ODDZIAŁYWANIE KSENOBIOTYKÓW Z DNA

Transkrypt

1 Wydział Chemiczny olitechniki Gdańskiej Katedra Technologii Leków i Biochemii Biochemia DDZIAŁYWAIE KSEBITYKÓW Z DA Struktura DA DA, kwas deoksyrybonukleinowy, może być docelowym miejscem działania ksenobiotyku (związku chemicznego obcego dla organizmu, niepotrzebnego dla jego prawidłowego funkcjonowania, ulegającego w organizmie przemianom metabolicznym). DA jest makrocząsteczką, złożoną z jednostek monomerycznych deoksyrybonukleotydów (rys. 1). Każdy nukleotyd składa się z zasady azotowej (purynowej adeniny lub guaniny, bądź też z pirymidynowej tyminy lub cytozyny), cukru deoksyrybozy oraz reszty kwasu fosforowego. Cukier połączony jest wiązaniem - glikozydowym z zasadą, a reszta kwasu fosforowego tworzy wiązanie estrowe z węglem C 5 ' lub C 3 ' w cząsteczce cukru. Kolejne nukleotydy połączone są ze sobą wiązaniem fosfodiestrowym. koniec 5' 5' 3' H 2 adeniana H 2 cytozyna H 2 guanina tymina Rys. 1 Struktura chemiczna fragmentu łańcucha DA koniec 3'

2 rzytoczony opis dotyczy struktury I-rzędowej DA. Struktura II-rzędowa zaproponowana przez Jamesa D. Watsona i Francisa W. Cricka (rys. 2) określa DA jako podwójną helisę, w której dwa łańcuchy złożone z cukrów połączonych wiązaniami fosfodiestrowymi nawinięte są spiralnie wokół wspólnej osi, przy czym łańcuchy te biegną w różnych kierunkach: jeden 5'-3', drugi 3'-5' (przytoczone cyfry to numery atomów węgla w deoksyrybozie). Rys. 2 Klasyczny model podwójnej helisy B-DA (Watsona-Cricka). Dwie nici biegną w przeciwnych kierunkach, a płaszczyzny zasad są prostopadłe do osi helisy [2] Zasady purynowe i pirymidynowe znajdują się wewnątrz helisy i są połączone wiązaniami wodorowymi w taki sposób, że adenina wiąże się z tyminą drugiego łańcucha DA dwoma wiązaniami wodorowymi, a guanina z cytozyną trzema wiązaniami, przy czym płaszczyzny wiązań są względem siebie równoległe. odwójna nić DA ulega skręceniu w ten sposób, że sąsiednie nukleotydy są przesunięte o kąt 34,6 względem siebie, co oznacza, że pełen obrót helisy następuje co 10,4 par zasad. Strukturę taką stabilizują nie tylko wiązania wodorowe między komplementarnymi zasadami, ale również tzw. oddziaływania warstwowe zasad ustawionych prostopadle do osi helisy. Są to przede wszystkim oddziaływania typu dipol-dipol oraz typu Van der Waalsa. Molekularny mechanizm oddziaływania ksenobiotyków z DA Molekularny mechanizm oddziaływania ksenobiotyków z DA może mieć charakter fizyko-chemiczny (m.in. interkalacyjny) i kowalencyjny, w zależności od struktury wiążącego się związku. Interkalacja do DA jest to niekowalencyjne oddziaływanie związku (np. m-amsa, ledakrin, aktynomycyna D) z DA polegające na wnikaniu płaskiej, najczęściej policyklicznej i aromatycznej cząsteczki związku pomiędzy pary zasad w podwójnej helisie DA. owoduje to zaburzenia w strukturze DA poprzez zmiany kąta skręcenia helisy, 2

3 zmiany odległości między parami zasad oraz średnicy cząsteczki DA. Stopień takiej modyfikacji zależy od struktury interkalatora. Zmiana kąta skręcenia waha się od 10 do 26, odległość między zasadami wzrasta z 0,34 nm do około 0,7-0,8 nm. Związki interkalujące są utrzymywane pomiędzy zasadami przez siły elektrostatyczne, wiązania wodorowe, oddziaływania van der Waalsa i oddziaływania hydrofobowe. ddziaływania te stabilizują IIrzędową strukturę DA hamując skutecznie replikację i transkrypcję. Utrudnione jest wówczas, niezbędne dla tych procesów, rozplecenie podwójnej helisy. Związki wiążące się w sposób trwały, tzn. z utworzeniem wiązania kowalencyjnego (np. cisplatyna, ledakrin, mitoksantron, mitomycyna), mogą wiązać się z jedną nicią DA lub z obydwoma niciami jednocześnie, tworząc międzyłańcuchowe lub wewnątrzłańcuchowe wiązanie sieciujące DA. Zarówno związki wiążące się z DA w sposób fizyko-chemiczny (a w tym interkalatory), jak i związki wiążące się kowalencyjnie mogą uszkadzać strukturę DA i jego funkcję jako matrycy genetycznej. Metody badania interkalacji do DA Większość metod badania interkalacji związków chemicznych do DA opiera się na obserwacji zmian jakie zachodzą w DA lub cząsteczce interkalatora w trakcie oddziaływania interkalacyjnego. Można wyróżnić następujące molekularne efekty interkalacji do DA: zmiany topologii helisy DA (rozwinięcie, wydłużenie i usztywnienie); zmiany we właściwościach elektronowych DA lub związku wnikającego pomiędzy pary zasad helisy DA; zmiany w orientacji i sztywności układu chromoforowego interkalatora. owodują one możliwe do obserwacji i zmierzenia makroskopowe zmiany we właściwościach DA lub interkalatora, takie jak: zmiany współczynnika sedymentacji DA (mierzone metodami ultrawirowania), wzrostu współczynnika lepkości roztworu DA (mierzony metodami wiskozymetrycznymi), zmianę topologii DA (mierzoną metodami elektroforetycznymi), wzrost stabilności podwójnej helisy (wyznaczony metodą pomiaru temperatury topnienia DA w kompleksie z interkalatorem), przesunięcie widma elektornowego interkalatora w stronę dłuższych fal i zmniejszenie jego intensywności (mierzone z wykorzystaniem absorpcji elektronowej), zmianę w widmie dichroizmu kołowego interkalatora, zmiany w intensywności, kształcie i polaryzowalności widma fluorescencyjnego interkalatora (określane z użyciem metod spektrofluorymetrycznych). 3

