Genetyka molekularna Prokaryota

Transkrypt

1 1 Genetyka molekularna Prokaryota

2 Genomy bakterii i archeonów Od 0,5 (mykoplazmy) do ~ 5 Mb Wyjątkowo 9 Mb (Bradyrhizobium japonicum) 13 Mb (Sorangium cellulosum) archeony z reguły 1,5-2,5 Mb Gęste upakowanie genów (~1 gen/kb) Krótkie obszary międzygenowe i regulatorowe Tylko sporadycznie występują introny Kodowane białka krótsze, niż u Eukaryota Tworzy z białkami upakowaną strukturę nukleoidu 2

3 Gęste upakowanie genomu E. coli Figure 8.6 Genomes 3 ( Garland Science 2007)

4 Nukleoid bakterii Figure 8.1 Genomes 3 ( Garland Science 2007)

5 Upakowanie DNA Figure 8.3 Genomes 3 ( Garland Science 2007)

6 Organizacja genomu Typowa pojedynczy chromosom kolisty Możliwe liczne warianty Więcej cząsteczek kolistych Cząsteczki liniowe Chromosomy i plazmidy Figure 8.5 Genomes 3 ( Garland Science 2007) Plazmidy mogą być koliste lub liniowe Z reguły mniejsze od chromosomów, ale mogą być bardzo duże (megaplazmidy) Plazmidy zwykle są opcjonalne, mogą też występować u wielu gatunków Rozróżnienie chromosomy zawierają geny metabolizmu podstawowego, niezbędne do życia, plazmidy nie. 6

7 Ewolucyjna zmienność Prokaryota Przy podobnej liczbie genów ogromna różnorodność zestawu genów Duże różnice między szczepami np. E. coli O157:H7 vs. E. coli K12 - ~1300 genów w O nie w K i ~500 w K nie w O(!) Częsty poziomy transfer genów (do kilkunastu procent genomu), nawet między odległymi gatunkami Problem definicji gatunku 7

8 Genomika porównawcza bakterii sposobem poznania ich fizjologii Bakterie mają genomy podobnej wielkości, mieszczące genów Około połowy genomu tworzą rodziny podobnych genów powstałych przez powielenie (duplikację) tzw. rodziny paralogów To, które geny są powielone świadczy o kierunku specjalizacji ewolucyjnej bakterii

9 Genomika porównawcza bakterii sposobem poznania ich fizjologii H. influenzae heterotrof pasożytniczy powielone geny kodujące białka rozkładające różne związki organiczne Methanococcus janaschii chemoautotrof powielone geny kodujące enzymy szlaków biosyntetycznych Pseudomonas aeruginosa groźny patogen oporny na wiele leków i szybko dostosowujący się do zmian środowiska powielone geny kodujące białka usuwające antybiotyki, rozkładające substancje organiczne, umożliwiające zagnieżdżanie się w powierzchniach. 9

10 Droga od DNA do bia ka Ekspresja genów jest najważniejszym dla funkcjonowania komórek i organizmów procesem Ekspresja genów składa się z wielu złożonych etapów, z których kazdy może podlegać regulacji 10

11 Centralna hipoteza ( dogmat ) DNA RNA BIAŁKO 11

12 Ekspresja genów prokariotycznych Prokaryota dominuje regulacja na poziomie transkrypcji policistronowe jednostki transkrypcyjne o wspólnej regulacji transkrypcyjnej operony mrna szybko degradowane, translacja zachodzi zasadniczo równocześnie z transkrypcją 12

13 Elementy systemów regulacji Elementy cis Znajdują się w obrębie tej samej cząsteczki, co element podlegający regulacji Elementy cis w obrębie DNA np. promotory, operatory, enhancery Elementy cis w obrębie RNA sekwencje wiążące białka regulujące translację, splicing, degradację itp. 13

