Anna K. Kwaszewska, Maria Sobiś-Glinkowska, Eligia M. Szewczyk

Transkrypt

1 MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2009, 61: Anna K. Kwaszewska, Maria Sobiś-Glinkowska, Eligia M. Szewczyk WPŁYW KONTAKTU ZE ŚRODOWISKIEM SZPITALA NA WRAŻLIWOŚĆ NA ANTYBIOTYKI I CHEMIOTERAPEUTYKI LIPOFILNYCH SZCZEPÓW CORYNEBACTERIUM REZYDUJĄCYCH NA SKÓRZE CZŁOWIEKA Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej; Katedra Biologii i Biotechnologii Farmaceutycznej; Uniwersytet Medyczny w Łodzi Kierownik Zakładu: dr hab. n. med. E. M. Szewczyk prof. UM W pracy analizowano wrażliwość na antybiotyki i chemioterapeutyki dwóch grup szczepów lipofilnych maczugowców rezydujących na skórze zdrowych osób nie mających kontaktu ze środowiskiem szpitala oraz lekarzy ściśle z nim związanych. Wykazano pięciokrotnie częstszą wielolekooporność wśród szczepów izolowanych od lekarzy w tym oporność na antybiotyki stosowane tylko w leczeniu szpitalnym. Florę rezydencką skóry człowieka stanowią drobnoustroje względnie trwale ulokowane w warstwie rogowej naskórka, nieusuwane przy zabiegach higienicznych, w związku z tym na długo związane z określoną osobą i względnie trudno ulegające wymianie na drobnoustroje z otoczenia. Florę tę tworzą w przeważającej liczbie gronkowce, propionibakterie i maczugowce. Udział ilościowy tych grup drobnoustrojów wśród rezydentów skóry jest cechą osobniczą, a wśród nich najmniej liczną stanowią maczugowce (11). Flora rezydencka stanowi istotną ochronę przed zasiedlaniem skóry przez drobnoustroje egzogenne, w tym bakterie chorobotwórcze (16). Wielokrotnie wykazywano jednak, że rezydenci skóry mogą być przyczyną zakażeń oportunistycznych, szczególnie u szpitalnych pacjentów z zaburzoną odpornością. Bardzo często takie zakażenia powodowane są gronkowcami koagulazoujemnymi. Coraz częściej wykazywany jest także udział maczugowców, szczególnie C. jeikeium w tych zakażeniach. Szczepy powodujące najniebezpieczniejsze zakażenia szpitalne charakteryzuje wielolekooporność. Ocena oporności maczugowców bytujących jako rezydenci na skórze osób, które nie miały kontaktu ze szpitalem i antybiotykami oraz zdrowych osób na co dzień mających bardzo bliski kontakt ze środowiskiem szpitalnym była przedmiotem badań prezentowanych w niniejszej pracy. 1 Praca finansowana z funduszy statutowych

