Genetyka. Krótkie wykłady H. Fletcher, I. Hickey, P. Winter,

Transkrypt

1 Genetyka. Krótkie wykłady H. Fletcher, I. Hickey, P. Winter, Wydanie trzecie, zmienione, Wydawnictwo Naukowe PWN 2011 Genetyka ogólna. Skrypt do ćwiczeń dla studentów biologii A. Sadakierska-Chudy, G. Dąbrowska, A. Goc Wydawnictwo: Uniwersytet Mikołaja Kopernika, Toruń,

2 Trzy wielkie działy genetyki: GENETYKA GENETYKA GENETYKA KLASYCZNA MOLEKULARNA EWOLUCYJNA

3 GENETYKA GENETYKA GENETYKA KLASYCZNA MOLEKULARNA EWOLUCYJNA (Mendel 1866) (Watson & Crick 1953) (Darwin-Wallace 1858)

4 Darwin C. R. and Wallace A. R On the tendency of species to form varieties; and on the perpetuation of varieties and species by natural means of selection. Journal of the Proceedings of the Linnean Society of London. Zoology 3:

5 Darwin sformułował cztery główne twierdzenia: * świat istot żywych nie jest niezmienny * proces zmian jest ciągły i stopniowy * wszystkie gatunki są ze sobą spokrewnione * zmiany ewolucyjne są wynikiem doboru naturalnego. Dwie pierwsze tezy zostały (po fali niemerytorycznych dyskusji) przyjęte jeszcze za życia Darwina. Niezbitych dowodów na potwierdzenie trzeciej dostarczyła dopiero biologia molekularna. Teza czwarta zyskała potwierdzenie dzięki badaniom ekologicznym i biogeograficznym. Do sformułowania współczesnej teorii ewolucji, opartej na przemyśleniach Darwina, ale adekwatnej do stanu wiedzy w wieku XX, wybitnie przyczynił się Theodosius Dobzhansky swoją syntezą ewolucjonizmu Darwina z genetyką mendlowską opublikowaną w książce Genetics and the Origin of Species (1937).

6 przyklasztorny ogródek, w którym Mendel uprawiał groszek, zdjęcie z r plac Mendla w Brnie

7 W latach Mendel * przetestował ok roślin grochu, * badał 7 cech, * z których każda miała dwie łatwo rozróżnialne formy. Innowacją było * użycie czystych linii, * zliczanie otrzymanych form potomstwa * analiza statystyczna wyników. Podsumowanie zostało zawarte w dwu wykładach, które

8 wygłosił po niemiecku 8 lutego i 8 marca 1865 r. na zebraniach Towarzystwa Historii Naturalnej w Brnie w budynku Kolegium Technicznego, ul. Jánská 22. Na budynku znajduje się plakietka upamiętniająca to wydarzenie.

9 Swoje wyniki opisał też w w długim artykule Versuche uber Pflanzenhybriden opublikowanym w sprawozdaniach tegoż Towarzystwa zatytułowanych Verhandlungen des naturforschenden Vereins w r Rozesłano 115 egzemplarzy, jeden do biblioteki Darwina. Darwin nawet nie rozciął kartek artykułu Mendla, choć przeczytał inne artykuły tego czasopisma.

10 Watson & Crick 1953

11 Odkryta przez Watsona i Cricka struktura DNA - podwójna spirala komplementarnych nici, którą charakteryzuje - kolejność/sekwencja nukleotydów ATCG, - zasada komplementarności A-T i G-C i obu nici, - zdolność do replikacji/powielania identycznych cząsteczek * zapewnia WIERNOŚĆ przekazywania cech (zarówno ogólnych charakterystycznych dla danego gatunku, jak i specyficznych gwarantujących podobieństwo między organizmami spokrewnionymi) * umożliwia też ZMIENNOŚĆ cech (co służy zachowaniu życia na Ziemi, umożliwia przystosowanie organizmów do warunków środowiska i ewolucję gatunków)

12 GENETYKA GENETYKA GENETYKA KLASYCZNA MOLEKULARNA EWOLUCYJNA prawa Mendla struktura i chemia DNA genetyka ilościowa mejoza i mitoza replikacja DNA prawo Hardy ego-weinberga determinacja płci transkrypcja przewidywanie równowagi sprzężenie z płcią translacja ewolucja mapowanie chromosomów klonowanie DNA specjacja cytogenetyka (zmiany chromosomowe) kontrola ekspresji genów mutacje i naprawa DNA dziedziczenie pozachromosomowe epigenetyka

13 GENETYKA nauka o dziedziczeniu, czyli przekazywaniu cech z pokolenia na pokolenie. * przekazywanie cech - wynik przekazywania DNA (a u niektórych wirusów RNA) * w DNA (genomowym RNA wirusów) - informacja o cechach danego organizmu * jednostka informacji genetycznej - gen

14 Przekazywanie cech/dna/genów z pokolenia na pokolenie * Organizmy rozmnażające się bezpłciowo - przed podziałem komórki zachodzi powielenie DNA do dwu identycznych kopii, obie komórki potomne obdarzane są identycznym DNA (wynik równego podziału chromosomów siostrzanych w mitozie), są klonami. * Organizmy rozmnażające się płciowo - przed powstaniem gamet zachodzi powielenie DNA do dwu identycznych kopii i redukcja liczby chromosomów (wynik rozdzielenia par chromosomów homologicznych w I podziale mejotycznym), każdy z rodziców przekazuje potomkowi połowę swoich genów, wśród nich mogą być różne proporcje genów babci i dziadka. Pełna informacja o cechach jednego człowieka to ok. 25 tys. genów przy takim przetasowywaniu genów, jakie ma miejsce w trakcie rozmnażania płciowego, każdy osobnik (za wyjątkiem bliźniąt jednojajowych) ma niepowtarzalny DNA i niepowtarzalny zestaw cech swoich przodków.

15 Definicja genu 1866 wg Mendla determinanta (gen) kontroluje jedną cechę fenotypową np. kolor kwiatu u grochu. (1909 Wilhelm Johannsen wprowadził termin gen) Ponad 30 lat później definicja sformułowana przez Mendla została ulepszona przez George a W. Beadle a i Edwarda L. Tatuma do postaci jeden gen - jeden enzym. Ponieważ wiele enzymów składa się z dwu lub więcej peptydów, z których każdy jest kodowany przez odrębny gen, ostateczna wersja brzmi jeden gen - jeden polipeptyd.

16 Długo uważano, że rekombinacja zachodzi pomiędzy genami, a więc, że gen jest też jednostką rekombinacji. Clarence Oliver opublikował w 1940 wyniki świadczące o o zachodzeniu rekombinacji wewnątrz genu lozenge Drosophila. We wczesnych 1940-tych Edward B.. Lewis opracował test komplementacji (cis-trans). Test pozwala określić czy dwie mutacje wpływające na ten sam fenotyp zaszły w tym samym genie czy dwu różnych genach. Wykorzystał go Seymour Benzer do eksperymentalnego zdefiniowania genu (cistronu) u faga T4, do którego w dalszym ciągu pasuje określenie jeden gen - jeden polipeptyd. W 1960-tych doświadczenia Charlesa Yanofsky ego, Sydney a Brennera i wsp. wykazały, że gen można definiować jako ciągłą sekwencję par nukleotydów kodującą kolinearną sekwencję aminokwasów w jego polipeptydowym produkcie. Koncepcję tę zburzyło odkrycie genów zachodzących na siebie i genów wewnątrz genów (późne 1960) oraz odkrycie, że sekwencja kodująca eukariotycznych genów jest poprzerywana niekodującymi intronami (późne 1970). Co więcej, niektóre geny, np. immunoglobulin, są w chromosomach komórek linii zarodkowej zapisane w postaci licznych krótkich segmentów składanych do dojrzałego funkcjonalnego genu w trakcie rozwoju.

17 sformułowanie jednej spójnej definicji molekularnej genu nie jest proste ze względu na istnienie: * 5 i 3 UTRów (ang. untranslated region) * intronów (genów podzielonych) typowy gen prokariotyczny typowy gen eukariotyczny

18 sformułowanie jednej spójnej definicji molekularnej genu nie jest proste ze względu na istnienie: * 5 i 3 UTRów * intronów (genów podzielonych) * alternatywnego składania mrna Pojedynczy gen, który podlega alternatywnemu składaniu eksonów może kodować rodzinę blisko spokrewnionych peptydów.

19 sformułowanie jednej spójnej definicji molekularnej genu nie jest proste ze względu na istnienie: * 5 i 3 UTRów * intronów (genów podzielonych) * alternatywnego składania mrna * zjawiska transsplicingu * sekwencji regulatorowych czasem oddalonych o tysiące pz od kontrolowanego genu * genów zachodzących na siebie * genów w genach * genów złożonych ze segmentów i wymagających rearanżacji by powstał gen funkcjonalny

20 Funkcjonalne geny łańcuchów lekkich i ciężkich immunoglobulin oraz receptorów T powstają w trakcie rozwoju limfocytów B lub T w wyniku rearanżacji (somatycznej rekombinacji) segmentów DNA

21 gen - odcinek DNA niosący informację o budowie * jednego polipeptydu (czasem rodziny blisko spokrewnionych polipeptydów tzw. izoform) lub * jednego rodzaju funkcjonalnego (niekodującego) RNA (rrna,trna,snrna,snorna,mirna...)