14 Elementy systemów regulacji Elementy trans Odrębne cząsteczki oddziałujące z elementami cis i modulujące ekspresję Białka regulujące transkrypcję (czynniki transkrypcyjne), aktywatory, represory itp. Białka regulujące inne etapy ekspresji (aktywatory/represory translacji, splicingu itp.) RNA regulatorowe (sirna, mirna itp.) 14

15 Podstawy regulacji genu Regulacja pozytywna czynnik trans jest aktywatorem zwiększa ekspresję Regulacja negatywna czynnik trans jest represorem osłabia ekspresję 15

16 Podstawy regulacji genu Regulacja indukowalna Sygnał zwiększa (indukuje) ekspresję Regulacja reprymowalna Sygnał zmniejsza (reprymuje) ekspresję Możliwe są różne układy, np. regulacja negatywna indukowalna Nie należy mylić pojęć: pozytywna/negatywna dotyczy aktywności czynnika trans a indukowalna/reprymowalna odpowiedzi na sygnał 16

17 Operony Typowy dla bakteri i archeonów system ekspresji Policistronowy transkrypt wspólna ekspresja wielu genów z jednego promotora Przeważnie geny związane funkcją, ale są wyjątki Figure 8.8 Genomes 3 ( Garland Science 2007) 17

18 Regulacja Polimeraza stosunkowo prosta, proste sekwencje promotorowe Rdzeń katalityczny wspólny, kilka podejednostek sigma o różnej specyficzności odpowiadających za rozpoznanie promotorów σ70 (RpoD) główny czynnik sigma ("housekeeping ) większość genów σ54 (RpoN) głód azotowy σ38 (RpoS) głód/faza stacjonarna σ32 (RpoH) szok cieplny σ28 (RpoF) wić Aktywatory i represory wpływają na wiązanie polimerazy z DNA 18

19 Przyk ad operon lac 19 W. S Klug, M.R Cummings Concepts of Genetics 8 th edition, Prentice Hall, 2005

20 Operon lac regulacja przez CAP 20 W. S Klug, M.R Cummings Concepts of Genetics 8 th edition, Prentice Hall, 2005

21 Operon lac Regulacja na poziomie inicjacji transkrypcji Negatywna indukowalna przez laktozę/represor laci Pozytywna reprymowalna przez glukozę/białko CAP Białko to reguluje szereg operonów związanych z wykorzystywaniem źródeł węgla - regulon 21

22 Terminacja transkrypcji Podczas transkrypcji cały czas konkurencja między kontynuowaniem a dysocjacją polimerazy Zależy od związanych białek, struktury transkryptu Terminatory samodzielne Rho zależne 22 Figure 12.8 Genomes 3 ( Garland Science 2007)

23 Regulacja na poziomie terminacji - antyterminacja Antyterminacja Regulacja pozytywna, czynnik trans wiążąc się z DNA znosi działanie terminatora Typowy przykład geny kaskady litycznej faga λ Najwcześniejsze Wczesne-opóźnione Genomes 3 ( Garland Science 2007) 23

24 Regulacja na poziomie terminacji - atenuacja Fakultatywna sekwencja terminatora na początku transkryptu, zależnie od warunków Kinetyka translacji dostępność naładowanego trna Wiązanie specyficznych białek Wiązanie ligandów drobnocząsteczkowych ryboprzełączniki (niektóre) 24

25 Atenuacja operon trp E. coli Zależnie od dostępności załadowanego trna Trp sekwencja lidera mrna przyjmuje różne konformacje trna Trp dostępny trna Trp niedostępny 25 W. S Klug, M.R Cummings Concepts of Genetics 8 th edition, Prentice Hall, 2005

26 Operon trp u Bacillus subtilis Białko TRAP wiąże naładowany trna Trp Kompleks TRAP z trna Trp wiąże mrna Dodatkowo białko AT (anty- TRAP) wiąże TRAP gdy bardzo mało naładowanego trna Trp trna Trp dostępny W. S Klug, M.R Cummings Concepts of Genetics 8 th edition, Prentice Hall,

