stem junction), [I.] czteroczłonowy styk, [J] pseudowęzeł. Wszystkie zasady tworzące pary zasad typu Watsona-Cricka są zacienione, natomiast regiony jednoniciowe są białe. Typowe, dwuniciowe fragmenty RA tworzą prawoskrętną helisę typu A-RA i są bardzo stabilne. W przeciwieństwie do nich, jednoniciowe odcinki wykazują większą dynamikę i są często aktywnymi miejscami selektywnego wiązania jonów magnezu oraz tworzenia kompleksów z białkami. Dla małych cząsteczek RA, regiony dwuniciowe w drugorzędowej strukturze mogą być badane metodami MR w oparciu o analizę sygnałów rezonansowych wymienialnych protonów. Uczestniczące w wiązaniach wodorowych protony iminowe (zasad U,G) i aminowe (zasad A,C,G) wolno wymieniają się z wodą dając stosunkowo wąskie sygnały, silnie przesunięte w stronę niższego pola 4. Dalszym etapem badań strukturalnych jest określenie trzeciorzędowej struktury, która definiuje sposób aranżacji jednoniciowych i dwuniciowych fragmentów RA w przestrzeni. Struktura trzeciorzędowa zależy od konformacji poszczególnych jednostek nukleotydowych opisanych przez: pofałdowanie pierścienia rybozy, kąt torsyjny wokół wiązania -glikozydowego, kąty torsyjne wokół pojedyńczych wiązań ugrupowania fosforocukrowego tworzącego szkielet (ang. backbone) RA. Wykorzystywane przy określaniu struktury trzeciorzędowej RA zależności pomiędzy danymi otrzymywanymi z badań MR (wartości stałych sprzężeń spin-spin i przesunięcia chemiczne oraz wielkości E) a konformacją pierścieni cukrowych i kątami torsyjnymi podane są w rozdziale II.4. Szczegółowy opis struktury dupleksów RA przedstawiłem w rozdziale II.7. 11

16 II.3. Metody spektroskopii MR w analizie strukturalnej RA. Korelacyjna spektroskopia MR umożliwia pełne przypisanie sygnałów rezonansowych oraz dostarcza najwięcej informacji strukturalnych o badanych cząsteczkach RA. Wykorzystując dodatkowe stopnie swobody standardowych widm jednowymiarowych, obecne stosowane wieloimpulsowe techniki korelacyjnej spektroskopii MR dają widma w dwóch (2D-MR) lub w kilku wymiarach (3D-, 4D-MR) Widma te przedstawiają absorpcję fal elektromagnetycznych badanej próbki, znajdującej się w silnym polu magnetycznym w funkcji dwóch lub więcej częstotliwości. Położenie każdego sygnału, w zależności od liczby wymiarów, określane jest przez n współrzędnych. Dwuwymiarowe widma korelacyjne MR są klasyfikowane ze względu na rodzaje oddziaływań między rezonującymi jądrami. W zależności od metody, każde oddziaływanie skalarne (przez wiązania kowalencyjne) lub dipolowe (przestrzenne) między spinami jest reprezentowane przez sygnał korelacyjny. Współrzędne ( 1, 2) sygnału w widmie 2D- MR odpowiadają częstotliwościom rezonansowym sprzęgających się jąder. Intensywność sygnałów korelacyjnych zależy od wielkości oddziaływań. Klasyfikacja różnych technik dwuwymiarowej spektroskopii korelacyjnej MR, najczęściej stosowanych w analizie RA, przedstawiona jest poniżej (rys. 7). Widma korelacyjne 2D-MR ddziaływania skalarne ddziaływania dipolowe homo-nuklearne hetero-nuklearne homo-nuklearne hetero-nuklearne CSY DQF-CSY E.CSY P.E.CSY R-CSY DR-CSY TCSY CC ETCR CLC MQC SQC ESY RESY ESY Rys. 7. Podział eksperymentów 2D-MR. Pierwszym eksperymentem dwuwymiarowym w spektroskopii