Biegłość laboratoriów mikrobiologicznych w oznaczaniu lekowrażliwości drobnoustrojów POLMICRO 2012

Transkrypt

1 diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics 203 Volume 49 Number 7-24 Praca oryginalna Original Article Biegłość laboratoriów mikrobiologicznych w oznaczaniu lekowrażliwości drobnoustrojów POLMICRO 202 Proficiency of microbiology laboratories in the determination of pathogens antimicrobial susceptibility - POLMICRO 202 Ewa Młodzińska, Elżbieta Stefaniuk,2, Karolina Bosacka, Beata Chmylak, Monika Fortuna, Waleria Hryniewicz,2 Centralny Ośrodek Badań Jakości w Diagnostyce Mikrobiologicznej, Warszawa 2 Narodowy Instytut Leków, Warszawa Streszczenie Praca przedstawia wyniki XIX edycji Ogólnopolskiego Sprawdzianu Wiarygodności Badań Mikrobiologicznych - POLMICRO 202. W roku 202 Centralny Ośrodek Badań Jakości w Diagnostyce Mikrobiologicznej (COBJDM) zorganizował dwa typy sprawdzianów: jeden przeznaczony dla laboratoriów świadczących diagnostykę w szerokim zakresie oraz drugi - oddzielny sprawdzian przeznaczony dla pracowni schorzeń jelitowych stacji sanitarno-epidemiologicznych. Przesyłane w ramach Programu izolaty bakteryjne różniły się wrażliwością na antybiotyki oraz wytwarzaniem różnych mechanizmów oporności. Celem Programu POLMICRO 202 była ocena biegłości laboratoriów w identyfikacji drobnoustrojów oraz ocena oznaczania ich lekowrażliwości wg europejskich rekomendacji (EUCAST). Summary The objective of this study was to analyse and discuss the results of 9th edition of Polish National External Quality Assessment Scheme in Microbiological Diagnostics - POLMICRO 202. In 202 two different types of proficiency programme were organised. The first one was aimed at laboratories providing a broad spectrum of microbiological diagnostics. The second, was prepared for enteric diseases laboratories in sanitary inspection. The distributed isolates present different susceptibility patterns and different mechanisms of resistance. The task of the laboratory was to identify to the species level every strain and to determine their susceptibility to antibiotics according to European Guidelines EUCAST. Słowa kluczowe: zewnątrzlaboratoryjny sprawdzian wiarygodności, identyfikacja, lekowrażliwość, mechanizmy oporności Key words: external quality assessment scheme, identification, susceptibility to antimicrobial agents, resistance s mechanisms Wstęp W roku 202 Centralny Ośrodek Badań Jakości w Diagnostyce Mikrobiologicznej (COBJwDM) zorganizował XIX edycję Ogólnopolskiego Sprawdzianu Wiarygodności Badań Mikrobiologicznych POLMICRO. Program POLMICRO łączy w sobie badania biegłości i porównania międzylaboratoryjne. W kolejnych edycjach programu poruszane są najnowsze problemy z diagnostyki mikrobiologicznej, jak również, ze względu na zachodzące na przestrzeni lat zmiany kadrowe w laboratoriach, powraca się do starych, ale wciąż aktualnych zagadnień. COBJwDM organizuje co roku dwa rodzaje sprawdzianów: sprawdzian POLMICRO dla laboratoriów świadczących szeroką diagnostykę mikrobiologiczną (Edycja Ogólna) oraz sprawdzian POLMICRO/SSE - dla pracowni/laboratoriów schorzeń jelitowych. Celem programu jest ocena kompetencji laboratoriów mikrobiologicznych w zakresie identyfikacji, oznaczania lekowrażliwości i wykrywania mechanizmów oporności na leki drobnoustrojów wywołujących zakażenia. Łącznie w roku 202 zorganizowano sześć tur sprawdzianów, cztery w edycji ogólnej i dwie dotyczące wyłącznie pałeczek jelitowych. Tematem niniejszego opracowania jest przedstawienie wyników edycji ogólnej programu - POLMICRO 202. Materiał i metody W roku 202 porównania międzylaboratoryjne w ramach XIX Edycji Ogólnej Programu POLMICRO zostały przeprowadzone z wykorzystaniem szczepów bakteryjnych przedstawionych w Tabeli I. Każde laboratorium uczestniczące w Sprawdzianie otrzymało w ciągu roku osiem izolatów 7

