Specificity of the anaerobic bacterial infections in the surgical and orthopedic wards

Transkrypt

1 MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2012, 64: Specyfika zakażeń bakteriami beztlenowymi na oddziałach chirurgicznych i ortopedycznych. Specificity of the anaerobic bacterial infections in the surgical and orthopedic wards Marta Kierzkowska, Anna Majewska, Anna Sawicka-Grzelak, Andrzej Młynarczyk, Katarzyna Ładomirska-Pestkowska, Grażyna Młynarczyk Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej Uniwersytetu Medycznego w Warszawie Bakterie beztlenowe są istotnym składnikiem prawidłowej mikroflory skóry oraz błon śluzowych. Uczestniczą także w etiologii zakażeń, najczęściej o charakterze endogennym. Zakażenia wywołane bakteriami beztlenowymi są problemem klinicznym i terapeutycznym u pacjentów z infekcją w obrębie narządu ruchu oraz hospitalizowanych w oddziałach chirurgicznych. Specyfika zakażeń w obrębie opisanych oddziałów jest odmienna i jej znajomość stanowi algorytm postępowania przeciwbakteryjnego. ABSTRACT Introduction. The aim of this study was to estimate the contribution strictly anaerobic bacteria in the etiology of infections in patients on surgery and orthopedic wards. Methods. We examined 159 samples taken from patients hospitalized in surgical wards and 179 clinical specimens taken from orthopedic patients. Clinical strains of obligate anaerobes were identified by API 20A biochemical tests (ATB Expression, biomerieux S.A., France). Susceptibility of the clinical strains was examined by ATB ANA (biomerieux S.A., France) system. The MIC values were determined by the gradient diffusion method, Etest (AB BIODISK, Sweden i biomerieux S.A., France). Results. Gram-negative bacteria predominant in the samples taken from surgical patients, Most frequently we isolated rods of the genus Bacteroides (26%): B. fragilis, B.ovatus/B. thetaiotaomicron, and B. distasonis. In 44 samples (28%) we identified only anaerobic bacteria. Multibacterial isolations, with the participation of anaerobic and aerobic flora, dominated among patients in the study. Overall 238 strictly anaerobic bacteria were cultured from patients hospitalized in orthopedic wards. Gram-positive bacteria accounted for 78%. The most frequently were isolated Peptostreptococcus (56%), Propionibacterium (10%) species. In this study all Bacteroides strains were resistant to penicillin G. Some species were

2 30 M. Kierzkowska i inni Nr 1 resistant to clindamycin, as well. Overall 40% of Bacteroides strains taken from surgical and 50% isolated from orthopedic wards showed no sensitivity to this antibiotic. A similar phenomenon was observed among bacteria of the genus Prevotella. Conclusions. In samples taken from orthopedic patients we observed the predominance of Gram-positive anaerobic bacteria. Some of them were part of the normal flora but they should not be excluded as an etiology agents of infection. The specimens taken from patients treated in surgical wards showed the presence of a mixed microflora, which included aerobic and anaerobic bacteria, primarily Gram-negative rods. Rational empirical therapy of infections with anaerobes should be mainly based on the resistance pattern in each ward and hospital. In