2 360 A.K. Kwaszewska, M. Sobiś-Glinkowska, E.M. Szewczyk Nr 4 MATERIAŁ I METODY S zczepy bakteryjne. Zbadano 179 szczepów maczugowców lipofilnych (Tabela I). Były to szczepy trwale rezydujące na skórze człowieka, wyizolowane od osób, które nie były związane ze środowiskiem medycznym ( I) i od lekarzy pracujących w Klinice Chirurgii Ogólnej i Kolorektalnej UM w Łodzi ( II). Sposób izolacji i identyfikacji tych maczugowców opisano wcześniej (10,11). Podłoża i metody badawcze. Szczepy przechowywano w bulionie z glicerolem w temp. 70 o C. Namnażano je na podłożu TYT-80: TSA (Graso); Yeast Extract - 0,3% (Difco); Tween 80-0,05% (INC Biomedicals); odwłókniona krew barania 5% (11). Wrażliwość na antybiotyki i chemioterapeutyki oznaczano na podłożu Mueller-Hinton 2 Agar (BioMerieux) z dodatkiem 0,1% Tween 80 (INC Biomedicals) metodą krążkowo-dyfuzyjną, przyjmując wytyczne i kryteria dla S.aureus Krajowego Ośrodka Referencyjnego ds. Lekowrażliwości Drobnoustrojów (7). Szczepy średnio wrażliwe według tych kryteriów klasyfikowano jako oporne. Wykonywano po dwa powtórzenia wszystkich oznaczeń. W badaniach stosowano krążki antybiotykowe firmy BBL: penicylina 10 IU, amoksycylina/kwas klawulanowy 30 μg, cefalotyna 30 μg, cefuroksym 30 μg, ceftriakson 30 μg, imipenem 10 μg, tetracyklina 30 μg, gentamicyna 10 μg, netilmicyna 30 μg, erytromycyna 15 μg, klindamycyna 2 μg, ciprofloksacyna 5 μg, lewofloksacyna 5 μg, chloramfenikol 30 μg, rifampicyna 5 μg. Analiza statystyczna. Otrzymane wyniki analizowano w oparciu o parametryczny test t oraz nieparametryczny Cohrana-Coxa przy użyciu programu Statistica 5.0 StatSoft. Przyjęto poziom ufności p<0,05. WYNIKI Według klinicznych kryteriów oceny, większość szczepów z obu kolekcji wykazywała oporność tylko na jedną lub dwie, rzadziej na trzy grupy badanych leków. Wśród szczepów izolowanych od lekarzy zaobserwowano jednak większy udział szczepów opornych na antybiotyki beta-laktamowe, tetracykliny, aminoglikozydy, fluorochinolony i chloramfenikol (Ryc. 1). Powszechna w obu grupach szczepów była kliniczna oporność na linkozamidy i makrolidy. Izolowane od osób spoza środowiska szpitalnego dwa szczepy Corynebacterium grupy CDC G 1 i jeden C. accolens były oporne na rifampicynę. W ocenie wrażliwości badanych szczepów przyjęto określenie wielolekooporność definiowane jako brak klinicznej wrażliwości szczepu na co najmniej cztery grupy antybiotyków i chemioterapeutyków. W kolekcji szczepów izolowanych od lekarzy wielolekooporność występowała pięciokrotnie częściej niż wśród szczepów pochodzących spoza środowiska szpitalnego (Ryc. 2). Tylko w tej kolekcji znalazły się szczepy oporne na więcej niż cztery grupy leków. Wśród szczepów wielolekoopornych dominowały Corynebacterium grupa CDC G2 i C. jeikeium (Tabela I). Przeprowadzono analizę statystyczną wrażliwości szczepów w obu ch, porównując wielkości stref zahamowania wzrostu wokół krążków z określonymi lekami. Podobną analizę wykonano również dla najczęściej izolowanych taksonów: C.jeikeium, Corynebacterium grupy CDC G1 oraz Corynebacterium grupy CDC G2 (Tabela II).

3 Nr 4 Lekowrażliwość Corynebacterium % 80% 79,2% 74,3% 86,8% 87,8% 60% 40% 20% 5,7% 13,5% 7,5% 20,3% 0,0% 1,4% 0,9% 6,8% 17,9% 27,0% 2,8% 0,0% 0% BETA-LAKTAMY TETRACYKLINY AMINOGLIKOZYDY MAKROLIDY LINKOZAMIDY FLUOROCHINOLONY CHLORAMFENIKOL RIFAMPICYNA I II Rycina 1. Odsetki szczepów opornych według kryteriów klinicznych na badane antybiotyki i chemioterapeutyki w obu ch 100,0% 87,6% 80,0% 74,3% 60,0% 40,0% 20,0% 9,5% 10,8% 2,9% 14,9% 0,0% wrażliwe na wszystkie leki oporne na mniej niż 4 grupy leków wielolekooporne I II Rycina 2. Wrażliwość i wielolekooporność badanych szczepów obu kolekcji Istotne statystycznie różnice odnotowano w przypadku dziesięciu antybiotyków. W dziewięciu przypadkach (wyjątek stanowiła rifampicyna) szczepy z kolekcji II, a więc pochodzące od lekarzy, miały mniejsze strefy zahamowania wzrostu, a zatem wykazywały