2 Biegłość laboratoriów mikrobiologicznych w oznaczaniu lekowrażliwości drobnoustrojów POLMICRO 202 Tabela I. Izolaty bakteryjne wykorzystane w ogólnej edycji sprawdzianu POLMICRO 202 (XIX edycja). Gatunek drobnoustroju nr kolekcji POLMICRO Fenotyp/mechanizm oporności POLMICRO 202 tura I Pseudomonas aeruginosa PM-95 MBL ujemny Pseudomonas aeruginosa PM-96 MBL ujemny Pseudomonas aeruginosa PM-97 MBL dodatni Pseudomonas aeruginosa PM-98 MBL ujemny POLMICRO 202 tura II Staphylococcus haemolyticus PM-99 MRCNS, MLS B indukcyjny Staphylococcus haemolyticus PM-200 MRCNS, MLS B indukcyjny POLMICRO 202 tura III Enterococcus faecalis PM-205 VRE Enterococcus faecium PM-206 POLMICRO 202 tura IV Pseudomonas aeruginosa PM-95 MBL ujemny Pseudomonas aeruginosa PM-207 MBL dodatni MBL - karbapenemazy klasy B, tzw. metalo β-laktamazy; MRCNS gronkowiec koagulazo - ujemny oporny na meticylinę; MLS B - oporność na makrolidy, linkozamidy i streptograminy B; VRE oporność na glikopeptydy (po dwa w każdej turze sprawdzianu), z dołączoną do nich szczegółową instrukcją postępowania z próbkami, a także informacją odnośnie sposobu udzielania odpowiedzi, wnoszenia i rozpatrywania reklamacji. Zadaniem laboratoriów było zidentyfikowanie izolatów do poziomu gatunku i określenie ich wrażliwości na leki z wykryciem mechanizmów oporności. Uzyskane wyniki przesyłane były do Centralnego Ośrodka drogą elektroniczną, poprzez wypełnienie ankiety dostępnej dla każdego laboratorium na stronie internetowej Ośrodka Wyniki testów wrażliwości podlegały ocenie wyłącznie dla izolatów poprawnie zidentyfikowanych; ocenę przeprowadzono w oparciu o kategoryzację błędnych wyników interpretacji klinicznej na małe, duże i bardzo duże błędy. Mały błąd (me - minor error) przyznawany był w sytuacji, kiedy szczep wrażliwy lub oporny został zaliczony jako średniowrażliwy; Rycina. Rozkład wartości MIC teikoplaniny dla szczepu S. haemolyticus PM-99 Rycina 2. Rozkład wartości MIC teikoplaniny dla szczepu S. haemolyticus PM-200 Rycina 3. Rozkład wartości MIC wankomycyny dla szczepu S. haemolyticus PM-99 Rycina 4. Rozkład wartości MIC wankomycyny dla szczepu S. haemolyticus PM-200 8

3 bądź szczep średniowrażliwy jako wrażliwy lub oporny. Duży błąd (ME- major error) oznaczał zakwalifikowanie szczepu wrażliwego jako oporny. Bardzo duży błąd (VME - very major error), za popełnienie którego przyznawano ocenę negatywną, oznaczał określenie szczepu opornego jako wrażliwy na dany antybiotyk/chemioterapeutyk. Zastosowana kwalifikacja błędów oparta jest na zaleceniach Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Wyniki i omówienie I tura programu POLMICRO 202 W ramach I tury POLMICRO 202 przygotowano zestawy kontrolne zawierające izolaty bakteryjne, należące do gatunku Pseudomonas aeruginosa. Przedmiotem tej tury sprawdzianu była przede wszystkim ocena umiejętności laboratoriów do wykrywania i interpretacji mechanizmów oporności szczepów pałeczek niefermentujących na karbapenemy, w szczególności mechanizmu polegającego na wytwarzaniu karbapenemaz klasy B - metalo-β-laktamaz zależnych od jonów Zn ++, tzw. MBL. Szczepy wysłano do 474 laboratoriów mikrobiologicznych, odpowiedź otrzymano od 458 uczestników. Pozytywny wynik I tury sprawdzianu POLMICRO 202 uzyskało trzysta pięćdziesiąt dziewięć, tj. 78,4% laboratoriów biorących udział w niniejszej turze programu. IDENTYFIKACJA Ogółem na 96 wyników identyfikacji uzyskano 99,6% zgodności wyników i tylko w czterech przypadkach błędnie określono przynależność gatunkową badanych szczepów. Szczep PM-98 nieprawidłowo zidentyfikowały dwa laboratoria: jedno jako Stenotrophomonas maltophilia i jedno jako Burkholderia cepacia. Jedno laboratorium szczep PM-95 zidentyfikowało jako Pseudomonas putida, a inne laboratorium zidentyfikowało szczep PM-96 jako Pseudomonas fluorescens. Izolat PM-97 został prawidłowo zidentyfikowany przez wszystkie laboratoria, które ten szczep otrzymały do badania. LEKOWRAŻLIWOŚĆ P. aeruginosa PM-95 Szczep P. aeruginosa PM-95 nie był producentem metaloβ-laktamaz (MBL), wykazywał natomiast obniżoną wrażliwość na meropenem i oporność na imipenem. Oporności na imipenem nie wykryły tylko cztery laboratoria, dwa z nich uzyskały wynik średniowrażliwy, a dwa określiły szczep jako wrażliwy. Prawidłowy wynik oznaczania wrażliwości na drugi z karbapenemów - meropenem, uzyskało 64,5% laboratoriów (n=47/228). Ze względu na duże różnice w wynikach wrażliwości szczepu PM-95 na cefepim, postanowiono nie uwzględniać tego parametru w ocenie końcowej I tury POLMICRO 202. Wyniki oznaczeń dla cefepimu zostały omówione łącznie z wynikami IV tury POLMICRO 202, w której ponownie