4 rzedmiotem ćwiczenia jest obserwacja procesu interkalacji do DA jednego z ksenobiotyków o działaniu przeciwnowotworowym, na podstawie zmian w widmie fluorescencyjnym kompleksu ksenobiotyk-da. W zastosowanej metodzie wykorzystuje się szczególne właściwości bromku etydyny. Jest on związkiem dobrze interkalującym do DA, dającym charakterystyczne widmo fluorescencyjne. Jego intensywność znacznie wzrasta w wyniku utworzenia kompleksu z DA, podczas gdy intensywność fluorescencji kompleksu ksenobiotyków z DA przeważnie jest znacznie niższa. onadto bromek etydyny tworzy nietrwałe wiązania fizykochemiczne z DA i łatwe do wyparcia, gdy w sąsiedztwie pojawi się silniejszy interkalator, dając w efekcie obniżenie fluorescencji roztworu. Zdolność interkalacji ksenobiotyku do DA określa się ilościowo, wyznaczając stałą asocjacji kompleksu DA-interkalator według zależności: K x C 50 = K (br.et.) x C 50(br.et), gdzie: K- stała wiązania ksenobiotyku z DA C 50 - stężenie ksenobiotyku powodujące spadek fluorescencji o 50 % K (br.et.) - stała wiązania bromku etydyny z DA; C 50(br.et) - stężenie bromku etydyny powodujące spadek fluorescencji o 50 % Wykonanie ćwiczenia: Materiały i sprzęt 1. Roztwór bromku etydyny w buforze TE; 0,1 mg/ml [10 µl] 2. Roztwór DA w buforze TE; 0,1 mg/ml [15 µl] 3. Roztwór ksenobiotyku w buforze TE; (związek i jego stężenie podaje w trakcie zajęć prowadzący) [50 µl] 4. Bufor TE; 10 mm Tris-base, 0,1 mm EDTA, ph =7,4 [5 ml] 1. ipety automatyczne; 1 ml, 0,1 ml, 0,02 ml [3] 2. robówki małe [3] 3. Spektrofluorymetr 4. Kiuweta kwarcowa [1] rzebieg ćwiczenia: rzygotować roztwór bromku etydyny o stężeniu 1,3 µm (M br.et. = 394,3 g/mol). rzygotować roztwór ksenobiotyku o stężeniu 0,4 mm. Ustawić parametry pracy spektrofluorymetru (λ em = 600 nm, λ eks = 546 nm, czas ekspozycji 2 s, szerokość przesłony 5,0). W komorze pomiarowej spektrofluorymetru umieścić kiuwetę z buforem TE (odnośnik) i ustawić zero na skali apratu. Do kiuwety z mieszadłem dodać l ml rozcieńczonego roztworu bromku etydyny (1,3 µm), umieścić kiuwetę w komorze pomiarowej spektrofluorymetru, włączyć mieszanie i po czasie 3-5 minut odczytać wielkość florescencji. 4

5 Do kiuwety dodać 12,5 µl roztworu DA i po czasie 3-5 minut odczytać wielkość florescencji. Do kiuwety dodać 5 µl roztworu ksenobiotyku, po czasie 3-5 minut odczytać wielkość florescencji. Dodawać kolejne porcje ksenobiotyku do momentu, gdy wartość emisji spadnie o połowę w stosunku do maksymalnej wartości otrzymanej dla roztworu bromku etydyny z DA. pracowanie wyników 1) a czym opiera się metodyka badania zdolności do interkalacji badanego ksenobiotyku do DA, wykorzystana w ćwiczeniu? 2) Wykonać wykres zależności fluorescencja = f (stężenie ksenobiotyku) i na tej podstawie wyznaczyć stałą wiązania ksenobiotyku z DA. 3) orównać otrzymaną wartość stałej wiązania K z wynikami otrzymanymi przez pozostałe podgrupy laboratoryjne, obliczyć średnią i odchylenie standardowe, ocenić dokładność otrzymanych wyników i powtarzalność stosowanej metody. 4) Co można powiedzieć o zdolności do interkalacji badanego związku chemicznego w porównaniu do innych znanych interkalatorów? Lp. Związek chemiczny Stała wiązania związku chem. z DA w ph 7,0 [mol -1 ] 1 Bromek etydyny 9,5 x m-amsa 4,107 x Ledakrin (C-283) 1,054 x 10 5 Literatura uzupełniająca [1] Bryszewska M., Leyko W.: Biofizyka kwasów nukleinowych dla biologów, Warszawa: W 2000; [2] Stryer L.: Biochemia, Warszawa: W 2000; [3] Węgleński.: Genetyka molekularna, Warszawa: W