ZAKAŻENIA RAN WYWOŁANE PRZEZ MACZUGOWCE REPREZENTUJĄCE GATUNKI BAKTERII UWAŻANYCH ZA OPORTUNISTYCZNE

Transkrypt

1 MED. DOŚW. MIKROBIOL., 010, 6: Alina Olender 1, Iwona Łętowska ZAKAŻENIA RAN WYWOŁANE PRZEZ MACZUGOWCE REPREZENTUJĄCE GATUNKI BAKTERII UWAŻANYCH ZA OPORTUNISTYCZNE 1 Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej Uniwersytetu Medycznego w Lublinie Kierownik: prof. dr hab. n. med. M. Kozioł-Montewka Zakład Profilaktyki Zakażeń i Zakażeń Szpitalnych Narodowego Instytutu Leków w Warszawie Kierownik Zakładu: dr n. med. P. Grzesiowski Przeprowadzono analizę 4 przypadków izolacji z ran w znamiennej ilości Gram-dodatnich maczugokształtnych pałeczek (C. amycolatum, C. striatum, C. grupa G, Brevibacterium sp., C. jeikeium, C. urealyticum, C. grupa F1). Scharakteryzowano oporność na antybiotyki na podstawie wartości MIC oznaczonych metodą Etest. U 83,3% szczepów występowała jednocześnie oporność na erytromycynę i klindamycynę (mechanizm MLSB), u 75% oporność na kotrimoksazol, u 71,7% oporność na chloramfenikol, u 16,7% na antybiotyki beta-lakatamowe. Wszystkie szczepy wykazywały wrażliwość na wankomycynę i teikoplaninę. Zakażenia ran najczęściej spowodowane są przez endogenną florę bakteryjną, która w wyniku przerwania ciągłości tkanek przedostaje się do miejsca ich uszkodzenia. Ilość dostających się drobnoustrojów ma bezpośredni wpływ na proces gojenia się rany, który uzależniony jest przede wszystkim od naturalnych mechanizmów immunologicznych zachodzących wokół zniszczonej tkanki. Nie zawsze obecność drobnoustrojów w ranie daje kliniczne objawy zakażenia, prowadząc niekiedy tylko do jej kolonizacji. W przypadku gwałtownego wzrostu bakterii i osłabionych procesów gojenia dochodzi do tzw. kolonizacji krytycznej i rozwoju zakażenia. Pojawienie się klinicznych objawów zakażenia związane jest z zaburzeniem procesów gojenia, przewlekłym stanem zapalnym oraz wystąpieniem objawów ogólnoustrojowych, uzależnionych m.in. od intensywności i patogennego działania drobnoustrojów. W sprzyjających warunkach i dużej liczby drobnoustrojów, nawet o niskim stopniu wirulencji, może dojść również do wystąpienia klinicznych objawów zakażenia. W leczeniu ran mogą pojawiać się problemy, które związane są z trudnością w interpretacji uzyskanych wyników badań mikrobiologicznych, szczególnie wtedy, gdy izolowane są drobnoustroje wchodzące w skład mikroflory kolonizującej skórę, co stwarza podejrzenie kontaminacji pobranego materiału.

2 136 A. Olender, I. Łętowska Nr Udział drobnoustrojów oportunistycznych w zakażeniach jest często dyskutowany i trudny w ostatecznym uznaniu ich jako faktycznego czynnika etiologicznego. Do bakterii, które mogą stwarzać tego typu problemy diagnostyczne można zaliczyć oportunistyczne gatunki z rodzaju Corynebacterium i pokrewne maczugowate określane jako coryneform. Doniesienia o przypadkach zakażeń ran (8, 16, 17) wywoływanych przez te potencjalnie niepatogenne drobnoustroje stały się podstawą przeprowadzenia niniejszych badań. Celem pracy była analiza przypadków izolacji z ran o różnej lokalizacji, Gram-dodatnich pałeczek oportunistycznych z rodzaju Corynebacterium i pokrewnych maczugowatych (coryneform), które uznano za czynniki etiologiczne zakażenia. MATERIAŁ I METODY Badania obejmowały 4 przypadki zakażonych ran, z których izolowano w postaci monokultury pałeczki maczugokształtne w ilości wskazującej na przyczynę zakażenia. Materiał - wymazy z ran (po amputacji nogi, po złamaniu otwartym, pooperacyjnych, pooparzeniowych, pourazowych) i ropnia okolicy odbytu pobierany był w sposób wykluczający jego kontaminację. W preparacie bezpośrednim z materiału, barwionym metodą Grama, stwierdzano liczne Gram-dodatnie maczugokształtne pałeczki. Hodowle prowadzono na podłożu Columbia Agar z 5% krwią baranią do 7 godzin inkubacji w temp. 37 C, w warunkach tlenowych. Identyfikację przeprowadzano na podstawie cech biochemicznych przy użyciu zestawów APICoryne (program apiweb - biomerieux) oraz dodatkowych testów biochemicznych zawartych w zestawie API ZYM (13) i API NE ( Fenylo-octan i asymilacja N-acetyl-D-glukozaminy) (14). Oznaczenie wrażliwości na antybiotyki wykonano za pomocą Etest (biomérieux) na podłożu Mueller Hinton Agar z 5% krwią baranią (biomerieux) stosując inoculum 1.0 McFarlanda w warunkach tlenowych w temp. 35ºC (4 godziny). Interpretację uzyskanych wartości MIC (µg/ml) dla: penicyliny, ceftriaksonu, cefotaksymu, klindamycyny, erytromycyny, imipenemu, wankomycyny, tetracykliny i trimetoprim/ sulfametoksazolu przeprowadzono wg zaleceń producenta Etest ów dla Corynebacterium sp., zgodnymi z rekomendacjami CLSI dla tej grupy drobnoustrojów (5). Do interpretacji MIC dla teikoplaniny i chloramfenikolu zastosowano rekomendacje CLSI dla Staphylococcus sp. - ze względu na ich brak dla Corynebacterium sp., tak jak stosowali to inni autorzy (10). WYNIKI Na podstawie przeprowadzonych badań wykazano, że najczęściej izolowanym gatunkiem był C. amycolatum (7/4 tj. 9,%). Pozostałe to: C. striatum (4/4 tj. 16,7%), C. grupa G (4/4 tj. 16,7%), Brevibacterium sp. (3/4 tj. 1,5%) oraz po 8,3% (/4): C. jeikeium, C. urealyticum i C. grupa F1 (Tabela I). W oparciu o analizę uzyskanych wartości MIC (Tabela II) stwierdzono występowanie u 83,3% szczepów jednoczesnej oporności na erytromycynę (MIC µg/ml) i klindamycynę (MIC 4 µg/ml), u 75% oporność na kotrimoksazol (MIC 4 µg/ml), u 71,7% oporność na chloramfenikol (MIC 16 µg/ml), u 16,7% na antybiotyki beta-lakatamowe (penicylina MIC 4 µg/ml, ceftriakson MIC 4 µg/ml, cefotaksym MIC 4 µg/ml). Wszystkie szczepy wykazywały wrażliwość na wankomycynę (MIC 0,750 µg/ml ) i teikoplaninę (MIC 0,750 µg/ml).

3 Nr Zakażenia oportunistycznymi maczugowcami 137 Tabela I. Oportunistyczne gatunki z rodzaju Corynebacterium i pokrewne coryneform izolowane z ran Gatunki Corynebacterium i pokrewne coryneform 1 n = 4 Procent 1. C. amycolatum 7 9,. C. striatum 4 16,7 3. C. grupa G 4 16,7 4. Brevibacterium sp ,5 5. C. jeikeium 8,3 6. C. urealyticum 8,3 7. C. grupa F1 8,3 DYSKUSJA Zakażenia ran spowodowane przez drobnoustroje pochodzące z mikroflory kolonizującej skórę zawsze będą budzić wątpliwości, czy można je uznać jako etiologiczny czynnik zakażenia, czy jest to przypadek kolonizacji lub kontaminacji i źle pobranego materiału. Gatunki oportunistyczne z rodzaju Corynebacterium mogą powodować zakażenia ran, jednak nie są to przypadki częste. Jako drobnoustroje o małej wirulencji są izolowane z zakażeń w dużej ilości, a czynnikiem dodatkowo sprzyjającym rozwojowi infekcji jest osłabienie procesów immunologicznych i przewlekły charakter wolno gojącej się rany (3). Wśród analizowanych w pracy przypadków zwraca uwagę fakt, że rany zakażone przez oportunistyczne Corynebacterium sp. powstały w wyniku urazów, oparzeń czy zabiegów chirurgicznych, co sprzyjało przemieszczeniu się bakterii ze skóry w rejon uszkodzonej tkanki. W większości przypadków z pobranego materiału wyhodowano C. amycolatum i C. striatum należące do gatunków, które wymieniane są jako jedne z najczęściej izolowanych z zakażeń u ludzi (1,, 4, 6, 15). Von Graevenitz i wsp. (16) z ran powstałych w wyniku zakażeń protez stawowych i otwartych złamań izolowali głównie C. striatum i C. amycolatum, co również potwierdza udział tych gatunków w zakażeniach. Gatunki te były najczęściej identyfikowane spośród 73 coryneform wyizolowanych z ran 60 badanych pacjentów. Przeprowadzone przez Frank i wsp. (8) badania przewlekłych, otwartych ran wskazują również na udział w zakażeniach Corynebacterium sp. Wśród szczepów uznanych za czynnik etiologiczny, na drugim miejscu po Staphylococcus sp., stwierdzono w 0% przypadków gatunki z rodzaju Corynebacterium (C. striatum, C. amycolatum). Identyfikację wykonano metodą genotypową na podstawie analizy sekwencji rrna, co umożliwiło wykrycie C. striatum również w pobranym materiale biopsyjnym z rany, mimo braku wzrostu w prowadzonej równolegle hodowli. Natomiast wyniki badań mikrobiologicznych żylnych owrzodzeń kończyn (6) wykazały obecność nie tyle monokultury bakteryjnej, co wielogatunkowej struktury wytworzonego biofilmu, w skład którego wchodziły również Corynebacterium sp. Różnorodność występujących drobnoustrojów tlenowych i beztlenowych może uniemożliwiać podjęcie skutecznej antybiotykoterapii, co dodatkowo utrudnia wytworzona struktura biofilmu, niepodatna na działanie antybiotyków.

4 138 A. Olender, I. Łętowska Nr Tabela II. Zakres wartości MIC antybiotyków dla izolowanych z ran oportunistycznych gatunków z rodzaju Corynebacterium i pokrewnych coryneform 1 Antybiotyki C. amycolatum C. striatum C. grupa G Zakres wartości MIC (µg/ml) Brevibacterium sp. 1 C. jeikeium C. urealyticum C. grupa F1 1.Penicylina.Ceftriakson 3.Cefotaksym 4.Klindamycyna 5. Erytromycyna 6. Imipenem 7. Wankomycyna 8. Teikoplanina 9. Tetracyklina 10.Chloramfenikol 11. Trimetoprim/ sulfametoksazol 0,15-56,00 0,500-56,00 0,15-56,00 0,50-56,00 3,00-56,00 0,940-56,00 0,50-0,750 1,00-4,00 1,00-0,15-0,750 0,15-0,750 56,00 56,00 0,094-0,15 1,00-4,00 1,00-0,500-6,00 56,00-56,00 0,094-8,00 0,064-8,00 0,750-56,00 0,500-56,00 0,50-56,00 0,15-0,30 0,500-4,00,00-3,00 0,500; 0,700 4,00; 56,00 4,00; 0,049; 0,15 0,500 1,00-4,00 0,019-0,380 0,15; 0,750 0,500; 0,750 0,500; 0,750 0,500; 1,00 0,750 0,094; 0,30 0,5-0,50 0,5-0,50 0,50 0,50-,00 0,15; 0,750 0,50; 56,00 0,5; 56,00 0,094; 0,15 0,50 0,50 1,00 1,00-

5 Nr Zakażenia oportunistycznymi maczugowcami 139 W naszych badaniach wyniki antybiotykowrażliwości u 83,3% izolowanych z ran szczepów z rodzaju Corynebacterium wskazywały na krzyżową oporność na makrolity, linkozamidy i streptograminy B - mechanizm oporności MLSB konstytutywny. U Corynebacterium sp. mechanizm ten może być związany z obecnością genów ermx oraz równoczesną opornością na inne grupy antybiotyków, co stwierdzono w szczepach izolowanych z zakażeń w środowisku szpitalnym (4,18). Maczugokształtne pałeczki Gram-dodatnie mogą być również przyczyną zakażenia endoprotez ortopedycznych C. massiliense (1), implantu cardiovereter-defibryllator (ICD) - C. xerosis (11), czy implantów piersi Corynebacterium sp. (7). Podsumowując uzyskane wyniki można stwierdzić, że gatunki z rodzaju Corynebacterium mogą powodować zakażenia różnie zlokalizowanych ran, powstałych po amputacji, złamaniach otwartych, pooperacyjnych, pooparzeniowych i pourazowych. Ważnym elementem diagnostyki mikrobiologicznej materiału pobranego z rany jest właściwa interpretacja wyników uzyskanej hodowli tj. wykluczenie kolonizacji i kontaminacji. W celu przeprowadzenia skutecznej antybiotykoterapii należy oznaczyć wrażliwość na antybiotyki określając wartość MIC, przy czym w przypadku gatunków wolnorosnących, lipofilnych (C. jeikeium, C. urealyticum) inkubację należy przedłużyć. Obserwowany wysoki odsetek szczepów jednocześnie opornych na makrolidy i linkozamidy wskazuje na występowanie krzyżowej oporności (MLSB), na co należy zwrócić uwagę przy wyborze antybiotykoterapii. A. Olender, I. Łętowska WOUND INFECTIONS DUE TO OPPORTUNISTIC CORYNEBACTERIUM SPECIES SUMMARY Wound infections are often due to endogenous bacterial flora which penetrates into a site of injury. The establishment of the etiologic agent can be problematic, especially when opportunistic bacteria are present, suggesting contamination of clinical material. Among bacteria that can cause such diagnostic problems are opportunistic Corynebacterium spp. and coryneforms colonizing skin. The aim of the study was to analyze the 4 clinical samples collected from wounds of different location, with Gram positive rods isolated in numbers suggesting the cause of infection. Bacterial identification was performed by API Coryne and additional biochemical tests (API ZYM, API NE). It was detected that the commonest species isolated were: C. amycolatum (9,%), C. striatum (16,7%), C. group G (16,7%) and Brevibacterium spp., C. jeikeium, C. urealyticum, C. group F1. The drug susceptibility testing was performed by E-test method. Among isolated strains, 83.3% were simultaneously resistant to erythromycin and clindamycin. In 75% cases resistance to co-trimoxazole was noted, in 71.7% resistance to chloramphenicol and in 16.7% resistance to beta-lactams were detected. In presented study the high percentage of strains resistant to macrolids and linkosamids (MLSB) was noted. All strains were susceptible to vancomycin and teicoplanin.

6 140 A. Olender, I. Łętowska Nr PIŚMIENNICTWO 1. Blaise G, Arjen MD, Nikkels MD i inni. Corynebacterium associated skin infections. Intern J Dermatol 008; 47: Boltin D, Katzir M, Boguslavsky V, Yalashvili I i inni. Corynebacterium striatum a classic pathogen eluding diagnosis. Eur J Inter Med 009; 0: Bowler PG, Duerdet BI, Armstrong DG. Wound microbiology and associated approaches to wound management. Clin Microbiol Rev 001; 14: Campanile F, Carretto E, Barbarini D i inni. Clonal multidrug-resistant Corynebacterium striatum strains Italy. Emerg Infect Dis 009; 15: Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI). Methods for Antimicrobial Dilution and Disk Susceptibility Testing of Infrequently Isolated or Fastidious Bacteria; (ISBN ), 009; M45-A, Vol. 6, No Coyle MB, Lipsky BA. Coryneform bacteria in infectious diseases: clinical and laboratory aspects. Clin Microbiol Rev 1990; 3: Del Pozo JL, Tran NV, Petty PM i inni. Pilot study of association of bacteria on breast implants with capsular contracture. J Clin Microbiol 009; 47: Frank DN, Wysocki A, Specht-Glick DD i inni. Microbial diversity in chronic open wounds. Wound Rep Reg 009; 17: Funke G, von Graevenitz A, Clarridge JEII. Clinical microbiology of coryneform bacteria. Clin Microbiol Rev 1997; 10: Johnson AP, Mushtaq S, Warner M, Livermore DM. Activity of daptomycin against multi-resistant Gram-positive bacteria including enterococci and Staphylococcus aureus resistant to linezolid. Int J Antimicrob Agents 004; 4: Marti J, Anton E, Idoate A. Implantable cardioverter-defibrillator infection due to Corynebacterium xerosis. Int J Card 008; 18: 1-1. Merhej V, Falsen E, Raoult D i inni. Corynebacterium timonense sp. nov. and Corynebacterium massilense sp. nov., isolated from human blood and human articular hip fluid. Int J Syst Evol Microbiol 009; 59: Renaud FNR, Gregory A, Berreau C i inni. Identification of Turicella otitidis isolated from a patient with otorrhea associated with surgery: differentiation from Corynebacterium afermentans and Corynebacterium auris. J Clin Microbiol 1996; 34: Renaud FNR, Dutaur M, Daoud S i inni. Differention of Corynebacterium amycolatum, C. minutissimum, and C. striatum by carbon substrate assimilation tests. J Clin Microbiol 1998; 36: Superti SV, Martins DS, Caierao J i inni. Corynebacterium striatum infecting a malignant cutaneous lesion: the emergence of an opportunistic pathogen. Rev Inst Med Trop S Paulo 009; 51: Von Graevenitz A, Frommelt L, Punter-Streit V i inni. Diversity of coryneforms found in infections following prosthetic joint insertion and open fractures. Infection 1998; 6: Wolcott RD, Gontcharova V, Sun Y i inni. Evaluation of the bacterial diversity among and within individual venous leg ulcers using bacterial tag-encoded FLX and Titanium amplicon pyrosequencing and metagenomic approaches. BMC Microbiology 009; 9: Yague Guirao G, Mora Peris B, Martinez-Toldos MC i inni. Implication of ermx genes in macrolide- and telithromycin-resistance in Corynebacterium jeikeium and Corynebacterium amycolatum. Rev Esp Quimioterap 005; 3: Otrzymano: 13 III 010 r. Adres Autora: Lublin, ul. W. Chodźki 1, Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej, Uniwersytet Medyczny w Lublinie