do wszystkich laboratoriów wysłano szczep P. aeruginosa PM- 95. Rycina 5 przedstawia rozkład uzyskanych w laboratoriach stref zahamowania wzrostu wokół krążka z cefepimem 30µg, natomiast na rycinie 7 przedstawiono rozkład wartości MIC (mg/l) cefepimu uzyskanych w laboratoriach dla szczepu P. aeruginosa PM-95. LEKOWRAŻLIWOŚĆ P. aeruginosa PM-96 Izolat P. aeruginosa PM-96 otrzymało także 228 laboratoriów, był to szczep wrażliwy na wszystkie leki zamieszczone w ankiecie POLMICRO z wyjątkiem gentamicyny. Oporności na gentamicynę nie wykryły 3 laboratoria popełniając bardzo duży błąd (VME). W wyniku analizy otrzymanych odpowiedzi odnotowano 0 dużych błędów (ME) w oznaczeniu wrażliwości na piperacylinę z tazobaktamem, 6 ME i jeden mały (me) w oznaczeniu wrażliwości na imipenem oraz 5ME i 6mE we wrażliwości na meropenem. Wyniki oznaczeń pozostałych antybiotyków i chemioterapeutyków były w przeważającej większości zgodne z oczekiwanymi (96,9% - 00%). LEKOWRAŻLIWOŚĆ P. aeruginosa PM-97 Szczep P. aeruginosa PM-97 - producenta metalo-β laktamazy z rodziny VIM otrzymało 230 laboratoriów. Szczep był wrażliwy tylko na kolistynę, wobec pozostałych leków wykazywał oporność. Zgodnie z zaleceniami EUCAST wrażliwość na kolistynę należy oznaczać wyłącznie na podstawie wartości MIC, mimo to dziesięć laboratoriów określiło wrażliwość szczepu metodą dyfuzyjno-krążkową, co uznano za niezgodne z aktualnymi rekomendacjami. Dwadzieścia dziewięć laboratoriów (2,6%) nie oznaczyło wrażliwości szczepu na kolistynę. Ogółem, odsetek prawidłowych wyników testów wrażliwości mieścił się w zakresie 98,7%- 99,6%. LEKOWRAŻLIWOŚĆ P. aeruginosa PM-98 Szczep P. aeruginosa PM-98 nie był producentem MBL i wykazywał wrażliwość na wszystkie antybiotyki i chemioterapeutyki zamieszczone w ankiecie POLMICRO. Dla większości antybiotyków wyniki oznaczeń lekowrażliwości szczepu PM-98 były zgodne z oczekiwanymi, a odsetek prawidłowych wyników wyniósł ponad 99%. WYKRYWANIE MECHANIZMÓW OPORNOŚCI Oznaczanie karbapenemaz klasy B tzw. metalo β-laktamaz (MBL) w omawianej edycji POLMICRO stanowiło trudność dla około 20% laboratoriów biorących udział w programie. Najwięcej problemów wystąpiło w przypadku oznaczania MBL w szczepie MBL-ujemnym P. aeruginosa PM-95, dla którego osiemdziesiąt pięć laboratoriów (37,3%) udzieliło błędnej odpowiedzi. Zgodnie z Rekomendacjami Krajowego Ośrodka Referencyjnego ds. Lekowrażliwości Drobnoustrojów (KORLD), podczas wykrywania produkcji MBL testem zbliżeniowym (z zastosowaniem krążków z 0µl 0,5M EDTA oraz krążków z imipenemem - 0µg i ceftazydymem - 30µg) wynik odczytujemy jako pozytywny, jeśli strefa zahamowania wzrostu wyraźnie powiększa się, rozszerza się wokół krążka z ceftazydymem i/lub imipenemem od strony krążka zawierającego EDTA. Dodatkowym testem proponowanym do wykrywania MBL u P. aeruginosa jest tzw. wersja kombinowana, w której na krążek z imipenemem nakrapla się 5µl 0,5M EDTA. Różnica pomiędzy strefami zahamowania wzrostu dla IMP/EDTA i IMP większa niż 5mm, oznacza wynik dodatni w kierunku MBL. W przypadku szczepu PM-95 nie obserwowano poszerzenia stref w metodzie zbliżeniowej, ani różnicy powyżej 5mm w wersji kombinowanej. Dla dwóch pozostałych szczepów MBL-ujemnych: P. aeru- 9

4 Biegłość laboratoriów mikrobiologicznych w oznaczaniu lekowrażliwości drobnoustrojów POLMICRO 202 ginosa PM-96 i P. aeruginosa PM-98 odpowiednio,8% i,3% laboratoriów popełniło błędy określając je jako szczepy jako MBL-dodatnie. Zdecydowanie najmniej błędnych odpowiedzi dotyczących obecności/braku mechanizmu MBL w badanym szczepie bakteryjnym, odnotowano dla szczepu P. aeruginosa PM- 97 jedynego w tej turze sprawdzianu, szczepu MBL-dodatniego. Produkcji MBL w tym izolacie nie wykryły tylko 3 laboratoria (,3%), pozostałe 227 laboratoriów (98,7%) oznaczyło mechanizm prawidłowo. II tura programu POLMICRO 202 Przygotowane zestawy kontrolne zawierały dwa izolaty bakteryjne z gatunku Staphylococcus haemolyticus wymienione w tabeli I. Szczepy wysłano do 467 laboratoriów mikrobiologicznych, odpowiedź otrzymano od 458 uczestników. Pozytywną ocenę końcową przyznano 437 laboratoriom, co stanowi 95,4% ogółu laboratoriów przystępujących do tej tury sprawdzianu. IDENTYFIKACJA Sześć laboratoriów spośród 458 popełniło