27 Ryboprze ączniki Wiązanie związków drobnocząsteczkowych bezpośrednio z mrna zmienia konformację, wpływając na ekspresję Atenuacja Dostępność miejsca wiązania rybosomu 27

28 Ryboprze ącznik TPP operon thi E. coli Odpowiada za biosyntezę tiaminy SD- Shine-Dalgarno TPP- pirofosforan tiaminy 28 Winkler et al. (2002) Nature 419,

29 Transdukcja sygna u systemy dwusk adnikowe Systemy umożliwiające regulację genów w odpowiedzi na czynniki zewnętrzne (transdukcja sygnału) Sensor domena wiążąca ligand + domena kinazy histydynowej (HK) autofosforylacja w odpowiedzi na sygnał Efektor (RR response regulator) fosforylowany przez aktywny sensor (w asparaginie) reguluje transkrypcję 29 West & Stock (2001). Trends Biochem. Sci., 26,

30 Globalne systemy regulujące - regulony Skoordynowana regulacja działania wielu operonów Represja kataboliczna (aktywator CAP) zależny od poziomu glukozy poziom camp Odpowiedź ścisła brak składników odżywczych, alarmon ppgpp, interakcja z polimerazą RNA, wybór podjednostki σ38 (RpoS) Odpowiedź SOS uszkodzenia genomu, białko RecA indukowana aktywność proteazy, tnie m. in. represor LexA 30

31 Życie spo eczne bakterii quorum sensing Mechanizm wyczuwania liczebności Ekspresja zależna od gęstości bakterii Komórki wydzielają cząsteczki sygnałowe autoinduktory (peptydy, związki laktonowe, pochodne S-AM) Przekroczenie progowego stężenia autoinduktorów aktywacja systemu dwuskładnikowego, zmiana ekspresji 31

32 Quorum sensing Vibrio fischeri Bioluminescencja tylko przy dużej gęstości w planktonie - nie w symbiozie z głowonogiem - tak Produkowany przez enzym LuxI autoinduktor wiąże aktywator LuxR, co aktywuje operon lucyferazy 32

33 Quorum sensing - biofilmy Tworzenie biofilmu kluczowe dla patogenezy, oporności na antybiotyki Np. Pseudomonas aeruginosa przewlekłe infekcje w płucach Infekcje oportunistyczne, np. u chorych na mukowiscydozę Fuqua & Greenberg (2002) Nature Reviews Molecular Cell Biology 3,

34 Kod genetyczny Trójkowy 20 aminokwasów kodony po 3 nukleotydy: 3 4 =64 możliwości (dwa: za mało) Dowody: badanie mutantów insercyjnych i delecyjnych (3 kolejne insercje lub delecje przywracały funkcje) 34

35 Kod genetyczny Nienakładający się Dowody: załóżmy sekwencję GTACA: jeden kodon: TAC, pozostałe: GTA i ACA (nakładanie 2 nukleotydów). Przy danym kodonie centralnym, możliwe tylko 4 2 = 16 różnych kombinacji trzyaminokwasowych. W naturze natomiast występują wszystkie możliwe kombinacje trzyaminokwasowe (20 2 =400). Pojedyncza zmiana nukleotydowa w sekwencji kodującej zmienia tylko jeden aminokwas, a nie dwa sąsiednie 35

36 Kod genetyczny Bezprzecinkowy Zdegenerowany 3 kodony STOP, pozostałe 61 kodonów koduje 20 aminokwasów 36

37 Kod genetyczny 37

38 Regularności w kodzie Trzecia pozycja kodonu najmniej znacząca (np. UCx Ser) Aminokwasy o podobnych właściwościach często z podobnymi kodonami Np. AAA, AAG: lizyna; AGA, AGG: arginina UCx: seryna; ACx: treonina 38

39 Parowanie wobble W 3 pozycji kodonu (1 antykodonu) dozwolone parowanie G-U oraz I-U/A/A (I inozyna) 39

40 Translacja 40

41 Nobel chemia 41

42 42