view of the increasing in the number of resistant strains is necessary to monitor drug resistance of anaerobic bacteria. WSTĘP Bakterie beztlenowe są składnikiem fizjologicznej mikroflory człowieka. Bytują w przewodzie pokarmowym, zasiedlają błony śluzowe jamy ustnej i górnych dróg oddechowych. Wchodzą również w skład fizjologicznej mikroflory bakteryjnej układu moczowo-płciowego. Beztlenowe, Gram-dodatnie ziarenkowce i pałeczki kolonizują przede wszystkim skórę i powierzchnię błon śluzowych jamy ustnej, natomiast pałeczki Gram-ujemne górne drogi oddechowe, układ pokarmowy i moczowo-płciowy. Drobnoustroje te są patogenami oportunistycznymi, odpowiedzialnymi za zakażenia endogenne. W przypadku osłabienia miejscowej lub ogólnej odporności immunologicznej, niedotlenienia tkanek, przerwania ciągłości bariery śluzówkowej lub skóry dochodzi do namnażania się bakterii beztlenowych i infekcji. Zakażenia mogą dotyczyć każdej tkanki i narządu. Bakterie beztlenowe najczęściej izolowane są z materiałów klinicznych wraz z mikroflorą tlenową. Celem pracy była ocena udziału bakterii bezwzględnie beztlenowych w etiologii zakażeń u pacjentów leczonych w Klinice Ortopedyczno-Traumatologicznej Narządu Ruchu oraz w Klinice Chirurgii Ogólnej i Transplantacyjnej Szpitala Klinicznego Dzieciątka Jezus- -Centrum Leczenia Obrażeń w Warszawie. MATERIAŁ I METODY Materiał badawczy stanowiły: fragmenty tkanek miękkich i kostnych, wymazy z przetok i ran, zeskrobiny z kości, płyny z jam stawowych (pobrane z oddziałów ortopedycznych) oraz wymazy z ran, owrzodzeń, ropa, płyn z jamy brzusznej i fragmenty tkanek (dostarczone z oddziałów chirurgicznych). Próbki pobrano w latach od pacjentów hospitalizowanych w oddziałach: Chirurgii, Intensywnego Nadzoru Chirurgicznego, Bloku Operacyjnego, Zapaleń Kości, Ortopedii, Traumatologii Narządu Ruchu oraz od pacjentów ambulatoryjnych z Poradni Chirurgii Ogólnej i Przychodni Urazowo-Ortopedycznej. Materiał posiewano na podłoża bakteriologiczne Schaedler Agar z 5% krwią baranią, witaminą K i heminą (biomerieux S.A., Francja). Inkubowano w temperaturze 37 C w anaerostatach, w atmosferze 85% azotu, 10% wodoru, 5% dwutlenku węgla. Okres inkubacji trwał od 48 h do 7 dni. Po ocenie morfologii wyhodowanych kolonii i ocenie mikroskopowej, dokonano identyfi-

3 Nr 1 Zakażenia beztlenowcami 31 kacji przy użyciu zestawu API 20A w automatycznym systemie ATB Expression (biomerieux S.A., Francja). Ocenę lekowrażliwości przeprowadzono z wykorzystaniem zestawu antybiotyków w teście ATB ANA (biomerieux S.A., Francja) według zaleceń CASFM i NCCLS. Pasek ATB ANA zawiera następujące antybiotyki w stężeniach (mg/l): penicylina 0,5-2, amoksycylina z kwasem klawulanowym 4/2-8/4, piperacylina 32-64, piperacylina z tazobaktamem 32/4-64/4, tikarcylina z kwasem klawulanowym 32/2-64/2, cefoksytyna 16-32, cefotetan 16-32, imipenem 4-8, klindamycyna 2-4, chloramfenikol 8-16, metronidazol l8-16. Określano także najmniejsze stężenie hamujące wzrost bakterii (MIC) przy użyciu gradientowo-dyfuzyjnej metody E-test (AB BIODISK, Szwecja i biomerieux S.A., Francja). Zastosowano paski E-test impregnowane gradientem stężeń: klindamycyny (CM 0, mg/l), metronidazolu (MZ 0, mg/l), imipenemu (IP 0,002-32mg/l), penicyliny G (PG 