błąd w identyfikacji obydwu szczepów, siedem laboratoriów błędnie zidentyfikowało jeden z dwóch otrzymanych szczepów kontrolnych. Tabela II przedstawia wyniki identyfikacji S. haemolyticus PM-99 i PM-200. LEKOWRAŻLIWOŚĆ Przesłany zestaw zawierał dwa szczepy bakteryjne wyizolowane z krwi, dlatego też w ocenie nadesłanych wyników wzięto pod uwagę interpretację wrażliwości na te leki, które mogą stanowić opcję terapeutyczną zakażeń. S. haemolyticus PM-99 oprócz wymienionych w tabeli I mechanizmów oporności, wykazywał także oporność na ciprofloksacynę, gentamicynę, trimetoprim/sulfametoksazol oraz teikoplaninę. Odsetek prawidłowych wyników wrażliwości S. haemolyticus PM-99 na większość ocenianych antybiotyków i chemioterapeutyków wynosił od 99,% do 00%. Bardzo duży błąd VME popełniło osiem laboratoriów spośród 44 oznaczając szczep S. haemolyticus PM-99 jako wrażliwy na trimetoprim/sulfametoksazol, mały błąd - me popełniło trzydzieści pięć laboratoriów, które oznaczyły szczep jako średniowrażliwy. S. haemolyticus PM-200 oprócz oporności na meticylinę i makrolidy/linkozamidy/streptograminy, był wrażliwy na pozostałe antybiotyki uwzględnione w ocenie końcowej sprawdzianu. Większość uzyskiwanych wyników była prawidłowa, odsetek poprawnych interpretacji przekroczył 99%. Nieznacznie niższy odsetek prawidłowych wyników interpretacji klinicznej odnotowano dla gentamicyny - 98,9% (5 ME) oraz wankomycyny 98,2% (6 ME; 2 me). Najsłabiej wypadło oznaczenie wrażliwości szczepu PM-200 na teikoplaninę. Oznaczenie wrażliwości na teikoplaninę wykonało 369 laboratoriów spośród 458, pozostałe 86 laboratoriów nie badało wrażliwości na teikoplaninę. Odsetek prawidłowych wyników wynosił tylko 68%, odnotowano 2 me i 6 ME - laboratoria zinterpretowały szczep jako oporny, zamiast wrażliwy. Przyczyny powstałych rozbieżności:. Trudności w interpretacji klinicznej uzyskanych wyników wrażliwości Wartość MIC teikoplaniny szczepu S. haemolyticus PM- 200 wynosiła 4mg/L co zgodnie z zaleceniami EUCAST należało interpretować jako wrażliwy. Sto dziewięćdziesiąt jeden laboratoriów podało dokładnie taką samą wartość MIC=4mg/L, jednakże duże rozbieżności zaobserwowano w interpretacji klinicznej wartości MIC: interpretację wrażliwy podały 73 laboratoria, oporny - 0 laboratoriów, średniowrażliwy - jedno laboratorium, 7 laboratoriów nie podało interpretacji klinicznej. Z nadesłanych przez laboratoria wyników i komentarzy wynikało, że: z powodu naturalnie obniżonej wrażliwości na teikoplaninę gatunku S. haemolyticus część laboratoriów zmieniła interpretację kliniczną z wrażliwy na oporny, część uczestników deklarowała interpretację zgodnie z rekomendacjami EUCAST - wrażliwy, natomiast w uwagach podawano informację o możliwym niepowodzeniu terapeutycznym z uwagi na naturalnie obniżoną wrażliwość gatunku na teikoplaninę, część laboratoriów nie podała w ogóle interpretacji klinicznej. Podsumowując, zgodnie z zaleceniami EUCAST nie należało zmieniać interpretacji klinicznej dla teikoplaniny, tylko raportować wrażliwość zgodnie z uzyskaną wartością MIC - czyli w przypadku szczepu S. haemolyticus PM-200 raportować jako wrażliwy. Tabela II. Wyniki identyfikacji szczepów S.haemolyticus PM-99 i S.haemolyticus PM-200 II tura POLMICRO 202 Podana identyfikacja S.haemolyticus S. aureus S.saprophyticus S.hominis S.lugdunensis S.epidermidis S. auricularis Staphylococcus koagulazoujemny S.haemolyticus PM Liczba laboratoriów S.haemolyticus PM

5 2. Stosowanie nieaktualnej metodyki oznaczania lekowraż- liwości Od kilku lat (Rekomendacje KORLD 2009) wrażliwość gronkowców na wankomycynę i teikoplaninę należy oznaczać wyłącznie poprzez określenie wartości MIC. Metoda dyfuzyjno krążkowa jest w tym przypadku niewiarygodna i nie pozwala na rozróżnienie pomiędzy szczepami dzikimi a opornymi z mechanizmem innym niż oporność uwarunkowana obecnością genu vana. Niniejsza tura sprawdzianu wykazała, że 9 laboratoriow nadal stosowało metodę dyfuzyjno-krażkową do oznaczania wrażliwości Staphylococcus sp. na glikopeptydy. Dziewięć laboratoriów podało strefy zahamowania wzrostu izolatów wokół krążków z wankomycyną i teikoplaniną, pięć z nich dodatkowo określiło wartości MIC, przy czym tylko jedno laboratorium określiło zarówno MIC wankomycyny, jak i teikoplaniny. Pozostałe cztery laboratoria zinterpretowały wrażliwość na wankomycynę i teikoplaninę wyłącznie na podstawie uzyskanych stref zahamowania wzrostu, co uznano za bardzo duży błąd (postępowanie niezgodne z rekomendacjami!!!). 