MR był eksperyment CSY 181,182 (ang. Crrelation SpectroscopY), wykonany i opisany przez R. R. Ernsta i współpracowników w roku Sekwencja impulsowa (rys. 8.) stosowana w tej metodzie składa się z dwóch impulsów /2, po których zbierany jest sygnał zaniku swobodnej precesji. dstęp czasu t1 pomiędzy impulsami (evolution time) zmienia się po każdej serii spójnych rejestracji. Po zebraniu wszystkich sygnałów i przeprowadzeniu podwójnej transformacji Fouriera otrzymuje się widmo, w którym sprzęgające się poprzez wiązania chemiczne pary protonów dają sygnały korelacyjne (ang. cross-peaks). W widmach CSY dla cząsteczek RA (wykonanych w D 2 ) można się spodziewać sygnałów korelacyjnych, związanych z dwuspinowym układem protonów zasad pirymidynowych 5-6 oraz sygnałów rybozy: 1'-2', 2'-3', 3'-4', 4'-5', 4'-5'' 12

17 i 5'-5'' (rys. 9). Ze względu na dużą wartość stałej sprzężenia 3 J 56 (ok. 7.5 z), sygnały korelacyjne 5-6 są na ogół dobrze widoczne. Występują one w charakterystycznym tylko dla siebie obszarze spektralnym. Ich ilość jest równa liczbie zasad pirymidynowych w łańcuchu RA. W specyficznym regionie spektralnym widm 2D-CSY występują również sygnały 1'-2' rybozy. Jednakże w strukturach dupleksów typu A-RA, sprzężenia 3 J 1'2' są słabe i w związku z tym przeniesienie magnetyzacji między protonami 1' i 2' jest mało efektywne. Przy szerokościach linii rezonansowych większych niż 2, sprzężenia skalarne n J nie są obserwowane. Pozostałe sygnały korelacyjne protonów rybozy grupują się w wąskim obszarze spektralnym w pobliżu głównej przekątnej widma 2D-CSY. Ze względu na silne nakładanie się tych sygnałów, analiza spektralna tego regionu jest najtrudniejsza. CSY DQF-CSY ESY _ _ _ _ _ _ _ _ R t1 t2 t1 t2 t m t2 A B D A B C D A B C D Rys. 8. Sekwencje impulsów stosowane w dwuwymiarowych eksperymentach CSY, DQF-CSY i ESY. Skala czasowa nie jest zachowana. Poszczególne etapy cyklu eksperymentalnego oznaczono jako: A- okres przygotowawczy (preparation period), B - okres ewolucji (evolution period), C - okres mieszania (mixing period), D - okres akwizycji danych (aquisition period). W schematach sekwencji oznaczono: t1- czas ewolucji, t2 - czas akwizycji, m - czas mieszania. W podstawowym, czterostopniowym cyklu fazowym sekwencji DQF-CSY, fazy impulsów są następujące: 1 (x x x x), 2 (x x x x), 3 (x y -x -y) i detektora R (x -y -x y). 5' 4' 3' ZASADA 2' 1' RYBZA RYBZA Rys. 9. Sprzężenia skalarne pomiędzy protonami występujące w RA. Widma CSY mogą być rejestrowane w trybie amplitudowym (ang. magnitude mode) lub mocy (ang. power mode). Tryby te charakteryzują się tym, że linie rezonansowe mają bardzo szerokie podstawy i w związku z tym subtelna (multipletowa) struktura sygnałów jest słabo widoczna. Ponadto bardzo silne i szerokie sygnały diagonalne (w tym również sygnał od D) zasłaniają blisko leżące sygnały korelacyjne. Różnorodne modyfikacje zastosowane w sekwencji impulsowej CSY w znacznym stopniu wyeliminowały te wady. ajlepszą modyfikacją dla badań RA okazała się sekwencja DQF-CSY (ang. Double Quantum Filtered Crrelation SpectroscopY). Sekwencja różni się od eksperymentu CSY dodatkowym impulsem /2 (rys. 8). Cykliczna zmiana faz impulsów pozwala wyeliminować 13

18 jednokwantowe koherencje. Położenia sygnałów korelacyjnych w widmach DQF-CSY są takie same, jak w widmach CSY, jednakże silna redukcja sygnałów diagonalnych pozwala badać korelacje między protonami, których różnice przesunięć chemicznych są bardzo małe (rzędu setnych części p.p.m.). Ponadto zastosowanie fazoczułej metody TPPI 187 (ang. Time Proportional Phase Incrementation) lub metody States'a 188 (hipercomplex), przy dużej rozdzielczości widm, umożliwiają analizę struktury subtelnej sygnałów i układów spinowych. Wyznaczanie stałych sprzężeń na podstawie sygnałów korelacyjnych widm DQF-CSY opisane jest w rozdz. II.4.1. Rozszerzoną modyfikację sekwencji impulsowej zastosowano w technice E.CSY 189,190 (ang. Extensive Crelation Spectroscopy). Technika ta bazuje na połączeniu dwukwantowej filtracji DQF (ang. Double Quantum Filtered) z trójkwantową TQF 191 (ang. Triple Quantum Filtered), w wyniku czego znacznie upraszcza się subtelna struktura sygnałów korelacyjnych w stosunku do analogicznych sygnałów otrzymanych z eksperymentów DQF-CSY. Ta redukcja ułatwia analizę stałych sprzężeń w złożonych układach spinowych oraz pozwala na ich dokładniejszy pomiar. Pewną wadą tego eksperymentu jest mniejsza intensywność sygnałów. Uproszczoną techniką E.CSY jest P.E.CSY 192 (ang. Primitive E.CSY). bie te metody, w analizie strukturalnej RA są stosowane jako alternatywne techniki w stosunku do DQF-CSY. W analizie bardzo złożonych widm stosowane są eksperymenty typu X-Filter CSY 193,194. W widmach otrzymywanych tą techniką obserwowane są tylko sygnały korelacyjne między wybranymi protonami, które bezpośrednio związane są z heteroatomami. W analizie RA wykorzystywane są filtry 13 C określonych atomów pierścieni rybozy. Techniki te stosowane są dla związków izotopowo znakowanych i dają możliwość redukowania sygnałów korelacyjnych. Sterowana redukcja sygnałów korelacyjnych, poprzez zastosowanie odpowiednich warunków eksperymentalnych, umożliwia analizę złożonych widm z nakładającymi się pasmami spektralnymi. Inne techniki, takie jak: DQ-CSY (ang. Double Quantum Crrelation SpectroscopY), MQ-CSY (ang. Multi-Quantum Crrelation SpectroscopY) i MQF-CSY 198,199 (ang. Multi Quantum Filtered Crrelation SpectroscopY), z-csy są rzadziej stosowane w analizie strukturalnej RA. sobną grupą metod homonuklearnej spektroskopii korelacyjnej MR stanowią techniki R.CSY 203,204 (ang. Relayed Crrelation SpectroscopY), DR.CSY 203,204 (ang. Double Relayed Crrelation SpectroscopY), TCSY (ang. Total Crrelation SpectroscopY). trzymane tymi technikami widma, oprócz sygnałów korelacyjnych typowych dla CSY, zawierają dodatkowe sygnały. Są to sygnały korelacyjne par protonów, które pośrednio sprzężone są ze sobą poprzez jeden proton (R.CSY), dwa protony (DR.CSY) lub wiele sprzężonych ze sobą protonów (TCSY). Widma te mają szerokie zastosowanie w analizie strukturalnej DA. iezależnie od konformacji cukru, pozwalają one skorelować przesunięcia chemiczne protonów 1' z przesunięciami chemicznymi pozostałych protonów dezoksyrybozy dla każdej jednostki monomerycznej DA. W przypadku RA, identyfikacja tymi technikami całego układu spinowego pierścieni cukrowych jest możliwa tylko wówczas, gdy sprzężenia 3 J 1'2' są