4 362 A.K. Kwaszewska, M. Sobiś-Glinkowska, E.M. Szewczyk Nr 4 Tabela I. Gatunki wrażliwe na wszystkie leki i gatunki wielolekooporne w obu badanych ch Gatunek/takson Liczba szczepów liczba szczepów wrażliwych liczba szczepów wielolekoopornych I II I II I II C. jeikeium Corynebacterium grupa CDC G Corynebacterium grupa CDC G C. afermentans subsp.lipophilum Corynebacterium grupa CDC F C. diphtheriae var. intermedius C. kroppenstedtii C. urealyticum C. accolens C. macginleyi Tabela II. Porównanie średnich wartości wielkości stref zahamowania wzrostu dla wszystkich szczepów oraz dla najczęściej izolowanych gatunków w obu ch Wszystkie badane szczepy C. jeikeium Corynebacterium grupa CDC G2 Corynebacterium grupa CDC G1 Średnia strefa (mm) dla: I II wartość p I II wartość p I II wartość p I II wartość p Penicylina , , , ,001 Amoksycylina /kwas klawulanowy , , , Cefalotyna , , , Cefuroksym , , , ,849 Ceftriakson , , , Imipenem , , , ,000 Tetracyklina , , , Gentamicyna , , , ,976 Netilmicyna , , , ,507 Erytromycyna , , ,000 Klindamycyna , , ,129 Ciprofloksacyna , , , ,000 Lewofloksacyna , , , ,968 Chloramfenikol , , , Rifampicyna , , , ,250

5 Nr 4 Lekowrażliwość Corynebacterium 363 mniejszą wrażliwość. Największe różnice dotyczyły imipenemu, aminoglikozydów i chinolonów. W przypadku antybiotyków β-laktamowych istotne statystycznie różnice wielkości stref, wskazujące na mniejszą wrażliwość szczepów pochodzących od lekarzy dotyczyły przede wszystkim Corynebacterium grupa CDC G2 i w mniejszym stopniu Corynebacterium grupa CDC G1, ale nie C. jeikeium. Szczepy wszystkich trzech gatunków tej kolekcji wykazywały wyraźnie mniejszą wrażliwość na chinolony, przy czym tylko w przypadku C. jeikeium dotyczyło to obu badanych preparatów tej grupy. Największe różnice między badanymi mi wykazały szczepy należące do Corynebacterium grupy CDC G2. Odnotowano mniejszą wrażliwość szczepów kolekcji II na osiem badanych leków. Dotyczyła ona prawie wszystkich badanych grup, w tym aminoglikozydów, tetracyklin i chloramfenikolu. Porównanie wielkości stref zahamowania wzrostu potwierdziło powszechną, dotyczącą wszystkich badanych gatunków i niezależną od miejsca izolacji oporność na makrolidy i linkozamidy. DYSKUSJA Informacje dotyczące wrażliwości na antybiotyki bakterii należących do rodzaju Corynebacterium dotyczą szczepów izolowanych od osób chorych i nie zawierają danych o naturalnej wrażliwości tych pałeczek na antybiotyki i chemioterapeutyki. Brak jest badań przeprowadzonych na szczepach spoza środowiska szpitalnego, czy też oceny łatwości nabywania genów oporności. Zastosowany w przedstawionych tu badaniach sposób izolacji maczugowców ze skóry gwarantował izolację stałych rezydentów, trwale związanych z jej powierzchnią na długie okresy czasu (11). Obie kolekcje bakterii izolowano od młodych, zdrowych mężczyzn nie poddawanych antybiotykoterapii w okresie co najmniej 3 miesięcy przed pobraniem próbek. Lekarze pracowali w oddziale zabiegowym, gdzie u pacjentów stosowano szerokowidmową profilaktykę, a często też terapię antybiotykową. Oznaczanie wrażliwości maczugowców na antybiotyki i chemioterapeutyki jest trudne, z powodu konieczności uwzględniania wymagań wzrostowych tych drobnoustrojów i ich powolnego wzrostu (12), oraz przyjęcia specjalnych kryteriów oceny tej wrażliwości. Przez różnych autorów i ośrodki naukowe, dla maczugowców przyjmowane są kryteria opracowane dla innych rodzajów bakterii: dla Listeria (19), Streptococcus (1,19), lub najczęściej, dla Staphylococcus (1,3). Oznaczanie wartości MIC jest polecaną metodą badania wrażliwości maczugowców w praktyce klinicznej (8), ale jest bardzo kosztowne przy analizie dużych grup szczepów (13). Dla potrzeb niniejszej pracy uznano, że porównanie szczepów obu kolekcji metodą dyfuzyjno-krążkową, poddaną starannej walidacji, da wystarczająco jasną odpowiedź na postawione w celu badań pytanie. W niektórych publikacjach opisywano izolowany z próbek materiału klinicznego C. jeikeium jako gatunek oporny na wszystkie antybiotyki z wyjątkiem glikopeptydów (2). W prezentowanej pracy większość szczepów wyizolowanych ze skóry zdrowych osób była jednak względnie wrażliwa. Wyniki tej pracy wskazują, że wielolekooporność lipofilnych maczugowców jest cechą nabywaną i selekcjonującą się w szpitalu. Często opisywana jest