3. Brak lub niewłaściwa kontrola jakości oznaczania lekowrażliwości Brak kontroli jakości pasków do oznaczania wartości MIC, bądź stosowanie nieodpowiednich szczepów wzorcowych jest najczęstszą przyczyną błędów oznaczania lekowrażliwości. Do kontroli jakości lekowrażliwości izolatów z rodzaju Staphylococcus EUCAST zaleca szczep S. aureus ATCC 2923 (zarówno do metody dyfuzyjno-krążkowej, jak i metody rozcienczeniowej). Stosowanie szczepu S. aureus ATCC 2923 zadeklarowało 39 laboratoriów spośród 458 (85,4%). Dziesięć laboratoriów nie wykonało kontroli jakości testów wrażliwości, pozostałe wskazały wymienione poniżej szczepy wzorcowe, błędnie wykorzystane do wewnętrznej kontroli jakości testów wrażliwości gronkowców: S. aureus ATCC 25923, E. coli ATCC 25922, S. aureus ATCC 43300, E. faecalis ATCC 2922, E. coli ATCC 3528, K. pneumoniae ATCC , P. aeruginosa ATCC 27853, S. pneumoniae ATCC Wyniki oznaczania wartości MIC teikoplaniny i wankomycyny uzyskane przez uczestników sprawdzianu POLMICRO dla obu szczepów przedstawiono na rycinach od do 4. WYKRYWANIE MECHANIZMÓW OPORNOŚCI Szczepy S. haemolyticus PM-99 i S. haemolyticus PM 200 były oporne na meticylinę; 00% (n=458) laboratoriów poprawnie określiło meticylinooporność przesłanych izolatów. Interpretację wyników oznaczania wrażliwości na meticylinę czterysta trzydzieści sześć laboratoriów (95,2%) podało na podstawie oznaczenia z krążkiem z cefoksytyną 30µg. Spośród pozostałych 22 laboratoriów, dziesięć określiło meticylinooporność na podstawie wartości MIC cefoksytyny, co jest niezgodne z aktualnymi rekomendacjami i świadczy o nieprawidłowym postępowaniu diagnostycznym. EUCAST wyraźnie podkreśla, że dla gronkowców koagulazo-ujemnych, innych niż S. lugdunensis, oznaczenie wartości MIC cefoksytyny jest słabszym wskaźnikiem oporności na meticylinę niż oznaczenie metodą dyfuzyjno-krążkową. Pozostałe laboratoria podały wyłącznie samą interpretację in vitro, prawdopodobnie opierając się na testach wykonanych przy pomocy systemów automatycznych. Obydwa przesłane szczepy charakteryzowały się obecnością indukcyjnego mechanizmu oporności MLS B. Identyfikacja fenotypu oporności na makrolidy, linkozamidy i streptograminy B sprawiła trudność tylko trzem laboratoriom, przy czym jedno z nich popełniło błąd w wykrywaniu mechanizmu w obydwu izolatach. Spośród ogółem 96 oznaczeń, odnotowano 4 nieprawidłowe, tj. 0.44%. III tura programu POLMICRO 202 W ramach III tury POLMICRO 202 sprawdzianu każde laboratorium otrzymało dwa szczepy z rodzaju Enterococcus. Szczepy wysłano do 466 laboratoriów mikrobiologicznych, odpowiedź otrzymano od 453 uczestników. Pozytywną ocenę końcową uzyskało 44 laboratoriów, co stanowiło 97,4% ogółu laboratoriów przystępujących do sprawdzianu. Szczegółowe wyniki przedstawiały się następująco: IDENTYFIKACJA Jedno laboratorium zidentyfikowało szczep E. faecalis PM- 205 jako E. faecium. Dwa laboratoria spośród 453 popełniły błąd w identyfikacji E. faecium PM-206 jedno laboratorium określiło szczep jako E. faecalis, a drugie jako E. gallinarum. Wyniki testów wrażliwości podlegały ocenie wyłącznie dla izolatów prawidłowo zidentyfikowanych. LEKOWRAŻLIWOŚĆ Znaczna część uczestników lekowrażliwość szczepów kontrolnych oznaczała metodą dyfuzyjno-krążkową (n=47, 92%), z czego 28 uczestników metodę dyfuzyjno-krążkową zastosowało tylko do oznaczenia wrażliwości na jeden lek (gentamicynę 25, ampicylinę, teikoplaninę, chinupristinę/ dalfopristynę po jednym laboratorium), a wrażliwość na pozostałe leki oznaczyła na podstawie wartości MIC (mg/l); ta grupa laboratoriów stanowi 6,2% ogółu uczestników. Tylko 36 laboratoriów spośród 453 biorących udział w sprawdzianie (8%), do oceny przedstawiło wyłącznie oznaczenie metodą rozcienczeniową. Przesłany zestaw zawierał dwa szczepy bakteryjne wyizolowane z krwi, dlatego też w ocenie nadesłanych wyników wzięto pod uwagę interpretację wrażliwości na te leki, które mogą stanowić opcję terapeutyczną. E. faecalis PM-205 posiada gen vana warunkujący oporność izolatu na wankomycynę (MIC 256 mg/l) i teikoplaninę (MIC=48 mg/l). Wszystkie laboratoria, które prawidłowo zidentyfikowały badany izolat (n=452/453) oznaczyły prawidłowo także oporność szczepu na wankomycynę. Wrażliwość badanego szczepu na teikoplaninę oznaczyło tylko 438 laboratoriów, z czego tylko jedno laboratorium podało wynik nieprawidłowy - określiło szczep jako wrażliwy, popeł- 2

6 Biegłość laboratoriów mikrobiologicznych w oznaczaniu lekowrażliwości drobnoustrojów POLMICRO 202 niając tym samym VME. Szczep E. faecalis PM-205 był wrażliwy na pozostałe leki i uczestnicy sprawdzianu w większości nie mieli trudności w uzyskaniu poprawnych wyników. Jedynie przy oznaczaniu wrażliwości izolatu na linezolid, trzy laboratoria (0,7%) popełniły ME oznaczając szczep jako oporny i jedno laboratorium popełniło me, określając szczep jako średniowrażliwy. Odsetek prawidłowych wyników dla większości ocenianych antybiotyków i chemioterapeutyków wynosił od 99% do 00%. E. faecium PM-206 oprócz oporności na ampicylinę szczep wykazywał obniżoną wrażliwość na chinupristinę/dalfopristinę (MIC=3mg/L), natomiast na pozostałe antybiotyki był wrażliwy. Ocenę lekowrażliwości tego szczepu przeprowadzono dla 45 laboratoriów, które prawidłowo zidentyfikowały badany izolat. Odsetek poprawnych wyników kategorii wrażliwości w odniesieniu do wszystkich leków wyniósł blisko 00%. Ogółem odnotowano siedem ME (wynik oporny - O zamiast wrażliwy - W), w tym: cztery dla teikoplaniny, dwa dla wankomycyny jeden dla linezolidu. WYKRYWANIE MECHANIZMÓW OPORNOŚCI Obydwa szczepy E. faecalis PM-205 i E. faecium PM 206 nie wykazywały oporności wysokiego stopnia na gentamicynę. Prawidłowe wyniki oznaczania oporności wysokiego stopnia na gentamicynę (HLGR) izolatu E. faecalis PM-205 udzieliło 99,3% (n=449), trzy laboratoria udzieliły błędnej odpowiedzi. Prawidłowe wyniki dla izolatu E. faecium PM-206 uzyskało 99,8% (n=450) laboratoriów, błąd popełniło jedno laboratorium wykrywając oporność HLGR. Jeden z uczestników zaznaczył dla obydwu szczepów przy oporności HLGR odpowiedź nie badano, pomimo wykonania oznaczenia wrażliwości na gentamicynę. Cztery laboratoria użyły do oznaczania wrażliwości na gentamicynę krążka o niewłaściwej zawartości antybiotyku (20µg lub 0µg zamiast 30µg), co w tabeli wyników zostało ocenione jako BŁĄD. Laboratoria te powinny zwrócić uwagę na znaczne różnice wielkości stref zahamowania wzrostu, wynoszące nawet 5-8 mm wokół krążka z gentamicyną (20 µg) w porównaniu z metodą odniesienia (30 µg). W przypadku szczepów badanych w niniejszej edycji nie spowodowało to wprawdzie różnicy w interpretacji wrażliwości, jednak w rutynowej diagnostyce zastosowanie krążków o nieprawidłowej zawartości antybiotyku jest bardzo dużym błędem i może skutkować niewiarygodnym wynikiem oznaczenia wrażliwości/wykrycia mechanizmu oporności. Do kontroli jakości lekowrażliwości izolatów z rodzaju Enterococcus EUCAST zaleca szczep E. faecalis ATCC 2922, ten sam dla metody dyfuzyjno-krążkowej, jak i metody rozcieńczeniowej (oznaczanie wartości MIC). Stosowanie takiego szczepu zadeklarowało 42 laboratoriów spośród 453, czyli tylko 9% uczestników. Siedem laboratoriów zaznaczyło odpowiedź wskazującą na to, ze nie prowadziło kontroli jakości testów wrażliwości, pozostałe laboratoria wskazały inne szczepy wzorcowe, nieprawidłowo wykorzystane do wewnętrznej kontroli jakości testów wrażliwości enterokoków: S. aureus ATCC 2923, E. coli ATCC 25922, E. faecalis ATCC 5299, S. aureus ATCC IV tura programu POLMICRO 202 W edycji tej przygotowano zestawy kontrolne zawierające dwa szczepy gatunku Pseudomonas aeruginosa wymienione w tabeli I. Szczepy wysłano do 460 laboratoriów mikrobiologicznych, odpowiedź otrzymano od 450 uczestników. Pozytywny wynik IV tury sprawdzianu POLMICRO 202 uzyskało czterysta jeden, czyli 89,% laboratoriów biorących udział w programie. Szczep P. aeruginosa PM-95 został włączony do sprawdzianu POLMICRO po raz drugi; część laboratoriów pierwszy raz pracowała z tym izolatem w ramach I tury POLMICRO 202. IDENTYFIKACJA Identyfikacja szczepów Pseudomonas aeruginosa nie sprawiła laboratoriom trudności, na 900 wyników tylko dwa były nieprawidłowe. Dwa laboratoria błędnie zidentyfikowały szczep PM-95 jako Pseudomonas fluorescens. LEKOWRAŻLIWOŚĆ P. aeruginosa PM-95 Dla przypomnienia, szczep P. aeruginosa PM-95 wykazywał obniżoną wrażliwość na meropenem i oporność na imipenem; nie wytwarzał metalo-β-laktamaz (MBL). Szczep otrzymały wszystkie laboratoria uczestniczące w IV turze POLMICRO 202; dla większości antybiotyków podano prawidłową interpretację kliniczną wrażliwości, błędy pojawiły się w interpretacji wyników wrażliwości na cefepim i meropenem. Ponad osiemdziesiąt procent uczestników (83,6%, n=376) uzyskało wynik prawidłowy wrażliwości na meropenem określiło izolat jako średniowrażliwy, pięćdziesiąt laboratoriów określiło szczep jako oporny, natomiast dwadzieścia jeden jako wrażliwy w obydwu przypadkach zostało to uznane jako mały błąd. Podobnie jak podczas I tury 202, pojawiły się rozbieżności w oznaczeniu wrażliwości szczepu P.aeruginosa PM-95 na cefepim. W I turze Polmicro 202 interpretację oznaczenia wrażliwości na cefepim dla PM-95 wycofano z oceny, z uwagi na niski odsetek poprawnych odpowiedzi - 6,%. W IV turze prawidłowy wynik - wrażliwy na cefepim - uzyskało 53,6% (n=24) uczestników sprawdzianu. Laboratoria, które określiły szczep jako oporny na cefepim 4,% (n=85) popełniły duży błąd, nie miał on jednak wpływu na ocenę końcową przyznaną laboratoriom. Ryciny 5 i 6 przedstawiają rozkład stref zahamowania wzrostu szczepu P. aeruginosa PM-95 wokół krążka z cefepimem, uzyskanych przez laboratoria w I i IV edycji. Najwyższe piki w I i IV edycji odnotowano dla stref zahamowania wzrostu, odpowiednio, 7 mm i 8 mm, przy czym wynik podany przez Centralny Ośrodek (jako wynik referencyjny) 22

7 Rycina 5. Rozkład stref zahamowania wzrostu (mm) szczepu P. aeruginosa PM-95 wokół krążka z cefepimem I tura POLMICRO 202. Rycina 7. Rozkład wartości MIC cefepimu dla szczepu P. aeruginosa PM-95 I tura POLMICRO 202. Rycina 6. Rozkład stref zahamowania wzrostu (mm) szczepu P. aeruginosa PM-95 wokół krążka z cefepimem IV tura POLMI- CRO 202. Rycina 8. Rozkład wartości MIC cefepimu dla szczepu P. aeruginosa PM-95 IV tura POLMICRO 202. to 8 mm. Najczęstsze wyniki różniły się od siebie tylko o mm, niestety, w tym przypadku wartość ta powoduje zmianę kategorii wrażliwości szczepu z wrażliwy (8 mm) na oporny (7 mm). Ryciny 7 i 8 przedstawiają z kolei rozkład wartości MIC (mg/l) cefepimu dla szczepu PM-95 w I i IV turze sprawdzianu. Siedemdziesiąt spośród osiemdziesięciu ośmiu laboratoriów (79,5%) w I turze uzyskało wartości MIC kwalifikujące szczep jako oporny, natomiast w IV turze tylko 76 (34%) uznało szczep jako oporny, a blisko 2/3 laboratoriów uzyskało wartości MIC dla szczepu PM 95 określające izolat jako wrażliwy. Wielkości stref zahamowania wzrostu plasujące się blisko wartości granicznej zamieszczonej w tabelach interpretacji wyników, zawsze powinny skłaniać laboratorium do wykonania testów inną metodą (Etest, MICE, czy system automatyczny), tak, aby mieć pewność uzyskania wiarygodnego wyniku. Wszystkie testy wykonywane w laboratorium powinny podlegać wewnętrznej kontroli jakości z odpowiednimi szczepami wzorcowymi. LEKOWRAŻLIWOŚĆ P. aeruginosa PM-207 Szczep był oporny na wszystkie antybiotyki i chemioterapeutyki zamieszczone w ankiecie za wyjątkiem kolistyny, wobec której pozostawał wrażliwy; był producentem karbapenemazy IMP-. Laboratoria nie miały żadnych trudności z uzyskaniem prawidłowych wyników oznaczeń lekowrażliwości tego izolatu. WYKRYWANIE MECHANIZMÓW OPORNOŚCI Oznaczanie karbapenemaz klasy B tzw. metalo β-laktamaz (MBL) w omawianej turze POLMICRO wypadło zadowalająco. Brak produkcji MBL przez P. aeruginosa PM-95 prawidłowo określiło 9,6% (n=42) laboratoriów, natomiast obecność MBL w szczepie PM-207 wykryło 96,2% (n=433) uczestników sprawdzianu. Dwieście dwadzieścia dwa laboratoria otrzymały szczep PM-95 zarówno w I, jak i IV turze POLMICRO 202. Siedemdziesiąt osiem laboratoriów, które w I turze popełnilo błąd w wykrywaniu mechanizmu oporności w szczepie PM- 95, przy ponownym oznaczaniu skorzystało z doświadczenia nabytego w I turze sprawdzianu i tym razem poprawnie zakwalifikowało szczep jako MBL-ujemny. Pięć laboratoriów ponownie popełniło błąd uznając szczep P. aeruginosa PM- 95 jako MBL-dodatni. Rycina 9 przedstawia wyniki otrzymane w turach I i IV przez wszystkie laboratoria, natomiast rycina 0 przedstawia grupę laboratoriów (n=222), które szczep P. aeruginosa PM-95 badały dwukrotnie. Odnotowano zdecydowanie niższy odsetek błędnych odpowiedzi w szczepie MBL-ujemnym P. aeruginosa PM-95 z 37,3% (85 z 228) w I turze, do 8,2% (37 z 450) w IV turze POLMICRO 202. W IV turze POLMICRO 202 poproszono laboratoria o skomentowanie wyniku oznaczania mechanizmu MBL w bada- 23