wystarczająco duże dla skutecznego przeniesienia magnetyzacji pomiędzy protonami anomerycznymi a pozostałymi protonami rybozy. Taka sytuacja zachodzi tylko w przypadku konformacji South lub East rybozy. W typowych dla RA konformacjach orth, przeniesienie magnetyzacji pomiędzy 1' a pozostałymi protonami jest bardzo słabe. Dlatego też, wprowadzono nowe techniki, które bazują na heteronuklearnych sprzężeniach skalarnych. W technikach typu CC, magnetyzacja z protonu 1' jest przenoszona na 2' "okrężną drogą" poprzez sprzężenia 1 J C1'1', 1 J C1'C2' i 1 J C2'2'. Ponieważ wartości tych stałych sprzężeń są kilkadziesiąt razy większe niż sprzężeń 3 J 1'2', efekt przekazywania magnetyzacji jest bardzo silny. Struktura widma CC jest podobna do widm 14

19 typu CSY, intensywniejsze są jednak sygnały korelacyjne. W widmach CC, niezależnie od wielkości wicynalnych sprzężeń 3 J, sygnały korelacyjne dla protonów związanych ze sobą mostkiem dwuwęglowym będą zawsze rejestrowane. Zastosowanie sekwencji impulsowej eksperymentu CC w połączeniu z sekwencjami R.CSY, DR.CSY lub TCSY daje możliwość pełnej identyfikacji układów spinowych związanych z pierścieniami cukrowymi. Metoda CC, która wykorzystuje sprzężenia skalarne 1 J CC wymaga jednak całkowitego wzbogacenia odpowiednich węgli izotopem 13 C. Sekwencja impulsowa CC stosowana jest w eksperymentach 2D i 3D-MR typu CC-CSY 210, CC-TCSY 211,212, CC-E.CSY 214, CC-TCSY-CC-E.CSY 215, które służą do przypisań sygnałów rezonansowych protonów dłuższych cząsteczek RA. Jedną z najważniejszych technik stosowanych w analizie strukturalnej RA jest 2D-ESY 216 (ang. uclear verhauser Enhancement SpectroscopY). Eksperyment ten opracowany został przez J. Jeenera w 1979 roku. Sekwencja impulsowa 2D-ESY (rys. 8.) składa się z trzech impulsów /2, po których zbierany jest w czasie t2 sygnał zaniku swobodnej precesji FID (ang. Free Induction Decay). Interwał czasowy t1 pomiędzy dwoma pierwszymi impulsami, zwany czasem ewolucji, każdorazowo jest powiększany o stałą wartość dla kolejnych, powtarzających się sekwencji impulsowych, natomiast odstęp czasu pomiędzy drugim i trzecim impulsem jest stały w trakcie całego eksperymentu. osi on nazwę czasu wymiany m. W tym czasie zachodzi wymiana podłużnej magnetyzacji między spinami i od długości trwania tego okresu zależy intensywność sygnałów korelacyjnych w widmach 2D ESY. W oryginalnej pracy Jeenera, metoda ESY przedstawiona została jako dwuwymiarowa spektroskopia wymiany (ang. 2D exchange spectroscopy). Eksperyment ESY rejestruje oprócz sygnałów E, które związane są z wzajemną relaksacją oddziałujących dipolowo protonów, także sygnały wywołane zmianami otoczenia chemicznego protonów. Mogą one wynikać z wymiany chemicznej, przejść konformacyjnych lub innych procesów chemicznych, które zachodzą wolno w sensie skali czasowej MR. Dla małych cząsteczek (o masie cząsteczkowej do 0.5 kd), które posiadają krótkie czasy korelacji c, sygnały korelacyjne związane z E są dodatnie, natomiast sygnały diagonalne i sygnały pochodzące z wolnej wymiany otoczenia chemicznego są ujemne. Przy długich czasach korelacji, typowych dla dużych molekuł (o masie cząsteczkowej powyżej 2 kd), znak efektu E jest ujemny i sygnały korelacyjne w widmach 2D-ESY są w tej samej fazie, co sygnały diagonalne i sygnały z wymiany. Analiza intensywności tych sygnałów w zależności od m pozwala obliczyć szybkość wzajemnej relaksacji (relaksacji krzyżowej) i określić odległości pomiędzy przestrzennie sprzężonymi dipolowo protonami. W przypadku sygnałów korelacyjnych iminowych i aminowych protonów, intensywność sygnałów korelacyjnych zależy także od szybkości wymiany chemicznej. W zakresie czasów korelacji c w przybliżeniu równych odwrotności częstotliwości Larmora ( o c 1), efekt E może nie być obserwowany. Dla roztworów o małej lepkości, w tym zakresie c znajdują się cząsteczki, których masa wynosi od ok. 0,5 do 2 kda. W tych przypadkach efekt verhausera w układzie rotacyjnym (tzw. efekt RE) związany z przeniesieniem poprzecznej magnetyzacji jest często silniejszy od efektu E. Technika RESY (ang. Rotating Frame verhauser Effect SpectroscopY), która rejestruje efekty RE, jest stosowana w analizie hydratacji i szybkości wymiany protonów aminowych kwasów nukleinowych. dmienną grupą eksperymentów MR są techniki oparte na heteronuklearnych sprzężeniach skalarnych. eteronuklearne widma korelacyjne wykorzystywane są przy identyfikacji sygnałów rezonansowych 31 P, 13 C, 15 oraz sprzężonych z nimi protonów. Są to 15

20 techniki typu ETCR 220 (ang. ETeronuclear CRrelation spectroscopy), CLC 221,222 (ang. Crrelated spectroscopy for Lng range Coupling) wykonywane przy normalnej detekcji nastawionej na częstotliwość rezonansową heteroatomu, oraz metody odwrotnej detekcji typu MQC (ang. eteronuclear Multiple Quantum Coherence) i SQC 223,226 (ang. eteronuclear Single Quantum Coherence), w których detektor nastawiony jest na częstotliwość protonu. Techniki z odwrotną detekcją są znacznie czulsze i wykorzystywane są do korelacji przesunięć chemicznych protonów i jąder 13 C, 15. Zastosowanie podwójnej sekwencji IEPT (ang. Intensitive uclei Enhanced by PolarisaTion) w technice SQC jeszcze bardziej zwiększa czułość tej metody, co umożliwia badanie korelacji za pomocą przesunięć chemicznych sygnałów cząsteczek RA, o naturalnym składzie izotopowym. Sekwencje MQC i SQC wykorzystane są wraz z sekwencją ESY w eksperymentach trójwymiarowych typu ESY-SQC i ESY-MQC Techniki te umożliwiają lepsze rozdzielenie sygnałów E pomiędzy protonami przez wykorzystanie dodatkowego wymiaru związanego z przesunięciami chemicznymi 13 C lub 15. Techniki korelacyjne ESY 230 (ang. eteronuclear verhauser Effect SpectroscopY) w analizie dużych w sensie MR cząsteczek, nie są stosowane ze względu na bardzo słabe efekty verhausera zachodzące pomiędzy 31 P, 13 C, 15 a protonami. Efekt ten występuje natomiast pomiędzy jądrami fluoru 19 F a 1, których intensywność jest podobna, jak w układach protonowych. Stąd też, techniki ESY miały zastosowanie w analizie strukturalnej tylko tych cząsteczek RA, które znakowane były atomami fluoru 231,232. II.4. Analiza elementów strukturalnych RA metodami MR. II.4.1. Konformacja rybozy Pierścień cukrowy utworzony przez atomy węgla C1', C2', C3', C4' i tlenu 4' przyjmuje konformację półkrzesła (konformacja skręcona T, ang. twist) lub koperty (E, ang. envelope) 233 (rys. 10). Konformacja typu E występuje wówczas, gdy cztery spośród wyżej wymienionych atomów leżą w jednej płaszczyźnie, a piąty znajduje się poza nią. Jeżeli atom wychylony z płaszczyzny pierścienia leży po tej samej stronie co atom C5' reszty cukrowej, to jego pozycję określa się jako endo, w przeciwnym przypadku mówimy o pozycji egzo. Ze względu na to, że każdy spośród pięciu atomów pierścienia może być wychylony z płaszczyzny pierścienia rybozy w kierunku endo lub egzo, istnieje 10 możliwych konformacji typu E (koperty) oraz 10 konformacji skręconych T (półkrzesła). Rys. 10. Konformacja rybozy typu półkrzesła C T (C2'-egzo,C3'-endo) i typu koperty 2' (C2'-endo). ' C 3' C 2 E Geometria pofałdowania cukru opisana jest przez pięć endocyklicznych kątów torsyjnych i, których definicje podano poniżej (rys. 11). 16

21 1 2 0 Symbol Kąt torsyjny 3 0 C1'-C2'-C3'-C4' 1 C2'-C3'-C4'-4' 2 C3'-C4'-4'-C1' 4 3 C4'-4'-C1'-C2' 4'-C1'-C2'-C3' 4 Rys. 11. Definicja kątów endocyklicznych rybozy. orth South Rys. 12. Koło pseudorotacji, na którym zaznaczone zostały zakresy wartości kątów fazowych P dla najbardziej energetycznie uprzywilejowanych konformacji C3'-endo i C2'-endo. a schematach pięcioczłonowych pierścieni cukrowych zaznaczono znaki endocyklicznych kątów v i. Rozwinięcia kątów torsyjnych i w szeregi Fouriera dają trzy współczynniki amplitudowe i dwa fazowe 234. Uwzględniając symetrię pięcioczłonowych pierścieni (równe kąty i długości wiązań chemicznych), trzy współczynniki Fouriera zerują się, niezależnie od pofałdowania 17

22 cukru. Pozostałe dwa parametry oznaczone przez P i, wg. teorii Altony i Sundaralingama 235,236, jednoznacznie określają geometrię pofałdowania rybozy. Pierwszy z nich, zwany kątem fazowym pseudorotacji P, opisuje typ konformacji cukru i zdefiniowany jest wzorem: ( 4 1) ( 3 0) tan( P) o 0 2 [sin( 36 ) sin( 72 )] 2 (1) Wszystkie konformacje E (koperty) i T (półkrzesła) rybozy mogą być uszeregowane według wartości kąta fazowego pseudorotacji P. To uszeregowanie przedstawione jest na tzw. kole pseudorotacji (rys. 12), na którym zaznaczono zakresy parametru P dla najbardziej energetycznie uprzywilejowanych konformacji ( ang. orth) i S (ang. South). Typowe dla RA konformacje rybozy C3'-endo znajdują się w regionie orth, natomiast C2'-endo, będąca w zakresie konformacji South jest charakterystyczna dla pierścieni cukrowych w DA. Drugi parametr wg. teorii Altony i Sundaralingama, opisuje amplitudę pofałdowania cukru i wyrażony jest: 0 cos( P ). (2) Dla większości znanych struktur rybozy kąt przyjmuje wartości w zakresie od 30 o do 50 o. Parametry P i określające konformacje rybozy w cząsteczkach RA można wyznaczyć na podstawie analizy: * homonuklearnych sprzężeń skalarnych ( 3 J 1'2', 3 J 2'3' i 3 J 3'4' ) , * heteronuklearnych sprzężeń skalarnych n J C, * wielkości E pomiędzy protonami w obrębie pierścienia cukrowego 244,245. Wartości wicynalnych stałych sprzężeń 3 J w układach -C-C- silnie zależą od kąta torsyjnego (rys. 13) oraz od elektroujemności i podstawników S 1, S 2, S 3, S 4. A B A S 3 B S 2 S 3 S 1 S 4 S 2 S 1 S 4 Rys. 13. Kąt torsyjny w łańcuchu -C-C- rybozy. Zależność ta opisana jest uogólnionym równaniem Karplusa 246,247 : 3 J 2 2 A1 cos ( )+A2 cos( )+A 3 + i [ A4 A5 cos ( i A )], (3) i 6 i 18