0, mg/l) oraz amoksycyliny z kwasem klawulanowym (XL 0, mg/l). Używano podłoża Brucella Agar z dodatkiem 5% krwi końskiej (Graso BIOTECH, Polska). Paski ATB ANA i płytki z E-testami inkubowano w 35 C w anaerostatach przez 48h. Technika wykonywania testów i sposób odczytywania wyników były zgodne z zaleceniami producenta. WYNIKI I ICH OMÓWIENIE W prowadzonym badaniu wykorzystano 159 próbek materiału pobranego od pacjentów z podejrzeniem choroby infekcyjnej przebywających na oddziałach chirurgicznych. Łącznie wyhodowano 239 drobnoustrojów bezwzględnie beztlenowych. Wykazano znaczny udział bakterii Gram-ujemnych (47%, 112 szczepów). W grupie tej dominowały pałeczki z rodzaju Bacteroides sp. (26%): B. fragilis, B. ovatus/thetaiotaomicron, B. distasonis. Około 8% stanowiły Prevotella bivia, P. intermedia/disiens, P. melaninogenica/oralis. Gatunki z rodzajów Porphyromonas i Prevotella stanowiły po 4% wyhodowań (Tabela I). Z bakterii Gram-dodatnich najliczniej izolowano Peptostreptococcus sp. (39%), Propionibacterium sp. (6%) oraz Actinomyces sp. (4%) i Eubacterium sp. (4%). Tabela I. Beztlenowe bakterie Gram-ujemne wyhodowane z próbek materiałów klinicznych od pacjentów z oddziałów chirurgicznych Rodzaj liczba szczepów Bacteroides sp. 62 B.fragilis 32 B.ovatus/thetaiotaomicron 14 B.distasonis 9 inne 7 Prevotella 19 P.bivia 8 P.melaninogenica/oralis 6 P.intermedia/disiens 5 Porphyromonas sp. 9 Fusobacterium sp. 9 Veillonella sp. 13 RAZEM 112

4 32 M. Kierzkowska i inni Nr 1 Wyłącznie bakterie beztlenowe izolowano z 44 próbek (28%). W 27 przypadkach (17%) stwierdzono obecność jednego gatunku bakterii beztlenowych. W pozostałych 11% zidentyfikowano od 2 do 5 szczepów bakterii z dominującym udziałem Bacteroides sp., Actinomyces sp., Prevotella sp. (82% takich materiałów pobrano od pacjentów przebywających na Bloku Operacyjnym). Zakażenia wielobakteryjne, z udziałem flory beztlenowej i tlenowej, okazały się dominować wśród pacjentów objętych badaniem. W tego rodzaju próbkach bakteriom beztlenowym, głównie: Bacteroides sp, Actinomyces sp., Prevotella sp., towarzyszyły bakterie tlenowe. Pałeczki Gram-ujemne z rodzaju Bacteroides w większości przypadków identyfikowano w materiale z jamy brzusznej i z ropni, co jest zbieżne z danymi piśmiennictwa (8, 10, 11). Wykonano posiewy 179 próbek materiału klinicznego pobranych od pacjentów hospitalizowanych na oddziałach ortopedycznych. Zidentyfikowano 238 szczepów bakterii bezwzględnie beztlenowych. Bakterie Gram-dodatnie stanowiły 78% (186 szczepy) wszystkich wyizolowanych bakterii beztlenowych. W badanym materiale dominowały gatunki z rodzaju Peptostreptococcus (58%). Zidentyfikowano również bakterie należące do rodzaju Propionibacterium (10%), głównie P. acnes, P. granulosum. Propionibacterium acnes, gatunek kolonizujący skórę, jest coraz częściej uznawany za czynnik infekcji protezy, na powierzchni której wytwarza biofilm (3). Rodzaj Actinomyces (A. meyerii/odontolitycus, A. naeslundii) i Eubacterium (E. aerofaciens, E. lentum), stanowiły po 3% wyhodowanych drobnoustrojów (Tabela II). Wśród pałeczek Gram-ujemnych z rodzaju Bacteroides (10%) dominował gatunek B. fragilis i B. ovatus/thetaiotaomicron. Pałeczki Gram-ujemne Prevotella (P. intermedia/disiens, P. melaninogenica/oralis) jak również Fusobacterium, głównie F. necrophorum/nucleatum stanowiły po 3% wszystkich oznaczonych szczepów. W 45 (25%) próbkach badanych wykazano obecność wyłącznie bakterii beztlenowych. Izolacje monobakteryjne (Peptostreptococcus sp. lub Propionibacterium acnes) dotyczyły głównie wymazów z ran i fragmentów tkanek. Mieszana, wyłącznie beztlenowa flora bakteryjna została wyhodowana z materiałów pobranych z przetok. W pozostałych przypadkach stwierdzono obecność także bakterii rosnących tlenowo. Tabela II. Beztlenowe bakterie Gram-dodatnie wyhodowane z próbek materiałów klinicznych od pacjentów z oddziałów ortopedycznych. Rodzaj liczba szczepów Peptostreptococcus sp. 139 Propionibacterium sp. 24 Actinomyces sp. 8 Eubacterium sp. 8 inne 7 RAZEM 186 W prowadzonym badaniu stwierdzono wrażliwość bakterii Gram-dodatnich na antybiotyki β-laktamowe. Zaobserwowano natomiast obniżoną wrażliwość na klindamycynę oraz metronidazol (dotyczy to głównie rodzaju Propionibacterium i Actinomyces). Spośród bakterii Gram-ujemnych, pałeczki rodzaju Bacteroides były oporne na penicylinę G (100%), co jest wynikiem wytwarzania przez nie β-laktamazy (4, 11). Ponadto niektóre z wyhodowanych szczepów były oporne na klindamycynę. W tabeli III przedstawiono zakresy wartości

5 Nr 1 Zakażenia beztlenowcami 33 Tabela III. Zakresy wartości MIC (mg/l) metronidazolu, klindamycyny, imipenemu, amoksycyliny z kwasem klawulanowym, penicyliny G dla Bacteroides sp. (liczba szczepów-14) Antybiotyk Zakres MIC MIC50 MIC90 Metronidazol 0,16-0,38 0,094 0,38 Klindamycyna 0, ,38 2 Imipenem 0, ,094 0,75 Amoksycylina z kwasem klawulanowym 0, , Penicylina G MIC wybranych antybiotyków dla rodzaju Bacteroides. Wszystkie szczepy Bacteroides sp. były wrażliwe na metronidazol (MIC 0,016-0,38 mg/l) oraz imipenem (MIC 0,002-1,0 mg/l). Na oddziałach chirurgicznych oporność szczepów Bacteroides na klindamycynę dotyczyła 40% izolatów, a na oddziałach urazowo-ortopedycznych 50% szczepów nie wykazuje wrażliwości na ten antybiotyk. Podobne zjawisko zaobserwowano wśród bakterii z rodzaju Prevotella, izolowanych na oddziałach urazowo-ortopedycznych, gdzie oporność na klindamycynę sięgała 50% izolatów. Klindamycyna jest antybiotykiem powszechnie stosowanym w szpitalnej i ambulatoryjnej profilaktyce antybiotykowej, głównie w chirurgii urazowo-ortopedycznej, ze względu na swoje właściwości farmakokinetyczne (1, 2). Oporność na klindamycynę związana jest z modyfikacją podjednostki 23S RNA w wyniku produkcji metylazy. Wśród pałeczek Bacteroides sp. najczęściej występują geny erm(f), erm(g) i erm(b), zlokalizowane na plazmidach lub transpozonach. Innym mechanizmem oporności jest aktywne usuwanie leku z komórki (efflux pump). Oporność na klindamycynę wymaga rutynowego monitorowania (5, 6, 7, 9). PODSUMOWANIE WYNIKÓW W próbkach materiałów pobranych od pacjentów leczonych w oddziałach ortopedycznych wykazano dominację Gram-dodatnich bakterii beztlenowych. Gatunki Peptostreptococcus sp. i Propionibacterium acnes, które dominowały w badanych próbkach mogą wchodzić w skład fizjologicznej mikroflory, ale nie należy wykluczać ich udziału w etiologii zakażeń. Gatunki bytujące na skórze mogą odpowiadać za zapalenie tkanki łącznej i zakażenia tkanek miękkich. W próbkach materiałów pobranych od pacjentów hospitalizowanych na oddziałach chirurgicznych wykazano obecność mikroflory mieszanej, w skład której wchodziły bakterie beztlenowe, głównie pałeczki Gram-ujemne i bakterie tlenowe. Gatunki zasiedlające jelito mogą odpowiadać za ropnie jamy brzusznej i z takich materiałów są najczęściej izolowane. Zakażenia bakteriami bezwzględnie beztlenowymi, zwłaszcza nieprzetrwalnikującymi, mają charakter endogenny. Mikroorganizmy odpowiedzialne za zakażenie należą do mikroflory fizjologicznej, zasiedlając błony śluzowe przewodu pokarmowego, odgrywają kluczową rolę w zapobieganiu kolonizacji bakteriami egzogennymi. Infekcje występujące u pacjentów hospitalizowanych na oddziałach chirurgicznych są skutkiem zaburzeń strukturalnych i czynnościowych, które powodują przerwanie ciągłości błony śluzowej, miejscowe niedokrwienie lub niedrożność. W etiologii tych zakażeń dominują bakterie należące do grupy Bacteroides fragilis. Drobnoustroje, będące składnikami

6 34 M. Kierzkowska i inni Nr 1 naturalnej mikroflory skóry, takie jak: Peptostreptococcus sp. i Propionibacterium sp. są częstymi czynnikami zakażeń w chirurgii ortopedycznej. Do leczenia infekcji wywołanych bakteriami beztlenowymi stosowanych jest kilka antybiotyków. Racjonalna terapia empiryczna powinna być wdrożona na podstawie klinicznej oceny przebiegu zakażenia oraz wzoru oporności na leki przeciwbakteryjne w oddziale i w szpitalu. PIŚMIENNICTWO 1 Babiak I, Golicki D, Dąbrowski F. Zastosowanie klindamycyny w praktyce ortopedycznej ze szczególnym uwzględnieniem procedur ambulatoryjnych. Ortopedia, traumatologia, rehabilitacja 2004; 6 (2): Babiak I, Kowalewski M, Szczęsny G i inni. Specyfika zakażeń na oddziałach urazowo-ortopedycznych wskazania terapeutyczne. Zakażenia 2004; 3: Butler-Wu S, Burns E, Pottinger P i inni: Optimization of Periprosthetic Culture for Diagnosis of Propionibacterium acnes Prosthetic Joint Infection. J. Clin. Microbiol. 2011; 49 (7): Brook I. Management of anaerobic infection. Export Rev.Anti-infect.Ther. 2004; 2(1), Kądzielska J, Kierzkowska M, Sawicka-Grzelak A i inni. Charakterystyka klinicznych szczepów Gram-ujemnych bezwzględnych beztlenowców. Med. Dośw. Mikrobiol 2007; 59: Kierzkowska M, Majewska A, Kądzielska J i inni. Udział beztlenowych Gram-ujemnych bakterii w zakażeniach hospitalizowanych pacjentów. Med. Dośw. Mikrobiol 2011; 63: Löfmark S, Jernberg C, Jansson JK i inni. Clindamycin-induced enrichment and long-term persistence of resistant Bacteroides spp. and resistance genes. J.Antimicrob. Chemother. 2006; 58 (6): Mazuski JE, Solomkin JS. Intra-abdominal infections. Surg Clin North Am. Apr 2009; 89(2): Nguyen MH, Yu VL, Morris AJ i inni. Antimicrobial Resistance and Clinical Outcome of Bacteroides Bacteremia: Findings of a Multicenter Prospective Observational Trial. Clin. Infect. Dis. 2000; 30: Solomkin JS, Mazuski JE, Baron EJ. Guidelines for the Selection of Anti-infective Agents for Complicated Intra-abdominal Infections. Clin. Infect. Dis. 2003; 37: Waxler HM. Bacteroides: The good, the bad, and the nitty-gritty. Clin. Microbiol. Rev. 2007; 20: 4, Otrzymano: 17 I 2012 r. Adres Autora: Warszawa, ul. T.Chałubińskiego 5, Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej WUM