22 Zgodnie z ogólnie przyjętą konwencją, geny na schematach przedstawia się od lewej do prawej, w kierunku transkrypcji. Nić DNA z taką samą sekwencją nukleotydów jak RNA, tzw. nić kodującą, zapisuje się u góry, 5 końcem po lewej i 3 końcem po prawej; dla wygody pokazuje się często tylko ją. Nić DNA komplementarną do mrna nazywa się nicią matrycową, bo służy jako matryca w procesie transkrypcji. Termin odcinek (sekwencja) po stronie 5 lub 3 - odnosi się do sekwencji nukleotydowych, odpowiednio, poprzedzających i następujących po regionie kodującym. Miejsce startu transkrypcji oznacza się +1 i strzałką wskazującą kierunek transkrypcji.

23 realizacja informacji zawartej w genach ekspresja genów istnieje wiele poziomów regulacji aktywności genu i jego produktu stąd, między innymi, istnieje potrzeba rozróżniania genotypu i fenotypu

24 poziomy regulacji aktywności genu i jego produktu u Procaryota: * inicjacja transkrypcji: ** dostępność promotora lub związanie aktywatora z operatorem (obecność czynników wiążących UE/UP) ** obecność właściwej podjednostki σ * inicjacja translacji (obecność białek wiążących się do sekwencji Shine-Dalgarno) * terminacja transkrypcji (attenuacja, obecność białek antyterminatorowych)

25 poziomy regulacji aktywności genu i jego produktu u Eucaryota: * struktura chromatyny (po części tkankowo specyficzna): położenie genu w obrębie chromosomu - efekt pozycji, miejsca przyczepu do macierzy jądrowej, metylacja DNA, modyfikacje histonów (de/acetylacja, metylacja, fosforylacja, ubikwitynacja), remodelowanie chromatyny * czynniki transkrypcyjne * stymulacja hormonalna * inicjacja transkrypcji (siła promotora, obecność wzmacniaczy i wyciszaczy) * dojrzewanie i modyfikacja transkryptu (metylacja i cięcie, dodanie czapeczki, składanie mrna w tym alternatywny splicing i transsplicing, poliadenylacja, redagowanie RNA) * stabilność mrna * transport RNA do cytoplazmy * translacja * potranslacyjne modyfikacje (obróbka proteolityczna polipeptydu, fałdowanie, glikozylacja, acetylacja, tworzenie mostków dwusiarczkowych ) * lokalizacja wewnątrzkomórkowa * tworzenie z podjednostek holoenzymu * fosforylacja peptydu * stabilność peptydu

26 promotor genu - miejsce wiązania pol RNA i inicjowania transkrypcji u Prokariota promotor * bezpośrednio poprzedza miejsce startu transkrypcji * składa się z elementu 10 (bogatego w A-T) i elementu Region -10 TATA Box Polimerazy RNA składają się z wielu podjednostek. U bakterii za specyficzne rozpoznawanie elementów 10 i 35 promotora odpowiada podjednostka σ. Po połączeniu pierwszych 8-9 rybonukleotydów podjednostka σ odłącza się od rdzenia polimerazy, który przeprowadza elongację transkrypcji. Komórka bakteryjna jest wyposażona w kilka podjednostek σ kodowanych przez odrębne geny i rozpoznających inne specyficzne sekwencje nukleotydowe elementów 10 i 35.

27 Terminacja transkrypcji u Prokariota zachodzi, gdy na skutek wewnątrzmolekularnego parowania 3 koniec transkryptu tworzy strukturę szpilki do włosów, za którą występuje region bogaty w U. Niekiedy do terminacji potrzebny jest specjalny białkowy czynnik rho.

28 Słabe promotory to takie, które są słabo rozpoznawane i wiązane przez polimerazę RNA. (O sile promotora decyduje skład nukleotydowy sekwencji 10 i 35.) Słabe promotory stają się w pełni funkcjonalne dzięki białkom aktywatorom, które, wiążąc się jednocześnie z pobliską sekwencją DNA zwaną UE/UP i polimerazą RNA, stabilizują wiązanie polimerazy do promotora i ułatwiają rozpoczęcie transkrypcji.

29 wspólna regulacja transkrypcji prokariotycznych genów kodujących funkcjonalnie powiązane ze sobą białka dzięki policistronowym jednostkom transkrypcyjnym - operonom operon laktozowy 1) region promotora lac 2) transkrypcja operonu zachodzi - wiązanie pol RNA i inicjacja transkrypcji możliwe dzięki temu, że białko represorowe nie okupuje operatora, a białko CAP/CRP wiąże rozpoznawaną przez siebie sekwencję regulatorową 3) i 4) represja przez wiązanie tetramerowego represora Lac do O1 i O3 (pol RNA nie może wiązać się do promotora) lub O1 i O2 (pol RNA może się wiązać do promotora, ale jest blokowana przez represor)

30 sekwencje operonu lac, które wiążą pol RNA, camp/crp i represor lac

31 represja poprzez wypętlenie DNA tetramerowy represor lac wiąże się do O1 i O3 tworząc pętlę DNA (z pomocą CRP, które zagina DNA)

32 Regulacja operonu laktozowego: negatywna (represja operonu laktozowego) przyłączenie represora do operatora uniemożliwia wiązanie pol RNA i zachodzenie transkrypcji pozytywna (represja kataboliczna) związanie kompleksu białko CAP-cAMP (camp/crp) do położonego powyżej operatora miejsca wiązania CAP (CRP) umożliwia (w obecności induktora, laktozy, usuwającego represor z operatora) indukcję operonu laktozowego tj. jego transkrypcję Represja kataboliczna, faworyzująca glukozę jako źródło węgla, dotyczy również operonów galaktozowego i arabinozowego, które także posiadają miejsce wiązania aktywatora CAP-cAMP.

33 operon tryptofanowy skupia 5 genów struktury białek biosyntezy trp Komórkowy poziom tryptofanu decyduje o aktywności represora tryptofanowego, który jest białkiem allosterycznym: przyłączenie tryptofanu powoduje subtelne zmiany w jego trójwymiarowej strukturze, umożliwiające mu związanie się z DNA operatora O trp i represję operonu. represja pol RNA transkrypcja aporepresor (monomer) aporepresor (monomer) aporepresor (dimer) aporepresor (dimer)

34 Operon tryptofanowy podlega dodatkowemu mechanizmowi kontroli transkrypcji zwanemu atenuacją. [Wykorzystuje on fakt, że u bakterii transkrypcja i translacja są ze sobą ściśle przestrzennie i czasowo powiązane: rybosomy przyłączają się do końca 5 mrna tuż po inicjacji transkrypcji i rozpoczynają translację.]

35 na 5 końcu mrna tryptofanowego, przed sekwencją genów strukturalnych, znajduje się tzw. odcinek liderowy trpl zawierający: krótką otwartą ramkę odczytu (ORF, tj. sekwencję mającą w tej samej fazie odczytu kodon startowy AUG i któryś z kodonów stop) licząca 14 kodonów, dwa spośród nich kodują tryptofan cztery regiony (1,2,3,4) zdolne do tworzenia dwu wzajemnie wykluczających się struktur szpilek do włosów (za regionem 4) ciąg urydyn, który wraz ze strukturą szpilki do włosów utworzoną przez regiony 3 i 4 stanowi terminator transkrypcji, miejsce które spowalnia polimerazę RNA, osłabia jej wiązanie do matrycy DNA i powoduje jej odpadnięcie Małe stężenie tryptofanu Duże stężenie tryptofanu Rybosom zatrzymuje się na kodonach trp transkrypcja jest kontynuowana region liderowy podlega całkowitej translacji utworzenie struktury szpilki do włosów prowadzi do terminacji transkrypcji rybosom odłącza się przy kodonie STOP

36 Szybkość, z jaką rybosom dokonuje translacji odcinka liderowego, może być, w zależności od chwilowej dostępności tryptofanu, różna dla każdego transkryptu. Pozwala to na precyzyjne regulowanie poziomu transkrypcji genów strukturalnych operonu trp. Represor trp decyduje o inicjacji transkrypcji, zaś atenuacja o jej elongacji. Oba sposoby regulacji zależą od stężenia tryptofanu w komórce. Przynajmniej 6 operonów kodujących enzymy odpowiedzialne za syntezę innych aminokwasów podlega atenuacji. Operon fenyloalaninowy, podobnie jak trp, jest regulowany zarówno przez represję jak i atenuację. Inne operony, takie jak histydynowy, leucynowy czy treoninowy, podlegają tylko atenuacji transkrypcji.