6 364 A.K. Kwaszewska, M. Sobiś-Glinkowska, E.M. Szewczyk Nr 4 oporność na penicylinę szczepów izolowanych z przypadków klinicznych (5). W przedstawianych badaniach szczepy C.jeikeium były na ogół wrażliwe na ten antybiotyk, ale widać znaczącą różnicę w oporności na antybiotyki β-laktamowe między szczepami Corynebacterium grupy CDC G2 i CDC G1 obu kolekcji. Wśród szczepów izolowanych od lekarzy była mniejsza wrażliwość, lub stwierdzono kliniczną oporność na imipenem, aminoglikozydy i chinolony - antybiotyki stosowane przede wszystkim, lub tylko, w warunkach szpitalnych. Przeprowadzone badania wyraźnie potwierdzają wcześniejsze obserwacje innych autorów mówiące o oporności lipofilnych maczugowców na klindamycynę i erytromycynę. U kilku szczepów zaobserwowano, że ma ona charakter indukcyjnej oporności MLS B. Oporność taką opisywali też Rosato i wsp. (14), wiążąc ją z obecnością genu ermx na transpozonie Tn5432 umiejscowionym w chromosomie. U innych gatunków gen ten znajdowano na plazmidzie (17, 18). Wymiana genetyczna, a tym samym pozyskiwanie genów oporności występuje między gatunkami maczugowców szczególnie w warunkach szpitalnych (6). Wiadomo, że komórki maczugowców lipofilnych często nie zawierają plazmidów lub mają je nieliczne (17). Nie udowodniono jeszcze u nich bezpośredniego transferu genów oporności. Tymczasem niektórzy autorzy sugerują pozyskiwanie ich przez maczugowce od współbytujących na skórze Propionibacterium (14), czy Staphylococcus (4). Szczególnie ważna dla szczepów rezydentów byłaby możliwość przekazywania ich przez gronkowce koagulazoujemne. Ich szczepy, stanowiąc istotny składnik flory rezydenckiej, są także elementem flory przejściowej. Jung i wsp. (9) twierdzą, że gronkowce koagulazoujemne są składnikiem flory skóry wywodzącym się z wielu źródeł. Potwierdza to fakt, że w środowisku szpitala wykrywane są liczne wielolekooporne szczepy tych bakterii (15). Można więc sądzić, że w badanym przez nas modelu to one mogły selekcjonować się na skórze leczonych antybiotykami pacjentów, a następnie być z łatwością przekazywane bezpośrednio lub pośrednio na skórę lekarzy i tam użyczać genów oporności ściślej związanym ze skórą maczugowcom. Dobler i Braveny izolowali z cewnika wielolekooporny szczep C. macginleyi obok gronkowców koagulazoujemnych o podobnym profilu oporności (4). Hipoteza o przekazywaniu genów lekooporności gronkowców maczugowcom wymaga jednak potwierdzenia na poziomie molekularnym. Dane przedstawione w tej pracy wskazują, że nabywanie oporności przez szczepy rezydujące na skórze personelu medycznego jest procesem powolnym. Wielolekooporność, pięciokrotnie częstsza, niż w grupie szczepów izolowanych od osób bez kontaktu ze szpitalem, dotyczyła 14,9% szczepów. Ich obecność wskazała proces, który może się pogłębiać. Badano osoby młode, o niedługim stażu pracy w szpitalu. Z czasem ich skóra może stanowić znaczące źródło wielolekoopornych pałeczek. W pracy wykazano także, że maczugowcami najczęściej kumulującymi geny antybiotykooporności były Corynebacterium grupa CDC G2, stanowiąc obok wskazywanych najczęściej w literaturze C. jeikeium, realne zagrożenie jako czynnik etiologiczny oportunistycznych zakażeń szpitalnych wywoływanych przez lipofilne maczugowce (20).

7 Nr 4 Lekowrażliwość Corynebacterium 365 A.K. Kwaszewska, M. Sobiś-Glinkowska, E.M. Szewczyk INFLUENCE OF CONTACT WITH HOSPITAL ENVIRONMENT ON SENSITIVITY TO ANTIBIOTICS OF LIPOPHILIC STRAINS OF CORYNEBACTERIUM RESIDING ON HUMAN SKIN SUMMARY Sensitivity of two groups of lipophilic corynebacteria strains of different species, which form stable residential flora on human skin, to therapeutically significant groups of antibiotic was compared. Strains were isolated from people who did not have any contact with hospital environment, and from doctors closely connected with hospital. It was shown that strains isolated from doctors, which were in fact not under antibiotic pressure, were five times more multiresistant whilst at the same time being resistant to antibiotics used only in hospital treatment. PIŚMIENNICTWO 1. Ang LMN, Brown H. Corynebacterium accolens isolated from breast abscess: possible association with granulomatous mastitis. J Clin Microbiol 2007; 45: Balci I, Ekşi F, Bayram A. Coryneform bacteria isolated from blood cultures and their antibiotic susceptibilities. J Int Med Res 2002; 30: Conejo MC, Martínez-Martínez L, Pascual Á i inni. Activities of ABT-773 against Listeria monocytogenes and coryneform bacteria of clinical interest. Antimicrob Agents Chemother 2003; 47: Dobler G, Braveny I. Highly resistant Corynebacterium macginleyi as cause of intravenous catheter-related infection. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2003; 22: Funke G, von Graevenitz A, Clarridge III JE, Bernard KA. Clinical microbiology of coryneform bacteria. Clin Microbiol Rev 1997; 10: Garcia-Bravo M, Aguado JM, Morales JM, Noriega AR. Influence of external factors in resistance of Corynebacterium urealyticum to antimicrobial agents. Antimicrob Agents Chemother 1996; 40: Hryniewicz W, Sulikowska A, Szczypta K i inni. Rekomendacje doboru testów do oznaczania wrażliwości bakterii na antybiotyki i chemioterapeutyki. Post Mikrobiol 2005; 44: Jorgensen JH. Methods for Antimicrobial Dilution and Disk Susceptibility Testing of Infrequently Isolated or Fastidious Bacteria; Approved Guideline. M45-A 9. Jung K, Brauner A, Kühn I i inni. Variation of coagulase-negative staphylococci in the skin flora of healthy individuals during one year. Microb Ecol Health Dis 1998; 10: Kaźmierczak AK, Szarapińska-Kwaszewska JK, Szewczyk EM. Opportunistic coryneform organisms residents of human skin. Pol J Microbiol 2005; 54: Kaźmierczak AK, Szewczyk EM. Bacteria forming a resident flora of the skin as a potential source of opportunistic infections. Pol J Microbiol 2004; 53: Martínez-Martínez L, Pascual Á, Suárez AI, Perea EJ. In-vitro activity of levofloxacin, ofloxacin and d-ofloxacin against coryneform bacteria and Listeria monocytogenes. J Antimicrob Chemother 1999; 43: Mikucka A. Znaczenie Corynebacterium sp. w zakażeniach szpitalnych. Post Mikrobiol 2003; 42: Rosato AE, Lee BS, Nash KA. Inducible macrolide resistance in Corynebacterium jeikeium. Antimicrob. Agents Chemother 2001; 45:

8 366 A.K. Kwaszewska, M. Sobiś-Glinkowska, E.M. Szewczyk Nr Szewczyk EM, Piotrowski A, Różalska M. Predominant staphylococci in the intensive care unit of a paediatric hospital. J Hosp Infect 2000; 45: Tancrède C. Role of human microflora in health and disease. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1992; 11: Tauch A, Kaiser O, Hain T i inni. Complete genome sequence and analysis of the multiresistant nosocomial pathogen Corynebacterium jeikeium K411, a lipid-requiring bacterium of the human skin flora. J Bacteriol 2005; 187: Tauch A, Krieft S, Kalinowski J, Pühler A. The 51,409-bp R-plasmid ptp10 from the multiresistant clinical isolate Corynebacterium striatum M82B is composed of DNA segments initially identified in soil bacteria and in plant, animal, and human pathogens. Mol Gen Genet 2000; 263: Weiss K, Laverdière M, Rivest R. Comparison of antimicrobial susceptibilities of Corynebacterium species by broth microdilution and disk diffusion methods. Antimicrob Agents Chemother 1996; 40: Williams DY, Selepak ST, Gill VJ. Identification of clinical isolates of nondiphtherial Corynebacterium species and their antibiotic susceptibility patterns. Diagn Microbiol Infect Dis 1993; 17: Otrzymano: 18 IX 2009 Adres Autora: Łódź, ul. Pomorska 137, Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej anna.kwaszewska@umed.lodz.pl, tel. (42)