8 Biegłość laboratoriów mikrobiologicznych w oznaczaniu lekowrażliwości drobnoustrojów POLMICRO 202 Rycina 9. Wyniki oznaczania mechanizmu MBL w szczepie P. aeruginosa PM-95 I i IV tura POLMICRO 202. nemy, uwarunkowanej wytwarzaniem karbapenemaz klasy B, tzw. metalo-β-laktamaz. Analiza wyników wykazała, że laboratoria prawidłowo identyfikowały izolaty MBL-dodatnie, natomiast nadal duża grupa laboratoriów nie posiada biegłości w zakresie interpretacji wyniku testu w kierunku MBL dla szczepów MBL-ujemnych. Odpowiedni dobór szczepów kontrolnych przez Centralny Ośrodek w ramach POLMICRO pozwala na poprawę diagnostyki mikrobiologicznej w laboratoriach uczestniczących w Programie poprzez ujednolicenie i standaryzację metod badawczych w tych laboratoriach. Ogółem w roku 202 przyznano 45 świadectw; wykaz laboratoriów, które otrzymały świadectwa w roku 202 zamieszczony został na stronie internetowej Centralnego Ośrodka ( Przyznawane laboratoriom świadectwa posiadają indywidualny numer i zachowują ważność w terminie jednego roku od dnia wystawienia. Rycina 0. Wyniki oznaczania mechanizmu MBL w szczepie P. aeruginosa PM-95 uzyskane przez laboratoria, które otrzymały szczep w I i IV turze POLMICRO 202. nych izolatach. Uzyskano następujące odpowiedzi: P. aeruginosa PM laboratoriów (6%) odpowiedziało wynik jest jednoznaczny, łatwy do zinterpretowania MBL-ujemny, natomiast 42 laboratoria (3,6%) wybrało odpowiedź wynik trudny do interpretacji, wymaga potwierdzenia w KORDL P. aeruginosa PM zdecydowana większość (353 laboratoria 78,4%) nie miała problemów z oznaczeniem tego mechanizmu oporności, a szczep zostałby wysłany do KORLD tylko w celach nadzoru epidemiologicznego. Piętnaście z tych laboratoriów uznało, ze szczepu MBL-dodatniego nie należy przesyłać do KORLD w celach nadzoru epidemiologicznego. Osiemdziesiąt osiem (9,6%) laboratoriów uznało, ze oznaczenie mechanizmu MBL w szczepie P. aeruginosa PM-207 jest trudne w interpretacji i wymaga potwierdzenia w ośrodku referencyjnym. Podsumowanie Analiza przesyłanych do Centralnego Ośrodka Badań Jakości w Diagnostyce Mikrobiologicznej wyników w postaci zestawień zarówno zbiorczych, jak i indywidualnych, dostępna była dla laboratoriów uczestniczących w Sprawdzianach na stronie internetowej Centralnego Ośrodka. Podobnie, jak w poprzednich edycjach Programu POLMI- CRO, główny nacisk położono na prawidłowe oznaczenie fenotypów lekowrażliwości badanych izolatów bakteryjnych z uwzględnieniem wytwarzanych przez nie mechanizmów oporności. Wiele uwagi poświęcono wykrywaniu oporności Gram-ujemnych pałeczek niefermentujących na karbape- Piśmiennictwo:. Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; Twenty Second Informational Supplement, CLSI document M00-S22, Wayne PA, Europejski Komitet ds. Oznaczania Lekowrażliwości (EUCAST), Tabele interpretacji wartości granicznych minimalnych stężeń hamujących (MIC) oraz wielkości stref zahamowania wzrostu; wersja 2.0, 202; Polskie tłumaczenie pod red. prof. dr hab. n. med. Walerii Hryniewicz 3. Eucast expert rules version http// 4. Hryniewicz Waleria, Żabicka D, Bartoszewicz M i wsp. Stanowisko Zespołu Roboczego ds. wprowadzania zaleceń Europejskiego Komitetu ds. Oznaczania Lekowrażliwości EUCAST w sprawie najczęściej zgłaszanych pytań dotyczących stosowania rekomendacji EUCAST, 20 czerwca Rekomendacje European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing EUCAST, Version 2.0, http// 6. Zasady interpretacji wyników oznaczania lekowrażliwości drobnoustrojów zalecenia ekspertów EUCAST, wersja, kwiecień Polskie tłumaczenie pod red. Prof. W. Hryniewicz - www. korld.edu.pl 7. http// Adres do korespondencji: Mgr Ewa Młodzińska Centralny Ośrodek Badań Jakości w Diagnostyce Mikrobiologicznej Warszawa, ul. Chełmska 30/34 Tel./fax emlodzinska@cls.edu.pl, sprawdzian@cls.edu.pl Zaakceptowano do publikacji: