Zgodnie z ogólnie przyjętą konwencją, geny na schematach przedstawia się od lewej do prawej, w kierunku transkrypcji. Nić DNA z taką samą sekwencją

Transkrypt

1 Zgodnie z ogólnie przyjętą konwencją, geny na schematach przedstawia się od lewej do prawej, w kierunku transkrypcji. Nić DNA z taką samą sekwencją nukleotydów jak RNA, tzw. nić kodującą, pokazuje się u góry, 5 końcem po lewej i 3 końcem po prawej; dla wygody pokazuje się często tylko ją. Nić DNA komplementarną do mrna nazywa się nicią matrycową, bo służy jako matryca w procesie transkrypcji. Termin odcinek (sekwencja) po stronie 5 lub 3 - odnosi się do sekwencji nukleotydowych, odpowiednio, poprzedzających i następujących po regionie kodującym.

2 geny mają różną orientację

3 holoenzym prokariotycznej pol RNA, RNAP, 465 kda: rdzeń zdolny do elongacji transkrypcji, α 2 ββ α 40 kd gen rpoa składanie enzymu β 155 kda gen rpob wiązanie nukleotydu β 160 kda, gen rpoc wiązanie matrycy podjednostka σ niezbędna do inicjacji transkrypcji (32-90 kda, σ 70 gen rpod), rozpoznaje i specyficznie wiąże elementy promotora : elem. -10 i -35

4 C-terminalna domena (CTD) podjednostki α prokariotycznej pol RNA oddziałuje zarówno z wyżej położonymi specyficznymi sekwencjami regulatorowymi (UP) w DNA jak i białkowymi aktywatorami

5 rodzaje podjednostek σ gen specyficzność sekw. -35 odstęp sekw. -10 σ 70 rpod ogólna TTGACA pz TATAAT σ 32 rpoh szok cieplny CCCTTGAA pz CCCGATNT σ 28 flia wić CTAAA 15 pz GCCGATAA σ 54 rpon głód azotowy CTGGNA 6 pz TTGCA

6 aktywatory podjedn. σ 54 wiążą się daleko (nawet ³kb) powyżej m-sca +1 dla genu syntetazy glutaminy (glna) aktywatorem σ 54 jest NtrC!!! Stillman/bi221/102700/notes.htm

7 pol RNA E. coli z lewej rdzeń po prawej holoenzym Images from analysis by Seth Darst.

8 terminacja transkrypcji u Prokariota niezależna zależna od rho s /week12/week12/img5.gif /chroms-genes-prots/rho-polarity.html

9 NEGATYWNA I POZYTYWNA REGULACJA OPERONU LAC CRP i represor lac są białkami HTH CRP-cAMP i RNAP działają kooperatywnie w wiązaniu do promotora

10 Podwójna regulacja operonu trp - represja przez represor aktywowany korepresorem (trp) Lehninger, Biochemistry, 2000

11 Podwójna regulacja operonu trp - represja przez represor aktywowany korepresorem (trp) - atenuacja transkrypcji Lehninger, Biochemistry, 2000

12 w operonie ara to samo białko AraC działa jako represor lub aktywator zależnie od obecności arabinozy, która zmienia jego konformację

13 obecność białek antyterminatorowych pozwala RNAP kontynuować transkrypcję poza terminator tak regulowana jest kaskada wczesnych, opóźnionych i późnych genów w cyklu litycznym faga λ

14 obecność białek antyterminatorowych pozwala RNAP kontynuować transkrypcję poza terminator tak regulowana jest kaskada wczesnych, opóźnionych i późnych genów w cyklu litycznym faga λ

15 porównanie transkrypcji pro- i eukariotycznej BAKTERIE ZWIERZĘTA jednostka transkrypcyjna policistronowa monocistronowa (?!) inicjacja pol RNA wiąże się do DNA szybkość elongacji ~ 40 nt/s ~ 40 nt/s 5 koniec ppp metylowana czapeczka tworzenie 3 końca terminacja uwalnia RNA cięcie uwalnia RNA 3 koniec ostatni kodowany nukleotyd poly(a) transport niepotrzebny niezbędny translacja ~ 45 nt/s ~ 20 nt/s półokres trwania mrna <5 min >4 godz ilość rybosomów/mrna >20 >10

16 czas PROKARIOTA EUKARIOTA 0 pol RNA wiąże się do DNA i rozpoczyna transkrypcję 0,5 ukazuje się wolny koniec 5 rybosomy łączą się z mrna rozpoczyna się translacja <1 modyfikacja 5 końca hnrna natychmiast po jego powstaniu 1,5 rybosomy podążają za pol RNA z podobną szybkością, za nimi postępuje degradacja 5 końca mrna 2 terminacja transkrypcji, uwolnienie mrna z bąbelka transkrypcyjnego 3 degradacja postępuje w kierunku 3 końca w miarę jak rybosomy kończą 5 polrna nie terminuje, lecz kontynuuje transkrypcję poza koniec genu 6 w wyniku cięcia endonukleolitycznego powstaje 3 koniec hnrna 25 dodanie poly(a) do 3 końca, usuwanie intronów (o ile nie zostały usunięte podczas transkrypcji) >4 h transport do cytoplazmy, translacja na rybosomach

17 procesy transkrypcji i dojrzewania transkryptu są sprzężone Orphanides i Reinberg 2002 Cell 108:

18 porównanie homologii podjednostek pol RNA pro- i eukariotycznych Lodish i in., 2000 Molecular Cell Biology, 4th ed. New York: W. H. Freeman

19 inicjacja transkrypcji u Eukariota wymaga * odpowiedniej pol RNA * jej ogólnych czynników transkrypcyjnych (TFI, II, III) * specyficznych czynników transkrypcyjnych (np. SRB) * oddziałujących z nimi i pol RNA mediatorów, kompleksów HAT (np. SAGA) i kompleksów remodelujących (np. SWI/SNF) Adapted from: Holstege et al Cell 95:

20

21

22 wiązanie ogólnych czynników transkrypcyjnych UBF i SL1 do promotora dla pol I RNA

23 terminacja transkrypcji przez pol I RNA 4-etapowy proces: (i) (ii) (iii) (iv) czynnik TTF-I wiąże element Sal Box na matrycy to powoduje pauzowanie pol I RNA co umożliwia czynnikowi PTRF (ang. Polymerase I and transcript release factor) oddziaływanie z potrójnym kompleksem i powoduje uwolnienie pre-rrna, pol I RNA i TTF-I

24 pol III RNA największa jądrowa pol RNA kd typy promotorów dla po III RNA 5S rrna trna U6 snrna, 7SK RNA PSE ang. proximal sequence element ICR ang. internal control region wiązanie TFIIIA, B, C i pol III RNA do promotorów Schramm & Hernandez 2002 Genes & Dev 16:

25 dir2.nichd.nih.gov/.../maraia%20page2.html terminacja transkrypcji przez pol III RNA

26 dwie ogólne części promotora dla pol II RNA sekwencja konsensusowa elem. TATA (Lodish et al., 2000).

27 m-sca wiązania tych samych czynników transkrypcyjnych występują w różnych kombinacjach w promotorach i enhancerach różnych genów zachowywaniu sekwencji kodujących nie towarzyszy konserwowanie promotorów Levin Genes VIII Pericuesta i in Reprod Biol & Endocrinol 4:5

28

29 CTD (domena C-końcowa, ang. C-terminal domain) największej podjedn. pol II RNA koordynuje transkrypcję i dojrzewanie pre-mrna zawiera powtórzenia (drożdże 26, ssaki 52) heptapeptydu (Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser) Ser i Thr są substratami dla kinaz m.in. TFIIH, ich fosforylacja aktywuje pol II RNA, CTD jest też miejscem wiązania licznych białek zw. srb lub mediatorami Orphanides, Reinberg 2002 Cell 108:

30 etapy inicjacji transkrycji przez pol II RNA Lodish i in Molecular Cell Biology. WH Freeman & Co

31

32 Orphanides, Reinberg 2002 Cell 108: NELF (ang. negative elongation factor) i DSIF (ang. 5,6-dichloro-1-D-ribofuranosylbenzimidazole sensitivity-inducing factor) są składnikami N-TEF (ang. negative transcription elongation factor). Enzymy dodające czapeczkę wiążą się poprzez oddziaływanie z P Ser5 CTD i DSIF. P-TEFb (ang. positive transcription elongation factor b) złożony z kinazy Cdk9 i jednej z cyklin CycT1, CycT2 lub CycK fosforyluje DSIF (N-TEF się odłącza) i Ser2 CTD.

33 dojrzewanie 5 końca transkryptów pol II RNA etapy dodawania 7mG czapeczki (ang. cap, capping) 5 pppnpnp Pi ppnpnp GTP PPi GpppNpNp CH 3 -GpppNpNp CH 3 -GpppNpNp CH 3 3 fosfataza transferaza guanylowa 7-metylo transferaza guaniny 2-O-metylo transferaza

34 rodzaje 7mG czapeczek czapeczkowanie zachodzi gdy transkrypt ma ok. 25 nt do struktury cap wiąże się CBC (ang. cap binding complex) złożony z białek CBP20 i CBP80 cap zabezpiecza przed 5 RNazami (dzięki wiązaniu 5-5 ), jest wymagana do eksportu z jądra i wiązania rybosomów w cytoplazmie, stymuluje poliadenylację i splicing Większość snrna jest syntetyzowana przez pol II RNA i standartowo czapeczkowana w jądrze. Po przejściu do cytoplazmy wiążą specyficzne białka, ich cap jest dodatkowo modyfikowana i staje się (2,2,7)m 3 G, po czym są reimportowane do jądra /.../EukaryoticTranscription.html

35 dojrzewanie 3 końca transkryptów pol II RNA * cięcie i poliadenylacja * użycie alternatywnych miejsc poliadenylacji * dojrzewanie pre-mrna histonów przy udziale U7 snrnp * różnice dodawania poly(a) u drożdży

36 cięcie i poliadenylacja DNA 5'...AATAAA..(20 zasad)..ca...ttgtgtgttg..3' 3'...TTATTT...GT...AACACACAAC..5' RNA 5'...AAUAAA.(20 zasad)...ca...uuguguguug..3' sygnał poliadenylacji m-sce cięcia m-sce dodania poly (A) region bagaty w GU Lodish i in Molecular Cell Biology. WH Freeman & Co CPSF (ang. cleavage and polyadenylation specificity factor) wiąże sekw. AAUAAA, 4 podjedn. (160, 100, 70, 30 kda), CstF (ang. cleavage stimulation factor) wiąże region bogaty w GU, 3 podjedn. (77, 64, 50 kda) CFI (ang. cleavage factor I) 3 podjedn. ( kda albo (68 lub 59) kda) CFII (ang. cleavage factor II) wiąże CFI i CPSF, 2 podjedn. (200, 47 kda) PAP (ang. poly(a) polymerase) 82 kda, ma 3 formy wynikające z alternatywnego splicingu (PAP I, PAP II, PAP III), może działać powoli lub szybko, być może regulowana fosforylacją 33 kda PABPII (ang. poly(a) binding protein II), co indukuje szybkie działanie PAP ( w cytoplazmie PABPII jest zastępowane cytoplazmatycznym 70 kda PAB I)

37 CPSF CstF '-GpppG AAUAAA G/U 3' 160 CPSF CstF 64 5'-GpppG AAUAAA 77 G/U 3' 160 CPSF CstF 64 5'-GpppGAAUAAA 77 G/U 3' 160 PAP 82 CFI CFII sphere.bioc.liv.ac.uk:8080/bio/studyweb/modules/biol402/lectures/dr_turner/lecture02

38 CPSF etap 1 - cięcie CstF 64 5'-GpppG AAUAAA 77 G/U 3' 160 PAP 82 CFI CPSF CFII 30 cleavage CstF '-GpppG AAUAAA G/U 3' 160 PAP 82 CFI CFII 5'-GpppG etap 2 - poliadenylacja sphere.bioc.liv.ac.uk:8080/bio/studyweb/modules/biol402/lectures/dr_turner/lecture02 PAB II AAAA A PAB II 30 A A A A A PAB II A AAUAAA A AA PAB II 160 PAP 82 PAB II A AAAAA A A PAB II AAAAAA AA PAB IIPAB II

39 sprzężenie czynników transkrypcji i poliadenylacji od momentu tworzenia PIC udokumentowane interakcje białko-białko Calvo i in.2003 Genes Dev 17:

40 użycie alternatywnych miejsc poliadenylacji zróżnicowana ekspresja białek wiążących RNA gen reduktazy dihydrofolianowej (DHFR) ma 7 m-sc poly(a) rozciągniętych na > 5 kb, transkrypcja zachodzi poprzez nie wszystkie i kończy się 1 kb poniżej ostatniego w przypadku genu kalcytoniny/cgrp użycie alternatywnych miejsc poliadenylacji jest ściśle powiązane z alternatywnym splicingiem

41 Phillips i in EMBO J 20: alternatywny splicing & poliadenylacja są też powiązane ze sobą w przypadku dojrzewania transkryptów genu IgM w komórkach B jest wysoki poziom białka hnrnp F(H,H'), które wiąże się do (GU) n i jest negatywnym regulatorem użycia sec-pa poprzez blokowanie wiązania tam CstF64 w komórkach plazmatycznych poziom hnrnp F(H,H') jest niski a zdolność wiązania CstF64 wysoka Veraldi i in Mol & Cell Biol 21:

42 dojrzewanie 3 końca pre-mrna histonów cięcie bez poliadenylacji pre-mrna histonów tworzy blisko 3 końca strukturę stem-loop, poniżej niej zawiera sekw. komplementarną do U7 snrna - parowanie pre-mrna z U7 snrnp wyznacza m-sce cięcia przez CPSF-73 poprzez kontakt pomiędzy białkami Sm proteins i podjedn. CstF Białka SM, wspólne z spliceosomalnymi snrnp, zaznaczono na niebieskozielono, a na niebiesko Lsm10 i Lsm11 specyficzne dla U7 Kolev i Steitz 2005 Genes Dev 19: